磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法
阅读：1023发布：2020-08-11
专利汇可以提供磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 工程 领域，涉及一种磷脂酰丝 氨 酸合成酶的制备方法，其技术方案是将工程菌 发酵 离心后粗酶液经 硫酸 铵盐析、中空 纤维 膜除盐浓缩、SP-Sepharose HP离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析等步骤纯化获得磷脂酰丝氨酸合成酶。本发明制备磷脂酰丝氨酸合成酶具有制备工艺简单、酶活 力 高等优点，适合工业化生产；并且由磷脂酰丝氨酸合成酶催化卵磷脂和丝氨酸合成的磷脂酰丝氨酸，在医药、食品及保健品领域具有良好的应用前景。，下面是磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1).制备粗发酵液
将工程菌接种至LB液体培养基中，36～38℃振荡培养10～14h，培养后产物按3～
7％的接种量转接至相同培养基中继续培养2～3h，然后加入10～20％的蔗糖水溶液，诱导26～30h，诱导后产物在3～5℃、8000r/min的条件下离心15～25min，收集上清，制得粗发酵液；
(2).盐析
粗发酵液在3～5℃、8000r/min的条件下离心15～25min，收集上清，加入硫酸铵至
75％饱和度，3～5℃静置10～14h后，在3～5℃、8000r/min的条件下离心15～25min，倾去上清，沉淀溶于pH 7.0、10mM的Tris-HCl缓冲液中；
(3).脱盐
将第(2)步的产物采用截流分子量为10kDa～20kDa的中空纤维膜进行超滤浓缩；
(4).SP-Sepharose HP离子交换层析
采用pH 7.0、10mM的Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，将脱盐后的活性组分用同样的缓冲液溶解，8000r/min离心15～25min，取上清，上样1～3mL后先用该缓冲液洗脱未吸附的蛋白，再用含0～1mol/L NaCl的该缓冲液进行梯度洗脱，收集活性组分；
(5).Sephadex G-75凝胶层析
离子交换层析得到的活性组分，先用含1.0％NaCl的Tris-HCl缓冲液溶解，8000r/min离心15～25min，取上清，上样1～3mL后用相同缓冲液进行洗脱，收集的活性组分即为磷脂酰丝氨酸合成酶，
所述的工程菌是保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.1395的枯草芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的LB培养基含有浓度为30μg/mL的卡那霉素。
3.根据权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的蔗糖水溶液的浓度为20％。
4.根据权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，其特征在于：所述的步骤(4)和(5)中的洗脱条件为：洗脱速度0.5mL/min，每管收集2mL。
磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法
技术领域
背景技术
[0003] 磷脂酰丝氨酸合成酶(phosphatidylserine synthase，PSS)是磷脂酶D家族成员之一，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，目前在细菌、酵母和哺乳动物细胞中均有发现。其中，源自大肠杆菌的磷脂酰丝氨酸合成酶具有该家族明显的序列特征，即含有两个间隔出现的H(x)K(x)4D保守序列，它能够催化合成大肠杆菌自身所需的大部分磷脂类物质，而不同于其它革兰氏阴性菌的磷脂类物质合成酶，并不紧密连接于细胞膜结构。对其进一步定位研究发现，该酶是一种外膜蛋白，主要通过脂类底物和弱酸性磷脂物质的电子传递链与膜表面互相作用。
[0004] 但是磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)在大肠杆菌中含量低(不到蛋白总含量的0.1％)，不利于直接工业化发酵生产；而枯草芽孢杆菌表达系统是一种较为理想的异源蛋白表达系统，可以高效地表达具有生物活性的异源蛋白并将其分泌到培养基中，且具有较高的生物安全性。本发明采用枯草芽孢杆菌系统表达磷脂酰丝氨酸合成酶基因，解决了出发菌株磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)表达量低的问题，发酵后粗酶液经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、离子交换层析、凝胶层析等步骤可获得高纯度的磷脂酰丝氨酸合成酶，具有制备工艺简单、酶活力高等优点，适合工业化生产。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备工艺简单，适合工业化生产且制备获得的合成酶酶活力高的磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法。
[0006] 本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0007] 一种磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，包括以下步骤：
[0008] (1).制备粗发酵液
[0009] 将工程菌接种至LB液体培养基中，36～38℃振荡培养10～14h，培养后产物按3～7％的接种量转接至相同培养基中继续培养2～3h，然后加入10～20％的蔗糖水溶液，诱导26～30h，诱导后产物在3～5℃、8000r/min的条件下离心15～25min，收集上清，制得粗发酵液；
[0010] (2).盐析
[0011] 粗发酵液在3～5℃、8000r/min的条件下离心15～25min，收集上清，加入硫酸铵至75％饱和度，3～5℃静置10～14h后，在3～5℃、8000r/min的条件下离心15～25min，倾去上清，沉淀溶于pH 7.0、10mM的Tris-HCl缓冲液中；
[0012] (3).脱盐
[0013] 将第(2)步的产物采用截流分子量为10kDa～20kDa的中空纤维膜进行超滤浓缩；
[0014] (4).SP-Sepharose HP离子交换层析
[0015] 采用pH 7.0、10mM的Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，将脱盐后的活性组分用同样的缓冲液溶解，8000r/min离心15～25min，取上清，上样1～3mL后先用该缓冲液洗脱未吸附的蛋白，再用含0～1mol/L NaCl的该缓冲液进行梯度洗脱，收集活性组分；
[0016] (5).Sephadex G-75凝胶层析
[0017] 离子交换层析得到的活性组分，先用含1.0％NaCl的Tris-HCl缓冲液溶解，8000r/min离心15～25min，取上清，上样1～3mL后用相同缓冲液进行洗脱，收集的活性组分即为磷脂酰丝氨酸合成酶。
[0018] 而且，所述的工程菌是保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.1395的枯草芽孢杆菌。
[0019] 而且，所述的步骤(1)中的LB培养基含有浓度为30μg/mL的卡那霉素。
[0020] 而且，所述的步骤(1)中的蔗糖水溶液的浓度为20％。
[0021] 而且，所述的步骤(4)或(5)中的洗脱条件均为：洗脱速度0.5mL/min，每管收集2mL。
[0022] 本发明的有益效果和优点：
[0023] 1.本发明对来源于大肠杆菌K12的磷脂酰丝氨酸合成酶基因(pss)进行克隆，与表达型质粒pBES连接构建重组质粒，并在枯草芽孢杆菌DB104中进行活性表达，提高了磷脂酰丝氨酸合成酶的表达量，改变了出发菌株中该酶含量低的现状(不到蛋白总含量的0.1％)。
[0024] 2.本发明将工程菌发酵离心后粗酶液经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、SP-Sepharose HP离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析等步骤纯化获得磷脂酰丝氨酸合成酶，由该方法制得的磷脂酰丝氨酸合成酶酶活力高、制备工艺简单，适合工业化生产。附图说明
[0025] 图1为本发明磷脂酰丝氨酸合成酶基因的PCR扩增电泳图；
[0026] 图2为本发明重组表达载体pBES-pss的构建示意图；
[0027] 图3为本发明重组表达载体pBES-pss的酶切验证图；
[0028] 图4为本发明重组表达载体pBES-pss的PCR验证图；
[0029] 图5为本发明磷脂酰丝氨酸合成酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
[0030] 下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0031] 一种磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，包括磷脂酰丝氨酸合成酶工程菌的构建及其酶的表达、重组磷脂酰丝氨酸合成酶的分离纯化两部分内容，下面分别予以叙述：
[0032] 一.磷脂酰丝氨酸合成酶工程菌的构建及其酶的表达
[0033] 采用的工程菌是保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 1.1395的枯草芽孢杆菌，其构建方法是：
[0034] 1.大肠杆菌Escherichia coli K12染色体DNA的提取
[0035] (1).挑取大肠杆菌Escherichia coli K12的单菌落接种到5mL LB培养基中，于37℃、180r/min培养12h。
[0036] (2).取1mL培养液于1.5mL EP管中，12000r/min离心10分钟，倒尽上清，将细菌沉淀重悬于200μL冰预冷的碱裂解液I中，剧烈振荡。
[0037] (3).加入50μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，4℃下消化1h。
[0038] (4).加入150μL浓度为2％的SDS溶液，反应10min至菌悬液呈现粘稠状。
[0039] (5).加入400μL饱和苯酚∶氯仿(1∶1)，混合均匀，12000r/min离心10min，将上清转移到另一干净EP管中，弃去下层有机相及蛋白沉淀，重复1次。
[0040] (6).加入400μL氯仿，混合均匀，12000r/min离心10min，将上清转移到另一干净EP管中，去除痕量苯酚。
[0041] (7).加入800μL的无水乙醇沉淀DNA，12000r/min离心10min，弃去上清，500μL70％乙醇洗涤2次。
[0042] (8).将EP管倒置于滤纸上，晾干后用TE缓冲液溶解，-20℃保存备用。
[0043] 2.引物设计及PCR扩增磷脂酰丝氨酸合成酶基因
[0044] (1).PCR扩增目的基因：参照数据库ExPASy上报道的磷脂酰丝氨酸合成酶基因(pss)序列(序列号P23830)设计引物，引物由上海英俊公司合成。
[0045] 上游引物P1：
[0046] 5′-AACTGCAGAATTGTCAAATTTAAGCGTAATAAAC-3′(下划线部分为加入的Pst I酶切位点)
[0047] 下游引物P2：
[0048] 5′-CCCAAGCTTTTACAGGATGCGGCTAATTAAT-3′(下划线部分为加入的HindIII酶切位点)
[0049] 以提取的大肠杆菌染色体DNA(10ng)为模板，PCR扩增条件为：94℃，预变性5min；94℃变性1min，50℃退火1min40s，72℃延伸1min，反应30个循环；最后72℃，延伸10min。
PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳(如图1)，将目的条带切下，用DNA试剂盒回收纯化。
PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳(如图1)，将目的条带切下，用DNA试剂盒回收纯化。
[0050] (2).大肠-枯草杆菌穿梭质粒pBES的提取：
[0051] ①.取一环保存有pBES质粒的Bacillus subtilis斜面接种，划线分离于LB固体培养基(含30μg/mL Kan)平板上，37℃倒置培养12h。
[0052] ②.挑取单菌落，接入到5mL含Kan的LB液体培养基中，于37℃、180r/min培养12h。
[0053] ③.将1.5mL菌液转入干净的微量离心管中，12000r/m离心30s收集菌体，弃上清。
[0054] ④.将沉淀重悬于100μL预冷的碱裂解液I中，混合均匀后添加10μL50mg/mL的溶菌酶，37℃保温30min。
[0055] ⑤.加入200μL碱裂解液II，盖紧管口，轻轻摇匀，确保离心管的整个内表面菌与碱裂解液II接触，将离心管放置冰上2min至液体清亮。
[0056] ⑥.加入150μL预冷的碱裂解液III，温和转动离心管，使碱裂解液III在粘稠的细菌裂解液中混合均匀，冰浴5min。
[0057] ⑦.12000r/min离心5min，将上清转移到另一管中，加400μL的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合溶液，混合均匀后，12000r/min离心5min，将上清转移到另一离心管中。
[0058] ⑧.加入800μL的无水乙醇，混合均匀后，-20℃放置30min，12000r/min离心5min收集沉淀。
[0059] ⑨.加入1mL 70％乙醇，洗涤沉淀2次，弃去残液，空气中干燥20min，用20μL灭菌的去离子水溶解沉淀。
[0060] (3).重组载体pBES-pss构建：将PCR产物和提取的质粒pBES分别用Pst I和Hind III进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用Solution I于16℃连接过夜得到重组质粒pBES-pss，质粒构建如图2。
[0061] 3.重组载体的转化及在宿主细菌中的表达
[0062] (1).重组载体的转化及鉴定：枯草芽孢杆菌转化在参照Spizizen方法的基础上进行了改进。取枯草芽孢杆菌DB104划LA平板，37℃培养箱培养12h。挑单菌落至3mL SPI培养基中，37℃、250r/min培养12h。次日取100μL培养液转接至5mL SPI培养基，37℃、250r/min培养至对数生长末期(OD600约为0.9)，取0.2mL培养液至2mL SPII培养基中，
37℃、150r/min培养90min。分装成0.5mL每管，各加入20μL重组质粒，再于37℃、100r/min震荡培养30min，然后250r/min培养90min，离心去处上清液，保留100μL上清液与菌液混合均匀后涂布筛选平板。
37℃、150r/min培养90min。分装成0.5mL每管，各加入20μL重组质粒，再于37℃、100r/min震荡培养30min，然后250r/min培养90min，离心去处上清液，保留100μL上清液与菌液混合均匀后涂布筛选平板。
[0063] 利用Spizizen法将重组质粒转入枯草芽孢杆菌DB104中，通过卡那霉素抗性平板筛选转化子，酶切和PCR验证结果如图3与图4所示，表明重组质粒上已经正确连接有目的基因。
[0064] (2).重组菌的诱导表达——磷脂酰丝氨酸合成酶粗发酵液的制备：接种重组枯草杆菌DB104/pBES-pss和对照菌DB 104/pBES于5mL含30μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养12h。按5％的接种量转接过夜培养物于30mL含30μg/mL卡那霉素的LB培养基中，振荡培养2h后加入20％蔗糖溶液至终浓度为2％，诱导24h。发酵液离心后，各取重组菌和对照菌上清10μL，分别与10μL上样缓冲液混合，沸水浴10min，离心取上清进行SDS-PAGE(12％分离胶，5％浓缩胶)电泳，检测蛋白表达情况如图5，发酵液上清可直接用于酶活力测定。
[0065] (3).酶活检测：采用酶联比色法进行活性检测。
[0066] 磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)催化水解L-α-卵磷脂生成胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的作用下生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化酶的作用下与4-氨基氨替比林和苯酚生成醌亚胺显色物质，在A＝500nm下具有吸光值。
[0067] 反应体系：将220mg的L-α-卵磷脂溶于含有3mL 50mM的SDS溶液、6mL 1M NaOAc缓冲液(pH＝8.0)、39mL的去离子水、0.272mL 17.9％的乙醇溶液(终浓为1％)的混合体系作为底物溶解液。将39mg 4-氨基氨替比林、80mg苯酚及8mg过氧化物酶溶于溶于5.5mL的100mM Tris HCl(pH＝8)缓冲液中作为胆碱显色剂。取2.4mL底物溶液、0.3mL的500mM CaCl2溶液、0.2mL的去离子水混合并置于35℃水浴。然后加入0.1mL的酶液，混合均匀，于35℃反应10min，沸水浴终止反应，待冷却至室温加入0.05mL 2M TrisHCl(pH＝9)缓冲液，混合并离心后，上清用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液2mL与0.1mL胆碱显色剂、0.1mL胆碱氧化酶溶液室温反应2.5h。在反应混合物中加入2.0mL去离子水，离心得到澄清透亮的粉红色溶液，最后于A500nm检测吸光值。
[0068] 酶活定义：pH＝8.0、T＝35℃时，磷脂酰丝氨酸合成酶1h内催化水解L-α-卵磷脂释放1.0μmol的胆碱所需要的酶量。
[0069] 二.重组磷脂酰丝氨酸合成酶的分离纯化
[0070] 1.制备粗发酵液
[0071] 将工程菌接种至LB液体培养基中，37℃振荡培养12h，培养后产物按5％的接种量转接至相同培养基中继续培养2h，然后加入10％的蔗糖水溶液，诱导28h，诱导后产物在4℃、8000r/min的条件下离心20min，收集上清，制得粗发酵液。
[0072] 2.盐析
[0073] 取28h发酵液，在4℃、8000r/min的条件下离心20min，收集上清，加入硫酸铵至75％饱和度，4℃静置12h后，在4℃、8000r/min的条件下离心20min，倾去上清，沉淀溶于pH 7.0、10mM的Tris-HCl缓冲液中。
[0074] 3.脱盐
[0075] 将盐析沉淀溶解于pH 7.0、10mM的Tris-HCl缓冲液后，用截流分子量为10kDa～20kDa的中空纤维膜超滤，对样品进行脱盐浓缩，除盐效果用BaCl2溶液检测，以滤出液滴入BaCl2溶液中无沉淀析出为终点。
[0076] 4.SP-Sepharose HP(2.4cm×30cm)离子交换层析
[0077] 采用pH 7.0、10mM的Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，将脱盐后的活性组分用同样的缓冲液溶解，8000r/min离心20min，取上清，上样2mL后先用该缓冲液洗脱未吸附的蛋白，再用含0.1mol/L NaCl的该缓冲液进行梯度洗脱，收集活性组分。
[0078] 5.Sephadex G-75(1.6cm×80cm)凝胶层析
[0079] 离子交换层析得到的活性组分，先用含1.0％NaCl 10mM的Tris-HCl缓冲液溶解，8000r/min离心20min，上样2mL后用相同的缓冲液以0.5mL/min的速度洗脱，每管收集2.0mL，收集活性组分，即为磷脂酰丝氨酸合成酶。
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