基于分子印迹的fish－in－net固定化酶
专利汇可以提供基于分子印迹的fish－in－net固定化酶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本方法是基于分子印迹的fish－in－net固定化酶，属于无机化学、物理化学和 生物 化学领域。以 硅 或/和金属 氧 化物的可溶性盐为原料，以 表面活性剂 为模板剂后形成溶胶，使在印迹分子保护下的酶与溶胶组装成无机－ 生物反应器 。壳为无机材料，催化活性中心是与糖相关的酶、酶系及酶制剂，印迹分子是酶的底物和/或产物中的糖类小分子。由于传统固定化酶酶活保持差，本方法在酶、酶系及酶制剂固定化中加入了酶的印迹分子，该印迹分子在固定化 进程 中从两个方面稳定目地催化体系：1)类似于印迹分子的作用，保护酶的活性中心的构象及催化活性；2)替代了酶外表面的 水 化位点，降低了固定化中出现的有机介质对酶的变性作用，极大保持了酶活性。，下面是基于分子印迹的fish－in－net固定化酶专利的具体信息内容。
1、基于分子印迹的fish-in-net固定化酶，其由如下方法制备：合成无机骨架， 它的壳为无机材料，催化活性中心是与糖相关的酶、酶系及酶制剂，且在 酶和酶系固定化中加入酶的印迹分子，用以保护酶的活性中心的化学结构 和几何构象。
2、如权利要求1所述的基于分子印迹的fish-in-net固定化酶，其特征在于： 上述催化活性中心的物种来源是植物、动物、微生物、人工合成和/或半合 成物。
3、如权利要求1所述的基于分子印迹的fish-in-net固定化酶，其特征在于： 酶是天然酶、突变酶、改造酶或是人工模拟酶类。
4、如权利要求3所述的基于分子印迹的fish-in-net固定化酶，其特征在于： 酶包括糖水解酶、糖异构酶、糖合成酶或糖基化酶。
5、如权利要求书4所述的基于分子印迹的fish-in-net固定化酶，其特征在于： 糖水解酶包括蔗糖酶、半乳糖苷酶、乳糖酶、麦芽糖水解酶、纤维二糖水 解酶、半乳糖水解酶；糖异构酶包括葡萄糖异构酶、木糖异构酶、甘露糖 异构酶；糖合成酶包括麦芽糖合成酶、葡聚糖合成酶、蔗糖合成酶、淀粉 合成酶。
6、如权利要求书1所述的基于分子印迹的fish-in-net固定化酶，其特征在于： 酶的印迹分子包括酶的底物或底物类似物、产物或产物类似物、中间过渡 代谢产物。
7、如权利要求书6所述的基于分子印迹的fish-in-net固定化酶，其特征在于： 酶的印迹分子是一种糖类物质，或是几种糖类物质混合物。
8、如权利要求书7所述的基于分子印迹的fish-in-net固定化酶，其特征在于： 酶的印迹分子为糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、核糖、麦芽糖、蔗糖、纤维 二糖、木糖、阿拉伯糖或甘露糖。
技术领域
本发明属于无机化学、物理化学和生物化学领域，具体涉及一种利用“网中 鱼(fish-in-net)”的方法制备的基于分子印迹的固定化酶，极大的保持了酶的活 性。
背景技术
采用无机硅或/和金属氧化物材料作为固定化的骨架，更有其优越性。首先， 易于将酶与底物、产物分开，方便后续的分离纯化，而且可以连续生产，酶的回 收率高，可反复使用；其次，酶的稳定性和最适温度改变，最适pH值改变；第 三，有些固定化酶，增加产物的收率，提高产物的质量，适合于产业化生产。
固定化酶同样存在着缺点，1)酶处于固定化材料的外表面时，酶容易受到 环境因素的影响，进而半衰期较短；2)酶处于固定化材料内部时，由于固定化 材料内部的空间较小且往往存在固定化材料与酶表面基团的相互作用，酶难于保 持其催化活性构象，进而催化活力大大下降；上述两种情况下，固定化的酶一旦 失去了活性，就只能依靠加入新的固定化酶来弥补催化能力的损失。这些问题， 我们已经通过专利200510017112.9给予解决。但是，在实际操作中仍存在下述 问题没有得到较好的解决：(1)有机溶剂的变性作用；(2)有机、无机粒子对 酶活性中心和构象进攻，影响酶的活性和功能。本专利中的新方法，是使用目的 固定化材料底物或底物类似物、产物或产物类似物、中间过渡代谢产物来稳定酶。 起两方面作用：(1)保护酶催化活性中心，不易受外界有机、无机粒子进攻；(2) 占领可溶剂化表面(水化层)，减少溶剂对酶构象的影响。而且存在于酶表面的 糖类物是饱和的小分子物质，是作为酶的底物或底物类似物、产物或产物类似物、 中间过渡态代谢产物，可以完全的进出无机外壳上孔道，对催化反应不会造成污 染。
发明内容
作为印迹分子的糖类物质，不仅能保持酶的活性中心，不易受外界有机、无 机粒子进攻，占领可溶剂化表面(水化层)，减少溶剂对酶构象的影响，且作为 酶的底物或底物类似物、产物或产物类似物、中间过渡代谢产物，可以完全的进 出无机外壳上孔道，对催化反应不会造成污染。
本发明方法的生物材料固载技术是，以硅或/和金属氧化物的可溶性盐为原 料，以表面活性剂为模板剂，后形成溶胶，具体各物质的摩尔配料比见专利 200510017112.9。我们将上述所形成的溶胶称作前驱体。糖相关的酶、酶系及 酶制剂和酶的印迹分子混合均匀，摩尔配料比为1：1，前驱体与上述酶的摩尔 配料比为1：0.03，前驱体与上述混合物组装成无机—生物反应器。
上述的与糖相关的酶包括糖水解酶、糖异构酶、糖合成酶、糖基化酶等。其 中糖水解酶包括蔗糖酶、半乳糖苷酶、乳糖酶、麦芽糖水解酶、纤维二糖水解酶、 半乳糖水解酶；糖异构酶包括葡萄糖异构酶、木糖异构酶、甘露糖异构酶；糖合 成酶包括麦芽糖合成酶、葡聚糖合成酶、蔗糖合成酶、淀粉合成酶等。
上述的酶的印迹分子包括酶的底物或底物类似物、产物或产物类似物、中间 过渡代谢产物。其中所述酶的糖类小分子物质包括寡糖，如果糖、葡萄糖、半乳 糖、乳糖、核糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等。
本发明方法在制备分子筛的同时利用表面活性剂的自组装缩聚以及和生物 材料的之间的协同作用，使得生物材料外表面为无机外壳，从而形成了催化活性 中心为酶、酶系及酶制剂的无机—生物反应器。同时，由于酶在与前驱体混合之 前，酶先与稳定酶构象的糖类物质混合，使酶的活性构象得以保持，不易受外界 有机、无机粒子的进攻，替代了酶外表面的水化位点，减少溶剂对酶构象的影响， 并且存在其表面的是饱和的小分子物质，是作为酶的底物或底物类似物、产物或 产物类似物、中间过渡代谢产物，可以完全的进出无机外壳上孔道，对催化反应 不会造成污染，使酶的活性较其它方法的固定化酶活大为的提高。
在最佳的条件下，本方法制备的固定化酶的稳定性高，可以反复使用10次 以上，并且较其它方法的固定化酶活大为的提高，几乎保持了初始固载酶的活性。
本发明方法提供的工艺制备固定化酶过程，是将无机材料，表面活性剂，酶 (酶系或酶制剂)，小分子糖类似物构建在一起的溶胶体系，通过能够稳定所述 酶的糖类小分子物质诱导出酶的活性构象，并且使其以大比例将酶包围，形成水 化层，替代其水化位点，对其形成保护，后进行固定化，能够使固定化的酶保持 活性构象，在无机外壳内发挥催化作用时不受空间位阻和外界刺激环境的影响， 提高了酶活性构象的稳定性，同时也使固定化酶的机械强度增加，酶的催化效率 提高，拓宽了酶的应用范围。
催化活性中心是与糖相关酶、酶系及酶制剂，稳定糖相关酶、酶系及酶制剂 的关键在于在制备固定化体系的过程中加入了稳定酶的小分子的糖类物质。
基于分子印迹的fish-in-net固定化酶，是由如下方法制备：参照我们申请的 专利200510017112.9所述的技术和方法合成无机骨架，它的壳为无机材料，催 化活性中心(催化材料)是与糖相关的酶、酶系及酶制剂，且在酶和酶系固定化 中加入酶的印迹分子，用以保护酶的活性中心的化学结构和几何构象。
进一步地，上述催化材料的物种来源可以是植物，动物，微生物，人工合成 和/或半合成物。上述酶可以是天然酶，突变酶，改造酶，或是人工模拟酶类。
其中的酶包括糖水解酶、糖异构酶、糖合成酶、糖基化酶等。
糖水解酶包括蔗糖酶、半乳糖苷酶、乳糖酶、麦芽糖水解酶、纤维二糖水解 酶、半乳糖水解酶；
糖异构酶包括葡萄糖异构酶、木糖异构酶、甘露糖异构酶；
糖合成酶包括麦芽糖合成酶、葡聚糖合成酶、蔗糖合成酶、淀粉合成酶等。
酶的印迹分子包括酶的底物或底物类似物、产物或产物类似物、中间过渡代 谢产物。
进一步的，酶的印迹分子，可以是一种糖类物质，也可以是几种糖类物质混 合物。
再进一步地，酶的印迹分子包括寡糖，如果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、核 糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等。
具体实施方式
无机骨架的合成
以TEOS(正硅酸乙酯)做硅源，以P123做表面活性剂(模板剂)。合成 介孔硅结构的配料SiO2/表面活性剂/CH3CH2OH/H2O/乳糖酶质量比值为1： 1.46：15：1.5：0.3。
首先，将p123溶于乙醇中，然后向其中加入硅源。待此溶于搅拌完全后， 向其中滴加HCL(盐酸)使其充分水解，使pH在6-8。然后将此混合体系在室 温下强力搅拌4-10小时。装入真空装置中搅拌的同时抽真空12-72小时，直到 溶液成透明粘稠的溶胶为止，制备成前驱体。
催化活性中心样品的制备：
乳糖与乳糖酶的质量比为10：1，将所用的乳糖酶做初步的纯化，然后使乳 糖酶与乳糖混合，在4℃在搅拌2小时，真空旋干成为糊状。将其与前驱体混合， 在4℃下温和搅拌继续真空条件下反应4-100小时。最后样品用醇/水多次洗涤 而得包埋乳糖酶的无机—生物反应器。经检测乳糖酶的活性与游离酶相比略有下 降，但酶的稳定性提高，且较其它方法的固定化酶活的提高，在使用10次后， 酶活力为初始固定酶活力的90％。
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