用于在产油酵母种中生产III型聚酮的组合物和方法
阅读：526发布：2020-05-17
专利汇可以提供用于在产油酵母种中生产III型聚酮的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及使用遗传修饰的产油 酵母 菌株例如解脂耶氏酵母生产III型聚 酮 化合物的组合物和方法。，下面是用于在产油酵母种中生产III型聚酮的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种遗传修饰的产油酵母细胞，其包含异源基因，其中所述异源基因编码III型聚酮合成酶。
2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其中所述产油酵母细胞是解脂耶氏酵母。
3.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述异源基因选自来自由非洲菊的CAA86219.2基因、来自大黄的AY517486基因、来自荧光假单胞菌的JX840717-JX840724基因、来自覆盆子的B0LDU5基因、来自灰色链霉菌的B1VLQ8基因、来自天蓝色链霉菌的SCO1206基因、来自啤酒花的BAB12102.2基因组成的组，或其组合。
4.根据权利要求3所述的酵母细胞，其中所述异源基因是来自非洲菊的CAA86219.2基因。
5.根据权利要求3所述的酵母细胞，其中所述异源基因是来自大黄的AY517486基因。
6.根据权利要求3所述的酵母细胞，其中所述异源基因是来自荧光假单胞菌的JX840717-JX840724基因。
7.根据权利要求3所述的酵母细胞，其中所述异源基因是来自覆盆子的B0LDU5基因。
8.根据权利要求3所述的酵母细胞，其中所述异源基因是来自灰色链霉菌的B1VLQ8基因。
9.根据权利要求3所述的酵母细胞，其中所述异源基因是来自啤酒花的BAB12102.2基因。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的酵母细胞，其中将所述异源基因掺入包含启动子和所述异源基因的基因表达盒中，其中所述基因表达盒整合到所述酵母细胞的所述基因组中。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的酵母细胞，其中所述异源基因的至少两个拷贝存在于所述酵母细胞的所述基因组中。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的酵母细胞，其中所述异源基因从质粒中游离表达。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞包含另外的遗传修饰。
14.根据权利要求13所述的酵母细胞，其中所述另外的遗传修饰增加乙酰-CoA或丙二酰-CoA水平或通量。
15.根据权利要求14所述的酵母细胞，其中所述另外的遗传修饰增加β-氧化速率以增加乙酰-CoA或丙二酰-CoA水平或通量。
16.根据权利要求15所述的酵母细胞，其中所述另外的遗传修饰包括消除或减少解脂耶氏酵母基因磷脂酸磷酸酶(PAH1；YALI0D27016)；和/或其中所述另外的遗传修饰包括一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，所述基因选自由过氧化物酶10(PEX10；
YALI0C01023)、多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)、初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)组成的组，或其组合。
17.根据权利要求13所述的酵母细胞，其中所述另外的遗传修饰包括消除或减少一种或多种解脂耶氏酵母基因，所述基因选自由天冬氨酰蛋白酶(PEP4；YALI0F27071p)、蛋白酶B液泡(PRB1；YALI0B16500p)、蛋白酶B液泡(PRB1H；YALI0A06435g)、葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶同种型1(GSY1；YALI0F18502p)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；YALI0E22649p)、丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；YALI0C16995p)、果糖-1,
6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)、线粒体载体(YIA6；YALI0E16478g)、线粒体载体蛋白(RIM2；YALI0F05500g)、醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)、醇脱氢酶2(ADH2；
YALI0E17787p)、醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)、C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；
YALI0F30745p)、C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)、磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)、甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)、脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)、脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)、磷脂酶磷酸酶(PAH1；YALI0D27016)组成的组，或其组合；和/或其中所述另外的遗传修饰包括一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，所述基因选自由乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；
YALI0C11407g)、丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)、苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)、乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)、丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)、ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)、ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)、AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)、乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)、推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)、乙酰-CoA合成酶1(ACS1；
YALI0F05962)、乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)、乙醛脱氢酶2(ALD2；YALI0C03025)、乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)、乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)、乙醛脱氢酶5(ALD5；
YALI0D07942)、乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)、丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；
YALI0F20702)、丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)、peroxin10(PEX10；
YALI0C01023)、多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)、初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)组成的组，或其组合。
18.根据权利要求17所述的酵母细胞，其中所述另外的遗传修饰包括消除或减少一种或多种解脂耶氏酵母基因，所述基因选自由天冬氨酰蛋白酶(PEP4；YALI0F27071p)、蛋白酶B液泡(PRB1；YALI0B16500p)、蛋白酶B液泡(PRB1H；YALI0A06435g)、葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶同种型1(GSY1；YALI0F18502p)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；YALI0E22649p)、丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；YALI0C16995p)、果糖-1,
6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)、线粒体载体(YIA6；YALI0E16478g)、线粒体载体蛋白(RIM2；YALI0F05500g)、醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)、醇脱氢酶2(ADH2；
YALI0E17787p)、醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)、C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；
YALI0F30745p)、C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)、磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)、甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)、脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)、脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)、(PAH1；
YALI0D27016)组成的组，或其组合。
19.根据权利要求17所述的酵母细胞，其中所述另外的遗传修饰包括一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，所述基因选自由乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；
YALI0C11407g)、丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)、苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)、乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)、丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)、ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)、ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)、AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)、乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)、推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)、乙酰-CoA合成酶1(ACS1；
YALI0F05962)、乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)、乙醛脱氢酶2(ALD2；YALI0C03025)、乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)、乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)、乙醛脱氢酶5(ALD5；
YALI0D07942)、乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)、丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；
YALI0F20702)、丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)、peroxin 10(PEX10；
YALI0C01023)、多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)、初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)组成的组，或其组合。
20.根据权利要求19所述的酵母细胞，其中所述另外的遗传修饰是丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)的过表达。
21.根据权利要求19所述的酵母细胞，其中所述另外的遗传修饰是苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)的过表达。
22.根据权利要求19所述的酵母细胞，其中所述另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)的过表达。
23.根据权利要求19所述的酵母细胞，其中所述另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)的过表达。
24.根据权利要求19所述的酵母细胞，其中所述另外的遗传修饰是丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)的过表达。
25.根据权利要求19所述的酵母细胞，其中所述另外的遗传修饰是乙酰-CoA脱羧酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)的过表达。
26.根据权利要求19所述的酵母细胞，其中所述另外的遗传修饰是乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)的过表达。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞是野生型株。
28.根据权利要求27所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞是PO1f株。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞已被预优化用于脂质过量产生。
30.一种生产III型聚酮化合物的方法，包括：1)在生长培养基中培养产油酵母细胞，其中所述酵母细胞包含异源基因，其中所述异源基因编码III型聚酮化合物合成酶；2)分离所述III型聚酮化合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述产油酵母细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述异源基因选自来自由非洲菊(Gerbera hybrida)的CAA86219.2基因、来自大黄(Rheum palmatum)的AY517486基因、来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的JX840717-JX840724基因、来自覆盆子(Rubus idaeus)的B0LDU5基因、来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的B1VLQ8基因、来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的SCO1206基因、来自啤酒花(Humulus lupulus)的BAB12102.2基因组成的组。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述III型聚酮化合物选自由三乙酸内酯、芦荟苦素、间苯三酚、苄叉丙酮、1,8-二羟基萘、淡黄霉素和phloroisovalerophenone组成的组。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述异源基因是来自非洲菊的CAA86219.2基因。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述异源基因是来自大黄的AY517486基因。
36.根据权利要求31所述的方法，其中所述异源基因是来自荧光假单胞菌的JX840717-JX840724基因。
37.根据权利要求31所述的方法，其中所述异源基因是来自覆盆子的B0LDU5基因。
38.根据权利要求31所述的方法，其中所述异源基因是来自灰色链霉菌的B1VLQ8基因。
39.根据权利要求31所述的方法，其中所述异源基因是来自啤酒花的BAB12102.2基因。
40.根据权利要求33所述的方法，其中所述III型聚酮化合物是三乙酸内酯。
41.根据权利要求33所述的方法，其中所述III型聚酮化合物是芦荟苦素。
42.根据权利要求33所述的方法，其中所述III型聚酮化合物是间苯三酚。
43.根据权利要求33所述的方法，其中所述III型聚酮化合物是苄叉丙酮。
44.根据权利要求33所述的方法，其中所述III型聚酮化合物是1,8-二羟基萘。
45.根据权利要求33所述的方法，其中所述III型聚酮化合物是淡黄霉素。
46.根据 权 利要 求 33 所 述的 方 法 ，其中 所 述 II I 型聚 酮 化合 物 是phloroisovalerophenone。
47.根据权利要求30至46中任一项所述的方法，其中将所述异源基因掺入包含启动子和所述异源基因的基因表达盒中，其中所述基因表达盒整合到所述酵母细胞的所述基因组中。
48.根据权利要求30至46中任一项所述的方法，其中所述异源基因的至少两个拷贝存在于所述酵母细胞的基因组中。
49.根据权利要求30至46中任一项所述的方法，其中所述异源基因从质粒中游离表达。
50.根据权利要求30至49中任一项所述的方法，其中所述酵母细胞包含另外的遗传修饰。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述另外的遗传修饰增加乙酰-CoA或丙二酰-CoA水平或通量。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述另外的遗传修饰增加β-氧化速率以增加乙酰-CoA或丙二酰-CoA水平或通量。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述另外的遗传修饰包括消除或减少解脂耶氏酵母基因磷脂酸磷酸酶(PAH1；YALI0D27016)；和/或其中所述另外的遗传修饰包括一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，所述基因选自由过氧化物酶10(PEX10；YALI0C01023)、多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)、初级油酸调节剂(POR1；
YALI0D12628)组成的组，或其组合。
54.根据权利要求50所述的方法，其中所述另外的遗传修饰包括消除或减少一种或多种解脂耶氏酵母基因，所述基因选自由天冬氨酰蛋白酶(PEP4；YALI0F27071p)、蛋白酶B液泡(PRB1；YALI0B16500p)、蛋白酶B液泡(PRB1H；YALI0A06435g)、葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶同种型1(GSY1；YALI0F18502p)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；YALI0E22649p)、丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；YALI0C16995p)、果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)、线粒体载体(YIA6；YALI0E16478g)、线粒体载体蛋白(RIM2；
YALI0F05500g)、醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)、醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)、醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)、C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；YALI0F30745p)、C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)、磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；
YALI0E02090p)、甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)、脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；
YALI0B19382p)、脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)、(PAH1；YALI0D27016)组成的组，或其组合；和/或其中所述另外的遗传修饰包括一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，所述基因选自由乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)、丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)、苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)、乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)、丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)、ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)、ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；
YALI0D24431p)、AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)、乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)、推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)、乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)、乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)、乙醛脱氢酶2(ALD2；YALI0C03025)、乙醛脱氢酶3(ALD3；
YALI0E00264)、乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)、乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)、乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)、丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)、丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)组成的组，或其组合；和/或其中所述另外的遗传修饰包括消除或减少解脂耶氏酵母基因磷脂酸磷酸酶(PAH1；YALI0D27016)；和/或其中所述另外的遗传修饰包括一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，所述基因选自由peroxin 10(PEX10；YALI0C01023)、多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)、初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)组成的组，或其组合。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述另外的遗传修饰包括消除或减少一种或多种解脂耶氏酵母基因，所述基因选自由天冬氨酰蛋白酶(PEP4；YALI0F27071p)、蛋白酶B液泡(PRB1；YALI0B16500p)、蛋白酶B液泡(PRB1H；YALI0A06435g)、葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶同种型1(GSY1；YALI0F18502p)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；YALI0E22649p)、丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；YALI0C16995p)、果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)、线粒体载体(YIA6；YALI0E16478g)、线粒体载体蛋白(RIM2；
YALI0F05500g)、醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)、醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)、醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)、C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；YALI0F30745p)、C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)、磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；
YALI0E02090p)、甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)、脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；
YALI0B19382p)、脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)、(PAH1；YALI0D27016)组成的组，或其组合。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述另外的遗传修饰包括一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，所述基因选自由乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)、丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；
YALI0D20768g)、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)、苹果酸脱氢酶(MAE1；
YALI0E18634p)、乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)、丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)、ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)、ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)、AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)、乙酰-CoA水解酶(ACH1；
YALI0E30965g)、推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)、乙酰-CoA合成酶1(ACS1；
YALI0F05962)、乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)、乙醛脱氢酶2(ALD2；YALI0C03025)、乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)、乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)、乙醛脱氢酶5(ALD5；
YALI0D07942)、乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)、丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；
YALI0F20702)、丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)、peroxin 10(PEX10；
YALI0C01023)、多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)、初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)组成的组，或其组合。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述另外的遗传修饰是丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)的过表达。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述另外的遗传修饰是苹果酸脱氢酶(MAE1；
YALI0E18634p)的过表达。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)的过表达。
60.根据权利要求56所述的方法，其中所述另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)的过表达。
61.根据权利要求56所述的方法，其中所述另外的遗传修饰是丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)的过表达。
62.根据权利要求56所述的方法，其中所述另外的遗传修饰是乙酰-CoA脱羧酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)的过表达。
63.根据权利要求56所述的方法，其中所述另外的遗传修饰是乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)的过表达。
64.根据权利要求30至63中任一项所述的方法，其中所述酵母细胞是野生型株。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述酵母细胞是PO1f株。
66.根据权利要求30至63中任一项所述的方法，其中所述酵母细胞已被优化用于脂质过量产生。
67.根据权利要求30-66中任一项所述的方法，其中所述生长培养基包含选自由葡萄糖、甘油、木糖、果糖、甘露糖、核糖、蔗糖和木质纤维素生物质组成的组的主要碳源。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述生长培养基包含葡萄糖作为所述主要碳源。
69.根据权利要求30-68中任一项所述的方法，其中所述生长培养基包含选自木质素或木质素衍生的芳族化合物的二次碳源。
70.根据权利要求30-69中任一项所述的方法，还包括添加溶解剂，其中所述溶解剂增加III型聚酮化合物的溶解度。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述溶解剂是三甘醇。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述溶解剂是γ-戊内酯。
用于在产油酵母种中生产III型聚酮的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
技术领域
[0003] 本发明涉及使用遗传修饰的产油酵母菌株例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)生产III型聚酮化合物的组合物和方法。
背景技术
[0004] 对可再生化学品和燃料日益增长的需求激发了人们对将细胞用作生化工厂的极大兴趣。在可能的分子中，聚酮化合物是由微生物和植物产生的一类引起兴趣的次级代谢产物，其在细胞防御和通讯等过程中具有天然作用(Austin,M.B.and J.P.Noel.Natural Product Reports,2002.20(1):p.79-110；Keatinge-Clay,A.T.Natural Product Reports,2012.29(10):p.1050；Lim,Y.等，Molecules,2016.21(6):p.806；Yu,D.等，IUBMB Life,2012.64(4):p.285-295)。聚酮化合物代表通过一系列缩合和随后的修饰从2个或更多碳单元合成的大量多种化合物。聚酮化合物存在于许多类型的生物中，包括真菌和菌丝体细菌，特别是放线菌。聚酮化合物结构种类繁多，聚酮化合物类包括许多具有不同活性的化合物。红霉素、巨蛋白、冥菌素、竹桃霉素、苦霉素、雷帕霉素、多杀菌素和泰乐菌素是聚酮化合物的实例。鉴于通过传统化学方法难以生产聚酮化合物，以及野生型微生物中聚酮化合物的产量通常较低，因此对寻找改进的或替代的生产聚酮化合物的方法存在相当大的兴趣。
[0005] 虽然许多聚酮化合物可用作有效的抗生素，但这类分子还包括具有其他有用性质的化学品，例如色素、抗氧化剂、抗真菌剂和其他生物活性性状。然而，使用这些分子的更独特的非医学应用受到限制，部分原因在于它们在天然宿主中的丰度低。具体地，产生聚酮化合物的生物通常是不适合高水平工业生产的非常规植物和细菌(Robinson,J.A.Philosophical Transactions of the Royal Society B:Biological Sciences,
1991.332(1263):p.107-114)。同样，聚酮化合物的传统化学合成受到低浓度和具有挑战性的手性中心的限制。虽然药品的规模和价格点可以容忍以植物为基础的聚酮化合物来源，但这不是许多大规模化学应用的选择。例如，简单的聚酮三乙酸内酯(TAL)已经被提出作为生物可再生的平台化学品，因为它可以转化为各种有价值的中间体和传统上源自化石燃料的产品(Chia,M.等.Green Chemistry,2012.14(7):p.1850)。在一个这样的应用中，TAL可以用作可再生山梨酸生产的原料，这是一种年度全球市场为100,000吨的分子。然而，假设当前的天然植物的浓度(如大丁草属(gerbera daisies))，必须利用4倍的全球耕地数量来生产足够的TAL才可满足世界每年的山梨酸需求。因此，尽管这些分子具有化学前景，但尚未探索或考虑聚酮化合物在独特化学应用中的应用，包括聚合物、涂料甚至商品化学品生产。
1991.332(1263):p.107-114)。同样，聚酮化合物的传统化学合成受到低浓度和具有挑战性的手性中心的限制。虽然药品的规模和价格点可以容忍以植物为基础的聚酮化合物来源，但这不是许多大规模化学应用的选择。例如，简单的聚酮三乙酸内酯(TAL)已经被提出作为生物可再生的平台化学品，因为它可以转化为各种有价值的中间体和传统上源自化石燃料的产品(Chia,M.等.Green Chemistry,2012.14(7):p.1850)。在一个这样的应用中，TAL可以用作可再生山梨酸生产的原料，这是一种年度全球市场为100,000吨的分子。然而，假设当前的天然植物的浓度(如大丁草属(gerbera daisies))，必须利用4倍的全球耕地数量来生产足够的TAL才可满足世界每年的山梨酸需求。因此，尽管这些分子具有化学前景，但尚未探索或考虑聚酮化合物在独特化学应用中的应用，包括聚合物、涂料甚至商品化学品生产。
[0006] 尽管聚酮化合物具有固有的化学多样性，但所有这些分子都是由相同的常见结构单元构建的：酰基辅酶A前体(Austin,M.B.and J.P.Noel.Natural Product Reports,2002.20(1):p.79-110；Keatinge-Clay,A.T.Natural Product Reports,2012.29(10):
p.1050；Lim,Y.等，Molecules,2016.21(6):p.806；Yu,D.等，IUBMB Life,2012.64(4):
p.285-295)。产生它们的酶(聚酮化合物合成酶(PKS))催化一系列脱羧缩合产生聚酮化合物链并利用链内的分子内反应产生环状化合物(Austin,M.B.and J.P.Noel.Natural Product Reports,2002.20(1):p.79-110)。
p.1050；Lim,Y.等，Molecules,2016.21(6):p.806；Yu,D.等，IUBMB Life,2012.64(4):
p.285-295)。产生它们的酶(聚酮化合物合成酶(PKS))催化一系列脱羧缩合产生聚酮化合物链并利用链内的分子内反应产生环状化合物(Austin,M.B.and J.P.Noel.Natural Product Reports,2002.20(1):p.79-110)。
[0007] 在一类特定的PKS中，III型PKS系统酶由含有一个活性位点的小同型二聚体组成，其中链延伸和环化均发生(Austin,M.B.and J.P.Noel.Natural Product Reports,2002.20(1):p.79-110；Lim,Y.等，Molecules,2016.21(6):p.806；Yu,D.等，IUBMB Life,
2012.64(4):p.285-295)。III型PKS能够通过使用各种较大的含CoA前体作为起始单元来生产多种多烯烃产品。这些起始物(starter)的范围从小的脂肪族分子(例如乙酰-CoA)到衍生自苯丙烷途径的较大的含环化合物(例如4-香豆酰-CoA)。通常，这些CoA分子通过酸性CoA连接酶的功能形成，该酸性CoA连接酶将羧酸转化为相应的CoA分子。
2012.64(4):p.285-295)。III型PKS能够通过使用各种较大的含CoA前体作为起始单元来生产多种多烯烃产品。这些起始物(starter)的范围从小的脂肪族分子(例如乙酰-CoA)到衍生自苯丙烷途径的较大的含环化合物(例如4-香豆酰-CoA)。通常，这些CoA分子通过酸性CoA连接酶的功能形成，该酸性CoA连接酶将羧酸转化为相应的CoA分子。
[0008] III型聚酮化合物可用作生物活性分子以及用于聚合物生产的单体前体。然而，该应用受限于适合以高产率生产这些产品以实现工业级生产的生产主体的可用性。例如，一些III型聚酮化合物(即三乙酸内酯(TAL))已在工业酵母属(Saccharomyces)酵母株中产生(Saunders,L.et al.,J.Ind.Microbiol Biotechnol(2015)42:711-721)。然而，来自这些菌株的TAL的产量不足以用于工业规模生产III型聚酮化合物，表明需要进一步的代谢和基因工程以实现足够的生产水平。
[0009] 因此，需要产生更高产率的III型聚酮化合物的改进的组合物和方法。
发明内容
[0010] 本文公开了遗传修饰的产油酵母菌株和用于足以实现工业规模生产的水平生产III型聚酮化合物的方法。由于它们已有丰富的CoA分子前体库，因此油脂酵母物种(例如解脂耶氏酵母)是用于生产III型聚酮化合物的优异宿主。通过代谢工程，这些生物的通量(flux)可以从脂肪酸的生产转移到III型聚酮化合物的生产。因此，本文公开的发明用作允许聚酮化合物作为化学原料的化学原料，用于化学和材料科学工业中的各种新应用。
[0011] 在一个方面，本文提供了一种遗传修饰的产油酵母细胞，其包含异源基因，其中该异源基因编码III型聚酮合成酶。在一个实施方案中，产油酵母细胞是解脂耶氏酵母。
[0012] 在一个实施方案中，本文提供了遗传修饰的产油酵母细胞，其包含异源基因，其中该异源基因选自来自非洲菊(Gerbera hybrida)的CAA86219.2(g2ps1)基因、来自大黄(Rheum palmatum)的AY517486(ALS)基因、来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的JX840717-JX840724(PHLD)基因、来自覆盆子(Rubus idaeus)的B0LDU5基因、来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的B1VLQ8(RPPA)基因、来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的SCO1206(THNS)基因、来自啤酒花(Humulus lupulus)的BAB12102.2基因、或其组合。在一个实施方案中，该异源基因是来自非洲菊的CAA86219.2(g2ps1；2-吡喃酮合成酶)基因。
[0013] 本文公开的遗传修饰的酵母菌株可用于增加III型聚酮化合物的产生。在一个方面，本文公开了一种制备III型聚酮化合物的方法，包括：1)在生长培养基中培养产油酵母细胞，其中酵母细胞包含异源基因，其中该异源基因编码III型聚酮化合物合成酶；2)分离该III型聚酮化合物。
[0014] 本文公开了一种制备III型聚酮化合物的方法，包括：1)在生长培养基中培养产油酵母细胞，其中该酵母细胞包含异源基因,其中该异源基因选自来自非洲菊(Gerbera hybrida)的CAA86219.2基因、来自大黄(Rheum palmatum)的AY517486基因、来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的JX840717-JX840724基因、来自覆盆子(Rubus idaeus)的B0LDU5基因、来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的B1VLQ8基因、来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的SCO1206基因、来自啤酒花(Humulus lupulus)的BAB12102.2基因；和2)分离该III型聚酮化合物。
[0015] 在另一实施方案中，本文公开了一种制备III型聚酮化合物的方法，包括：1)在生长培养基中培养解脂耶氏酵母细胞，其中该酵母细胞包含一种或多种异源基因,其中该异源基因选自来自非洲菊(Gerbera hybrida)的CAA86219.2基因、来自大黄(Rheum palmatum)的AY517486基因、来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的JX840717-JX840724基因、来自覆盆子(Rubus idaeus)的B0LDU5基因、来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的B1VLQ8基因、来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的SCO1206基因、来自啤酒花(Humulus lupulus)的BAB12102.2基因；和2)分离该III型聚酮化合物。
[0016] 在一个实施方案中，该异源基因整合到该酵母细胞基因组中。在另一实施方案中，该异源基因的至少两个拷贝存在于该酵母细胞的基因组中。在一个实施方案中，将该异源基因掺入包含启动子和该异源基因的基因表达盒中，其中该基因表达盒整合到酵母细胞的基因组中。在备选实施方案中,该异源基因从质粒中游离表达。
[0017] 另一方面，遗传修饰的产油酵母细胞(例如解脂耶氏酵母)包含另外的遗传修饰。例如，另外的遗传修饰可以增加乙酰-CoA和/或丙二酰-CoA水平或通量。在一些实施方案中，该另外的遗传修饰增加β-氧化速率以增加乙酰-CoA或丙二酰-CoA水平或通量。
[0018] 在一些实施方案中，该另外的遗传修饰包括消除或减少解脂耶氏酵母基因磷脂酸磷酸酶(PAH1；YALI0D27016)；和/或该另外的遗传修饰包括一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自过氧化物酶10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
[0019] 在一些实施方案中，另外的遗传修饰包括：1)消除或减少一种或多种解脂耶氏酵母基因，该基因选自天冬氨酰蛋白酶(PEP4；YALI0F27071p)，蛋白酶B液泡(PRB1；YALI0B16500p)，蛋白酶B液泡(PRB1H；YALI0A06435g)，葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶同种型
1(GSY1；YALI0F18502p)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；YALI0E22649p)，丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；YALI0C16995p)，果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)，线粒体载体(YIA6；YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；
YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；
YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；
YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)，(PAH1；YALI0D27016)，或其组合；和/或2)一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；
YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，peroxin10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
1(GSY1；YALI0F18502p)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；YALI0E22649p)，丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；YALI0C16995p)，果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)，线粒体载体(YIA6；YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；
YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；
YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；
YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)，(PAH1；YALI0D27016)，或其组合；和/或2)一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；
YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，peroxin10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
[0020] 在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)的过表达。在一个实施方案中，所述另外的遗传修饰是苹果酸脱氢酶(MAE1；
YALI0E18634p)的过表达。在一个实施方案中，所述另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)的过表达。在一个实施方案中，所述另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)的过表达。在一个实施方案中，所述另外的遗传修饰是丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)的过表达。在一个实施方案中，所述另外的遗传修饰是乙酰-CoA脱羧酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)的过表达。在一个实施方案中，所述另外的遗传修饰是乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)的过表达。
YALI0E18634p)的过表达。在一个实施方案中，所述另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)的过表达。在一个实施方案中，所述另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)的过表达。在一个实施方案中，所述另外的遗传修饰是丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)的过表达。在一个实施方案中，所述另外的遗传修饰是乙酰-CoA脱羧酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)的过表达。在一个实施方案中，所述另外的遗传修饰是乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)的过表达。
[0021] 在一个实施方案中，解脂耶氏酵母细胞是野生型株。在进一步的实施方案中，野生型株是PO1f株。在另外的实施方案中，解脂耶氏酵母细胞已被预优化用于脂质过量产生。在一个实施方案中，酵母细胞是L36株。
[0022] 在一些实施方案中，所述生长培养基包含选自葡萄糖、甘油、木糖、果糖、甘露糖、核糖、蔗糖和木质纤维素生物质的主要碳源。在一个实施方案中，所述生长培养基包含葡萄糖作为主要碳源。在另外的实施方案中，所述生长培养基包含选自木质素或木质素衍生的芳族化合物的次级碳源。
[0025] 图1.在野生型(PO1f)解脂耶氏酵母和先前工程化的解脂耶氏酵母株(用于高脂质生产(L36))中随时间三乙酸内酯(TAL)的产生。
[0026] 图2.三乙酸内酯(TAL)的产生随着野生型(PO1f)解脂耶氏酵母和先前工程化的解脂耶氏酵母菌株(用于高脂质生产(L36))的g2ps1基因拷贝的增加和葡萄糖量的增加而增加。
[0027] 图3.在生物反应器试验#1中随时间三乙酸内酯(TAL)的产生(g/L)。
[0028] 图4.在生物反应器试验#2中随时间三乙酸内酯(TAL)的产生(g/L)。
[0029] 图5.三乙酸内酯(TAL)的产生可导致溶解度问题，当停止搅拌时容易观察到，并且反应器在中间阶段与结晶TAL结合成不同的相。
[0030] 图6.在过表达ACL1、MAE1或PDC1的酵母株中，三乙酸内酯(TAL)的产生增加。
[0031] 图7.在过表达AceCoA、ACL2、PDCE2或AceCarb的酵母株中，三乙酸内酯(TAL)的产生增加。
[0032] 图8.在野生型解脂耶氏酵母中表达五种不同的PKS基因导致颜料的质量变化：A)细胞悬浮在去离子水中，B)细胞培养上清液，和C)在蓝光下悬浮的沉淀。
[0033] 图9.使用LC-MS测量PKS株的菌株代谢物扰动。当与野生型色谱图比较时，通过LC-MS在12.869和13.210分钟鉴定pO1j ALS(蓝色)中的新峰。
[0034] 图10.过表达与乙酰-CoA和丙二酰-CoA的产生增加有关的靶标以改善三乙酸内酯(TAL)的效价的图形描述。
[0035] 图11.如通过qPCR测量的，完整丙酮酸途径PDH复合物的过表达导致在含有四个拷贝的g2ps1的菌株背景中TAL的产生增加。
[0036] 图12.单独ACL1和ACL2的过表达对TAL效价没有积极影响。过量表达具有ACL1和ACL2的AMPD可提高效价，但仍未将生产恢复到此另外的工程之前的水平。单独的AMPD将在有和没有ACC1过表达的情况下过表达。正如脂肪酸效价增加所证明的那样，当AMPD过表达时，预计TAL效价会增加。
[0037] 图13.通过乙酸途径(通过ALD1)过表达基因增加了在含有4个拷贝的g2ps1的菌株背景中产生的TAL的效价。
[0038] 图14.通过乙酸途径(通过ALD3)过表达基因增加了在含有4个拷贝的g2ps1的菌株背景中产生的TAL的效价。
[0039] 图15.通过乙酸途径(通过ALD2)过表达基因增加了在含有4个拷贝的g2ps1的菌株背景中产生的TAL的效价。ACC1将在含有PDC2的菌株中过表达。
[0040] 图16.通过乙酸途径(通过ALD5或ALD6)过表达基因增加了在含有4个拷贝的g2ps1的菌株背景中产生的TAL的效价。ACC1在含有PDC2的菌株中过表达。
[0041] 图17.通过乙酸途径(通过ALD5或ALD6)过表达基因增加了在含有4个拷贝的g2ps1的菌株背景中产生的TAL的效价。ACC1在含有ALD5和PDC1的菌株中过表达。
具体实施方式
[0042] 本文公开了使用产油酵母菌株(例如，基因工程真菌宿主解脂耶氏酵母)生产高水平III型聚酮化合物的组合物和方法。虽然生产已在其他宿主中得到证实，但效价和产量仍然太低，无法在工业环境中使用。本文公开的工程化真菌宿主的生产水平可以超过先前报道的这些III型聚酮化合物分子的生产。工程化的产油酵母菌株，例如解脂耶氏酵母菌株的特定特征包括在这些细胞中产生极高水平(g/L水平)的能力。这些生产水平可以使这些类型的分子首次实现工业规模生产。
[0043] 本文公开的遗传修饰的酵母菌株和方法产生可再生的、清洁的用于在微生物中生产III型聚酮化合物的方法。用于获得这些分子的先前方法包括从植物中提取它们并且难以培养生物。基于这些现有方法，聚酮化合物的量通常太低而不能用作商品和/或散装化学品。与这些现有方法(难以使用的生物和植物提取物)相比，本公开允许以高于先前报道的重组生物的产率非常快速地产生高效价(g/L值)。这些较高效价的聚酮化合物可用作商品化学品和新材料的单体。
[0044] 现在将详细参考本发明的实施方案，其实例在附图和实施例中示出。然而，本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应该被解释为限于这里阐述的实施方案。
[0045] 除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。提供以下定义是为了充分理解本说明书中使用的术语。
[0046] 术语
[0047] 术语“产油生物”是指能够以超过正常细胞存活和繁殖所需量的水平产生脂质、脂质前体、油类化学物质或油(或其组合)的生物(例如细胞，例如酵母细胞)，例如结构完整性(例如膜形成和维持)和细胞维持所必需的。超过正常细胞存活和繁殖所需量的量的实例包括大于20％wt/wt总干重的脂质、油、脂质前体和油类化学物质的量。在一些实施方案中，产油生物是产油酵母。在一些实施方案中，产油酵母来自选自以下的属：Apiotrichum,假丝酵母属(Candida),隐球酵母属(Cryptococcus),德巴里酵母属(Debaromyces),拟内孢霉属(Endomycopsis),地丝菌属(Geotrichum),生丝毕赤酵母属(Hyphopichia),油脂酵母属(Lipomyces),Lypomyces,毕赤酵母属(Pichia),Rodosporidium,红酵母属(Rhodotorula),掷孢酵母属(Sporobolomyces),Starmerella,孢圆酵母属(Torulaspora),毛孢子菌属(Trichosporon),威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces),耶氏酵母属(Yarrowia)和接合囊酵母属(Zygoascus)。在实施方案中，产油酵母选自Apiotrichum curvatum,假丝酵母(Candida apicola),弯假丝酵母(Candida curvata),Candida revkaufi,铁红假丝酵母(Candida pulcherrima),热带假丝酵母(Candida tropicalis),产朊假丝酵母(Candida utilis),弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus),Cryptococcus terricolus,Debaromyces hansenii,Endomycopsis vernalis,Geotrichum carabidarum,Geotrichum cucujoidarum,Geotrichum histeridarum,Geotrichum silvicola,Geotrichum vulgare,Hyphopichia burtonii,Lipomyces lipoferus,产油油脂酵母(Lipomyces lipofer),Lypomyces orentalis,斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi),Lipomyces tetrasporous,墨西哥毕赤酵母(Pichia mexicana),Rodosporidium sphaerocarpum,Rhodosporidium toruloides,Rhodotorula aurantiaca,Rhodotorula dairenensis,Rhodotorula
diffluens,Rhodotorula glutinus,Rhodotorula glutinis var.glutinis,Rhodotorula gracilis,Rhodotorula graminis,Rhodotorula minuta,Rhodotorula mucilaginosa,Rhodotorula mucilaginosa Rhodotorula mucilaginosa,Rhodotorula terpenoidalis,Rhodotorula toruloides,Sporobolomyces alborubescens,Starmerella bombicola,Torulaspora delbruekii,Torulaspora pretoriensis,贝伦德丝孢酵母(Trichosporon behrend),芸薹丝孢酵母(Trichosporon brassicae),皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum),Trichosporon domesticum,发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans),Trichosporon laibachii,Trichosporon loubieri,Trichosporon loubieri
var.loubieri,Trichosporon montevideense,丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulans),Wickerhamomyces canadensis,解脂耶氏酵母和Zygoascus meyerae。
diffluens,Rhodotorula glutinus,Rhodotorula glutinis var.glutinis,Rhodotorula gracilis,Rhodotorula graminis,Rhodotorula minuta,Rhodotorula mucilaginosa,Rhodotorula mucilaginosa Rhodotorula mucilaginosa,Rhodotorula terpenoidalis,Rhodotorula toruloides,Sporobolomyces alborubescens,Starmerella bombicola,Torulaspora delbruekii,Torulaspora pretoriensis,贝伦德丝孢酵母(Trichosporon behrend),芸薹丝孢酵母(Trichosporon brassicae),皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum),Trichosporon domesticum,发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans),Trichosporon laibachii,Trichosporon loubieri,Trichosporon loubieri
var.loubieri,Trichosporon montevideense,丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulans),Wickerhamomyces canadensis,解脂耶氏酵母和Zygoascus meyerae。
[0048] 术语“碳底物”是指微生物(例如油酵母)将代谢以获得能量的碳源(例如单糖、低聚糖、多糖、烷烃、脂肪酸、甲醛、甲酸盐或含碳胺)。术语“碳源”是指含碳组合物(例如，化合物，化合物的混合物)、生物(例如，酵母细胞)可以代谢以供生物使用或者可以用于生物活力。“主要碳源”是指含碳组合物，其在特定时间(例如，酵母培养物生长时的培养基，培养酵母时生物反应器中的培养基或酵母生产脂质时的培养基)占生物可用碳源的50％以上(例如在培养基中，在生长培养基中，在用于培养酵母细胞的确定培养基中，或在用于通过酵母细胞产生脂质的确定培养基中)。在实施方案中，可以使用培养基培养产油酵母，该培养基包含选自葡萄糖，甘油，木糖，果糖，甘露糖，核糖，蔗糖和木质纤维素生物质的主要碳源。在实施方案中，可以使用培养基培养产油酵母，该培养基包含一种或多种碳源，该碳源选自葡萄糖，果糖，蔗糖，乳糖，半乳糖，木糖，甘露糖，鼠李糖，阿拉伯糖，甘油，乙酸酯，解聚糖用甜菜浆，黑液，玉米淀粉，解聚纤维素材料，玉米秸秆，甜菜浆，柳枝稷，乳清，糖蜜，马铃薯，大米，高粱，甘蔗，小麦及其混合物(例如甘油和葡萄糖的混合物，葡萄糖和木糖的混合物，果糖和葡萄糖的混合物，蔗糖和解聚糖用甜菜浆，解聚的纤维素材料，玉米秸秆，甜菜浆，柳枝稷，乳清，糖蜜，马铃薯，大米，高粱，甘蔗和/或小麦的混合物)。在一些实施方案中，使用包含一种或多种碳源的培养基培养油酵母，该碳源选自解聚糖用甜菜浆，黑液，玉米淀粉，解聚纤维素材料，玉米秸秆，糖用甜菜浆，柳枝稷，乳清，糖蜜，马铃薯，大米，高粱，甘蔗，浓甘蔗汁，糖用甜菜汁和小麦。在实施方案中，使用包含木质纤维素生物质的培养基培养产油酵母。在实施方案中，碳源可以是单糖(例如葡萄糖，果糖)，二糖(例如乳糖，蔗糖)，低聚糖，多糖(例如淀粉，纤维素或其混合物)，糖醇(例如甘油)或或可再生原料的混合物(例如，干酪乳清渗透物，玉米浆，糖用甜菜糖蜜或大麦麦芽)。另外，碳源可包括烷烃，脂肪酸，脂肪酸酯，甘油单酯，甘油二酯，甘油三酯，磷脂，各种商业脂肪酸来源，包括植物油(例如大豆油)或动物脂肪。在一些实施方案中，除了主要(或大多数)碳源之外，培养基可以含有一种或多种次级碳源。在一些实施方案中，该次级碳源包含木质素或木质素衍生的芳族化合物的二次碳源。在一些实施方案中，该次级碳源包含木质素分解产物。在一些实施方案中，木质素分解产物包括例如对香豆酸、松柏酸和芥子酸。在一些实施方案中，该次级碳源可以包括木脂素衍生的化合物包括开环异落叶松脂素，马台树脂醇，落叶松脂醇和松脂醇。在一些实施方案中，次级碳源可以是酸，包括例如对香豆酸，反式阿魏酸，3-苯基丙酸，辛酸，反式肉桂酸，3-氟代肉桂酸，苯甲酸，3-氨基苯甲酸，丙酸，2-溴苯甲酸，苯乙酸，苯丙酮酸，戊酸，甲基丙二酸，乙基丙二酸，氯代丙二酸，肉桂酸和其他脂肪酸。
[0049] 氮可以由无机源(例如(NH4)2SO4)或有机源(例如尿素、谷氨酸)提供。术语“氮源”是指含氮组合物(例如，化合物，化合物的混合物，盐)、生物(例如，酵母细胞)可以代谢以供生物使用或者可以用于生物活力。“主要氮源”是指含氮组合物，其在特定时间(例如，酵母培养物生长时的培养基，培养酵母时生物反应器中的培养基或酵母生产脂质时的培养基)占生物可用氮源的50％以上(例如在培养基中，在生长培养基中，在用于培养酵母细胞的确定培养基中，或在用于通过酵母细胞产生脂质的确定培养基中)。
[0050] 术语“生物质”是指通过细胞的生长和/或繁殖产生的材料。“木质纤维素生物质”根据其普通和普通含义使用，并且是指包含碳水化合物(例如纤维素或半纤维素)和聚合物(例如木质素)的植物干物质。木质纤维素生物质可包括农业残余物(例如玉米秸秆或甘蔗渣)，能源作物(例如杨树，柳树，芒草(Miscanthus purpureum)，狼尾草(Pennisetum purpureum)，象草，玉米，苏丹草，小米，白花草木樨，油菜籽，巨型芒草，柳枝稷，麻风树，Miscanthus giganteus或甘蔗)，木材残留物(例如锯木厂或造纸厂废弃物)或市政废纸。
[0051] 术语“培养(culture)”、“培养(cultivate)”和“发酵”可互换使用，指一种或多种细胞(例如产油酵母)的代谢，分解代谢和/或合成代谢的有意生长，繁殖，增殖和/或促成作用。)。生长和繁殖的组合可以称为增殖。实例包括生物产生目标聚酮化合物。在没有人为干预的情况下，培养不是指微生物在自然界中的生长或繁殖。
[0052] 术语“生长”意指细胞大小、总细胞含量和/或细胞质量或细胞(例如含油酵母)的重量的增加。
[0053] 如本文所用的“生长培养基”可以是固体、粉末或液体混合物，其包含支持酵母生长所必需的全部或基本上所有营养物；当测定特定的酵母物种时，优选制备各种营养组合物。在培养基中提供氨基酸、碳水化合物、矿物质、维生素和本领域技术人员已知的酵母生长所必需的其他元素。在一个实施方案中，生长培养基是液体。在一个实施方案中，生长培养基是用于从产油酵母细胞大规模生产III型聚酮化合物的生产培养基(例如，任选含有更高浓度的葡萄糖和/或改变的氮浓度的培养基)。
[0054] 术语“脂质”是指一类可溶于非极性溶剂(例如醚或氯仿)，相对或完全不溶于水的分子，并且包括一个或多个疏水的烃链。在实施方案中，脂质可以是三酰基甘油酯(即脂肪)，脂肪酸(例如饱和或不饱和的)；甘油酯(例如甘油单酯，甘油二酯，甘油三酯，中性脂肪，磷酸甘油酯或甘油磷脂)；鞘脂；甾醇脂质(例如胆固醇或类固醇激素)；异戊烯脂质(例如萜类化合物)；脂肪醇；蜡；聚酮；糖连接的脂质，糖脂或蛋白质相关的脂质。
[0055] 术语“油”是指由生物(例如含油生物，产油酵母，植物和/或动物)产生的三酰基甘油酯(或甘油三酯油)。在正常环境温度和压力下，油通常是液体。在实施方案中，油可以是源自植物(例如大豆、油菜籽、油菜(canola)、棕榈、棕榈仁、椰子、玉米、橄榄、向日葵、棉籽、萼距花属(cuphea)、花生、亚麻荠、芥菜籽、腰果、燕麦、羽扇豆、红麻、金盏花(calendula)、大麻、咖啡、亚麻籽、榛子、大戟属(euphorbia)、南瓜子、芫荽、山茶、芝麻、红花、大米、桐油树、可可、椰子树(copra)、罂粟(pium poppy)、蓖麻子、山核桃、荷荷巴油、麻风树、澳大利亚坚果(macadamia)、巴西坚果、油梨或其组合)的植物油或种子油。油可包括多种不同的三酰基甘油酯。例如，蔬菜或种子油可包括一种以上的三酰基甘油酯，并且当提及由含油生物体产生的油时，使用该植物油或种子油(例如大豆、油菜籽、油菜籽、棕榈等)的名称应理解为含有通常在植物油或种子油中的大多数(例如所有)三酰基甘油酯的油(例如，相对于彼此的不同比率或相对于彼此的相同或相似的比例)。在其他实施方案中，油可以是多种三酰基甘油酯和由产油生物产生的其他脂质分子。
[0056] 术语“繁殖”是指通过细胞分裂增加细胞数量。
[0057] 术语“启动子”或“调节元件”是指位于转录起点上游或下游的区域或序列决定簇，其参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录。启动子不必是酵母来源的，例如，衍生自病毒或来自其他生物的启动子可用于本文前述的组合物或方法中。
[0058] 如果多核苷酸序列源自外来物种，或者如果来自相同物种，则是通过人类作用从其原始形式修饰，则多核苷酸序列与第二多核苷酸序列是“异源的”。例如，与异源编码序列可操作地连接的启动子是指来自与启动子来源的物种不同的物种的编码序列，或者，如果来自相同物种，则是指与天然存在的等位基因变体不同的编码序列。
[0059] 术语“重组”是指人操纵的核酸(例如多核苷酸)或人操纵的核酸(例如多核苷酸)的拷贝或互补物，或者如果涉及蛋白质(即“重组蛋白”)，由重组核酸(例如多核苷酸)编码的蛋白质。在实施方案中，包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的启动子的重组表达盒可包括作为人类操作的结果与第二核酸(例如多核苷酸)异源的启动子(例如，通过在Sambrook等,Molecular Cloning—A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)或Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3,John Wiley&Sons,Inc.(1994-1998)中所描述的方法)。在另一个实例中，重组表达盒可包含以这样的方式组合的核酸(例如多核苷酸)，使得核酸(例如多核苷酸)极不可能在自然界中发现。例如，人操纵的限制性位点或质粒载体序列可以将启动子与第二核酸(例如多核苷酸)侧翼或分开。在实施方案中，重组核酸是已经由人操纵的产油生物体(例如产油酵母)中的核酸，例如相对于不存在重组核酸包含在产油生物中过表达的蛋白质的编码区的重组核酸，或导致产油生物的编码区或启动子区的破坏并且相对于不存在重组核酸减少或消除蛋白的表达的重组核酸。本领域技术人员将认识到核酸(例如多核苷酸)可以以许多方式操作，并且不限于上述实例。
[0060] 本文使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或语法等同物是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。术语“核酸”包括单链、双链或多链DNA、RNA及其类似物(衍生物)。寡核苷酸的长度通常为约5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多个核苷酸，长度最多约100个核苷酸。核酸和多核苷酸是任何长度、包括更长的长度例如200、300、500、1000、2000、
3000、5000、7000、10,000等的聚合物。在某些实施方案中，本文的核酸含有磷酸二酯键。在其他实施方案中，包括可具有替代主链的核酸类似物。该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与所需目的参考核酸的相似或改善的结合特性。特定的核酸序列还包括“剪接变体”。类似地，由核酸编码的特定蛋白质包括由该核酸的剪接变体编码的任何蛋白质。顾名思义，“剪接变体”是基因选择性剪接的产物。转录后，可以剪接初始核酸转录物，使得不同的(选择性)核酸剪接产物编码不同的多肽。产生剪接变体的机制各不相同，但包括外显子的选择性剪接。通过直读转录从相同核酸衍生的选择性多肽也包括在该定义中。剪接反应的任何产物，包括剪接产物的重组形式，都包括在该定义中。在Leicher等,J.Biol.Chem.273(52):35095-35101(1998)中讨论了钾通道剪接变体的实例。
3000、5000、7000、10,000等的聚合物。在某些实施方案中，本文的核酸含有磷酸二酯键。在其他实施方案中，包括可具有替代主链的核酸类似物。该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与所需目的参考核酸的相似或改善的结合特性。特定的核酸序列还包括“剪接变体”。类似地，由核酸编码的特定蛋白质包括由该核酸的剪接变体编码的任何蛋白质。顾名思义，“剪接变体”是基因选择性剪接的产物。转录后，可以剪接初始核酸转录物，使得不同的(选择性)核酸剪接产物编码不同的多肽。产生剪接变体的机制各不相同，但包括外显子的选择性剪接。通过直读转录从相同核酸衍生的选择性多肽也包括在该定义中。剪接反应的任何产物，包括剪接产物的重组形式，都包括在该定义中。在Leicher等,J.Biol.Chem.273(52):35095-35101(1998)中讨论了钾通道剪接变体的实例。
[0061] 术语“表达盒”是指核酸构建体，其在引入宿主细胞时分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。在实施方案中，包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的启动子的表达盒可包括作为人类操作的结果与第二核酸(例如多核苷酸)异源的启动子(例如，通过在Sambrook等,Molecular Cloning—A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)或Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3,John Wiley&Sons,Inc.(1994-1998)中所描述的方法)。在一些实施方案中，包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的终止子(或终止序列)的表达盒可包括作为人工操作的结果与第二核酸(例如多核苷酸)异源的终止子。在一些实施方案中，表达盒包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的启动子和作为人工操作的结果可操作地连接到第二核酸(例如多核苷酸)的终止子。在一些实施方案中，表达盒包含内源启动子。在一些实施方案中，表达盒包含内源终止子。在一些实施方案中，表达盒包含合成(或非天然)启动子。在一些实施方案中，表达盒包含合成(或非天然)终止子。
[0062] 在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指两个或更多个相同或具有指定百分比的氨基酸残基或核苷酸的序列或子序列相同(在比较和比对以在比较窗口或指定区域上进行最大对应时，在指定区域内的即约60％同一性，优选61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法，或通过手动比对和目视检查所测量的(参见例如NCBI网站等)。然后，这些序列被称为“基本相同”。该定义还涉及或可以应用于测试序列的互补序列(compliment)。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有置换的序列。如下所述，优选算法可以解决缺口等。优选地，同一性存在于长度为至少约10个氨基酸或20个核苷酸的区域上，或更优选地长度为10-50个氨基酸或20-50个核苷酸的区域上。如本文所用，氨基酸序列同一性百分比(％)定义为在比对序列并引入缺口(如果需要)以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。
用于确定序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公共可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。
用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法可以通过已知方法确定。
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法，或通过手动比对和目视检查所测量的(参见例如NCBI网站等)。然后，这些序列被称为“基本相同”。该定义还涉及或可以应用于测试序列的互补序列(compliment)。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有置换的序列。如下所述，优选算法可以解决缺口等。优选地，同一性存在于长度为至少约10个氨基酸或20个核苷酸的区域上，或更优选地长度为10-50个氨基酸或20-50个核苷酸的区域上。如本文所用，氨基酸序列同一性百分比(％)定义为在比对序列并引入缺口(如果需要)以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。
用于确定序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公共可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。
用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法可以通过已知方法确定。
[0063] 对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，将测试序列与参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
[0064] 适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字来识别高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的字对齐时，该短字匹配或满足一些正值阈值分数T。T被称为相邻字得分阈值(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。这些初始相邻字命中作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。只要可以增加累积比对得分，字命中就沿着每个序列在两个方向上延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<
0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，停止每个方向上的字命中的扩展：累积对齐得分从其最大实现值的数量X下降；由于一个或多个负得分残基排列的累积，累积得分为零或低于零；或达到任一序列的结尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长为
3、期望值(E)为10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。
0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，停止每个方向上的字命中的扩展：累积对齐得分从其最大实现值的数量X下降；由于一个或多个负得分残基排列的累积，累积得分为零或低于零；或达到任一序列的结尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长为
3、期望值(E)为10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。
[0065] BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计学分析(参见，例如Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2、更优选小于约0.01，则认为核酸与参考序列相似。
[0066] 短语“密码子优化”，因为它指的是用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区，是指多核酸分子的基因或编码区中的密码子的改变，以反映所选择生物的典型密码子使用而不改变由DNA编码的多肽。这种优化包括用一种或多种密码子替换至少一种、或多于一种或大量密码子，该密码子更常用于所选生物的基因中。例如，基于解脂耶氏酵母中优选的密码子使用，可以对解脂耶氏酵母中表达的异源基因的序列进行“密码子优化”以优化基因表达。
[0067] 短语“选择性地(或特异性地)杂交”是指分子仅与具有更高亲和力的特定核苷酸序列结合、双链体化或杂交，例如在更严紧的条件下，而不是其他核苷酸序列(例如，总细胞或文库DNA或RNA)。
[0068] 短语“严紧杂交条件”是指探针通常在复杂的核酸混合物中与其靶子序列杂交但不与其它序列杂交的条件。严紧条件是序列依赖性的，并且在不同情况下会有所不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的充分指南见于Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。通常，严紧条件选择为在特定离子强度pH下比特定序列的热解链点(Tm)低约5-10℃。Tm是这样的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)，其中50％与靶标互补的探针在平衡时与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，Tm为50％)探针的平衡状态。加入去稳定剂如甲酰胺也可以达到严紧条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选是背景杂交的10倍。示例性严紧杂交条件可以如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃孵育,或者5×SSC、1％SDS，在65℃孵育，其中在0.2×SSC和0.1％SDS中在65℃洗涤。
[0069] 如果它们编码的多肽基本上相同，则在严紧条件下彼此不杂交的核酸仍然基本相同。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，会发生这种情况。在这种情况下，核酸通常在中等严紧杂交条件下杂交。示例性的“中等严紧杂交条件”包括在37℃在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中杂交，以及在45℃在1×SSC中洗涤。阳性杂交是背景的至少两倍。普通技术人员将容易认识到，可以利用替代的杂交和洗涤条件来提供类似严紧性的条件。用于确定杂交参数的其他指南在许多参考文献中提供，例如，和Current Protocols in Molecular Biology,ed.Ausubel等。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可以适当调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。“基本相似”的多肽共享如上述的序列，除了不相同的残基位置可能因保守氨基酸变化而不同。保守氨基酸置换是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。示例性保守氨基酸置换的组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0070] 术语“调节剂”是指增加或降低靶分子水平或靶分子的活性或功能水平或分子靶标的物理状态的组合物。在实施方案中，调节剂是重组核酸，其能够增加或减少细胞中蛋白质的量或细胞中蛋白质的活性水平或细胞中第二核酸的转录。在实施方案中，调节剂增加或降低蛋白质的活性水平或细胞中蛋白质的量。术语“调节(modulate)”根据其普通和普通含义使用，并且是指改变或变化一种或多种性质的行为。“调节(modulation)”是指改变或变化一个或多个属性的过程。例如，当应用于调节剂对靶蛋白的作用时，通过增加或减少靶分子的性质或功能或靶分子的量来调节改变的手段。在实施方案中，相对于不存在重组核酸，调节蛋白质活性水平的重组核酸可以增加蛋白质的活性或量。在实施方案中，蛋白质的活性或量的增加可包括蛋白质的过表达。“过表达”根据其普通和普通含义使用，并且是指蛋白质相对于对照(例如不包括有助于蛋白质过表达的重组核酸的细胞或表达系统)的表达水平增加。在实施方案中，蛋白质的活性或量的降低可包括突变(例如，点突变体、功能丧失突变、错义突变、缺失或异源核酸的插入；其中所有/任何可能在蛋白质的编码区中或在蛋白质的可操作连接区域(例如启动子)中)。术语“增加的”是指与对照相比可检测的增加。
[0071] 当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，其“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与DNA的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指连接的DNA序列彼此接近，并且在分泌性前导序列的情况下，连续且处于阅读阶段(reading phase)。然而，可操作连接的核酸(例如增强子和编码序列)不必是连续的。通过在方便的限制性位点连接来完成连接。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。在实施方案中，当启动子能够影响(例如相对于启动子的不存在而调节)来自该编码序列的蛋白质的表达时，启动子与编码序列可操作地连接(即，编码序列在增强子的转录控制下)。
[0072] “转化”是指核酸分子转移到宿主生物(例如产油酵母)中。在实施方案中，核酸分子可以是自主复制的质粒，或者可以整合到宿主生物(例如产油酵母)的基因组中。含有转化的核酸分子的宿主生物可以称为“转基因的”或“重组的”或“转化的”生物(例如产油酵母)。“遗传修饰的”生物(例如遗传修饰的酵母细胞)是包括已经通过人为干预修饰的核酸的生物(例如酵母细胞)。通过人为干预修饰的核酸的实例包括但不限于插入、缺失、突变、表达核酸构建体(例如过表达或表达来自非天然启动子或控制序列或可操作地连接的不同于生物中的天然存在的启动子和基因核酸的启动子和基因核酸)、染色体外核酸和基因组包含的修饰核酸。遗传修饰的生物可以通过合理修饰核酸制备，或者可以通过使用诱变或诱变方案制备，该诱变或诱变方案(例如UV暴露、EMS暴露、诱变剂暴露、随机基因组诱变、不同核酸构建体文库的转化)导致在使用诱变或诱变方案之前未鉴定(例如预期的或靶向的)突变。可以通过使用鉴定感兴趣的遗传修饰生物的选择标准(例如脂质、脂质前体和/或油脂化学物质的水平增加；不包括相同遗传修饰的生物体上方的漂浮物(float))筛选包括一种或多种转基因生物的多种生物来鉴定包含在制备转基因生物之前先前未知或预期的修饰(例如修饰、插入、缺失、突变)的遗传修饰生物。在实施方案中，遗传修饰的生物包括重组核酸。
[0073] 如本文所用，术语“游离体”或“游离地(episomally)”意指当与宿主细胞的染色体DNA物理分离时可在宿主细胞中自主复制的染色体外DNA部分或质粒。
[0074] 用于合成序列和将序列组合在一起的方法已经很好地建立并且是本领域技术人员已知的。例如，可以使用体外诱变和选择、定点诱变、易错PCR(Melnikov等,Nucleic Acids Research,27(4):1056-1062(1999年2月15日))、“基因改组”或其他手段来获得天然存在的基因的突变。
[0075] 当提及产油生物(例如酵母菌株或解脂耶氏酵母菌株)时，本文所用的术语“野生型”是指未经遗传修饰以改善脂质产生的生物(例如，增加脂质的产量，改变由生物体产生的脂质的结构，减少一种脂质的产生以改善第二种脂质的产生，或调节脂质的产生)。在一些实施方案中，野生型酵母菌株可以是一种或多种化合物(例如亮氨酸和/或尿嘧啶)的营养缺陷型。在一个实施方案中，选择解脂耶氏酵母的野生型菌株用于本文的方法。在一个实施方案中，野生型解脂耶氏酵母菌株是PO1f(ATCC#MYA-2613)，没有任何分泌蛋白酶活性的亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型(Madzak,C.等,J Mol Microbiol Biotechnol.2000 Apr；2(2):207-16)。在一个实施方案中，野生型解脂耶氏酵母菌株是L36，没有任何分泌蛋白酶活性的亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型(Liu,L.等,Metabolic Engineering(2015)31:102-111)。
[0076] 术语“油类化学物质”在本文中根据其众所周知的含义使用，并且是指衍生自脂质或脂肪的化学品或化合物。在实施方案中，油类化学物质是衍生自不同脂质或脂肪的脂质或脂肪。在实施方案中，油类化学物质是由产油生物产生的化学品或化合物。在实施方案中，油类化学物质是衍生自由产油生物产生的脂质或脂质前体的化学品或化合物(例如，衍生自通过酯交换通过产油生物产生的脂肪酸的脂肪酸酯，例如甲酯、乙酯、丙酯或丁酯)。在实施方案中，油类化学物质可以包括通过内源或异源修饰酶或化学反应实现的脂质或脂质前体的进一步体内或体外修饰。
[0077] 术语“脂质前体”根据其众所周知的含义使用，并且是指脂质生物合成中的途径中间体(例如乙酰-CoA或丙二酰-CoA)。在实施方案中，脂质前体可以是沿生物合成途径的任何分子，其产生甘油三酯，包括游离柠檬酸盐、乙酰-CoA、游离脂肪酸、丙酮酸、柠檬酸循环中间体、二酰基甘油酯和/或三酰基甘油酯。
[0078] III型聚酮合成酶
[0079] 聚酮化合物合成酶(PKS)是与脂肪酸合成酶(FAS)相关的多功能酶。PKS通过酰基硫酯(通常为乙酰基、丙酰基、丙二酰基或甲基丙二酰基)之间的重复(脱羧)缩合来催化聚酮化合物的生物合成。
[0080] 存在三种一般类型的聚酮化合物合酶(PKS)。一类称为I型，“复合物”或“模块化”PKS，由大环内酯类如红霉素的PKS代表。“模块化”PKS是几种大型多功能蛋白质的组件，在它们之间携带一组单独的活性位点，用于碳链组装和修饰的每个步骤。结构多样性发生在这一类中，来自PKS中活性位点的数量和类型的变化。
[0082] 第三类PKS通常称为“真菌”PKS，并且通常是在单个阅读框中编码的多功能蛋白质。因此，真菌PKS不能完全符合芳香族与模块化的分类，因此构成第三组。
[0083] III型聚酮化合物具有多种用途，例如营养补充剂、生物活性化合物、药物、含能材料，以及作为新型聚合物材料的单体。III型聚酮化合物的实例包括芦荟中的活性成分、柚皮素、白藜芦醇、二苯乙烯类、间苯三酚、类姜黄素和姜辣素。
[0084] 可使用本文公开的遗传修饰的酵母菌株产生的III型聚酮化合物的实例包括但不限于三乙酸内酯、芦荟苦素、间苯三酚、苯甲酰丙酮、1,8-二羟基萘、黄酮和phloroisovalerophenone。
[0085] 可以通过从非洲菊(Gerbera hybrida)表达三乙酸内酯合酶(CAA86219.2；g2ps1基因)来制备三乙酸内酯。可以通过从大黄(Rheum palmatum)表达芦荟苦素合酶(AY517486)来制备芦荟苦素。可以通过表达来自荧光假单胞菌(Pseudomonas
fluorescens)的JX840717-JX840724基因来制备间苯三酚。可以通过表达来自覆盆子(Rubus idaeus)的B0LDU5来制备苯甲酰丙酮。可以通过表达来自灰色链霉菌
(Streptomyces griseus)的B1VLQ8基因来制备1,8-二羟基萘和黄酮。可以通过表达来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的SCO1206来制备1,8-二羟基萘。最后，可以通过表达来自啤酒花(Humulus lupulus)的BAB12102.2来制备phloroisovalerophenone。
fluorescens)的JX840717-JX840724基因来制备间苯三酚。可以通过表达来自覆盆子(Rubus idaeus)的B0LDU5来制备苯甲酰丙酮。可以通过表达来自灰色链霉菌
(Streptomyces griseus)的B1VLQ8基因来制备1,8-二羟基萘和黄酮。可以通过表达来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的SCO1206来制备1,8-二羟基萘。最后，可以通过表达来自啤酒花(Humulus lupulus)的BAB12102.2来制备phloroisovalerophenone。
[0086] 可以通过从非洲菊(Gerbera hybrida)表达三乙酸内酯合酶(CAA86219.2；g2ps1；2-吡喃酮合成酶基因)来制备三乙酸内酯(TAL)。与其他III型聚酮化合物合酶一样，g2ps1是一种相对较小的蛋白质，它使用单个活性位点进行脱羧和环化反应。2-PS利用乙酰辅酶A(乙酰CoA)作为初始底物并催化两个丙二酰-CoA的脱羧和缩合以产生TAL。
[0087] 间苯三酚(1,3,5-三羟基苯)及其衍生物广泛用于商业。间苯三酚及其衍生物(例如三甲基间苯三酚)用作药剂，例如作为抗痉挛剂。间苯三酚用作药物、杀微生物剂和其他有机合成中的原料或中间体。间苯三酚用作含有木质素的显微镜样品(例如木材样品)的染色剂，并且它用于制造染料，包括皮革、纺织品和染发剂。它用于制造粘合剂和作为环氧树脂固化剂，以及用于制备炸药。间苯三酚还起到抗氧化剂、稳定剂和耐腐蚀剂的作用，并且用作光敏复印纸的偶联剂、作为制雨中的碘化银的替代物、作为骨样品脱钙剂以及作为花卉防腐剂。
[0088] 此外，许多聚酮化合物产物可以由丙二酰-coA前体与乙酰辅酶-coA组合制备。由于乙酰-coA是丙二酰-coA的前体，因此不需要对产生丙二酰-coA的菌株进行额外的修饰。可以通过表达酶功能来制备产物，以将丙二酰-coA和乙酰-coA转化为产物。本说明书中讨论的任何增加通过丙二酰-coA的通量的菌株可用于生产这些产品。6-hydroxymellein可以通过从芦荟或胡萝卜中表达6-hydroxymellein合成酶来制备。
[0089] 可以通过从木立芦荟(Aloe arborescens)或大黄表达芦荟苦素合酶来制备芦荟苦素。可以通过表达来自覆盆子(Rubus idaeus)的B0LDU5来制备苯甲酰丙酮。B0LDU5酶是查尔酮合酶(CHS)超家族的植物特异性III型聚酮化合物合酶。可以通过表达来自啤酒花的BAB12102.2基因来制备phloroisovalerophenone。可以通过表达来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的B1VLQ8基因来制备1,8-二羟基萘和黄酮(4,5,7-三羟基萘-1,
2-二酮)。可以通过表达来自天蓝色链霉菌的SCO1206基因来制备1,8-二羟基萘。
BAB12102.2基因编码phloroisovalerophenone合酶并产生3-甲基-1-(2,4,6-三羟基苯基)丁-1-酮(phloroisovalerophenone)。
2-二酮)。可以通过表达来自天蓝色链霉菌的SCO1206基因来制备1,8-二羟基萘。
BAB12102.2基因编码phloroisovalerophenone合酶并产生3-甲基-1-(2,4,6-三羟基苯基)丁-1-酮(phloroisovalerophenone)。
[0090] 在一些实施方案中，可以对编码III型聚酮化合物合酶的异源基因序列或基因序列进行密码子优化，而不改变所得多肽序列。在一些实施方案中，密码子优化包括用一种或多种密码子替换至少一种、或多于一种或大量密码子，该密码子更常用于所选产油酵母的基因中。例如，基于解脂耶氏酵母中优选的密码子使用，可以对解脂耶氏酵母中表达的异源基因的序列进行“密码子优化”以优化基因表达。
[0091] 在一些实施方案中，异源基因与其天然宿主物种中的异源基因的野生型序列基本相同。在一些实施方案中，当在指定区域上就最大对应进行比较和比对时，异源基因与异源基因在其天然宿主物种中的野生型序列具有约60％相同，优选61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％,94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更高相同。
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％,94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更高相同。
[0092] 产油酵母
[0093] 在一些实施方案中，产油生物是产油酵母。在一些实施方案中，产油酵母来自选自以下的属：Apiotrichum,假丝酵母属(Candida),隐球酵母属(Cryptococcus),德巴里酵母属(Debaromyces),拟内孢霉属(Endomycopsis),地丝菌属(Geotrichum),生丝毕赤酵母属(Hyphopichia),油脂酵母属(Lipomyces),Lypomyces,毕赤酵母属(Pichia),Rodosporidium,红酵母属(Rhodotorula),掷孢酵母属(Sporobolomyces),Starmerella,孢圆酵母属(Torulaspora),毛孢子菌属(Trichosporon),威克汉姆酵母属
(Wickerhamomyces),耶氏酵母属(Yarrowia)和接合囊酵母属(Zygoascus)。在实施方案中，产油酵母选自Apiotrichum curvatum,假丝酵母(Candida apicola),弯假丝酵母(Candida curvata),Candida revkaufi,铁红假丝酵母(Candida pulcherrima),热带假丝酵母(Candida tropicalis),产朊假丝酵母(Candida utilis),弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus),Cryptococcus terricolus,Debaromyces hansenii,Endomycopsis vernalis,Geotrichum carabidarum,Geotrichum cucujoidarum,Geotrichum histeridarum,Geotrichum silvicola,Geotrichum vulgare,Hyphopichia burtonii,Lipomyces lipoferus,产油油脂酵母(Lipomyces lipofer),Lypomyces orentalis,斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi),Lipomyces tetrasporous,墨西哥毕赤酵母(Pichia mexicana),Rodosporidium sphaerocarpum,Rhodosporidium toruloides,Rhodotorula aurantiaca,Rhodotorula dairenensis,Rhodotorula diffluens,Rhodotorula glutinus,
Rhodotorula glutinis var.glutinis,Rhodotorula gracilis,Rhodotorula graminis,Rhodotorula minuta,Rhodotorula mucilaginosa,Rhodotorula mucilaginosa
Rhodotorula mucilaginosa,Rhodotorula terpenoidalis,Rhodotorula toruloides,Sporobolomyces alborubescens,Starmerella bombicola,Torulaspora delbruekii,Torulaspora pretoriensis,贝伦德丝孢酵母(Trichosporon behrend),芸薹丝孢酵母(Trichosporon brassicae),皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum),Trichosporon domesticum,发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans),Trichosporon laibachii,Trichosporon loubieri,Trichosporon loubieri var.loubieri,Trichosporon
montevideense,丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulans),Wickerhamomyces
canadensis,解脂耶氏酵母和Zygoascus meyerae。
(Wickerhamomyces),耶氏酵母属(Yarrowia)和接合囊酵母属(Zygoascus)。在实施方案中，产油酵母选自Apiotrichum curvatum,假丝酵母(Candida apicola),弯假丝酵母(Candida curvata),Candida revkaufi,铁红假丝酵母(Candida pulcherrima),热带假丝酵母(Candida tropicalis),产朊假丝酵母(Candida utilis),弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus),Cryptococcus terricolus,Debaromyces hansenii,Endomycopsis vernalis,Geotrichum carabidarum,Geotrichum cucujoidarum,Geotrichum histeridarum,Geotrichum silvicola,Geotrichum vulgare,Hyphopichia burtonii,Lipomyces lipoferus,产油油脂酵母(Lipomyces lipofer),Lypomyces orentalis,斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi),Lipomyces tetrasporous,墨西哥毕赤酵母(Pichia mexicana),Rodosporidium sphaerocarpum,Rhodosporidium toruloides,Rhodotorula aurantiaca,Rhodotorula dairenensis,Rhodotorula diffluens,Rhodotorula glutinus,
Rhodotorula glutinis var.glutinis,Rhodotorula gracilis,Rhodotorula graminis,Rhodotorula minuta,Rhodotorula mucilaginosa,Rhodotorula mucilaginosa
Rhodotorula mucilaginosa,Rhodotorula terpenoidalis,Rhodotorula toruloides,Sporobolomyces alborubescens,Starmerella bombicola,Torulaspora delbruekii,Torulaspora pretoriensis,贝伦德丝孢酵母(Trichosporon behrend),芸薹丝孢酵母(Trichosporon brassicae),皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum),Trichosporon domesticum,发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans),Trichosporon laibachii,Trichosporon loubieri,Trichosporon loubieri var.loubieri,Trichosporon
montevideense,丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulans),Wickerhamomyces
canadensis,解脂耶氏酵母和Zygoascus meyerae。
[0094] 在另一实施方案中，酵母细胞选自耶氏酵母属，假丝酵母属，红酵母属，红冬孢酵母属(Rhodosporidium)，隐球菌属，丝孢酵母属(Rhodosporidium)和油脂酵母属。在实施方案中，酵母细胞选自：Rhodosporidium toruloides,Lipomyces starkeyii,Lipomyces lipoferus,Apiotrichum curvatum,弯假丝酵母(Candida curvata),弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus),发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans),Candida revkaufi,铁红假丝酵母(Candida pulcherrima),热带假丝酵母(Candida tropicalis),产朊假丝酵母(Candida utilis),Trichosporon pullans,Trichosporon cutaneum,Rhodotorula glutinus,Rhodotorula graminis和解脂耶氏酵母。在实施方案中，酵母细胞选自Lipomyces starkeyii,Rhodosporidium toruloides，Apiotrichum curvatum,弯假丝酵母(Candida curvata),弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)，发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)，Rhodotorula glutinis和解脂耶氏酵母。
[0095] 在一个实施方案中，酵母细胞是解脂耶氏酵母。解脂耶氏酵母的遗传易处理性，许多能源的有效利用以及天然积累脂质的能力使其成为合成III型聚酮化合物的理想平台。解脂耶氏酵母具有完全定义的代谢工程工具箱，其通过基因组操作实现细胞内通量控制。
解脂耶氏酵母通常用于异源蛋白质分泌并检查和操作脂质和脂肪酸代谢，并且已经证明适合于其脂肪酸含量的下游操作以改变去饱和水平或合成新的油脂化学物质。因此，解脂耶氏酵母脂质储备对于烷烃、脂肪酸酯的体内催化或基于标准酯交换的转化和用作生物柴油是理想的。特别是，与其他替代燃料相比，生物柴油生产具有较高的净能量增加，对环境的影响最小，并且从诸如解脂耶氏酵母的微生物来源收获脂质储备使得能够在不影响食物供应的情况下容易地扩大生产。解脂耶氏酵母的天然脂质含量主要由C16:0、C16:1、C18:0、C18:1和C18:2脂肪酸组成，非常类似于衍生自大豆和油菜籽的生物柴油的脂肪酸含量。通过充分利用来自木质纤维素生物质的所有糖或通过使用来自工业废物流的碳，可以极大地提高经济可行性。在这方面，解脂耶氏酵母可以有效地利用疏水和废碳源，例如粗甘油，并且当使用葡萄糖、蔗糖、甘油或油酸作为碳源时显示出优异的异源基因表达。最后，解脂耶氏酵母被认为是“安全使用(safe-to-use)”的生物。参见WO2014179748中对解脂耶氏酵母的另外讨论，其通过引用并入本文。
解脂耶氏酵母通常用于异源蛋白质分泌并检查和操作脂质和脂肪酸代谢，并且已经证明适合于其脂肪酸含量的下游操作以改变去饱和水平或合成新的油脂化学物质。因此，解脂耶氏酵母脂质储备对于烷烃、脂肪酸酯的体内催化或基于标准酯交换的转化和用作生物柴油是理想的。特别是，与其他替代燃料相比，生物柴油生产具有较高的净能量增加，对环境的影响最小，并且从诸如解脂耶氏酵母的微生物来源收获脂质储备使得能够在不影响食物供应的情况下容易地扩大生产。解脂耶氏酵母的天然脂质含量主要由C16:0、C16:1、C18:0、C18:1和C18:2脂肪酸组成，非常类似于衍生自大豆和油菜籽的生物柴油的脂肪酸含量。通过充分利用来自木质纤维素生物质的所有糖或通过使用来自工业废物流的碳，可以极大地提高经济可行性。在这方面，解脂耶氏酵母可以有效地利用疏水和废碳源，例如粗甘油，并且当使用葡萄糖、蔗糖、甘油或油酸作为碳源时显示出优异的异源基因表达。最后，解脂耶氏酵母被认为是“安全使用(safe-to-use)”的生物。参见WO2014179748中对解脂耶氏酵母的另外讨论，其通过引用并入本文。
[0096] 基因改造的产油酵母细胞
[0097] 本文公开了遗传修饰的产油酵母菌株和用于以足以实现工业规模生产的水平生产III型聚酮化合物的方法。由于它们已经丰富的CoA分子前体库，因此油脂酵母物种(例如解脂耶氏酵母)是用于生产III型聚酮化合物的优异宿主。通过代谢工程，这些生物的通量(flux)可以从脂肪酸的生产转移到III型聚酮化合物的生产。
[0098] 在一个方面，本文提供了一种遗传修饰的产油酵母细胞，其包含异源基因，其中该异源基因编码III型聚酮合成酶。在一个实施方案中，产油酵母细胞是解脂耶氏酵母。
[0099] 在一个实施方案中，本文提供了遗传修饰的产油酵母细胞，其包含异源基因，其中该异源基因编码选自来自非洲菊的CAA86219.2基因、来自大黄的AY517486基因、来自荧光假单胞菌的JX840717-JX840724基因、来自覆盆子的B0LDU5基因、来自灰色链霉菌的B1VLQ8基因、来自天蓝色链霉菌的SCO1206基因、来自啤酒花的BAB12102.2基因、或其组合的III性型聚酮合成酶。在一个实施方案中，该异源基因是来自非洲菊的CAA86219.2(g2ps1；2-吡喃酮合成酶)基因。
[0100] 在一个方面，本文提供了遗传修饰的解脂耶氏酵母酵母细胞，其包含异源基因，其选自来自非洲菊(Gerbera hybrida)的CAA86219.2基因、来自大黄(Rheum palmatum)的AY517486基因、来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的JX840717-JX840724基因、来自覆盆子(Rubus idaeus)的B0LDU5基因、来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的B1VLQ8基因、来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的SCO1206基因、来自啤酒花(Humulus lupulus)的BAB12102.2基因、或其组合。
[0101] 在一个实施方案中，该异源基因整合到该酵母细胞基因组中。在另一实施方案中，该异源基因的至少两个拷贝存在于该酵母细胞的基因组中。在一个实施方案中，将该异源基因掺入包含启动子和该异源基因的基因表达盒中，其中该基因表达盒整合到酵母细胞的基因组中。在备选实施方案中,该异源基因从质粒中游离表达。
[0102] 酵母菌株的其他遗传变化也可以帮助改善靶向III型聚酮化合物的产生。在另一方面，遗传修饰的解脂耶氏酵母酵母细胞(例如含有异源基因的细胞包含另外的遗传修饰)。例如，另外的遗传修饰可以增加乙酰-CoA或丙二酰-CoA水平。在一些实施方案中，另外的遗传修饰包括：1)消除或减少解脂耶氏酵母基因，该基因选自天冬氨酰蛋白酶(PEP4；YALI0F27071p)，蛋白酶B液泡(PRB1；YALI0B16500p)，蛋白酶B液泡(PRB1H；YALI0A06435g)，葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶同种型1(GSY1；YALI0F18502p)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；
YALI0E22649p)，丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；
YALI0C16995p)，果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)，线粒体载体(YIA6；
YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；
YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；
YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；
YALI0B15059p)，(PAH1；YALI0D27016)，或其组合；和/或2)解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；
YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；
YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，peroxin 10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
YALI0E22649p)，丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；
YALI0C16995p)，果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)，线粒体载体(YIA6；
YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；
YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；
YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；
YALI0B15059p)，(PAH1；YALI0D27016)，或其组合；和/或2)解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；
YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；
YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，peroxin 10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
[0103] 在一个实施方案中，另外的遗传修饰可以增加乙酰-CoA或丙二酰-CoA水平。在一些实施方案中，另外的遗传修饰包括：1)消除或减少解脂耶氏酵母基因，该基因选自天冬氨酰蛋白酶(PEP4；YALI0F27071p)，蛋白酶B液泡(PRB1；YALI0B16500p)，蛋白酶B液泡(PRB1H；YALI0A06435g)，葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶同种型1(GSY1；YALI0F18502p)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；YALI0E22649p)，丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；YALI0C16995p)，果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)，线粒体载体(YIA6；
YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；
YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；
YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；
YALI0B15059p)，或其组合；和/或2)一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；
YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；
YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；
YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；
YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；
YALI0E27005)，或其组合。
YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；
YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；
YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；
YALI0B15059p)，或其组合；和/或2)一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；
YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；
YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；
YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；
YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；
YALI0E27005)，或其组合。
[0104] 在一些实施方案中，另外的遗传修饰基本上由以下组成：1)消除或减少一种或多种解脂耶氏酵母基因，该基因选自天冬氨酰蛋白酶(PEP4；YALI0F27071p)，蛋白酶B液泡(PRB1；YALI0B16500p)，蛋白酶B液泡(PRB1H；YALI0A06435g)，葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶同种型1(GSY1；YALI0F18502p)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；YALI0E22649p)，丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；YALI0C16995p)，果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)，线粒体载体(YIA6；YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；
YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；
YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)，(PAH1；YALI0D27016)，或其组合；和/或2)一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；
YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，peroxin 10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；
YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)，(PAH1；YALI0D27016)，或其组合；和/或2)一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；
YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，peroxin 10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
[0105] 在一些实施方案中，该另外的遗传修饰由以下组成：1)消除或减少解脂耶氏酵母基因，该基因选自天冬氨酰蛋白酶(PEP4；YALI0F27071p)，蛋白酶B液泡(PRB1；YALI0B16500p)，蛋白酶B液泡(PRB1H；YALI0A06435g)，葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶同种型
1(GSY1；YALI0F18502p)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；YALI0E22649p)，丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；YALI0C16995p)，果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)，线粒体载体(YIA6；YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；
YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；
YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；
YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)，(PAH1；YALI0D27016)，或其组合；和/或2)一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；
YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，peroxin10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
1(GSY1；YALI0F18502p)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；YALI0E22649p)，丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；YALI0C16995p)，果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)，线粒体载体(YIA6；YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；
YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；
YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；
YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)，(PAH1；YALI0D27016)，或其组合；和/或2)一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；
YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，peroxin10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
[0106] 在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是苹果酸脱氢酶(MAE1；
YALI0E18634p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基
1(ACL1；YALI0E34793p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是乙酰-CoA脱羧酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)的过表达。
YALI0E18634p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基
1(ACL1；YALI0E34793p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是乙酰-CoA脱羧酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)的过表达。
[0107] 在一些实施方案中，该另外的遗传修饰包括消除或减少解脂耶氏酵母基因磷脂酸磷酸酶(PAH1；YALI0D27016)；和/或该另外的遗传修饰包括一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自过氧化物酶10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
[0108] 在一个实施方案中，解脂耶氏酵母细胞是野生型株。在进一步的实施方案中，野生型株是PO1f株。在另外的实施方案中，解脂耶氏酵母细胞已被预优化用于脂质过量产生。在一个实施方案中，酵母细胞是L36株。被称为L36的解脂耶氏酵母菌株被鉴定为显示出显著的三酰基甘油酯积累能力。该菌株的全基因组测序确定了MGA2转录调节因子中的突变是最可能的基因组解释。MGA2p截短突变体在野生型背景中的互补测定达到L36脂质水平的50％。
[0109] 通过使用每种异源基因，遗传修饰的酵母细胞可用于制备许多靶III型聚酮化合物分子。可以从遗传修饰的酵母细胞(含有上文列出的异源基因)合成的III型聚酮化合物靶分子包括例如三乙酸内酯(TAL)(CAA86219.2(非洲菊))，芦荟苦素(AY517486(大黄))，间苯三酚(JX840717-JX840724(荧光假单胞菌))，苯甲酰丙酮(B0LDU5(覆盆子))，1,8-二羟基萘和黄酮(B1VLQ8(灰色链霉菌))，1,8-二羟基萘(SCO1206(天蓝色链霉菌))和phloroisovalerophenone(BAB12102.2(啤酒花))。
[0110] 酵母菌株的其他遗传变化也可以帮助改善靶向III型聚酮化合物的产生。在一些实施方案中，酵母细胞经遗传修饰以敲除(基因表达被消除)或敲低(基因表达降低)基因，其中遗传修饰的酵母菌株具有增强的乙酰-CoA和/或丙二酰-CoA的可用性。在一些实施方案中，可以是敲除或敲低的靶的基因包括，例如：天冬氨酰蛋白酶(PEP4；YALI0F27071p)，蛋白酶B液泡(PRB1；YALI0B16500p)，蛋白酶B液泡(PRB1H；YALI0A06435g)，葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶同种型1(GSY1；YALI0F18502p)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；YALI0E22649p)，丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；YALI0C16995p)，果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)，线粒体载体(YIA6；YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；
YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)，(PAH1；
YALI0D27016)，或其组合。
YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)，(PAH1；
YALI0D27016)，或其组合。
[0111] 在一些实施方案中，酵母细胞经遗传修饰过表达基因，其中遗传修饰的酵母菌株具有增强的乙酰-CoA和/或丙二酰-CoA的可用性。在一些实施方案中，可以是过表达的靶的基因包括，例如：乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；
YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，peroxin 10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，peroxin 10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
[0112] 在一些实施方案中，酵母细胞经遗传修饰以敲除(基因表达被消除)或敲低(基因表达降低)基因，其中遗传修饰的酵母菌株具有增强的乙酰-CoA和/或丙二酰-CoA的可用性。在一些实施方案中，可以是敲除或敲低的靶的基因包括，例如：天冬氨酰蛋白酶(PEP4；YALI0F27071p)，蛋白酶B液泡(PRB1；YALI0B16500p)，蛋白酶B液泡(PRB1H；YALI0A06435g)，葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶同种型1(GSY1；YALI0F18502p)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；
YALI0E22649p)，丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；
YALI0C16995p)，果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)，线粒体载体(YIA6；
YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；
YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；
YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；
YALI0B15059p)，或其组合。
YALI0E22649p)，丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；
YALI0C16995p)，果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)，线粒体载体(YIA6；
YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；
YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；
YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；
YALI0B15059p)，或其组合。
[0113] 在一些实施方案中，酵母细胞经遗传修饰过表达基因，其中遗传修饰的酵母菌株具有增强的乙酰-CoA和/或丙二酰-CoA的可用性。在一些实施方案中，可以是过表达的靶的基因包括，例如：乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；
YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，或其组合。
YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，或其组合。
[0114] 在一些实施方案中，基因从质粒过表达。在一些实施方案中，基因从整合的构建体过表达。在一些实施方案中，用于过表达该基因的启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，用于过表达该基因的启动子是条件启动子(例如，基于培养条件改变表达的启动子，例如不同的碳源)。
[0115] 在一些实施方案中，重组核酸编码包含相对于野生型蛋白质的突变的蛋白质。在实施方案中，突变是点突变。在实施方案中，突变是缺失。在实施方案中，突变是插入。在实施方案中，突变是与第二蛋白质的融合。
[0116] 在一些实施方案中，相对于在其他方面与遗传修饰的产油生物(例如酵母细胞，产油酵母细胞，解脂耶氏酵母)相同(例如遗传)的遗传上未修饰的产油生物(例如酵母细胞，产油酵母细胞，解脂耶氏酵母)，遗传修饰提高了转基因产油生物(例如酵母细胞，产油酵母细胞，解脂耶氏酵母)中乙酰-CoA的水平。在一些实施方案中，相对于在其他方面与遗传修饰的产油生物(例如酵母细胞，产油酵母细胞，解脂耶氏酵母)相同(例如遗传)的遗传上未修饰的产油生物(例如酵母细胞，产油酵母细胞，解脂耶氏酵母)，遗传修饰提高了转基因产油生物(例如酵母细胞，产油酵母细胞，解脂耶氏酵母)中丙二酰-CoA的水平。
[0117] 碳源
[0118] 一系列III型聚酮化合物可由各种起始碳源制成。这些碳源的实例包括，例如，葡萄糖、甘油、木糖、果糖、甘露糖、核糖、蔗糖和木质纤维素生物质。在一些实施方案中，碳源可以是乙醇或乙酸盐。在一个实施方案中，碳源是葡萄糖。
[0119] 替代碳源可导致不同的CoA前体库。使用来自木质素等来源的各种CoA前体，可以研究一整套聚酮化合物合成酶，用于生产各种聚酮化合物分子。通过添加(feed)这些CoA前体并使用宿主自身的丙二酰-CoA生产，不需要设计酵母来制备它们自己的新型CoA。这使得新陈代谢更集中于最终化学靶的产生。
[0120] 在一些实施方案中，可以使用培养基培养产油酵母，该培养基包含一种或多种碳源，该碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘油、乙酸酯、解聚糖用甜菜浆、黑液、玉米淀粉、解聚纤维素材料、玉米秸秆、甜菜浆、柳枝稷、乳清、糖蜜、马铃薯、大米、高粱、甘蔗、小麦及其混合物(例如甘油和葡萄糖的混合物、葡萄糖和木糖的混合物、果糖和葡萄糖的混合物、蔗糖和解聚糖用甜菜浆、解聚的纤维素材料、玉米秸秆、甜菜浆、柳枝稷、乳清、糖蜜、马铃薯、大米、高粱、甘蔗和/或小麦的混合物)。在实施方案中，使用包含木质纤维素生物质的培养基培养产油酵母。
[0121] 在一些实施方案中，碳源可以是单糖(例如葡萄糖、果糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖)、低聚糖、多糖(例如淀粉、纤维素或其混合物)、糖醇(例如甘油)或或可再生原料的混合物(例如、干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜或大麦麦芽)。另外、碳源可包括烷烃、脂肪酸、脂肪酸酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂、各种商业脂肪酸来源、包括植物油(例如大豆油)或动物脂肪。
[0122] 在一些实施方案中，该生长培养基包含选自葡萄糖，甘油，木糖，果糖，甘露糖，核糖，蔗糖和木质纤维素生物质的主要碳源。在一个实施方案中，该生长培养基包含葡萄糖作为主要碳源。
[0123] 在一些实施方案中，除了主要或大部分碳源之外，培养基可以含有一种或多种次级碳源。在一些实施方案中，该次级碳源包含木质素或木质素衍生的芳族化合物的二次碳源。在一些实施方案中，该次级碳源包含木质素分解产物。在一些实施方案中，木质素分解产物包括例如对香豆酸、松柏酸和芥子酸。在一些实施方案中，该次级碳源可以包括木脂素衍生的化合物包括开环异落叶松脂素，马台树脂醇，落叶松脂醇和松脂醇。在一些实施方案中，co-A分子衍生自酸，包括例如对香豆酸，反式阿魏酸，3-苯基丙酸，辛酸，反式肉桂酸，3-氟代肉桂酸，苯甲酸，3-氨基苯甲酸，丙酸，2-溴苯甲酸，苯乙酸，苯丙酮酸，戊酸，甲基丙二酸，乙基丙二酸，氯代丙二酸，肉桂酸和其他脂肪酸。
[0124] 产油酵母细胞的培养条件和生长培养基是本领域已知的。参见例如WO2014179748；Blazeck,J.等Metab Eng.2015Nov 32:66-73；Liu,L.等Metab Eng.2015Sep
31:102-11；Blazeck,J.等Nat Commun.2014 5:3131；Blazeck,J.等J Biotechnol.2013Jun
165(3-4):184-94；在此引入作为参考。
31:102-11；Blazeck,J.等Nat Commun.2014 5:3131；Blazeck,J.等J Biotechnol.2013Jun
165(3-4):184-94；在此引入作为参考。
[0125] 聚酮化合物生产方法
[0126] 本文公开的遗传修饰的酵母菌株可用于增加III型聚酮化合物的产生。
[0127] 本文公开了一种制备III型聚酮化合物的方法，包括：1)在生长培养基中培养产油酵母细胞，其中酵母细胞包含异源基因，其中该异源基因编码III型聚酮化合物合成酶；2)分离该III型聚酮化合物。
[0128] 本文公开了一种制备III型聚酮化合物的方法，包括：1)在生长培养基中培养产油酵母细胞，其中该酵母细胞包含异源基因,其中该异源基因编码选自来自非洲菊(Gerbera hybrida)的CAA86219.2基因、来自大黄(Rheum palmatum)的AY517486基因、来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的JX840717-JX840724基因、来自覆盆子(Rubus idaeus)的B0LDU5基因、来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的B1VLQ8基因、来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的SCO1206基因、来自啤酒花(Humulus lupulus)的BAB12102.2基因的III型聚酮化合物；和2)分离该III型聚酮化合物。
[0129] 在另一实施方案中，本文公开了一种制备III型聚酮化合物的方法，包括：1)在生长培养基中培养解脂耶氏酵母细胞，其中该酵母细胞包含一种或多种异源基因,其中该异源基因选自来自非洲菊(Gerbera hybrida)的CAA86219.2基因、来自大黄(Rheum palmatum)的AY517486基因、来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的JX840717-JX840724基因、来自覆盆子(Rubus idaeus)的B0LDU5基因、来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的B1VLQ8基因、来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的SCO1206基因、来自啤酒花(Humulus lupulus)的BAB12102.2基因；和2)分离该III型聚酮化合物。
[0130] 在一个实施方案中，该异源基因是来自非洲菊的CAA86219.2基因。在一个实施方案中，该异源基因是来自大黄的AY517486基因。在一个实施方案中，该异源基因是来自荧光假单胞菌的JX840717-JX840724基因。在一个实施方案中，该异源基因是来自覆盆子的B0LDU5基因。在一个实施方案中，该异源基因是来自灰色链霉菌的B1VLQ8基因。在一个实施方案中，该异源基因是来自天蓝色链霉菌的SCO1206基因。在一个实施方案中，该异源基因是来自啤酒花的BAB12102.2基因。
[0131] 在一些实施方案中，该III型聚酮化合物选自三乙酸内酯，芦荟苦素，间苯三酚，苄叉丙酮，1,8-二羟基萘，淡黄霉素和phloroisovalerophenone。在一个实施方案中，III型聚酮化合物是三乙酸内酯。在一个实施方案中，III型聚酮化合物是芦荟苦素。在一个实施方案中，III型聚酮化合物是间苯三酚。在一个实施方案中，III型聚酮化合物是苄叉丙酮。在一个实施方案中，III型聚酮化合物是1,8-二羟基萘。在一个实施方案中，III型聚酮化合物是淡黄霉素。在一个实施方案中，III型聚酮化合物是phloroisovalerophenone。
[0132] 在一个实施方案中，该异源基因整合到该酵母细胞基因组中。在另一实施方案中，该异源基因的至少两个拷贝存在于该酵母细胞的基因组中。在一个实施方案中，将该异源基因掺入包含启动子和该异源基因的基因表达盒中，其中该基因表达盒整合到酵母细胞的基因组中。在备选实施方案中,该异源基因从质粒中游离表达。
[0133] 酵母菌株的其他遗传变化也可以帮助改善靶向III型聚酮化合物的产生。在另一方面，遗传修饰的解脂耶氏酵母酵母细胞包含另外的遗传修饰。例如，另外的遗传修饰可以增加乙酰-CoA或丙二酰-CoA水平。在一些实施方案中，该另外的遗传修饰包含：1)消除或减少一种或多种解脂耶氏酵母基因，该基因选自天冬氨酰蛋白酶(PEP4；YALI0F27071p)，蛋白酶B液泡(PRB1；YALI0B16500p)，蛋白酶B液泡(PRB1H；YALI0A06435g)，葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶同种型1(GSY1；YALI0F18502p)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；YALI0E22649p)，丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；YALI0C16995p)，果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)，线粒体载体(YIA6；YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；
YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；
YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)，(PAH1；
YALI0D27016)，或其组合；和/或2)一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；
YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；
YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；
YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；
YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；
YALI0E27005)，peroxin 10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；
YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)，(PAH1；
YALI0D27016)，或其组合；和/或2)一种或多种解脂耶氏酵母基因的过表达，该基因选自乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；
YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；
YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；
YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；
YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；
YALI0E27005)，peroxin 10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
[0134] 在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是苹果酸脱氢酶(MAE1；
YALI0E18634p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基
1(ACL1；YALI0E34793p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是乙酰-CoA脱羧酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是peroxin 10(PEX10；YALI0C01023)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)的过表达。
YALI0E18634p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基
1(ACL1；YALI0E34793p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是乙酰-CoA脱羧酶(AceCarb(ACC1)；YALI0C11407g)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是peroxin 10(PEX10；YALI0C01023)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)的过表达。在一个实施方案中，该另外的遗传修饰是初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)的过表达。
[0135] 在进一步的实施方案中，解脂耶氏酵母细胞是PO1f株。在另外的实施方案中，解脂耶氏酵母细胞是L36株。被称为L36的解脂耶氏酵母菌株被鉴定为显示出显著的三酰基甘油酯积累能力。该菌株的全基因组测序确定了MGA2转录调节因子中的突变是最可能的基因组解释。MGA2p截短突变体在野生型背景中的互补测定达到L36脂质水平的50％。
[0136] 通过使用每种异源基因，遗传修饰的酵母细胞可用于制备许多靶III型聚酮化合物分子。可以从含有上文所描述的异源基因的遗传修饰的酵母细胞合成的III型聚酮化合物靶分子包括例如三乙酸内酯(TAL)(CAA86219.2(非洲菊))，芦荟苦素(AY517486(大黄))，间苯三酚(JX840717-JX840724(荧光假单胞菌))，苯甲酰丙酮(B0LDU5(覆盆子))，1,8-二羟基萘和黄酮(B1VLQ8(灰色链霉菌))，1,8-二羟基萘(SCO1206(天蓝色链霉菌))和phloroisovalerophenone(BAB12102.2(啤酒花))。
[0137] 酵母菌株的其他遗传变化也可以帮助改善靶向III型聚酮化合物的产生。在一些实施方案中，酵母细胞经遗传修饰以敲除(基因表达被消除)或敲低(基因表达降低)基因，其中遗传修饰的酵母菌株具有增强的乙酰-CoA和/或丙二酰-CoA的可用性。在一些实施方案中，可以是敲除或敲低的靶的基因包括，例如：天冬氨酰蛋白酶(PEP4；YALI0F27071p)，蛋白酶B液泡(PRB1；YALI0B16500p)，蛋白酶B液泡(PRB1H；YALI0A06435g)，葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶同种型1(GSY1；YALI0F18502p)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1；YALI0E22649p)，丙酮酸羧化酶1(PYC1；YALI0C24101p)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1；YALI0C16995p)，果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1；YALI0A15972p)，线粒体载体(YIA6；YALI0E16478g)，线粒体载体蛋白(RIM2；YALI0F05500g)，醇脱氢酶1(ADH1；YALI0D25630p)，醇脱氢酶2(ADH2；YALI0E17787p)，醇脱氢酶3(ADH3；YALI0A16379p)，C1-四氢叶酸合成酶(MIS1；
YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)，(PAH1；
YALI0D27016)，或其组合。
YALI0F30745p)，C1-THFS蛋白C1-四氢叶酸合成酶前体线粒体(MTHFD1L；YALI0E01056g)，磷酸葡萄糖变位酶(PGM2；YALI0E02090p)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1；YALI0B02948p)，脂肪酸合成酶亚基α(FAS2；YALI0B19382p)，脂肪酸合成酶亚基β(FAS1；YALI0B15059p)，(PAH1；
YALI0D27016)，或其组合。
[0138] 在一些实施方案中，酵母细胞经遗传修饰过表达基因，其中遗传修饰的酵母菌株具有增强的乙酰-CoA和/或丙二酰-CoA的可用性。在一些实施方案中，可以是过表达的靶的基因包括，例如：乙酰-CoA羧化酶(AceCarb(ACC)；YALI0C11407g)，丙酮酸脱羧酶(Pyrudecarb(PDC1)；YALI0D10131p)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3；YALI0D20768g)，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PDE2；YALI0D23683g)，苹果酸脱氢酶(MAE1；YALI0E18634p)，乙酰-CoA合成酶(AceCoA；YALI0F05962g)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDC-E1；YALI0F20702p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基1(ACL1；YALI0E34793p)，ATP-柠檬酸裂解酶亚基2(ACL2；YALI0D24431p)，AMP脱氨酶(AMPD；YALI0E11495p)，乙酰-CoA水解酶(ACH1；YALI0E30965g)，推定丙酮酸脱羧酶2(PDC2；YALI0D06930)，乙酰-CoA合成酶1(ACS1；YALI0F05962)，乙醛脱氢酶1(ALD1；YALI0B01298)，乙醛脱氢酶2(ALD2；YALI0C03025)，乙醛脱氢酶3(ALD3；
YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，peroxin 10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
YALI0E00264)，乙醛脱氢酶4(ALD4；YALI0F23793)，乙醛脱氢酶5(ALD5；YALI0D07942)，乙醛脱氢酶6(ALD6；YALI0F04444)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α(PDA1；YALI0F20702)，丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β(PDB1；YALI0E27005)，peroxin 10(PEX10；YALI0C01023)，多功能β氧化蛋白(氧化还原酶和氢裂解酶)(MFE1；YALI0E15378)，初级油酸调节剂(POR1；YALI0D12628)，或其组合。
[0139] 在一些实施方案中，基因从质粒过表达。在一些实施方案中，基因从整合的构建体过表达。在一些实施方案中，用于过表达该基因的启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，用于过表达该基因的启动子是条件启动子(例如，在不同碳源例如半乳糖中增加表达的启动子)。
[0140] 在实施方案中，重组核酸编码包含相对于野生型蛋白质的突变的蛋白质。在实施方案中，突变是点突变。在实施方案中，突变是缺失。在实施方案中，突变是插入。在实施方案中，突变是与第二蛋白质的融合。
[0141] 在该方法的一些实施方案中，该生长培养基包含选自葡萄糖，甘油，木糖，果糖，甘露糖，核糖，蔗糖和木质纤维素生物质的主要碳源。在一个实施方案中，该生长培养基包含葡萄糖作为主要碳源。
[0142] 还可包括任选的CoA连接酶以提供所公开方法的初始起始材料。在一些情况下，本文公开的方法还包括添加分子，例如儿茶酚、对香豆酰-CoA、阿魏酰-CoA、羟基苯甲酰-CoA和/或异戊酰-CoA。在一些情况下，本文公开的方法还包括添加分子，例如对香豆酸、松柏酸和芥子酸。在一些实施方案中，本文公开的方法还包括添加分子，例如木脂素衍生的化合物，包括例如开环异落叶松脂素，马台树脂醇，落叶松脂醇和松脂醇。在一些实施方案中，衍生的co-A分子起源自酸，包括例如对香豆酸，反式阿魏酸，3-苯基丙酸，辛酸，反式肉桂酸，3-氟代肉桂酸，苯甲酸，3-氨基苯甲酸，丙酸，2-溴苯甲酸，苯乙酸，苯丙酮酸，戊酸，甲基丙二酸，乙基丙二酸，氯代丙二酸，肉桂酸和其他脂肪酸。
[0143] 除了本文公开的关键遗传改变之外，由于可以溶解产物并促进产品配制的培养条件，可以进一步提高III型聚酮化合物的产率。在一个实施方案中，可加入溶解剂以增加III型聚酮化合物的溶解度。在一个实施方案中，溶解剂是γ-戊内酯。在一个实施方案中，溶解剂是三甘醇。
[0144] 在一些实施方案中，本文公开的酵母菌株和方法用于产生高水平的聚酮化合物，例如，大于5g/L。在一些实施方案中，产生的聚酮化合物量大于5g/L，大于10g/L，大于15g/L，大于20g/L，大于25g/L，大于50g/L，或大于100g/L。
[0145] 在一些实施方案中，在20℃至40℃培养酵母菌株。在一些实施方案中，在25℃至35℃培养酵母菌株。
[0146] 在一些实施方案中，使用0至250g/L糖的糖添加量培养酵母菌株。在一些实施方案中，初始糖添加是20g/L糖(例如葡萄糖)。
[0147] 实施例
[0148] 以下列出的实施例用于说明根据所公开的主题的组合物、方法和结果。这些实施例不旨在包括本文公开的主题的所有方面，而是旨在说明代表性的方法和结果。这些实施例不是要排除本领域技术人员显而易见的本发明的等同物和变化形式。
[0149] 实施例1.在解脂耶氏酵母中生产III型聚酮三乙酸内酯(TAL)
[0150] 由于它们已有丰富的CoA分子前体库，因此研究油脂酵母物种作为用于生产III型聚酮化合物的优异宿主。在一些实施方案中，这些生物的通量(flux)可以从脂肪酸的生产转移到聚酮化合物的生产。在该实施例中使用解脂耶氏酵母来证明产油酵母通过产生III型聚酮三乙酸内酯(TAL)产生III型聚酮化合物的能力。
[0151] 菌株和途径的工程改造
[0152] 为了改善III型聚酮化合物产生的产生，已经鉴定了多种基因靶标用于敲低和过表达。通过平衡代谢和辅因子，可以将更大的可用前体库加入聚酮化合物的生产中。这些靶涉及增强可用乙酰-CoA和丙二酰-CoA的途径。所有基因和蛋白质序列均可从美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)或Genolevures：Hemiascomycte Yeasts网站的基因组探索(www.genolevures.org)获得。
[0153] 表1.敲除或敲低靶
[0154]
[0155]
[0156] 表2.过表达靶
[0157]
[0158]
[0159] III型聚酮合成酶
[0160] 已经探索了III型聚酮化合物的途径酶的来源。可以探索这些用于聚酮化合物生产的途径，同时利用这些酶的一般杂乱性(promiscuity)来产生衍生分子。在解脂耶氏酵母中鉴定用于聚酮化合物生产的初始III型聚酮化合物合酶的非限制性实例列于下表3中。
[0161] 表3.III型聚酮合成酶的实例
[0162]
[0163] 还可包括任选的CoA连接酶以用于提供初始起始材料。在一些情况下，可以使用诸如儿茶酚、对香豆酰-CoA、阿魏酰-CoA、羟基苯甲酰-CoA和/或异戊酰-CoA的分子。
[0164] 碳源
[0165] 替代碳源可导致不同的CoA前体库。使用来自木质素等来源的各种CoA前体，可以研究一整套聚酮化合物合成酶，用于生产各种III型聚酮化合物分子。通过添加(feed)这些CoA前体并使用宿主自身的丙二酰-CoA生产，不需要设计酵母来制备它们自己的新型CoA。这使得新陈代谢更集中于最终化学靶的产生。
[0166] 使用来自非洲菊的III型聚酮化合物合酶g2ps1进行TAL生产
[0167] 来自植物非洲菊的III型聚酮合成酶g2ps1通过蓝鹭(Blue Heron)密码子优化并整合到解脂耶氏酵母的基因组中。通过反相HLPC测定密码子优化形式的g2ps1的活性。已经在大肠杆菌中产生并表征了具有增加活性的g2ps1的两种突变体变体。通过使用定点诱变，考虑到解脂耶氏酵母中的密码子偏倚，重复这些突变。通过为该宿主设计的合成的杂合启动子实现表达。
[0168] 菌株开发
[0169] 研究了解脂耶氏酵母的各种起始菌株的TAL产生。在野生型菌株(PO1f)和先前工程改造的高脂质生产菌株(L36)中都观察到TAL的产生(图1)。在一些实例中，观察到TAL的产生依赖于亮氨酸和尿嘧啶基因表达，因为这似乎在不同菌株之间变化。
[0170] 接下来，检查了多个拷贝的g2ps1的效果。据观察，多拷贝表达导致更高的生产效价(图2)。此外，较高水平的葡萄糖导致TAL产生量增加。
[0171] 使用生物反应器检查放大反应的能力。根据表4中的条件进行两次生物反应器运行。
[0172] 表4.生物反应器条件
[0173]
[0174]
[0175] 由于溶解度问题，这些报告的数字(见图3和4)小于实际效价。在使用三甘醇作为添加剂以增加溶解度的另外的HPLC运行中，反应器#2的最终滴度平均为5.6g/L的TAL。当停止搅拌时容易观察到这些溶解度问题，并且反应器在中间阶段与结晶TAL结合成不同的相。
[0176] 途径工程改造
[0177] 选择来自上表(表2)中列出的过表达靶的许多基因用于进一步分析。发现这些靶中的一些(例如，ACL1、ACL2、MAE1、PDC1、PDCE2、AceCoA和AceCarb)使TAL水平增加了2倍(图6和图7)。在进一步的实施例中，检查这些基因的组合以获得高于单基因靶的额外改进。
[0178] 实施例2.聚酮合酶的分析
[0179] 选择利用乙酰-CoA和丙二酰-CoA作为唯一引发剂和增量剂分子的五种聚酮合酶的子集用于在解脂耶氏酵母中进行测试。这五个靶在下表5中找到，其中列出了它们的天然宿主、基因标识和靶分子。每个PKS用Blue Heron Biotech算法进行密码子优化，并合成为gblock(IDT)。用URA3标记将每个PKS随机整合到野生型pO1j(pO1fΔTRP1)的基因组中。从平板中挑取随机菌落，放入甘油，每个菌落的一个菌落在CSM中作为起子生长2天，稀释回OD600为0.1，再生长2天，然后通过LCMS分析上清液。在pO1j ALS的上清液的色谱图中鉴定出两个新的峰。发酵后，每种菌株的色素的视觉差异是明显的，并且将每个沉淀物悬浮在水中以显现荧光。每种菌株的表型存在差异，其进一步表征以鉴定正在产生的分子。
[0180] 表5.本实施例中使用的靶聚酮合酶(PKS)基因
[0181]
[0182]
[0183] 通过增加g2ps1用于制备TAL的乙酰-CoA和丙二酰-CoA前体的通量可以改善TAL效价。研究了三种途径对乙酰-CoA的影响-通过乙酸盐，丙酮酸盐和柠檬酸盐，有或没有过表达乙酰-CoA羧化酶，ACC1强制从乙酰-CoA到丙二酰-CoA的通量。这些途径中的每一个都构建在YCP63-一种菌株中，该菌株含有四个拷贝的g2ps1(通过qPCR测量)，其使用LEU2和URA3标记整合到野生型pO1f中。为了增加选择可用性，通过用CRISPR-Cas9产生插入缺失突变(indel)，在YCP63中敲除TRP1。TRP1的缺失对TAL的产生具有可忽略的影响。
[0184] 乙酸途径首先利用丙酮酸脱羧酶从丙酮酸形成乙醛。先前已经鉴定了丙酮酸脱羧酶PDC1，但是还通过序列同源性鉴定了推定的酶PDC2，并且还进行了研究。使用五种单独的乙醛脱氢酶将乙醛转化为乙酸(ALD1、ALD2、ALD3、ALD5、ALD6)。最后，使用乙酰-CoA合成酶ACS1将乙酸转化为乙酰-CoA。将该乙酸途径中的天然基因随机整合用于过表达。完成的途径显示ALD5和PDC1与ACS1和ACC1一起在4天管发酵中产生最多TAL(3.1g/L，最初添加20g/L葡萄糖)。TAL的第二高产量是菌株pO1f g2ps1ΔTRP1ACS1ALD3PDC2ACC1，其产生2.7g/L的TAL，最初添加20g/L葡萄糖。在任何这些工程菌株中都没有看到生长缺陷，这表明解脂耶氏酵母确实是产生高效价III型聚酮化合物的可行平台。
[0185] 丙酮酸脱氢酶复合物由四个独立的基因构建-丙酮酸脱氢酶亚基α和β(PDA1、PDB1)、二氢硫辛酰胺酰基转移酶(PDE2)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(PDE3)。通过随机基因组整合过表达整个天然丙酮酸脱氢酶复合物。随着整个途径的过度表达，TAL效价增加约20％。
[0186] 基于先前对增加的脂肪酸效价的经验，选择柠檬酸途径的部分用于过表达。编码ATP柠檬酸裂解酶(ACL1、ACL2)的两个亚基的天然基因用AMP脱氨酶(AMPD)过表达以增加可用于TAL产生的乙酰-CoA。单独的ACL1和ACL2对TAL的产生没有积极作用，但是在含有过表达的ATP柠檬酸裂解酶的菌株中分析过表达的AMPD有增加的TAL产生。
[0187] 表6.在乙酰-CoA途径中的代表性基因
[0188]
[0189] 除了通过直接影响上游前体形成的过度表达增加可用的乙酰-CoA和丙二酰-CoA之外，被捕获在(trapped)解脂耶氏酵母丰富的脂肪酸库中的碳可以通过过表达与β-氧化相关的基因并敲除与脂肪酸储存相关的非必需基因来得到释放。选择三个基因靶用于过表达——peroxin 10(PEX10)、多功能β-氧化蛋白(MFE1)和初级油酸调节剂(POR1)。选择一个靶用于敲除磷酸化磷酸酶(PAH1)。基因过度表达和敲除是在YCP63ΔTRP1中构建的。分析这些基因的组合以增加通过β-氧化释放的乙酰-CoA，从而产生更高的TAL效价。
[0190] 表7.与β-氧化上调相关的其他靶基因。
[0191]
[0192] 通过脂肪酸的分解测定表7中的这些另外的靶基因对增加乙酰-CoA库的影响，以改善TAL的产生。
[0193] 虽然已经参考各种和优选实施例描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解，在不脱离本发明的实质范围的情况下，可以进行各种改变并且可以用等同物替换其元件。另外，在不脱离本发明的实质范围的情况下，可以进行许多修改以使特定情况或材料适应本发明的教导。
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