二穗短柄草抗旱抗盐基因及其编码蛋白质与应用
阅读：814发布：2020-05-16
专利汇可以提供二穗短柄草抗旱抗盐基因及其编码蛋白质与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种二穗短柄草抗旱抗盐基因编码蛋白的应用。该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列或与SEQ ID NO.1所示的序列互补的核苷酸序列。该 蛋白质 由 权利要求 1所述的基因编码得到，所述蛋白质的 氨 基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述基因用于在提高 植物 对干旱和 盐胁迫 的耐受性方面的应用。本发明所述基因调节植物通过透物质的积累，保持细胞 水 分；通过提高抗 氧 化酶 系统活 力 ，减少ROS积累，降低 活性氧 造成的细胞膜氧化损伤；通过在干旱下加快气孔关闭，减少通过蒸腾作用损失的水分和提高胁迫相关基因的表达水平等途径提高转基因 烟草 的抗旱和抗盐能力。并且该基因的转基因烟草对干旱和盐胁迫的耐受性依赖于ABA合成的调节和ABA 信号 通路。，下面是二穗短柄草抗旱抗盐基因及其编码蛋白质与应用专利的具体信息内容。
1.一种植物抗旱抗盐基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列或与SEQ ID NO.1所示序列互补的序列。
2.一种植物蛋白质，其特征在于，该蛋白质由权利要求1所述的基因编码得到，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，该蛋白质在细胞核、细胞质和细胞膜中表达。
4.一种重组表达载体，其特征在于，该载体含有权利要求1所述的基因；
优选地，该载体还含有报告基因；
优选地，所述报告基因为绿色荧光蛋白基因。
5.一种工程菌，其特征在于，含有权利要求4所述的重组表达载体；
优选地，所述工程菌为大肠杆菌。
6.如权利要求1所述基因在提高植物对干旱和盐胁迫的耐受性方面的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因通过提高植物抗氧化系统活力来清除植物活性氧，以此降低活性氧对细胞造成的氧化损伤；
优选地，所述抗氧化系统为过氧化氢酶系统、过氧化物酶系统、超氧化物歧化酶系统和羟自由基清除系统中的至少一种。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因在干旱和盐胁迫环境下通过促进植物长出发达的根系，提高植物对干旱和盐胁迫的耐受性。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因通过诱导蔗糖合成酶基因和可溶性糖合成基因表达，增加植物细胞中蔗糖和可溶性糖积累，从而使细胞内的渗透压提高，提高植物对干旱和盐胁迫的耐受性。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因通过参与ABA信号途径，提高植物对干旱和盐胁迫的耐受性；
优选地，所述基因通过增强对外源ABA信号途径的敏感性，参与ABA信号途径介导的植物气孔关闭，上调ABA信号通路基因的表达，并调节盐胁迫基因的表达，提高植物对干旱和盐胁迫的耐受性。
二穗短柄草抗旱抗盐基因及其编码蛋白质与应用
技术领域
背景技术
[0002] 干旱、高盐等不利环境通过影响植物的光合作用、脂质代谢与蛋白质 合成代谢等过程影响植物的正常生长发育，并造成作物减产、品质下降。 生态失衡和环境污染使植物的生长环境更加复杂，并不断恶化，植物的正 常生长受到严重威胁。因为不能像动物一样通过自身移动到有利的位置来 躲避环境胁迫，植物在进化过程中形成了在分子、细胞和生理水平上感知、 传递和响应各种胁迫的完整系统。阐明植物抗逆机制，在此基础上培育抗 逆植物(作物)新品种的研究正日益受到人们的重视。与传统育种方法相 比，转基因技术因为周期短、效率高等优点，被越来越多地应用到农业科 学与实践之中。近年来随着生物信息学、基因组学、测序技术等的快速发 展，越来越多的与植物抗逆相关的基因及基因家族被鉴定和克隆，为作物 育种提供了良好的资源和理论基础。
[0003] 14-3-3作为接头蛋白通过与被磷酸化了的靶蛋白相结合进而改变靶蛋 白的定位、活性、稳定性等生理特性，在多种植物生命进程中发挥广泛而 重要的调节作用。14-3-3通过与蛋白互作可以参与调节基础代谢，光信号 通路，植物激素信号转导等多种生理过程；越来越多的研究表明14-3-3在 逆境胁迫应答中也发挥重要作用。近些年来，在拟南芥、大豆等物种中的 研究表明，14-3-3蛋白通过调节气孔运动、根部运动、激素信号、基础代 谢和应激反应等在干旱、盐、冷、重金属毒害等非生物逆境胁迫应答中发 挥作用。
[0004] 二穗短柄草是早熟禾亚科植物，具有基因组小、生长周期短、自花授 粉、个体小、以及遗传转化操作简便、突变体易获得等特征，较水稻等其 他模式植物，二穗短柄草更适合作为包括小麦、大麦在内的温带禾谷类作 物功能基因组研究的模式植物。随着2010年二穗短柄草二倍体株系Bd21 基因组测序的完成，二穗短柄草作为一种新兴的禾本科模式植物越来越受 到关注。鉴定二穗短柄草抗逆基因并分析其功能有助于推动对小麦、大麦 等农作物非生物胁迫响应相关基因的研究。在二穗短柄草中分离得到抗旱、 抗盐功能基因，为运用基因工程技术提高作物对干旱和盐胁迫的耐受性， 提供了更加丰富的抗逆优良候选基因。
发明内容
[0005] 本发明提供了二穗短柄草抗旱基因BdGF14a及其表达载体和其编码蛋 白和应用，为作物抗逆尤其是抗旱、抗盐提供了一种新的基因及应用。
[0006] 按照本发明的第一方面，提供了一种植物抗旱抗盐基因，该基因的核 苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列或与SEQ ID NO.1所示序列互补的序列。
[0007] 按照本发明的另一方面，提供了一种植物蛋白质，该蛋白质由权利要 求1所述的基因编码得到，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008] 优选地，该蛋白质在细胞核、细胞质和细胞膜中表达。
[0009] 按照本发明的另一方面，提供了一种重组表达载体，该载体含有权利 要求1所述的基因；
[0010] 优选地，该载体还含有报告基因；
[0011] 优选地，所述报告基因为绿色荧光蛋白基因。
[0013] 优选地，所述工程菌为大肠杆菌。
[0014] 按照本发明的另一方面，提供了所述基因在提高植物对干旱和盐胁迫 的耐受性方面的应用。
[0016] 优选地，所述抗氧化系统为过氧化氢酶系统、过氧化物酶系统、超氧 化物歧化酶系统和羟自由基清除系统中的至少一种。
[0017] 优选地，所述基因在干旱和盐胁迫环境下通过促进植物长出发达的根 系，提高植物对干旱和盐胁迫的耐受性。
[0018] 优选地，所述基因通过诱导蔗糖合成酶基因和可溶性糖合成基因表达， 增加植物细胞中蔗糖和可溶性糖积累，从而使细胞内的渗透压提高，提高 植物对干旱和盐胁迫的耐受性。
[0019] 优选地，所述基因通过参与ABA信号途径，提高植物对干旱和盐胁迫 的耐受性；
[0020] 优选地，所述基因通过增强对外源ABA信号途径的敏感性，参与ABA 信号途径介导的植物气孔关闭，上调ABA信号通路基因的表达，并调节盐 胁迫基因的表达，提高植物对干旱和盐胁迫的耐受性。
[0021] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要 具备以下的技术优点：
[0022] (1)本发明所述基因过表达提高了转基因植株对干旱和盐胁迫的耐受 性。干旱和盐胁迫使植物细胞内活性氧ROS含量升高，造成细胞膜及细胞 内不可逆的氧化损伤；降低CO2摄入量引起光呼吸作用增强，阻碍ATP合 成等，最终引起光合作用等多种重要生理过程受阻，导致作物产量下降。 本发明所述基因调节植物通过关闭气孔减少通过蒸腾作用损失的水分；长 出更多更发达的根系保证水分的吸收；提高抗氧化酶系统中过氧化氢酶、 过氧化物酶、超氧化物歧化酶等酶活力及时清除活性氧ROS，以此降低活 性氧对细胞造成的氧化损伤；提高渗透物质脯氨酸和可溶性糖的积累，增 强膜系统的稳定性，提高植物对干旱和高盐胁迫的耐受性。
[0024] 图1是利用荧光倒置显微镜观察BdGF14g基因的报告基因绿色荧光蛋 白的表达。
[0025] 图2是BdGF14a转基因烟草株系转录表达水平的半定量分析。
[0026] 图3是BdGF14a转基因草抗旱、抗盐表型分析；其中图3(a)将在 MS固体培养基上正常生长两周的转基因及野生型烟草幼苗移栽至营养土 中继续生长三周，干旱处理4周和浇水恢复3周，观察其表型；及500mM 氯化钠处理4周后，观察其表型；图3(b)离体叶片失水率分析；图3(c) 复水3周和氯化钠处理4周后，各转基因株系及野生型烟草的存活率分析。 误差线用±SE表示。用Student’s t检验进行差异分析，星号代表转基因株系 与对照株系(WT和VC)之间存在显著(*P<0.05)或极显著(**P<0.01) 差异。
[0027] 图4是BdGF14a转基因株系及野生型烟草的气孔运动分析；(a)取4 周大的WT，VC和BdGF14a转基因烟草幼苗的叶片进行脱水，200mM氯 化钠和50μM ABA处理后在荧光倒置显微镜下观察其气孔张开情况，Scale bar＝5μM。(b)气孔开度的统计分析。数据＝平均数±SE。用Student’s t检验进行差异分析，星号代表转基因株系与对照株系的气孔开度差异(WT 和VC)之间存在显著(*P<0.05)或极显著(**P<0.01)差异。
[0028] 图5是BdGF14a转基因株系及野生型烟草的根长分析。(a)将在MS 固体培养基上正常生长2周的转基因烟草及野生型烟草幼苗转移到分别含 有10μM ABA，150mM甘露醇，100mM氯化钠和甘露醇/氯化钠+0.1mM 钨酸钠的培养基上处理2周，观察其根长生长情况；
(b)测量正常生长条 件下及处理后各转基因株系及野生型烟草幼苗根长并统计结果。数据＝平均 数±SE。用Student’s t检验进行差异分析，星号代表转基因株系与对照株系 (WT和VC)之间存在显著(*P<0.05)或极显著(**P<0.01)差异。
(b)测量正常生长条 件下及处理后各转基因株系及野生型烟草幼苗根长并统计结果。数据＝平均 数±SE。用Student’s t检验进行差异分析，星号代表转基因株系与对照株系 (WT和VC)之间存在显著(*P<0.05)或极显著(**P<0.01)差异。
[0029] 图6为BdGF14a转基因株系及野生型烟草生理指标的测量；分别取正 常生长条件及干旱或高盐处理下BdGF14a基因过表达烟草株系及野生型烟 草的叶片，测量其(a)离子渗漏(Ions leakage)、(b)丙二醛(MDA) 含量、(c)脯氨酸(Proline)含量、和(d)可溶性糖(Sugar)含量。用 Student’s t检验进行差异分析，星号代表转基因株系与对照株系(WT和VC) 间各生理指标存在显著(*P<0.05)或极显著(**P<0.01)差异。
[0030] 图7为BdGF14a转基因株系及野生型烟草抗氧化酶活力和过氧化氢含 量的测定；干旱和盐处理后，采集对照株系和BdGF14a转基因烟草株系叶 片样品测定过氧化氢含量(a)、过氧化氢酶(CAT)活性(b)、过氧化 物酶(POD)活性(c)、超氧化物歧化酶(SOD)活性(d)、羟自由基 清除能力(D)(e)、总抗氧化能力(T-AOC)(f)。数据＝平均数±SE。 用Student’s t检验进行差异分析，星号代表转基因株系与对照株系(WT和 VC)之间存在显著(*P<0.05)或极显著(**P<0.01)差异。
[0031] 图8是3，3，二氨基联苯胺(DAB)和硝基四氮唑蓝(NBT)组织化 学染色分析；在蛭石中培养4周大的烟草进行脱水处理1周或500mM氯 化钠处理3周后，以及在1/2MS培养基上生长2周大的幼苗在甘露醇(300 mM)和氯化钠(200mM)溶液中处理2天后，取叶片进行DAB(a)和 NBT(b)染色。
[0032] 图9为BdGF14a基因过表达株系及野生型烟草中，ABA信号通路相关 基因表达分析；用qRT-PCR检测正常生长条件下，氯化钠和甘露醇处理条 件下，野生型和转基因烟草叶片中NtNCED1(a)，NtDREB3(b)，NtABF2 (c)，NtLEA5(d)，NtTobLTP1(e)，NtERD10C(f)，NtLTP1(g)和 NtERD10D(h)。数据＝平均数±SE。用Student’s t检验进行差异分析，星 号代表转基因株系与WT对照株系间中各相关基因转录表达水平存在显著 (*P<0.05)或极显著(**P<0.01)差异。
[0033] 图10为BdGF14a基因过表达株系及野生型烟草中，ROS清除系统相 关基因表达分析；用qRT-PCR检测正常生长条件下，氯化钠和甘露醇处理 条件下，及添加有钨酸钠的氯化钠和甘露醇处理下，野生型和转基因烟草 叶片中NtCAT(a)，NtAPX(b)，NtSOD(c)，NtRBOHD(d)，NtPOX2 (e)，NtGST(f)和NtRBOHF(g)的表达情况。数据＝平均数±SE。用 Student’s t检验进行差异分析，星号代表转基因株系与WT对照株系间中各 相关基因转录表达水平存在显著(*P<0.05)或极显著(**P<0.01)差异。
[0034] 图11为BdGF14a基因过表达株系及野生型烟草中，ROS清除系统相 关基因表达分析；用qRT-PCR检测正常生长条件下，氯化钠和甘露醇处理 条件下，及添加有钨酸钠的氯化钠和甘露醇处理下，野生型和转基因烟草 叶片中NtADC1(a)，NtSAMDC(b)，NtP5CS1(c)，NtSUS1(d)和 NtSPSA(e)的表达水平。数据＝平均数±SE。用Student’s t检验进行差异分 析，星号代表转基因株系与WT对照株系间中各相关基因转录表达水平存 在显著(*P<0.05)或极显著(**P<0.01)差异。
具体实施方式
[0035] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图 及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体 实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的 本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可 以相互组合。
[0036] 实施例1：二穗短柄草BdGF14a基因的分离
[0037] 1、BdGF14a基因克隆
[0038] 在Phytozome v12.1(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)Blast 得到的14-3-3基因序列(BRADI1G11290.1，GenBank:KU933262.1)提交 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对分析。利用Primer6 引物设计软件对二穗短柄草BdGF14a特异性扩增引物，引物序列见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，PCR反应体系见表1，PCR程序如下：98℃预 变性3min；98℃变性15s；65℃退火5s；72℃延伸30s；72℃终延伸 10min；4℃保存。其中，变性、退火、延伸三个连续的步骤设置35个循 环反应。
[0039] 表1 PCR反应体系
[0040]
[0041] 2、目的片段的胶回收
[0042] 将PCR反应产物在1％的琼脂糖凝胶上进行点样，在120V电压下电泳 20min。用凝胶成像分析系统检测目的条带，在蓝光切胶仪上用手术刀小心 切下目的片段胶带放至1.5mL灭菌离心管中，用天根生化科技有限公司胶 回收试剂盒进行目的片段的回收。实验步骤如下：
[0043] 1)在装有切下的目的基因块的1.5mL离心管中加入等体积的溶胶液 PN，在50℃水浴锅中溶化，期间不时颠倒混匀，待溶好后，冷却至室温；
[0044] 2)加入平衡好的吸附柱中，室温吸附1min；
[0045] 3)12,000rpm离心1min，弃上清；
[0046] 4)加入500μL漂洗液PW漂洗，弃上清；
[0047] 5)重复步骤4)；
[0048] 6)13,000rpm空转2min；
[0049] 7)去掉收集管，打开吸附柱盖子并在室温下晾干；
[0050] 8)将晾干的吸附柱套在新的收集管中，向吸附柱中间加入30～50μL 洗脱缓冲液EB(65℃预温)，室温放置吸附2min；
[0051] 9)将上述收集管12,000rpm离心2min，收集所得液体，即目的基因 DNA溶液。
[0052] 3、BdGF14a基因的克隆载体构建
[0053] 按照表2配置连接反应体系。将反应体系PCR管用涡旋仪混匀，并简 短离心，置于16℃恒温连接仪上反应5～8h。
[0054] 表2连接反应体系
[0055]
[0056] 4、大肠杆菌感受态细胞的转化
[0057] 大肠杆菌感受态细胞的转化所有步骤均在超净工作台中进行无菌操 作，具体实验步骤如下：
[0058] 1)取10μL连接产物加入到50μL感受态细胞(冰上放置)中，轻轻 混匀，简短离心，冰浴30min；
[0059] 2)将冰浴好的感受态细胞在42℃水浴锅中热激90s，迅速冰浴5min；
[0060] 3)在感受态细胞中加入200μL LB液体培养基，在摇床上37℃，220rpm 培养1h；
[0061] 4)将培养的感受态细胞菌液涂平板至含有50mg/L氨苄青霉素的LB 固体培养基上；
[0062] 5)恒温培养箱中37℃倒置培养12～16h。
[0063] 5、菌液PCR检测
[0064] 在倒置培养过夜的LB固体培养基上，挑取8个单克隆至2mL灭菌离 心管中，加入含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，在摇床中37℃， 280rpm振荡培养3～5h，在超净工作台中分别吸取2μL菌液作为检测模板 进行PCR扩增，PCR反应体系同表2，PCR反应程序为：98℃预变性3min； 98℃变性15s；65℃退火5s；72℃延伸30s；72℃终延伸10min；4℃ 保存。其中，变性、退火、延伸三个连续的步骤设置35个循环反应。PCR 反应程序结束后，将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统分 析检测结果，得到含有正确目的条带的单克隆并送测序，将测序正确的单 克隆菌液保种。
[0065] 实施例2：pBI121-BdGF14a-GFP真核表达载体的构建
[0066] 1、BdGF14a基因的PCR扩增
[0067] 分别以含有测序正确的二穗短柄草BdGF14a基因的克隆载体 pMD18-T-BdGF14a为模板，用Oligo7引物设计软件设计5’端带有pBI121 载体多克隆位点区XbaI酶切位点及BamHI酶切位点的基因特异性引物进行 PCR扩增，引物序列见表SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，PCR反应体系见 表3/同表1，PCR程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s；65℃退 火5s；72℃延伸30s；72℃终延伸10min；4℃保存。其中，变性、退火、 延伸三个连续的步骤设置
35个循环反应。
35个循环反应。
[0068] 表3 PCR反应体系
[0069]
[0070] 2、目的片段的胶回收
[0071] 将PCR反应产物在1％的琼脂糖凝胶上进行点样，在120V电压下电泳 20min。用凝胶成像分析系统检测目的条带，在蓝光切胶仪上用手术刀小心 切下目的片段胶带放至1.5mL灭菌离心管中，用天根生化科技有限公司胶 回收试剂盒进行目的片段的回收。实验步骤如下：
[0072] 1)在装有切下的目的基因块的1.5mL离心管中加入等体积的溶胶液 PN，在50℃水浴锅中溶化，期间不时颠倒混匀，待溶好后，冷却至室温；
[0073] 2)加入平衡好的吸附柱中，室温吸附1min；
[0074] 3)12,000rpm离心1min，弃上清；
[0075] 4)加入500μL漂洗液PW漂洗，弃上清；
[0076] 5)重复步骤4)；
[0077] 6)13,000rpm空转2min；
[0078] 7)去掉收集管，打开吸附柱盖子并在室温下晾干；
[0079] 8)将晾干的吸附柱套在新的收集管中，向吸附柱中间加入30～50μL 洗脱缓冲液EB(65℃预温)，室温放置吸附2min；
[0080] 9)将上述收集管12,000rpm离心2min，收集所得液体，即目的基因 DNA溶液。
[0081] 3、pBI121-GFP空载体的酶切反应
[0082] 按照限制性内切酶说明书在250μL灭菌小离心管中配制好酶切反应体 系，涡旋混匀并短暂离心后，放入37℃恒温培养箱进行pBI121-GFP空载 体酶切反应20min。酶切体系如表4。酶切结束后，将酶切反应体系离心管 置于80℃水浴锅水浴10min将限制性内切酶灭活，并冷却至室温。
[0083] 表4酶切反应体系
[0084]
[0085] 4、目的基因连接到载体
[0086] 用T4连接酶将胶回收的目的基因片段与双酶切过的pBI121-GFP空载 体进行连接反应，连接体系如表5。将反应体系PCR管用涡旋仪混匀，并 简短离心，置于16℃恒温连接仪上反应12～16h。
[0087] 表5连接反应体系
[0088]
[0089] 5、大肠杆菌感受态细胞的转化
[0090] 大肠杆菌感受态细胞的转化所有步骤均在超净工作台中进行无菌操 作，具体实验步骤如下：
[0091] 1)取10μL连接产物加入到50μL感受态细胞(冰上放置)中，轻轻 混匀，简短离心，冰浴30min；
[0092] 2)将冰浴好的感受态细胞在42℃水浴锅中热激90s，迅速冰浴5min；
[0093] 3)在感受态细胞中加入200μL LB液体培养基，在摇床上37℃，220rpm 培养1h；
[0094] 4)将培养的感受态细胞菌液涂平板至含有50mg/L氨苄青霉素的LB 固体培养基上；
[0095] 5)恒温培养箱中37℃倒置培养12～16h。
[0096] 6、菌液PCR检测
[0097] 在倒置培养过夜的LB固体培养基上，挑取8个单克隆至2mL灭菌离 心管中，加入含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，在摇床中37℃， 280rpm振荡培养3～5h，在超净工作台中分别吸取2μL菌液作为检测模板 进行PCR扩增，PCR反应体系同表2，PCR反应程序为：98℃预变性3min； 98℃变性15s；65℃退火5s；72℃延伸30s；72℃终延伸10min；4℃ 保存。其中，变性、退火、延伸三个连续的步骤设置35个循环反应。PCR 反应程序结束后，将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统分 析检测结果，得到含有正确目的条带的单克隆，将该单克隆菌液保种，并 取20μL该菌液加入25mL含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基进行扩 大培养，待抽质粒。
[0098] 7、质粒的提取
[0099] 使用天根生化科技有限公司质粒小提试剂盒提取质粒，操作步骤如下：
[0100] 1)将25mL扩大培养的含有正确目的条带的单克隆大肠杆菌菌液进行 12,000rpm离心1min，弃上清；
[0101] 2)在所得大肠杆菌菌体中加入1mL P1溶液重悬，用涡旋仪混匀；
[0102] 3)在上述溶液中加入1mL P2溶液室温裂解3min，其间轻柔混匀不 得剧烈震荡，直至菌液变得清亮；
[0103] 4)在上述溶液中迅速加入1.4mL P3溶液，迅速轻轻混匀以防产生局 部沉淀；
[0104] 5)将离心管进行12,000rpm离心10min，转移上清至事先平衡好的吸 附柱中(吸附柱套在收集管中)，室温吸附1min；
[0105] 6)将收集管12,000rpm离心1min，弃上清；
[0106] 7)在吸附柱中加入500μL漂洗液PW，进行12,000rpm离心1min， 弃上清；
[0107] 8)重复步骤7)；
[0108] 9)将装有吸附柱的收集管13,000rpm离心2min；
[0109] 10)去掉收集管，打开吸附柱盖子，室温晾干；
[0110] 11)将晾干的吸附柱套在新的收集管中，向吸附柱中间悬空加入60μL 洗脱缓冲液EB(65℃预温)，室温静置2min；
[0111] 12)将收集管12,000rpm离心1min，所得溶液即含有目的基因的质粒 溶液。
[0112] 8、重组质粒的酶切鉴定
[0113] 酶切体系的配制同表3。将配好的酶切反应体系用涡旋仪混匀，简短离 心，37℃恒温培养箱反应20min，加入1μL 10×上样缓冲液终止酶切反应， 对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统下检测重组质粒是否 含有被正确双酶切开的目的条带。
[0114] 9、重组质粒测序
[0115] 将被正确双酶切开的重组质粒送测序公司测序，得到 pBI121-BdGF14a-GFP真核表达载体。
[0116] 实施例3：二穗短柄草BdGF14a蛋白的亚细胞定位
[0117] 1、农杆菌感受态的制备及转化
[0118] 农杆菌细胞感受态的制备及转化实验所有操作步骤均在超净工作台中 进行无菌操作，具体流程如下：
[0119] 1)从-80℃超低温冰箱取保种的农杆菌EHA105菌株接种到含有50 mg/L Str的YEB固体培养基上(划线)，在28℃暗培养2～3d。
[0120] 2)挑取大而圆的单克隆菌落，接种入1mL含50mg/L Str的YEB液 体培养基内，28℃，200rpm暗培养12～16h。
[0122] 4)将上述农杆菌菌液冰浴30min；
[0123] 5)将冰浴后的农杆菌菌液进行4℃5,000rpm离心5min；
[0124] 6)去上清，在所得菌体中加入预冷的10mL 20mM CaCl2悬浮所得菌 体；
[0125] 7)将悬浮的农杆菌进行4℃5,000rpm离心5min；
[0126] 8)去上清，在所得菌体中加入1mL 20mM CaCl2再次悬浮所得菌体；
[0127] 9)将上述农杆菌菌体悬浮液分装到1.5mL的灭菌离心管中，用液氮对 其进行冷冻处理。将制备成功的农杆菌感受态细胞保存至-80℃超低温冰 箱。
[0128] 10)取制备成功的农杆菌感受态细胞放置于冰上，向其中加入8μL重 组质粒载体；
[0129] 11)将含有重组质粒的农杆菌感受态细胞冰浴30min；
[0130] 12)将上述农杆菌感受态细胞进行液氮处理1min；
[0131] 13)将液氮处理后的感受态细胞放至37℃水浴锅中水浴5min后，立 即放至冰上冰浴2-5min；
[0132] 14)向上述农杆菌感受态细胞中加入500μL YEB液体培养基；
[0133] 15)将上述农杆菌菌液在28℃摇床上200rpm振荡培养3小时；
[0134] 16)将培养好的农杆菌菌液涂平板至添加50mg/L链霉素，50mg/L卡 那霉素的YEB固体培养基上，28℃恒温培养箱中避光倒置培养3天；
[0135] 17)用基因特异性引物对在上述筛选培养基上生长出来的农杆菌单克 隆进行PCR检测，将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统 下分析农杆菌转化阳性克隆，挑取阳性克隆至1mL添加50mg/L链霉素， 50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，在28℃摇床上200rpm避光振荡 培养6h，用30％甘油进行保种。
[0136] 2、采用基因枪轰击洋葱内表皮细胞的方法进行亚细胞定位分析。
[0137] 1)选择尽量新鲜的洋葱，在水中预培养1～2天(待看到有新根长出， 说明状态较好)。在外面去除干表皮和根等后进入超净工作台，用手术刀 剥去外面的2～3较老的磷叶。换干净的平皿和刀片后，将状态较好的第3～5 层的中间部位切成3*3cm左右的方块。内表皮接触MS培养基，培养12h。
[0138] 2)金粉包裹前准备
[0139] 75％酒精处理包裹金粉超净工作台；放入酒精灯，超声仪，涡旋仪，冰 盒，1.5mL EP管，板子(放1.5mL管子)，镊子，20、50、100、200μL 移液枪及枪头，无菌空平皿，垃圾桶，无水乙醇，封口膜等；将经无水乙 醇洗涤后的载样片放到在金属支架上，晾干备用；紫外照射15min；擦拭 基因枪及其超台；将经无水乙醇洗涤后的爆破片和金属网放到在金属支架 上，晾干；紫外照射15min；从-20℃冰箱取出准备金粉，亚精胺和CaCl2 工作液，待其自然融化备用；将质粒稀释到0.2μg/μL(先配现用)，准备 30μL即可。
[0140] 3)金粉包裹
[0141] 使用金粉包裹质粒DNA的步骤如下，所有操作需在超净工作台内完 成：
[0142] (1)取已融化的金粉(40mg/mL 25μL)一管，超声1min，然后涡 旋震荡和超声处理交替进行，每次10s，重复三次，使之完全得到成为金粉 悬浊液；
[0143] (2)吸取25μL的质粒(0.2μg/μL)，加在金粉悬浊液的管壁上，迅 速涡旋5s，使质粒DNA和金粉充分混匀；
[0144] (3)分别吸取20μL的亚精胺(0.1M)和50μL的CaCl2(2.5M)工 作液工作液到金粉DNA溶液EP管的盖内，吸打混匀；
[0145] (4)将EP管水平放置，平移到涡旋仪上方，盖上管盖，迅速直立EP 管并涡旋5s，混合均匀；
[0146] (5)室温静置3～5min；期间准备载样片，铺平；
[0147] (6)13,000rpm，3s；
[0148] (7)弃上清，加入无水乙醇150μL，反复吸打并刮下管壁的金粉，涡 旋10s；
[0149] (8)13,000rpm，3s；
[0150] (9)弃上清，加入70μL无水乙醇，涡旋5s；
[0151] (10)吸取7μL样品打在载样片中央，待其自然铺开(每次都从溶液 的中部吸取样，每次上样前都需涡旋5s)；
[0153] 4)基因枪轰击洋葱表皮
[0154] 将预培养的洋葱翻开，使洋葱内表皮朝上；使用PDS-1000型基因枪轰 击洋葱表皮细胞，轰击压强为1,200psi，爆破片压力为1,100psi。
[0155] 5)检测GFP荧光
[0156] (1)使打枪后的洋葱内表皮接触培养基，黑暗条件下，25℃培养48h；
[0157] (2)撕洋葱内表皮，制作临时装片。
[0158] (3)在荧光倒置显微镜(IX71，Olympus，日本)下观察。用含目的 基因pBI121-BdGF14a-GFP重组质粒载体及pBI121-GFP空载体对照的农杆 菌菌液对烟草叶片下表皮细胞进行瞬时转化后，撕取烟草叶片下表皮利用 荧光倒置显微镜对绿色荧光蛋白的表达情况进行观察。结果如图1所示， 在注射含pBI121-GFP空载体对照农杆菌的烟草叶片中，绿色荧光蛋白在叶 片下表皮细胞膜、细胞质、细胞核内均有表达；注射含目的基因 pBI121-BdGF14a-GFP重组质粒载体农杆菌的烟草叶片中，绿色荧光蛋白在 叶片下表皮细胞膜、细胞质、细胞核均有表达，表明BdGF14a蛋白定位于 细胞核、细胞质、细胞膜中。
[0159] 实施例4：二穗短柄草BdGF14a基因遗传转化烟草
[0160] 1、农杆菌感受态的制备及转化
[0161] 农杆菌细胞感受态的制备及转化实验所有操作步骤均在超净工作台中 进行无菌操作，具体流程如下：
[0162] 1)用微量移液器从-80℃超低温冰箱吸取保种的农杆菌EHA105菌株 菌液10μL至2mL灭菌离心管中，加入1mL含有50mg/L链霉素的YEB 液体培养基，在28℃摇床上用200rpm转速进行过夜培养；
[0163] 2)取1mL上述所得菌液转移至100mL YEB中(内含50mg/L链霉素)， 在28℃摇床200rpm进行扩大培养，用紫外/可见分光光度计测量其OD值 至OD600＝0.4左右；
[0164] 3)将上述农杆菌菌液冰浴30min；
[0165] 4)将冰浴后的农杆菌菌液进行4℃5,000rpm离心5min；
[0166] 5)去上清，在所得菌体中加入预冷的10mL 20mM CaCl2悬浮所得菌 体；
[0167] 6)将悬浮的农杆菌进行4℃5,000rpm离心5min；
[0168] 7)去上清，在所得菌体中加入1mL 20mM CaCl2再次悬浮所得菌体；
[0169] 8)将上述农杆菌菌体悬浮液分装到1.5mL的灭菌离心管中，用液氮对 其进行冷冻处理。将制备成功的农杆菌感受态细胞保存至-80℃超低温冰 箱。
[0170] 9)取制备成功的农杆菌感受态细胞放置于冰上，向其中加入8μL重 组质粒载体；
[0171] 10)将含有重组质粒的农杆菌感受态细胞冰浴30min；
[0172] 11)将上述农杆菌感受态细胞进行液氮处理1min；
[0173] 12)将液氮处理后的感受态细胞放至37℃水浴锅中水浴5min后，立 即放至冰上冰浴2-5min；
[0174] 13)向上述农杆菌感受态细胞中加入500μL YEB液体培养基；
[0175] 14)将上述农杆菌菌液在28℃摇床上200rpm振荡培养3小时；
[0176] 15)将培养好的农杆菌菌液涂平板至添加50mg/L链霉素，50mg/L卡 那霉素的YEB固体培养基上，28℃恒温培养箱中避光倒置培养3天；
[0177] 16)用基因特异性引物对在上述筛选培养基上生长出来的农杆菌单克 隆进行PCR检测，将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统 下分析农杆菌转化阳性克隆，挑取阳性克隆至1mL添加50mg/L链霉素， 50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，在28℃摇床上200rpm振荡培养 6h，进行保种。
[0178] 2、烟草叶片的处理
[0179] 处理烟草叶片所有实验步骤均在超净工作台中进行无菌操作，流程如 下：
[0180] 1)选取长势良好、大而平展的烟草叶片，用75％乙醇消毒表面10s， 无菌超纯水清洗3-5遍；
[0181] 2)用0.1％HgCl2消毒叶片8min，无菌水清洗3-5遍；
[0182] 3)用灭菌滤纸擦干烟草叶片表面，用锋利的手术刀将其切成1×1cm2的小块，放至共培养基平板上28℃暗培养3天，期间及时检查叶片染菌 情况并及时处理。
[0183] 3、农杆菌的活化
[0184] 1)挑取含有目的基因质粒载体的农杆菌平板划线单克隆，加入5-10mL LB液体培养基，在28℃摇床中250rpm振荡培养过夜；
[0185] 2)按1:500-1,000的比例将振荡培养过夜的农杆菌转接至新的LB液 体培养基中(含10mM MES生物缓冲液，20μM乙酰丁香酮，50mg/L卡 那霉素，50mg/L链霉素)，在相同条件下继续培养，直至OD600升至大约 0.4；
[0186] 3)将上述农杆菌菌液进行4℃4,000rpm离心10min，去上清；
[0187] 4)用MS液体培养基(含10mM MES生物缓冲液，150μM乙酰丁香 酮，10mM MgCl2)重悬所得菌体。
[0188] 3、农杆菌侵染烟草叶片
[0189] 1)取出暗培养的烟草叶片放至盛有用MS液体培养基悬浮的农杆菌菌 液的三角瓶中浸染10min，期间不断摇晃，使农杆菌充分接触侵染叶片；
[0190] 2)倒掉农杆菌菌体悬浮液，用灭菌滤纸小心擦干烟草叶片表面残留的 农杆菌菌液；
[0191] 3)在共培养固体培养基上铺一层灭菌滤纸，使滤纸与培养基贴合，将 侵染后的叶片下表皮朝下接触滤纸平铺于培养基上，叶片之间稍留空隙， 进行为期三天的共培养；
[0192] 4)将以上烟草叶片挪至分化平板，进行25℃光照培养。期间不断观 察愈伤生长分化情况，并注意及时清理和转移染菌叶片；
[0193] 5)待经农杆菌侵染的烟草叶片边缘长出愈伤组织，并分化出芽时，用 锋利的手术刀片切下小芽相对粗壮的嫩茎部分，将其插在生根培养基中， 在组织培养间继续进行25℃光照生根培养；
[0194] 6)待生根培养基中的小芽生根且根系生长较为发达后移栽至营养土 中，在人工气候室继续光照培养。
[0195] 4、转基因烟草阳性植株鉴定及转基因株系的获得
[0196] 用液氮对在人工气候室培养的，生长状态良好的转基因烟草幼苗叶片 分别进行取样，用植物总RNA提取试剂盒分别提取所取样本总RNA，用 反转录试剂盒进行反转录合成cDNA作为转基因植株阳性检测的模板。分 别用基因特异性引物及载体上标记基因的引物对各转基因烟草株系cDNA 模板进行PCR检测，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析 系统下鉴定含有目的基因的转基因阳性烟草幼苗并最终分别收获其种子。 将所收取不同转基因株系阳性种子晒干后放至冷库处理两周。从冷库取转 基因阳性不同烟草株系的种子，放入2mL灭菌离心管中，在超净工作台中 分别用75％乙醇消毒其表面30s，10％过氧化氢消毒8min，用无菌超纯水 清洗3～5遍后，用镊子铺至含有100mg/L卡那霉素的MS固体培养基上， 放至组织培养间进行光照培养。观察含有卡那霉素的筛选培养基上转基因 烟草种子的萌发及生长情况。将筛选成功长出真叶的烟草幼苗移栽至营养 土中，在人工气候室继续光照培养直至成熟，仔细收取各转基因株系烟草 种子即T1代种子，晒干后放至冷库处理两周。从冷库取转基因烟草阳性株 系T1代种子，放入2mL灭菌离心管中，在超净工作台中用75％乙醇消毒 表面30s，10％过氧化氢消毒8min，用无菌超纯水清洗3～5遍后，用镊子 铺至含有100mg/L卡那霉素的MS固体培养基上，放至组织培养间进行光 照培养，用液氮对长出的T2代烟草幼苗进行取样，分别提取总RNA并反 转录合成cDNA作为模板，用荧光定量PCR分析目的基因在T2代转基因阳 性烟草中的过表达情况，挑取三个独立的转基因阳性株系进行抗旱性研究 或移栽至营养土中进行抗旱表型的鉴定。
[0197] 用基因特异性引物及卡那霉素、GFP载体标记引物分别对二穗短柄草 BdGF14a转基因株系、空载体对照、野生型烟草模板cDNA进行半定量PCR 检测，共获得3个独立的RNA水平上BdGF14a转基因阳性烟草株系，收 获T2代种子后，挑选株系OE1，OE3，OE31进行后续转基因烟草表型鉴定 分析。半定量PCR结果分析如图2。其中，OE1，OE3，OE31表示选取的 3个独立的BdGF14a转基因烟草株系，WT表示野生型烟草株系，VC表示 转空载体烟草株系，烟草NtGAPDH基因作为内参基因。从图2可得知， BdGF14a基因过表达阳性烟草株系中BdGF14a基因得到了表达，野生型烟 草株系和转空载体烟草株系中BdGF14a基因未表达。
[0198] 实施例5：转基因烟草阳性株系抗旱表型的鉴定
[0199] 转基因烟草抗旱表型分析
[0200] 在超净工作台中消毒T2代不同转基因烟草阳性株系种子及野生型烟草 种子，用镊子铺至含有100mg/L卡那霉素的MS固体培养基上萌发并在组 织培养间光照培养两周后，将长势良好且相似的烟草幼苗移栽至营养土中 ，放至组织培养间培养架上，继续生长三周，挑选长势良好且相似的烟草 幼苗，干旱处理4周或500mM氯化钠处理4周后，观察不同转基因烟草 株系及野生型的生长状况并拍照；对干旱处理4周的转基因烟草株系及野 生型植株进行浇水恢复3周，观察其生长状态并拍照，统计分析存活率。
[0201] 结果如图3(a)、图3(b)和图3(c)所示，正常生长条件下培养4 周的BdGF14a转基因株系与空载体转基因材料和野生型烟草长势良好且相 似，没有显著差异。停止给水4周后，WT和VC出现了明显的叶片皱缩、 卷曲、黄化、衰老甚至死亡现象，而BdGF14a转基因株系生长状况则显著 较好。复水3周后，大部分BdGF14a转基因株系能够恢复正常生长状态； 统计结果也显示三个BdGF14a转基因烟草株系的存活率为40～55％显著高 于WT和VC(16～20％)。500mM氯化钠处理4周后，WT和VC出现了 明显的叶片萎蔫、卷曲甚至死亡等现象；而BdGF14a转基因株系则叶片较 舒展且绿叶数目较多，状态较好。统计分析表明，对照株系的存活率分别 为20％和38％，显著低于BdGF14a转基因株系的60％～85％。
[0202] 干旱和高盐胁迫会造成了叶片因失水而出现叶片皱缩和卷曲，为了进 一步分析胁迫环境下BdGF14a转基因烟草的耐受性表型，我们进行了离体 叶片脱水实验。选择脱水处理24h内的12个时间点测定叶片重量，并计算 其失水率。结果显示，在处理9h内，转基因株系的失水率略低于对照株 系株系，但差异并不明显；9h后WT和VC的失水率显著高于BdGF14a 转基因株系。以上结果表明BdGF14a基因可以通过提高叶片的保水能力增 强转基因烟草叶片对逆境的耐受性。
[0203] 实施例6：转基因烟草阳性株系抗旱、抗盐机制分析
[0204] 1、气孔实验
[0205] 分别取正常生长条件下长势良好、叶片平展、大小相似的二穗短柄草 BdGF14a转基因株系及野生型烟草叶片浸没于气孔张开缓冲液(含50μM CaCl2，30mM KCl，10mM MES-Tris，氢氧化钾调pH至6.15)中，26℃ ，光照培养4～6h(注意避风)。撕烟草叶片下表皮，制临时观察玻片，在 荧光倒置显微镜下观察。待气孔完全张开后，分别在其缓冲液中加入200 mM氯化钠(处理30min)和50μM ABA(处理1h)，以及自然条件下脱 水处理(40min)。制临时观察玻片，在显微镜下观察叶片在氯化钠、干旱 和ABA处理后的气孔开度情况并拍照(注意：叶片大小、老幼等状态及温 度、光照等环境都会影响气孔闭合的速度，故处理期间要跟踪观察，以免 错过时机)。最后测量气孔的长度和宽度，按照气孔开度＝气孔宽度/气孔长 度计算统计结果结果如图4所示。正常条件下生长的烟草叶片经预处理后 ，转基因材料和对照株系的气孔都完全打开，开度情况无显著差异。气孔 充分打开的叶片在脱水处理40min和200mM氯化钠处理30min后， BdGF14a转基因材料的气孔都已闭合或即将闭合；而WT和VC的气孔开 度虽然比处理前略小，但是大部分气孔仍然处于张开状态。统计结果也显 示，脱水和氯化钠处理后，BdGF14a转基因株系的气孔开度明显比对照株 系更小。以上结果表明BdGF14a转基因烟草可能通过加快气孔闭合来减少 水分的散失从而提高对干旱和高盐胁迫的耐受性。
[0206] ABA在植物响应非生物逆境胁迫中发挥重要作用，并且是调节植物的 气孔闭合和生长发育的重要植物激素。为了进一步探究BdGF14a转基因烟 草的气孔是否也受到ABA的调节，我们开展了50μM ABA处理下的气孔 实验。结果如图4所示，BdGF14a转基因材料的气孔几乎都已闭合；而大 部分对照株系的气孔仍是张开状态。统计结果也显示，ABA处理后，对照 株系的气孔开度明显比BdGF14a转基因株系更大。以上结果表明BdGF14a 参与了ABA介导的气孔闭合并且增加了转基因烟草对ABA的敏感性。
[0207] 2、转基因烟草根长实验
[0208] 为了进一步确认BdGF14a转基因烟草在干旱和高盐胁迫下的耐受性表型， 我们对进行了幼苗的根长分析实验。在超净工作台中消毒T2代不同转基因 烟草阳性株系种子及野生型烟草种子，用镊子铺至含有100mg/L卡那霉素 的MS固体培养基上萌发并在组织培养间光照培养2周后，将长势良好且 相似的烟草幼苗转移至分别含有10μM ABA，150mM甘露醇，100mM氯 化钠和甘露醇/氯化钠+0.1mM钨酸钠的MS固体培养基及MS固体培养基 上继续生长2周。观察野生型、空载体对照及不同过表达株系烟草幼苗根 长生长情况，测量并分析数据。结果如图5所示，在MS培养基上WT、 VC和转基因株系间没有显著差异。在含有100mM氯化钠、150mM甘露 醇的培养基上VC和WT较转基因株系的根长更短；统计结果也显示转基 因株系的主根显著较对照株系长。外源ABA处理下的根长分析结果表明 BdGF14a转基因株系的根长显著比VC和WT对照株系短。另外，在同时 添加ABA合成抑制剂Tu的NaCl和甘露醇处理下，BdGF14a转基因株系 的主根伸长表型受到抑制，转基因株系和对照株系之间的没有显著差异。 以上结果说明，与成苗期的抗旱、抗盐表型一致，在幼苗期BdGF14a也能 够增强转基因烟草对干旱和盐胁迫的耐受性；并且BdGF14a提高了转基因 烟草对ABA的敏感性，参与了ABA介导的气孔关闭；BdGF14a增强转基 因烟草对非生物逆境胁迫的耐受性依赖与内源ABA的积累。
[0209] 3、转基因烟草生理指标的测定
[0210] 为研究TaGF14b转基因烟草对干旱和盐耐受性的机理，我们测定了相 关生理指标包括离子渗漏(Ion leakage)、丙二醛(MDA)含量、可溶性 糖(Sugar)含量、脯氨酸(Proline)含量、过氧化氢含量和抗氧化酶活力。 在超净工作台中消毒T2代转基因烟草阳性种子及野生型烟草种子，用镊子 铺至含有100mg/L卡那霉素的MS固体培养上萌发并在组织培养间培养两 周后，将长势良好且相似的烟草幼苗移栽至营养土中，组织培养间继续生 长三周，挑选长势良好且相似的烟草幼苗，干旱处理15天左右，分别取干 旱处理下及正常生长条件下转基因烟草及野生型烟草叶片测定各项生理指 标。
[0211] (1)丙二醛(MDA)含量的测定
[0212] 使用丙二醛含量测定试剂盒测定。氧自由基作用于脂质的不饱和脂肪 酸，生成过氧化脂质；过氧化脂质逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中 包括MDA。通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平。MDA与硫 代巴比妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)缩合，生成红色产物，在532nm 有最大吸收峰，进行比色后可估测样品中过氧化脂质的含量；同时测定600 nm下的吸光度，利用532nm与600nm下的吸光度的差值计算MDA的含 量。
[0213] (2)相对水含量(Relative water content，RWC)的测定
[0214] 分别剪取干旱处理15天及正常生长条件下的BdGF14a基因过表达株 系及野生型、空载体对照烟草叶片，用分析天平称重并记录其鲜重(FW)， 然后将各叶片分别放入含有超纯水的干净培养皿中，做好标记，使之完全 浸泡在水中，浸泡6h后，用滤纸轻轻擦干并称重(TW)，再将叶片彻底 烘干48h后取出称重(DW)。RWC(％)＝[(FW-DW)/(TW-DW)]×100。 通过计算可得干旱处理下及正常生长条件下二穗短柄草BdGF14a基因过表 达株系及野生型、空载体对照间烟草叶片相对水含量差异。
[0215] (3)离子渗漏(Ion leakage，IL)测定
[0216] 根据Hu等人的方法测定离子渗漏。步骤如下：分别剪取干旱处理下及 正常生长条件下BdGF14a基因过表达株系及野生型、空载体对照烟草叶片 0.3g左右，将叶片剪成宽约0.5cm的条状。将各基因型叶片分别放入装有 10mL灭菌超纯水的15mL离心管中，使超纯水完全浸没叶片，室温静置 过夜。用电导率测定仪测定初始电导率C1；随后将各离心管样品放入100℃ 水浴锅中进行沸水浴30min，冷却至室温后分别测定其电导率，记为C2。 其中，用灭菌超纯水调零。离子渗漏计算公式为：IL(％)＝C1/C2×100。
[0217] (4)H2O2含量的测定
[0218] 使用过氧化氢(H2O2)含量测定试剂盒测量。过氧化氢(H2O2)可以 与钼酸作用生成一种络合物，在405nm处测定其生成量可计算出H2O2的 量。
[0219] (5)超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
[0220] 使用总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性测定试剂盒测量。超氧化物歧 化酶(SOD)对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清 除超氧阴离子自由基(O2-·)保护细胞免受损伤。通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化 酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O2-·)，超氧阴离子自由基(O2-·)氧 化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计 测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的 抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管 的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。
[0221] (6)过氧化物酶(POD)活力测定
[0222] 使用过氧化物酶(POD)活性测定试剂盒测量。利用过氧化物酶(POD) 催化过氧化氢反应的原理，通过测定420nm处吸光度的变化得出其酶活性。 具体实验步骤参见说明书。
[0223] (7)过氧化氢酶(CAT)活力测定
[0224] 使用过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒测量。过氧化氢酶(CAT)分解过 氧化氢的反应可通过加入钼酸铵而迅速终止，剩余的过氧化氢与钼酸铵作 用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其变化量，可计算出CAT 的活力。
[0225] (8)羟自由基清除能力(D)测定
[0226] 使用羟自由基清除能力测定试剂盒(分光光度法)测量。H2O2/Fe2+通 过Fenton反2+ 2+ 3+
应产生羟自由基，将邻二氮菲-Fe 水溶液中Fe 氧化为Fe ， 导致536nm吸光度下降，样品对536nm吸光度下降速率的抑制程度，反映 了样品清除羟自由基的能力。
应产生羟自由基，将邻二氮菲-Fe 水溶液中Fe 氧化为Fe ， 导致536nm吸光度下降，样品对536nm吸光度下降速率的抑制程度，反映 了样品清除羟自由基的能力。
[0227] (9)总抗氧化能力的测定
[0228] 使用总抗氧化能力测定试剂盒测定，测定对象中各种抗氧化物质和抗 氧化酶等构成总抗氧化水平。在酸性环境下，物质还原三价铁离子-三吡啶 三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的二价铁离子-三吡啶三吖嗪(Fe2+-TPTZ) 的能力反映了其总抗氧化能力。
[0229] (10)DAB和NBT染色实验
[0230] 为了检测植物体内ROS的积累情况，我们采用了3,3,二氨基联苯胺(DAB)和硝基四氮唑蓝(NBT)染色的方法，分别检测叶片中H2O2和 O2-的含量。在蛭石中培养4周大的烟草进行脱水处理1周或500mM氯化 钠处理3周后，取叶片进行染色；1/2MS培养基上生长2周大的幼苗在300 mM甘露醇和200mM氯化钠溶液中处理2天后进行DAB和NBT染色。 实验步骤参照Li和Hu等，略有改进。用无水乙醇：冰乙酸：甘油＝3：1： 1的体积比配制的脱色液，沸水浴，脱色20min。
[0231] 结果如图6所示，在没有处理的对照组中，WT、VC和转基因材料之 间并没有显著差异。离子渗漏和丙二醛是ROS引起的膜氧化损伤的两个生 理参数。在干旱处理下，BdGF14a转基因株系中比对照株系更低的离子渗 漏、丙二醛和脯氨酸含量以及更多的可溶性糖。在盐处理下，BdGF14a转 基因株系中的离子渗漏和丙二醛含量比对照株系更低，可溶性糖和脯氨酸 含量更高。这些生理结果表明，干旱和盐逆境胁迫下，BdGF14a转基因植 物减少了膜脂的过氧化损伤并积累了胁迫相关的渗透调节物质。
[0232] 环境胁迫诱导的ROS过量积累会引起细胞损伤，激活抗氧化系统是植 物清除体内多余ROS，调节ROS平衡的有效手段。因此我们检测了ROS 清除系统的几种代表性酶的活力。结果如图7所示，正常培养条件下，除 了POD外，三个转基因株系和对照株系之间没有显著差异。在干旱和盐处 理下，相对于WT和VC对照株系，BdGF14a转基因烟草有更少的H2O2含 量，显著更高的CAT、SOD、POD(盐处理)，和更强的D和T-AOC。此 外，NBT和DAB组织化学染色实验结果也显示：无论是幼苗期还是成苗期 烟草，正常培养的对照组WT、VC和转基因幼苗染色相对较浅且没有显著 差异；甘露醇和氯化钠处理后，VC和WT染色比BdGF14a转基因幼苗更 深。这一结果表明，干旱和盐胁迫下BdGF14a转基因植物积累的H2O2和 O2-更少(图8)。
以上结果表明BdGF14a增强了转基因烟草的抗氧化能力； BdGF14a能够通过增强CAT，SOD，POD，D和T-AOC的活力来提高ROS 清除能力，减少H2O2积累，响应干旱和盐胁迫。
以上结果表明BdGF14a增强了转基因烟草的抗氧化能力； BdGF14a能够通过增强CAT，SOD，POD，D和T-AOC的活力来提高ROS 清除能力，减少H2O2积累，响应干旱和盐胁迫。
[0233] 4、过表达烟草株系胁迫相关基因的表达分析
[0234] 为研究进一步研究BdGF14a转基因烟草提高对干旱和盐胁迫耐受性的 分子机制，我们对胁迫相关基因进行了荧光定量PCR分析。在超净工作台 中消毒T2代BdGF14a基因不同过表达株系及野生型、空载体对照烟草种子 ，用镊子铺至含有100mg/L卡那霉素的MS固体培养上萌发并放至组织培 养间组培架上光照培养两周后，将长势良好且相似的烟草幼苗转移至含有 300mM甘露醇的MS固体培养基及MS固体培养基上，继续光照培养一周 。将继续生长一周的各转基因株系及野生型烟草幼苗分别用液氮进行整株 取样，用植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，用cDNA第一链合成反转 录试剂盒反转录所提RNA，合成cDNA，作为模板进行荧光定量PCR分析 。具体分析以下基因的调控情况：NtGAPDH基因、NtERD10D基因、 NtERD10C基因、NtLEA5基因、NtNCED1基因、NtNABF2基因、ToLTP1 基因、NtLTP1基因、NtDREB3基因、NtPOX2基因、NtSOD基因、NtCAT1 基因、NtAPX基因、NtGST基因、NtRbohD基因、NtRbohF基因、NtP5CS1 基因、NtADC1基因、NtSAMDC基因、NtSUS1基因和NtSPSA基因。
[0235] 结果如图9所示，ABA信号通路相关基因，包括NtABF2(ABA信号 通路转录调节关键基因)，NtNCED1(ABA合成关键基因)及六个ABA 诱导的调节蛋白基因(NtLEA5，NtDREB3，NtLTP1，NtTobLTP1，NtERD10C 和NtERD10D)在正常条件下，除了NtNCED1和NtLTP1外在BdGF14a转 基因株系中的表达水平都显著低于WT对照；在干旱和盐处理下，除了 NtLEA5外，所有检测的基因在BdGF14a转基因烟草中的表达显著高于对 照株系。BdGF14a转基因烟草中NtLEA5的表达在盐处理下高于WT，在干 旱胁迫下则低于WT株系。这一结果表明BdGF14a转基因烟草提高对干旱 和盐胁迫耐受性与ABA信号通路有关。
[0236] 此外，正常培养条件下ROS相关基因在转基因株系中的表达水平普遍 低于WT对照(NtSOD没有显著差异)。在干旱和盐处理下NtCAT，NtSOD， NtPOX2和NtAPX在BdGF14a转基因烟草中的表达水平都显著高于WT对 照；而NtGST，NtRBOHD和NtRBOH在干旱或者盐处理下的表达水平都高 于WT对照(图10)。其他胁迫相关基因(NtADC1，NtSAMDC，NtP5CS1， NtSUS1和NtSPSA)在BdGF14a转基因烟草中都上调表达(图11)。5、ABA 合成抑制剂处理下转基因烟草胁迫相关基因的表达分析。
[0237] 本研究发现BdGF14a能够加快ABA-介导的气孔闭合，增强了转基因 烟草对外援ABA的敏感性，并且BdGF14a转基因烟草在NaCl和甘露醇 处理下的根长伸长能够被Tu(ABA合成抑制剂)抑制，ABA信号通路相 关基因表达上调。因此我们推测，BdGF14a增强转基因烟草植株对干旱和 盐胁迫的耐受性可能与ABA信号通路相关。为了进一步的验证TaGF14b 转基因烟草对干旱和盐胁迫的耐受性与ABA相关基因的表达分析。实验结 果如图10、11所示，胁迫处理下ROS和胁迫响应相关基因的显著上调表 达，在同时添加有钨酸钠的干旱或/和盐处理下，受到不同程度的抑制。以 上结果说明BdGF14a通过调节胁迫相关基因的表达来增强对非生物逆境的 耐受性，并且这种调节与内源ABA的积累相关。
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