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从二生物生产丁醇的设计者生物体

阅读:1026发布:2020-08-09

专利汇可以提供从二生物生产丁醇的设计者生物体专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供一种基于设计者转基因 植物 、设计者藻类、设计者蓝绿藻(蓝藻(cyanobacteria)和原绿球藻(oxychlorobacteria))或设计者植物细胞的 生物 安全防护型光生物丁醇生产技术。产生设计者光合生物体以便驯化内源光生物调控机制,且从光合过程获得的还原 力 (NADPH)和 能量 (ATP)是用于从二 氧 化 碳 (CO2)和 水 (H2O)直接合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)。本发明的丁醇生产方法通过避免 生物质 技术的 瓶颈 问题完全消除了顽抗性木质 纤维 素的问题。预期本发明的光生物丁醇生产技术具有比当前技术高得多的 太阳能 至丁醇 能源 转换效率,并且也可帮助保护地球环境,避免大气中CO2的危险积聚。,下面是从二生物生产丁醇的设计者生物体专利的具体信息内容。

1.一种光合生产丁醇的方法,其包括:使转基因设计者植物或植物细胞在液体培养基中生长,其中所述植物或植物细胞是经基因工程改造以表达一组酶,所述酶作用于卡尔文循环的中间产物并将所述中间产物转化为丁醇;和从所述液体培养基回收丁醇。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述植物是生植物。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述水生植物选自由以下组成的组:水
下 水 草 (submersed aquatic herbs)( 黑 藻 (Hydrilla verticillata)、水 蕴 草(Elodeadensa)、杉叶藻(Hippuris vulgaris)、气泡草(Aponogeton Boivinianus)、硬叶浪草(Aponogeton Rigidifolius)、大卷浪草(Aponogeton Longiplumulosus)、顿草(Didiplis Diandra)、新加坡莫丝(Vesicularia Dubyana)、小柳(Hygrophilia Augustifolia)、珍珠金线(Micranthemum Umbrosum)、大克草(Eichhornia Azurea)、美洲三白草(Saururus Cernuus)、舌头椒草(Cryptocoryne Lingua)、北极杉百叶草(Hydrotriche Hottoniiflora EustralisStellata)、红 苦 草 (Vallisneria Rubra)、柳叶水蓑衣(Hygrophila Salicifolia)、泰国水剑(Cyperus Helferi)、培茜椒草(Cryptocoryne Petchii)、美洲苦草(Vallisneria americana)、托塔苦草(Vallisneria Torta)、北极杉(HydrotricheHottoniiflora)、黑乐草(Crassula Helmsii)、石龙尾(Limnophila Sessiliflora)、穿叶眼子菜(Potamogeton Perfoliatus)、红松尾(Rotala Wallichii)、贝克椒草(Cryptocoryne Becketii)、无尾水筛(Blyxa Aubertii)、水罗兰(HygrophilaDifformmis))、浮萍(duckweeds)(紫萍(Spirodela polyrrhiza)、无根萍(Wolffiaglobosa)、品藻(Lemna trisulca)、卵叶青萍(Lemna gibba)、青萍(Lemnaminor)、紫 萍(Landoltia punctata))、水 芙 蓉(water cabbage/Pistia stratiotes)、毛 茛(buttercups/Ranunculus)、菱(water caltrop)(四角菱(Trapa natans)和乌菱(Trapa bicornis))、睡莲(water lily)(齿叶睡莲(Nymphaea lotus)、睡莲科(Nymphaeaceae)和 莲 科 (Nelumbonaceae))、水 葫 芦 (waterhyacinth/Eichhornia crassipe)、黑木蕨 (Bolbitis heudelotii)、水 盾 草(Cabombasp.)、海 藻(seagrasses)(小 竹 叶(Heteranthera Zosterifolia)、波喜荡草科(Posidoniaceae)、大叶藻科(Zosteraceae)、水鳖科(Hydrocharitaceae)和丝粉藻科(Cymodoceaceae))和藻类。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述藻类选自由以下组成的组:绿藻、红藻、褐藻、蓝绿藻(生光细菌(oxyphotobacteria),包括蓝藻(cyanobacteria)和原绿球藻(oxychlorobacteria))、藻、海洋藻、淡水藻、耐冷藻株、耐热藻株、天线色素缺陷型突变株、耐丁醇藻株和其组合。
5.根据权利要求3所述的方法,其中所述藻类选自由以下组成的组:莱茵衣藻
(Chlamydomonas reinhardtii)、亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、小球藻(Chlorella fusca)、耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)、寻常小球藻(Chlorella vulgaris)、椭圆小球藻(′Chlorella′ellipsoidea)、小球藻(Chlorellaspp.)、杜氏盐藻(Dunaliella salina)、韦氏杜氏藻(Dunaliella viridis)、巴氏杜氏藻(Dunaliella bardowil)、雨生血球藻(Haematococcus pluvialis)、Parachlorella kessleri、琼枝(Betaphycus gelatinum)、皱波角叉菜(Chondruscrispus)、原始红藻(Cyanidioschyzon merolae)、Cyanidium caldarium、Galdieriasulphuraria、匐 枝 凝 花 菜 (Gelidiella acerosa)、张氏江蓠(Gracilaria changii)、长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)、Porphyra miniata、Ostreococcus tauri、条斑紫菜(Porphyra yezoensis)、紫球藻(Porphyridium sp.)、掌状红皮藻(Palmaria palmata)、江蓠(Gracilaria spp.)、球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、卡帕藻(Kappaphycus spp.)、海带(Laminaria japonica)、海带(Laminaria spp.)、礁膜(Monostroma spp.)、微拟球藻(Nannochloropsisoculata)、紫菜(Porphyra spp.)、紫球藻(Porphyridium spp.)、裙带菜(Undariapinnatifida)、石莼(Ulva lactuca)、石莼(Ulva spp.)、裙带菜(Undaria spp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum Tricornutum)、舟形藻(Navicula saprophila)、寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)、隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)、纤细眼虫(Euglena gracilis)、前沟藻(Amphidinium sp.)、单细胞双鞭毛藻(Symbiodinium microadriaticum)、巨 藻 (Macrocystis pyrifera)、布 朗 纤 维 藻 (Ankistrodesmus braunii)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)和其组合。
6.根据权利要求4所述的方法,其中所述藻类是莱茵衣藻。
7.根据权利要求4所述的方法,其中所述藻类选自由单细胞藻类、多细胞藻类和海藻组成的组。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述海藻选自由以下组成的组:青海苔(Ulva latissima)(海白菜(sea lettuce))、褐藻(Ascophyllum nodosum)、刺松藻(Codium fragile)、墨角藻(Fucus vesiculosus)、细齿麒麟菜(Eucheumadenticulatum)、细江蓠(Gracilaria gracilis)、水 网 藻(Hydrodictyonreticulatum)、海 带 (Laminaria japonica)、裙带菜(Undaria pinntifida)、昆布(Saccharina japonica)、条斑紫菜(Porphyra yezoensis)和紫菜(Porphyratenera)。
9.根据权利要求4所述的方法,其中所述蓝绿藻(生氧光细菌,包括蓝藻和原绿球藻)选自由以下组成的组:细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)BP-1、发菜(Nostoc sp.)PCC 7120、细长聚球藻(Synechococcuselongatus)PCC 6301、聚球藻(Syncechococcus sp.)PCC 7942株、聚球藻PCC7002株、集胞藻(Syncechocystis sp.)PCC
6803株、海洋原绿球藻(Prochlorococcus marinus)MED4、海洋原绿球藻MIT 9313、海洋原绿球藻NATL1A、原绿球藻(Prochlorococcus)SS120、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)(钝顶节旋藻(Arthrospira platensis))、太平洋螺旋藻(Spirulina pacifica)、巨大鞘丝藻(Lyngbya majuscule)、鱼腥藻(Anabaena sp.)、集胞藻(Synechocystis sp.)、细长聚球藻(Synechococcus elongates)、聚球藻(MC-A)、束毛藻(Trichodesmium sp.)、胞内植生藻(Richelia intracellularis)、聚球藻WH7803、聚球藻WH8102、念珠藻(Nostoc punctiforme)、聚球藻PCC 7943株、集胞藻(Synechocyitis)PCC 6714藻蓝蛋白缺陷型突变株PD-1、蓝杆菌(Cyanothece)51142株、蓝杆菌CCY0110、丰裕颤藻(Oscillatoria limosa)、巨大鞘丝藻(Lyngbya majuscula)、藓生束藻(Symploca muscorum)、无类囊体蓝藻(Gloeobacter violaceus)、原绿藻(Prochloron didemni)、荷兰原绿丝蓝细菌(Prochlorothrix hollandica)、聚球藻(MC-A)、束毛藻、胞内植生藻、海洋原绿球藻、原绿球藻SS120、聚球藻WH8102、巨大鞘丝藻、藓生束藻、Synechococcus bigranulatus、嗜冷颤藻(cryophilic Oscillatoria sp.)、席藻(Phormidium sp.)、发菜-1、墙壁眉藻(Calothrix parietina)、嗜热Synechococcus bigranulatus、灰蓝聚球藻(Synechococcus lividus)、嗜热层理鞭枝藻(Mastigocladus laminosus)、佛氏拟绿胶蓝细菌(Chlorogloeopsisfritschii)PCC 6912、瓦氏聚球藻(Synechococcus vulcanus)、聚球藻MA4株、聚球藻MA19株和细长嗜热聚球藻。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述植物细胞是水生植物组织或细胞培养物。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述植物细胞是非水生植物组织或细胞培养物。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述非水生植物组织或细胞培养物选自由以下组成的组:木苹果(Feronia limonia)的幼苗组织培养物、玉米植物(Zeamays)的叶绿素愈伤组织培养物、菊科(Asteraceae)和茄科(Solanaceae)物种的绿色根培养物、甘蔗茎杆薄壁组织的组织培养物、小立碗藓(Physcomitrella patens)的组织培养物、大豆植物(Glycine max)的光合细胞悬浮培养物、绿色普通烟草(Nicotiana tabacum L.)细胞的光自养和光混合营养培养物、针晶粟草(Gisekia pharnaceoides)(C4植物)的细胞悬浮培养物,和鲍威尔苋(Amaranthus powellii Wats.)、毛曼陀罗(Datura innoxiaMill.)、陆地(Gossypium hirsutum L.)和普通烟草(Nicotiana tabacum)x心叶烟(Nicotiana glutinosa L.)融合杂交体的光合悬浮培养细胞系。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述一组酶是由磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、+
酸激酶、丙酮酸-氧还蛋白氧化还原酶(或丙酮酸-NADP 氧化还原酶)、硫解酶、
3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁脱氢酶、丁醇脱氢酶和其组合组成。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶可利用NADPH,或NADPH和NADH。
15.根据权利要求1所述的方法,其中所述一组酶是由甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶(或+
丙酮酸-NADP 氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和其组合组成。
16.根据权利要求1所述的方法,其中所述一组酶是由醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮+
酸-NADP 氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和其组合组成。
17.根据权利要求1所述的方法,其中所述一组酶是由磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸+
激酶、丙酮酸-NADP 氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和其组合组成。
18.根据权利要求1所述的方法,其中所述一组酶是由淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮+
酸-NADP 氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和其组合组成。
19.根据权利要求1所述的方法,其中所述一组酶是经基因工程改造以插入宿主光合生物体的叶绿体中。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述一组酶插入所述叶绿体中是由基质信号肽引导。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述信号肽选自由以下组成的组:氢化酶转运肽序列(HydA1和HydA2)、铁氧还蛋白转运肽序列(Frx1)、硫氧还蛋白m转运肽序列(Trx2)、谷酰胺合成酶转运肽序列(Gs2)、LhcII转运肽序列、PSII-T转运肽序列(PsbT)、PSII-S转运肽序列(PsbS)、PSII-W转运肽序列(PsbW)、CF0CF1亚基-γ转运肽序列(AtpC)、CF0CF1亚基-δ转运肽序列(AtpD)、CF0CF1亚基-II转运肽序列(AtpG)、光系统I(PSI)转运肽序列、Rubisco SSU转运肽序列和其组合。
22.根据权利要求20所述的方法,其中所述信号肽是选自由以下组成的组的蛋白质的转运肽序列:Hyd1转运肽(序列:msalvlkpca avsirgsscr arqvapraplaastvrvala tleaparrlg nvacaa,SEQ ID NO:54)、RbcS2转运肽(maaviakssvsaavarpars svrpmaalkp avkaapvaap aqanq,SEQ ID NO:55)、铁氧还蛋白转运肽(mamamrs,SEQ ID NO:56)、和CF0CF1亚基-δ转运肽(mlaaksiagp rafkasavraapkagrrtvv vma,SEQ ID NO:57)和其组合。
23.根据权利要求1所述的方法,其中所述酶的表达由诱导型启动子控制。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述启动子可由厌氧生活诱导。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述启动子是氢化酶启动子。
26.根据权利要求23所述的方法,其中所述启动子可通过操纵设计者生物体培养基中的硝酸盐相对于铵的浓度来诱导。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述启动子是硝酸还原酶启动子。
28.根据权利要求1所述的方法,其中所述植物或植物细胞是经基因工程改造以便还含有编码至少一种促进NADPH/NADH转化以增强丁醇光生物生产的酶的DNA构建体。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述酶是NADPH磷酸酶或NAD激酶或其组合。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述酶的表达是由诱导型启动子控制,且在表达后,所述酶插入叶绿体的基质区域。
+
31.根据权利要求28所述的方法,其中所述酶是NAD 依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
32.根据权利要求31所述的方法,其中所述NADPH/NADH转化是通过两步机制实现:
i)使用卡尔文循环的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的步骤,其利用NADPH将1,3-二磷酸甘油酸还原为甘油醛-3-磷酸;和
+
ii)使用所述NAD 依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶的步骤,其在将甘油醛-3-磷酸氧化为1,3-二磷酸甘油酸中产生NADH。
33.根据权利要求1所述的方法,其中所述植物或植物细胞经基因工程改造以还使淀粉合成活性失活。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述淀粉合成活性失活包括抑制淀粉合成酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶、磷酸葡萄糖异构酶或磷酸葡萄糖变位酶的表达或活性。
35.根据权利要求34所述的方法,其中所述失活包括引入DNA构建体,其编码和诱导性地表达干扰iRNA分子。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述iRNA分子选自由淀粉合成酶iRNA、葡萄糖-1-磷酸-腺苷酰转移酶iRNA、磷酸葡萄糖异构酶iRNA、磷酸葡萄糖变位酶iRNA和其组合组成的组。
37.根据权利要求1所述的方法,其中所述植物或植物细胞经基因工程改造以诱导性地表达另一组设计者酶,其促进叶绿体基质区域中的淀粉降解和糖酵解。
38.根据权利要求37所述的方法,其中所述另一组设计者酶包括淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶和其组合。
39.一种核酸构建体,其从5’到3’包含诱导型启动子、编码基质信号肽的核苷酸序列和编码光合丁醇生产途径酶的核苷酸序列。
40.根据权利要求39所述的构建体,其中所述酶选自由以下组成的组:磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯+
醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-NADP 氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和其组合。
41.一种核酸构建体,其从5’到3’包含诱导型启动子、编码基质信号肽的核苷酸序列和编码至少一种促进NADPH/NADH转化的酶的核苷酸序列。
+
42.根据权利要求41所述的构建体,其中所述酶是NADPH磷酸酶或NAD激酶或NAD 依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其组合。
43.一种核酸构建体,其从5’到3’包含诱导型启动子和编码抑制淀粉合成酶表达的干扰RNA分子的核苷酸序列。
44.根据权利要求43所述的构建体,其中所述淀粉合成酶选自由淀粉合成酶、葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)腺苷酰转移酶、磷酸葡萄糖变位酶和磷酸己糖异构酶组成的组。
45.一种核酸构建体,其从5’到3’包含诱导型启动子、编码基质信号肽的核苷酸序列和编码促进淀粉降解和糖酵解的酶的核苷酸序列。
46.根据权利要求45所述的构建体,其中所述酶选自由以下组成的组:淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶和其组合。
47.根据权利要求39、41、43或45中任一项权利要求所述的构建体,其中所述启动子选自由以下组成的组:氢化酶启动子[HydA1(Hyd1)和HydA2,登记号:AJ308413、AF289201、AY090770]、Cyc6基因启动子、Cpx1基因启动子、热休克蛋白启动子HSP70A、CabII-1基因(登记号M24072)启动子、Ca1基因(登记号P20507)启动子、Ca2基因(登记号P24258)启动子、硝酸还原酶(Nia1)启动子、亚硝酸还原酶基因(nirA)启动子、双向氢化酶基因hox启动子、光反应性和热反应性groE启动子、Rubisco操纵子rbcL启动子、金属(锌)诱导型smt启动子、铁反应性idiA启动子、氧化还原反应性crhR启动子、热休克基因hsp16.6启动子、小分子热休克蛋白(Hsp)启动子、CO2反应性酸酐酶基因启动子、绿光/红光反应性cpcB2A2启动子、UV光反应性lexA、recA和ruvB启动子、硝酸还原酶基因(narB)启动子和其组合。
48.根据权利要求39、41、43或45中任一项权利要求所述的构建体,其中所述信号肽是选自由以下组成的组的蛋白质的转运肽序列:氢化酶载脂蛋白、铁氧还蛋白载脂蛋白(Frx1)、硫氧还蛋白m载脂蛋白(Trx2)、谷氨酰胺合成酶载脂蛋白(Gs2)、LhcII载脂蛋白、PSII-T载脂蛋白(PsbT)、PSII-S载脂蛋白(PsbS)、PSII-W载脂蛋白(PsbW)、CF0CF1亚基-γ载脂蛋白(AtpC)、CF0CF1亚基-δ载脂蛋白(AtpD)、CF0CF1亚基-II载脂蛋白(AtpG)、光系统I(PSI)载脂蛋白、Rubisco SSU载脂蛋白和其组合。
49.一种可用于光合生产丁醇的转基因植物或植物细胞,其包含根据权利要求39、41、
43或45中任一项权利要求所述的核酸构建体。
50.一种可用于光合生产丁醇的转基因植物或植物细胞,其经基因工程改造以在叶绿体中诱导性地表达磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还+
原酶(或丙酮酸-NADP 氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶。
51.根据权利要求50所述的转基因植物或植物细胞,其还在叶绿体中诱导性地表达甘油醛-3-磷酸脱氢酶和磷酸甘油酸激酶。
52.根据权利要求51所述的转基因植物或植物细胞,其还在叶绿体中诱导性地表达醛缩酶和磷酸丙糖异构酶。
53.根据权利要求52所述的转基因植物或植物细胞,其还在叶绿体中诱导性地表达磷酸果糖激酶。
54.根据权利要求53所述的转基因植物或植物细胞,其还在叶绿体中诱导性地表达淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶。
55.根据权利要求49-54中任一项权利要求所述的转基因植物或植物细胞,其还在叶绿体中诱导性地表达以下至少一种:NADPH磷酸酶;NAD激酶;抑制磷酸葡萄糖异构酶(G-P-异构酶)或磷酸葡萄糖变位酶表达的干扰RNA分子;或促进淀粉降解和糖酵解的由以下组成的一组酶的一部分或全部:淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶和其组合。
56.根据权利要求49-55中任一项权利要求所述的转基因植物,其中所述植物是藻类。
57.根据权利要求49-55中任一项权利要求所述的转基因植物,其中所述设计者丁醇生产途径酶不仅在叶绿体中,而且也在细胞质中表达和分布。
58.根据权利要求57所述的转基因植物,其中所述设计者丁醇生产途径酶在细胞质中的所述表达通过在丁醇生产途径基因设计中省略叶绿体靶向序列实现。
59.根据权利要求49-55中任一项权利要求所述的转基因植物,其中所述植物是蓝绿藻(蓝藻或原绿球藻)。
60.根据权利要求59所述的转基因植物,其中所述设计者丁醇生产途径酶通过在丁醇生产途径基因设计中省略叶绿体靶向序列而全部在细胞质中表达。
61.一种光合生产丁醇的方法,所述方法包括以下步骤:
a)使转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞在包含水的液体培养基中生长,其中所述转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞包含用于至少一种设计者丁醇生产途径的至少一种外源转基因;
b)诱导所述转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞以产生被诱导转基因生物体,其使所述至少一种转基因被激活以赋予至少一种设计者丁醇生产途径;和
c)提供二氧化碳和光能,借此被诱导的转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞将二氧化碳、水和光能转化为某些中间产物,最终转化为丁醇和氧。
62.根据权利要求61所述的方法,其中所述转基因设计者生物体使用CO2作为主要碳源进行光自养生长。
63.根据权利要求61所述的方法,其中转基因设计者生物体使用选自由以下组成的组的有机底物进行光异养或光混合营养生长:蔗糖、葡萄糖、乙酸盐、丁醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙酮、淀粉、半纤维素、纤维素、脂质、蛋白质、有机酸生物质材料和其组合。
64.根据权利要求61所述的方法,其中步骤a)中具有氢化酶启动子控制型设计者基因的设计者生物体的生长是在有氧环境下进行。
65.根据权利要求61所述的方法,其中步骤a)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计者基因的设计者生物体的生长是在有氧环境下在铵而不是硝酸盐形式的氮肥存在下进行。
66.根据权利要求61所述的方法,其中步骤a)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计者基因的设计者生物体的生长是在厌氧环境下在铵而不是硝酸盐形式的氮肥存在下进行。
67.根据权利要求61所述的方法,其中步骤b)中具有氢化酶启动子控制型设计者基因的设计者生物体的诱导是在无O2的厌氧环境下进行。
68.根据权利要求61所述的方法,其中步骤b)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计者基因的设计者生物体的诱导是在有氧环境下通过添加硝酸盐形式的氮肥进行。
69.根据权利要求61所述的方法,其中步骤b)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计者基因的设计者生物体的诱导是在厌氧环境下通过添加硝酸盐形式的氮肥进行。
70.根据权利要求61所述的方法,其中所提供的CO2的来源是来自燃烧化石燃料和/或燃烧生物质的工业设施的烟气CO2。
71.根据权利要求61所述的方法,其中来自燃烧化石燃料和/或燃烧生物质的工业设施的烟气CO2流通过管道引入生物反应器中。
72.根据权利要求61所述的方法,其中所提供的CO2的来源是来自环境和大气的空气CO2。
73.根据权利要求61所述的方法,其中所提供的CO2的其它来源选自由气态CO2、溶解CO2、碳酸氢盐和碳酸盐组成的组。
74.根据权利要求70所述的方法,其中产生CO2供应的所述燃烧化石燃料和/或燃烧生物质的工业设施选自由以下组成的组:燃电厂、炼铁工业、水泥厂、炼油设施、化肥厂、燃烧生物质和/或化石燃料的生物燃料蒸馏/分离设施、生物质热解工艺、烟囱、发酵生物反应器、生物燃料精炼设施和其组合。
75.根据权利要求61所述的方法,其进一步包括以下步骤:
d)通过膜过滤与丁醇收集技术的组合从环境收集丁醇;
e)收集用过的从被诱导转基因生物体转化而来的转基因设计者生物体;
f)重复权利要求61的步骤a)到c)和步骤d)和e),以用于连续的光生物丁醇生产。
76.根据权利要求75所述的方法,其进一步包括收集也可由被诱导的转基因设计者生物体利用所述设计者丁醇生产途径生产的中间产物的步骤。
77.根据权利要求76所述的方法,其中可利用所述设计者途径从CO2和H2O光生物生产的所述中间产物选自由以下组成的组:丁醛、丁酰辅酶A、巴豆酰辅酶A、3-羟基丁酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A、乙酰辅酶A、丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸、2-磷酸甘油酸、1,3-二磷酸甘油酸、甘油醛-3-磷酸、二羟基丙酮磷酸、果糖-1,6-二磷酸、果糖-6-磷酸、6-磷酸葡萄糖、葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸和其组合。
78.根据权利要求77所述的方法,其中所述中间产物的生产可通过关闭催化设计者途径中所述中间产物的消耗的设计者酶活性来选择性地增强。
79.根据权利要求77所述的方法,其中所述中间产物的生产可通过使用设计者生物体来增强,其中编码催化所述中间产物的消耗的酶的设计者基因从设计者途径中选择性地省略。
80.一种用于生物燃料的生物安全防护型光合生产的方法,其包括:使细胞分裂可控型转基因设计者植物或植物细胞在液体培养基中生长,其中所述植物或植物细胞经基因工程改造以含有设计者生物安全机制并表达一组设计者生物燃料生产途径酶,所述酶作用于卡尔文循环的中间产物并将所述中间产物转化为生物燃料;和从所述液体培养基回收生物燃料。
81.根据权利要求80所述的方法,其中所述植物是水生植物。
82.根据权利要求81所述的方法,其中所述水生植物选自由以下组成的组:水下水草(黑藻、水蕴草、杉叶藻、气泡草、硬叶浪草、大卷浪草、牛顿草、新加坡莫丝、小柳、珍珠金线、大艾克草、美洲三白草、舌头椒草、北极杉百叶草、红苦草、柳叶水蓑衣、泰国水剑、培茜椒草、美洲苦草、托塔苦草、北极杉、黑乐草、石龙尾、穿叶眼子菜、红松尾、贝克椒草、无尾水筛、水罗兰)、浮萍(紫萍、无根萍、品藻、卵叶青萍、青萍、紫萍)、水芙蓉、毛茛、菱角(四角菱和乌菱)、睡莲(齿叶睡莲、睡莲科和莲科)、水葫芦、黑木蕨、水盾草、海藻(小竹叶、波喜荡草科、大叶藻科、水鳖科和丝粉藻科)和藻类。
83.根据权利要求82所述的方法,其中所述藻类选自由以下组成的组:绿藻、红藻、褐藻、蓝绿藻(生氧光细菌,包括蓝藻和原绿球藻)、硅藻、海洋藻、淡水藻、耐冷藻株、耐热藻株、天线色素缺陷型突变株、耐丁醇藻株和其组合。
84.根据权利要求82所述的方法,其中所述藻类选自由以下组成的组:莱茵衣藻、亚心形扁藻、小球藻、耐热性小球藻、寻常小球藻、椭圆小球藻、小球藻、杜氏盐藻、韦氏杜氏藻、巴氏杜氏藻、雨生血球藻、Parachlorella kessleri、琼枝、皱波角叉菜、原始红藻、Cyanidium caldarium、Galdieria sulphuraria、匐枝凝花菜、张氏江蓠、长心卡帕藻、Porphyra miniata、Ostreococcus tauri、条斑紫菜、紫球藻、掌状红皮藻、江蓠、球等鞭金藻、卡帕藻、海带、海带、礁膜、微拟球藻、紫菜、紫球藻、裙带菜、石莼、石莼、裙带菜、三角褐指藻、舟形藻、寇氏隐甲藻、筒柱藻、隐秘小环藻、纤细眼虫、前沟藻、单细胞双鞭毛藻、巨藻、布朗纤维藻、斜生栅藻和其组合。
85.根据权利要求82所述的方法,其中所述藻类是莱茵衣藻。
86.根据权利要求82所述的方法,其中所述藻类选自由单细胞藻类、多细胞藻类和海藻组成的组。
87.根据权利要求86所述的方法,其中所述海藻选自由以下组成的组:青海苔(海白菜)、褐藻、刺松藻、墨角藻、细齿麒麟菜、细江蓠、水网藻、海带、裙带菜、昆布、条斑紫菜和紫菜。
88.根据权利要求83所述的方法,其中所述蓝绿藻(生氧光细菌,包括蓝藻和原绿球藻)选自由以下组成的组:细长嗜热聚球藻BP-1、发菜PCC 7120、细长聚球藻PCC 6301、聚球藻PCC 7942株、聚球藻PCC 7002株、集胞藻PCC 6803株、海洋原绿球藻MED4、海洋原绿球藻MIT 9313、海洋原绿球藻NATL1A、原绿球藻SS120、钝顶螺旋藻(钝顶节旋藻)、太平洋螺旋藻、巨大鞘丝藻、鱼腥藻、集胞藻、细长聚球藻、聚球藻(MC-A)、束毛藻、胞内植生藻、聚球藻WH7803、聚球藻WH8102、念珠藻、聚球藻PCC 7943株、集胞藻PCC 6714藻蓝蛋白缺陷型突变株PD-1、蓝杆菌51142株、蓝杆菌CCY0110、丰裕颤藻、巨大鞘丝藻、藓生束藻、无类囊体蓝藻、原绿藻、荷兰原绿丝蓝细菌、聚球藻(MC-A)、束毛藻、胞内植生藻、海洋原绿球藻、原绿球藻SS120、聚球藻WH8102、巨大鞘丝藻、藓生束藻、Synechococcus bigranulatus、嗜冷颤藻、席藻、发菜-1、墙壁眉藻、嗜热Synechococcus bigranulatus、灰蓝聚球藻、嗜热层理鞭枝藻、佛氏拟绿胶蓝细菌PCC 6912、瓦氏聚球藻、聚球藻MA4株、聚球藻MA19株和细长嗜热聚球藻。
89.根据权利要求80所述的方法,其中所述植物细胞是水生植物组织或细胞培养物。
90.根据权利要求80所述的方法,其中所述植物细胞是非水生植物组织或细胞培养物。
91.根据权利要求90所述的方法,其中所述非水生植物组织或细胞培养物选自由以下组成的组:木苹果的幼苗组织培养物、玉米植物的叶绿素愈伤组织培养物、菊科和茄科物种的绿色根培养物、甘蔗茎杆薄壁组织的组织培养物、小立碗藓的组织培养物、大豆植物的光合细胞悬浮培养物、绿色普通烟草细胞的光自养和光混合营养培养物、针晶粟草(C4植物)的细胞悬浮培养物,和鲍威尔苋、毛曼陀罗、陆地棉和普通烟草x心叶烟融合杂交体的光合悬浮培养细胞系。
92.根据权利要求80所述的方法,其中所述设计者生物安全机制包括可在某些特定诱导条件下诱导的设计者质子通道基因。
93.根据权利要求92所述的方法,其中所述设计者质子通道基因是在某些特定诱导条件下诱导性地表达,以将设计者质子通道插入细胞质膜并保持光合类囊体膜完好。
94.根据权利要求93所述的方法,其中设计者质子通道在细胞质膜中的所述插入破坏横跨细胞质膜的质子梯度,从而使任何细胞分裂和杂交能永久丧失以帮助确保生物安全。
95.根据权利要求92所述的方法,其中所述设计者质子通道基因包括诱导型启动子、质子通道编码序列和转录与翻译终止子。
96.根据权利要求95所述的方法,其中所述质子通道编码序列是蜂毒肽编码序列。
97.根据权利要求95所述的方法,其中所述诱导型启动子是硝酸还原酶Nia1启动子。
98.根据权利要求80所述的方法,其中所述设计者生物安全机制包括可在某些特定诱导条件下诱导的设计者细胞分裂周期iRNA基因。
99.根据权利要求98所述的方法,其中所述设计者细胞分裂周期iRNA基因在某些特定诱导条件下诱导性地表达,以永久抑制细胞分裂周期并保持细胞处于G1期或G0状态以帮助确保生物安全。
100.根据权利要求80所述的方法,其中所述设计者生物安全机制是通过使用高CO2需求突变株作为宿主生物体而赋予,所述宿主生物体是供设计者生物燃料生产途径基因转化之用,以便产生所述设计者细胞分裂可控型光合生物体。
101.根据权利要求100所述的方法,其中所述高CO2需求突变株选自由以下组成的组:
莱茵衣藻碳酸酐酶缺陷型突变株12-1C(CC-1219 cal mt-)、莱茵衣藻cia3突变株、聚球藻PCC 7942株的高CO2需求突变株M3、集胞藻PCC 6803的羧酶体缺陷型细胞和其组合。
102.根据权利要求100所述的方法,其中所述设计者生物燃料生产途径基因选自由以下组成的组:设计者丁醇生产途径基因、设计者乙醇生产途径基因、生物油生产基因、生物氢生产基因和其组合。
103.根据权利要求80所述的方法,其中所述设计者生物燃料生产途径酶选自由以下组成的组:设计者乙醇生产途径酶、设计者丁醇生产途径酶和其组合。
104.根据权利要求80所述的方法,其中所述设计者生物燃料生产途径酶选自由以下组成的组:淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸+
变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、丙酮酸-NADP 氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和其组合。
105.根据权利要求80所述的方法,其中所述设计者生物安全机制和所述生物燃料生产途径酶的表达是通过使用诱导型启动子控制。
106.根据权利要求80所述的方法,其中所述诱导型启动子选自由以下组成的组:氢化酶启动子[HydA1(Hyd1)和HydA2,登记号:AJ308413、AF289201、AY090770]、Cyc6基因启动子、Cpx1基因启动子、热休克蛋白启动子HSP70A、CabII-1基因(登记号M24072)启动子、Ca1基因(登记号P20507)启动子、Ca2基因(登记号P24258)启动子、硝酸还原酶(Nia1)启动子、亚硝酸还原酶基因(nirA)启动子、双向氢化酶基因hox启动子、光反应性和热反应性groE启动子、Rubisco操纵子rbcL启动子、金属(锌)诱导型smt启动子、铁反应性idiA启动子、氧化还原反应性crhR启动子、热休克基因hsp16.6启动子、小分子热休克蛋白(Hsp)启动子、CO2反应性碳酸酐酶基因启动子、绿光/红光反应性cpcB2A2启动子、UV光反应性lexA、recA和ruvB启动子、硝酸还原酶基因(narB)启动子和其组合。
107.一种光合生产生物燃料的方法,所述方法包括以下步骤:
a)使细胞分裂可控型转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻(生氧光细菌)或植物细胞在包含水的液体培养基中生长,其中所述转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞包含用于至少一种设计者生物燃料生产途径的至少一种外源转基因;
b)诱导所述转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞以产生被诱导转基因生物体,其使得所述至少一种转基因被激活以赋予至少一种设计者生物燃料生产途径;和c)提供二氧化碳和光能,借此被诱导的转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞将二氧化碳、水和光能转化为某些中间产物,最终转化为生物燃料(例如乙醇和/或丁醇)和氧。
108.根据权利要求107所述的方法,其中所述细胞分裂可控型转基因设计者生物体使用CO2作为主要碳源进行光自养生长。
109.根据权利要求107所述的方法,其中细胞分裂可控型转基因设计者生物体使用选自由以下组成的组的有机底物进行光异养或光混合营养生长:蔗糖、葡萄糖、乙酸盐、甲醇、丙醇、丁醇、丙酮、淀粉、半纤维素、纤维素、脂质、蛋白质、有机酸、生物质材料和其组合。
110.根据权利要求107所述的方法,其中步骤a)中具有氢化酶启动子控制型设计者基因的细胞分裂可控型设计者生物体的生长是在有氧环境下进行。
111.根据权利要求107所述的方法,其中步骤a)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计者基因的细胞分裂可控型设计者生物体的生长是在有氧环境下在铵而不是硝酸盐形式的氮肥存在下进行。
112.根据权利要求107所述的方法,其中步骤a)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计者基因的细胞分裂可控型设计者生物体的生长是在厌氧环境下在铵而不是硝酸盐形式的氮肥存在下进行。
113.根据权利要求107所述的方法,其中步骤b)中具有氢化酶启动子控制型设计者基因的细胞分裂可控型设计者生物体的诱导是在无O2的厌氧环境下进行。
114.根据权利要求107所述的方法,其中步骤b)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计者基因的设计者生物体的诱导是在有氧环境下通过添加硝酸盐形式的氮肥进行。
115.根据权利要求107所述的方法,其中步骤b)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计者基因的设计者生物体的诱导是在厌氧环境下通过添加硝酸盐形式的氮肥进行。
116.根据权利要求107所述的方法,其中所提供的CO2的来源是来自燃烧化石燃料和/或生物质的工业设施的烟气CO2。
117.根据权利要求107所述的方法,其中来自燃烧化石燃料和/或生物质的工业设施的烟气CO2流通过管道引入生物反应器中。
118.根据权利要求107所述的方法,其中所提供的CO2的来源是来自环境和大气的空气CO2。
119.根据权利要求107所述的方法,其中所提供的CO2的其它来源选自由气态CO2、溶解CO2、碳酸氢盐和碳酸盐组成的组。
120.根据权利要求119所述的方法,其中产生CO2供应的所述燃烧化石燃料和/或生物质的工业设施选自由以下组成的组:燃煤电厂、炼钢铁工业、水泥厂、炼油设施、化肥厂、生物质燃烧和/或化石燃料燃烧生物燃料蒸馏/分离设施、生物质热解工艺、烟囱、发酵生物反应器、生物燃料精炼设施和其组合。
121.根据权利要求107所述的方法,其进一步包括以下步骤:
d)通过膜过滤与生物燃料收集技术的组合从环境收集生物燃料;
e)收集用过的从被诱导转基因生物体转化而来的转基因设计者生物体;
f)使用所述细胞分裂可控型设计者生物体,重复权利要求107的步骤a)到c)和步骤d)和e),以用于生物燃料的连续的生物安全防护型光生物生产。
122.根据权利要求121所述的方法,其进一步包括收集也可由被诱导转基因设计者生物体利用所述设计者丁醇生产途径生产的中间产物的步骤。
123.根据权利要求122所述的方法,其中可利用所述设计者途径从CO2和H2O光生物生产的所述中间产物选自由以下组成的组:乙醛、丁醛、丁酰辅酶A、巴豆酰辅酶A、3-羟基丁酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A、乙酰辅酶A、丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸、2-磷酸甘油酸、1,3-二磷酸甘油酸、甘油醛-3-磷酸、二羟基丙酮磷酸、果糖-1,6-二磷酸、果糖-6-磷酸、6-磷酸葡萄糖、葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸和其组合。

说明书全文

从二生物生产丁醇的设计者生物体

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请主张2008年2月23日申请的美国临时申请第US61/066,845和US61/066,835号的权益。这两个申请的全部公开内容以引用的方式并入本文。

技术领域

[0003] 本发明一般涉及生物安全防护型生物燃料能源生产技术。更具体地说,本发明提供一种基于设计者转基因(designer transgenic)植物如转基因藻类、蓝绿藻(蓝藻(cyanobacteria)和原绿球藻(oxychlorobacteria))或植物细胞的光生物丁醇生产方法,所述设计者转基因植物被产生来利用从光合过程获得的还原(NADPH)和能量(ATP)直接从二氧化碳(CO2)和水(H2O)立即合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)。

背景技术

[0004] 丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)是一种四碳醇,可用作液体燃料以驱动发动机,例如汽车。丁醇可代替汽油,并且这两种燃料的能含量几乎相同(每加仑丁醇的能含量为110,000Btu;每加仑汽油的能含量为115,000Btu)。与乙醇相比,丁醇作为替代燃料也有很多优越的性质。这些性质包括:1)丁醇的能含量(每加仑丁醇的能含量为110,000Btu)高于乙醇(每加仑乙醇的能含量为84,000Btu);2)丁醇的“蒸发性”比乙醇小6倍,比汽油小
13.5倍,使得其作为氧合物使用时更加安全,从而消除在夏季和冬季对非常特殊的掺合物的需求;3)丁醇可通过现有的燃料基础设施(包括汽油管道)运输,而乙醇必须通过路、驳船或卡车运送;和4)丁醇可以加仑对加仑地用作汽油的替代品,例如100%或任何其它百分比,而乙醇只能用作汽油的添加剂,最高为约85%(E-85),并且只有在对发动机显著改进后才能使用(而丁醇可作为100%替代燃料工作,无需改进现有汽车发动机)。
[0005] 丁醇作为液体燃料在当前的运输和能源系统中已有巨大的潜在市场。丁醇也用作工业溶剂。在美国,丁醇目前主要是由石油制造。历史上(20世纪初到20世纪50年代),人们通过典型地利用特定产丁醇菌(例如丙丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii))的发酵方法从玉米和糖蜜制造生物丁醇,所述发酵过程也产生丙酮和乙醇并且被称为ABE(丙酮、丁醇、乙醇)发酵。然而,当大约1954年美国失去从古巴的低价糖供应时,利用发酵的丁醇生产就开始下滑,主要是因为石油价格降到比糖价还低的水平。最近,对于使用梭菌和/或酵母发酵方法,从例如玉米淀粉生物质生产丁醇和/或乙醇重新给予了R&D关注。然而,与“玉米淀粉乙醇生产”的情形类似,“玉米淀粉丁醇生产”方法也需要很多的耗能步骤,包括农业玉米作物培育、玉米谷物收获、玉米谷物淀粉加工和淀粉制糖制丁醇发酵。“玉米淀粉丁醇生产”方法也可能消耗与其丁醇产物的能量值几乎一样多的能量。这并不令人吃惊,可以理解的原因是当前技术可以利用的玉米淀粉只占包括玉米杆、叶子和根的玉米作物生物质的一小部分。玉米秸通常被丢弃在农田里,缓慢分解成CO2,因为其在很大程度上代表了无法由当前的生物精炼工业有效用于生产乙醇或丁醇的木质纤维素生物质材料。人们已经进行研究试图从木质纤维素植物生物质材料制造乙醇或丁醇,即称作“纤维素乙醇”或“纤维素丁醇”的概念。然而,植物生物质已经进化出了有效机制以用于抵御微生物和动物界对其细胞壁结构糖的攻击。这种性质构成天然顽抗性(natural recalcitrance)的基础,从而为节省成本地将木质纤维素生物质转换为可发酵糖设置了障碍。因此,一个被称作“木质纤维素顽抗性”的难题在节省成本地将植物生物质转换为可发酵糖这一方面构成了难以逾越的技术屏障。也就是说,因为顽抗性问题,木质纤维素生物质(例如玉米秸、柳枝稷和木本植物材料)无法容易地转换为可发酵糖,从而无法在没有特定预处理的情况下制造乙醇或丁醇,预处理通常与高昂的加工成本有关。虽然在木质纤维素生物质预处理和发酵型丁醇生产加工方面的R&D工作已有50多年之久,但是顽抗性木质纤维素的问题仍然是至今也无法消除的难以逾越的技术屏障。此外,木质纤维素生物质培育、收获、预处理加工和纤维素制糖制丁醇发酵等步骤都消耗能量。因此,任何可规避生物质技术中的这些瓶颈问题的新技术都是有用的。
[0006] 生氧 光细 菌(oxyphotobacteria)(也 称作 蓝绿 藻,包 括蓝 藻和 原 绿球 藻) 和 藻 类 (例 如 莱 茵 衣 藻(Chlamydomonas reinhardtii)、亚 心 形 扁 藻(Platymonassubcordiformis)、小 球藻 (Chlorella fusca)、杜 氏盐 藻 (Dunaliella salina)、布朗纤维藻(Ankistrodesmus braunii)和斜生栅藻(Scenedesmus obliquus))可在液体培养基中利用从水形成的O2来执行CO2的光合同化,其太阳能转换为生物质能的最大理论转换率为约10%,并且在作为清洁再生能源方面具有巨大的潜力。然而,野生型产氧光合绿色植物,例如蓝绿藻和真核藻类,并不具有从CO2和H2O直接生产丁醇的能力。野生型光合作用利用从光合水裂解和穿过藻类类囊体膜系统的与质子梯度偶联的电子传递过程产生的还原力(NADPH)和能量(ATP),在藻类或绿色植物叶绿体的基质区域,用统称为“卡尔文循环(Calvincycle)”的一系列酶将CO2还原为碳水化合物(CH2O)n,例如淀粉。野生型光合过程的最终结果是根据以下过程反应利用太阳光能将CO2和H2O转化为碳水化合物(CH2O)n和O2:
[0007] nCO2+nH2O→(CH2O)n+nO2 [1]
[0008] 碳水化合物(CH2O)n然后在细胞代谢和生长期间进一步转换为各种各样的复杂细胞(生物质)材料,包括蛋白质、脂质和纤维素,以及其它细胞壁材料。
[0009] 在某些藻类如莱茵衣藻中,一些有机储备物如淀粉可通过二级发酵代谢途径缓慢代谢成乙醇(而不是丁醇)。藻类发酵代谢途径与酵母发酵过程类似,淀粉借此被分解成较小的糖,例如葡萄糖,其接着通过糖酵解过程转换为丙酮酸丙酮酸然后可通过许多其它代谢步骤转换为甲酸、乙酸和乙醇(G feller和Gibbs(1984)“Fermentative metabolism of Chlamydomonas reinhardtii,”PlantPhysiol.75:212-218)。此二级代谢过程的效率非常有限,可能是因为其只能利用藻类细胞中有限的有机储备物如淀粉中的一小部分。此外,天然藻类二级代谢过程不能产生任何丁醇。如上所述,丁醇具有许多优越的物理性质,使得其可代替汽油用作燃料。因此,需要具有高的太阳能至丁醇能源转换效率的新颖光生物丁醇生产机制。
[0010] 本发明提供革命性的设计者光合生物体,其能够利用太阳光直接从CO2和H2O合成丁醇。本发明提供的光生物丁醇生产系统可避免上述生物质技术的所有瓶颈问题。

发明内容

[0011] 本发明提供基于设计者转基因植物(例如藻类和生氧光细菌)或植物细胞的光生物丁醇生产方法。设计者光合生物体是通过基因工程来产生,使得内源光合调控机制被驯化,并且从光合水裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程获得的还原力(NADPH)和能量(ATP)可用于从二氧化碳(CO2)和水(H2O)直接合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)。本发明的光生物丁醇生产方法通过避免生物质技术的瓶颈问题完全消除了顽抗性木质纤维素的问题。预期本发明的光合丁醇生产技术的太阳能至丁醇能源转换效率显著高于当前技术。
[0012] 本发明的光合丁醇生产方法的基础特征是产生设计者植物(例如藻类)或植物细胞,其含有编码一组酶的转基因,所述酶可作用于卡尔文循环的中间产物并将中间产物直接转化为丁醇,而不是制造淀粉和其它复杂生物质材料。因此,本发明尤其提供基于设计者植物或植物细胞生产丁醇的方法,编码设计者丁醇生产途径的基因的DNA构建体,以及产生的设计者植物和设计者植物细胞。
[0013] 一方面,本发明提供一种通过使设计者植物(例如设计者藻类或设计者蓝绿藻)或植物细胞在液体培养基中生长来光合生产丁醇的方法,其中所述植物或植物细胞经基因工程改造以表达一组酶,所述酶可作用于卡尔文循环的中间产物并将中间产物转化为丁醇。
[0014] 根据本发明,用于光合生产丁醇的设计者植物(例如设计者藻类)或设计者植物细胞可利用基本上任何植物、植物组织或植物细胞作为宿主来产生,只要这类植物、植物组织和细胞具有光合能力并且能在液体培养基中培养即可。在一优选实施方案中,利用水生植物来产生设计者植物,包括(但不限于)水下水草(submersed aquatic herbs)(例如黑藻(Hydrilla verticillata)、水蕴草(Elodea densa)、气泡草(Aponogeton boivinanus)、水罗兰(Hygrophiladifformmis))、浮萍(duckweeds)(例如紫萍(Spirodela polyrrhiza)、无根萍(Wolffiaglobosa)、紫萍(Landoltia punctata))、水芙蓉(water cabbage/Pistia stratiotes)、毛茛(buttercups/Ranunculus)、菱(water caltrop)(四角菱(Trapa natans)和乌菱(Trapa bicornis))、睡莲(water lily)(例如齿叶睡莲(Nymphaea lotus))、水葫芦(water hyacinth)(Eichhornia crassipes)、海 藻(seagrasses)(例如小竹叶(Heteranthera Zosterifolia))和藻类。
[0015] 在一特别优选的实施方案中,使用藻类作为宿主来产生用于光合生产丁醇的设计者藻类。适用于本发明的藻类可为单细胞或多细胞藻类(后者包括(但不限于)海藻,例如青海苔(Ulva latissima)(海白菜(sea lettuce))、褐藻(Ascophyllum nodosum)和紫菜(Porphyra tenera)),并且包括绿藻(绿藻(Chlorophyta))、红藻(红藻门(Rhodophyta))、褐藻(褐藻门(Phaeophyta))、藻(硅藻门(Bacillariophyta))和蓝绿藻(生氧光细菌,包括蓝藻(Cyanophyta(cyanobacteria))和原绿球藻(Prochlorophyte(oxychlorobacteria)))。原核蓝绿藻(生氧光细菌)和真核藻类都非常适用于本发明。用于本发明的尤其优选的藻类物种是绿藻物种莱茵衣藻,其基因组最近已被测序。
[0016] 适合用于在宿主中产生设计者丁醇生产途径的酶的选择取决于设计者途径在卡尔文循环的何种中间产物处开始从卡尔文循环分叉。在一个实施方案中,设计者途径从甘油-3-磷酸点分叉,并通过使用例如由甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘+油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶(或丙酮酸-NADP氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶组成的一组酶将其转化为丁醇。在此设计者途径中,为了将两分子的甘油醛-3-磷酸转化为丁醇,在由甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的从甘油醛-3-磷酸至1,3-二磷+ +
酸甘油酸的步骤中从NAD 产生两个NADH分子;同时两个NADH分子转化为NAD :一个是在由3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶催化的将乙酰乙酰辅酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A的步骤中,另一个是在由丁酰辅酶A脱氢酶催化的将巴豆酰辅酶A还原为丁酰辅酶A的步骤中。
因此,在此设计者途径中,所消耗NADH分子的数量与所产生NADH分子的数量保持平衡。此外,由丁醛脱氢酶催化的将丁酰辅酶A还原为丁醛的步骤和由丁醇脱氢酶催化的将丁醛还原为丁醇的最终步骤皆可使用NADPH,其可通过光合水裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程再生。因此,此设计者丁醇生产途径可连续工作。
[0017] 在另一个实例中,产生设计者途径,其采用中间产物3-磷酸甘油酸,并通过使用例如由磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶组成的一组酶将其转化为丁醇。为了此3-磷酸甘油酸分叉的丁醇生产途径能够工作,使用可利用NADPH的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和丁酰辅酶A脱氢酶非常重要,NADPH可由光驱动的电子传递过程供应。可选地,当使用只能利用NADH的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和丁酰辅酶A脱氢酶时,此处优选使用另一种实施方案,其可赋予NADPH/NADH转化机制,通过将NADPH转化为NADH来供应NADH,以便于经由3-磷酸甘油酸分叉的设计者途径光合生产丁醇。
[0018] 在另一个实例中,产生设计者途径,其采用果糖-1,6-二磷酸,并通过使用例如由醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯+醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-NADP 氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶组成的一组酶将其转化为丁醇。在设计者生物体中添加另一种酶——即磷酸果糖激酶——可允许产生另一种设计者途径,其从果糖-6-磷酸点分叉以便生产丁醇。类似于甘油醛-3-磷酸分叉的丁醇生产途径,果糖-1,6-二磷酸分叉的途径和果糖-6-磷酸分叉的途径自身皆可产生NADH以用于途径中的以下步骤:由3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶催化的将乙酰乙酰辅酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A的步骤,和由丁酰辅酶A脱氢酶催化的将巴豆酰辅酶A还原为丁酰辅酶A的步骤。在这些设计者丁醇生产途径的每一种中,所消耗NADH分子的数量与所产生NADH分子的数量保持平衡;并且丁醛脱氢酶(催化将丁酰辅酶A还原为丁醛的步骤)和丁醇脱氢酶(催化将丁醛还原为丁醇的最终步骤)皆可利用NADPH,其可通过光合水裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程再生。因此,这些设计者丁醇生产途径可连续工作。应注意,某些组的设计者酶可允许两种或两种以上的设计者途径、即从卡尔文循环的两个或两个以上点分叉的用于生产丁醇的途径。
[0019] 根据本发明,对编码这些酶的核酸进行基因工程改造,使得所表达的酶插入宿主叶绿体中以实现靶向细胞定位。设计者丁醇生产途径酶的靶向插入可经由使用编码基质“信号”肽的核苷酸序列来实现,所述核苷酸序列被放置成与编码设计者酶的核苷酸序列可操作地连接。许多转运肽序列都适合用于设计者丁醇生产酶靶向插入叶绿体中,包括(但不限于)氢化酶载脂蛋白(例如Hyd1)、铁氧还蛋白载脂蛋白(Frx1)、硫氧还蛋白m载脂蛋白(Trx2)、谷酰胺合成酶载脂蛋白(Gs2)、LhcII载脂蛋白、PSII-T载脂蛋白(PsbT)、PSII-S载脂蛋白(PsbS)、PSII-W载脂蛋白(PsbW)、CF0CF1亚基-γ载脂蛋白(AtpC)、CF0CF1亚基-δ载脂蛋白(AtpD)、CF0CF1亚基-II载脂蛋白(AtpG)、光系统I(PSI)载脂蛋白(例如基因PsaD、PsaE、PsaF、PsaG、PsaH和PsaK的PSI载脂蛋白)和Rubisco小亚基(SSU)载脂蛋白(例如RbcS2)的转运肽序列。优选的转运肽序列包括Hyd1转运肽、Frx1转运肽和Rubisco SSU转运肽(例如RbcS2)。
[0020] 另外根据本发明,设计者丁醇生产途径的表达是经由使用外部诱导型启动子来控制,使得设计者转基因在某些特定条件下诱导性地表达。在一个实施方案中,用于控制设计者基因表达的诱导型启动子是可由厌氧生活诱导的启动子,包括例如氢化酶基因(Hyd1)、编码细胞色素C6的载脂蛋白的Cyc6基因和编码粪生素(coprogen)氧化酶的Cpx1基因的启动子。适合用于本发明的其它诱导型启动子包括硝酸还原酶(Nia1)启动子、热休克蛋白启动子HSP70A、CabII-1启动子、Ca1启动子、Ca2启动子、亚硝酸还原酶基因(nirA)启动子、双向氢化酶基因hox启动子、光反应性和热反应性groE启动子、Rubisco操纵子rbcL启动子、金属(锌)诱导型smt启动子、铁反应性idiA启动子、氧化还原反应性crhR启动子、热休克基因hsp16.6启动子、小分子热休克蛋白(Hsp)启动子、CO2反应性碳酸酐酶基因启动子、绿光/红光反应性cpcB2A2启动子、UV光反应性lexA、recA和ruvB启动子、硝酸还原酶基因(narB)启动子和其组合。
[0021] 在本发明的另一方面,提供设计者DNA构建体,其含有编码一种或一种以上设计者丁醇生产途径酶的一种或一种以上核苷酸序列,所述核苷酸序列各自被放置成与诱导型启动子和编码适当叶绿体靶向转运肽的核苷酸序列可操作地连接。构建体可含有其它适当序列,例如选择标记基因,以便于筛选和鉴别转化体。携带设计者基因的核酸构建体可使用可用的基因转化技术递送到宿主藻类、植物生物体或植物组织或细胞中,例如电穿孔、天然转化、接合、PEG诱导的摄入、DNA的基因枪递送和农杆菌介导的转化。
[0022] 已经产生的含有一种或一种以上设计者构建体的设计者植物(例如设计者藻类)、植物组织和植物细胞形成本发明的另一个实施方案。在进一步的方面,本发明提供用于增强光合丁醇生产的其它方法,相关设计者构建体,和设计者植物、植物组织和细胞。
[0023] 在一具体实施方案中,如上所述的光合产丁醇设计者植物(例如设计者藻类)、植物组织或细胞已被进一步修饰成含有其它设计者转基因,以便诱导性地表达一种或一种以+上促进NADPH/NADH转化的酶,例如NAD 依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶、NADPH磷酸酶和NAD激酶。可选地,设计者植物、植物组织或细胞的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶可被选择和修饰,使得其也可利用NADPH。
[0024] 在另一个实施方案中,光合产丁醇设计者植物或植物组织或细胞已被进一步修饰成使淀粉合成活性失活。在一具体实施方案中,所述进一步修饰包括引入编码和诱导性地表达干扰RNA(iRNA)分子的设计者DNA构建体,所述iRNA分子特异性地抑制淀粉合成途径酶(例如淀粉合成酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶、磷酸葡萄糖异构酶和/或磷酸葡萄糖变位酶)的合成,以便增强丁醇光生物生产。
[0025] 在另一个实施方案中,光合产丁醇设计者植物或植物组织或细胞已被进一步修饰成含有另外一组促进基质中的淀粉降解和糖酵解的设计者基因。此类其它设计者基因包括例如编码淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶和磷酸葡萄糖异构酶的基因。
[0026] 在另一个实施方案中,光生物丁醇生产途径是分成几部分分布在叶绿体和细胞质中。设计者丁醇生产途径酶在叶绿体与细胞质之间的分布是通过在设计者DNA构建体中使用和/或缺失转运肽序列来控制。
[0027] 在另一个实施方案中,光生物丁醇生产途径是全部分布在细胞质中,如在包括设计者蓝藻和设计者原绿球藻的设计者生氧光细菌(蓝绿藻)的情况下。
[0028] 本发明还提供一种生物安全防护型光生物生物燃料生产技术,其是基于细胞分裂可控型设计者转基因植物、藻类、蓝绿藻(蓝藻和原绿球藻)或植物细胞。细胞分裂可控型设计者光合生物体含有两种关键功能:设计者生物安全机制和设计者生物燃料生产途径。设计者生物安全特征是由包括以下的许多机制赋予:(1)设计者质子通道可诱导性地插入细胞质膜以使任何细胞分裂和/或杂交能力永久丧失,(2)选择性地应用设计者细胞分裂周期调控蛋白或干扰RNA(iRNA),以永久抑制细胞分裂周期且优选使细胞保持在G1期或G0状态,和(3)创新使用高CO2需求的宿主光合生物体以用于表达设计者生物燃料生产途径。
设计者细胞分裂控制技术可帮助确保使用设计者生物体来光合生产生物燃料中的生物安全。
[0029] 本发明进一步提供一种使用设计者光合生物体(例如设计者蓝藻或藻类)结合光生物反应器系统和丁醇分离/收集方法,利用太阳光从CO2和H2O直接光生物生产丁醇和O2的方法。工业CO2来源和/或来自环境的大气CO2皆可用于光生物丁醇生产方法中。附图说明
[0030] 图1展现从卡尔文循环分叉的设计者丁醇生产途径,其使用来自光合水裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程的还原力(NADPH)和能量(ATP),通过一系列酶促反应将二氧化碳(CO2)还原为丁醇CH3CH2CH2CH2OH。
[0031] 图2A展现设计者丁醇生产途径基因的DNA构建体。
[0032] 图2B展现用于NADPH/NADH相互转化的NADPH/NADH转化设计者基因的DNA构建体。
[0033] 图2C展现设计者iRNA淀粉/糖原合成抑制剂基因的DNA构建体。
[0034] 图2D展现设计者淀粉降解-糖酵解基因的DNA构建体。
[0035] 图2E展现用于细胞溶质表达的设计者丁醇生产途径基因的DNA构建体。
[0036] 图2F展现用于在生氧光细菌中整合式基因转化的具有两个重组位点的设计者丁醇生产途径基因的DNA构建体。
[0037] 图2G展现设计者生物安全控制基因的DNA构建体。
[0038] 图2H展现设计者质子通道基因的DNA构建体。
[0039] 图3A说明含有两种关键功能的细胞分裂可控型设计者生物体:设计者生物安全机制和设计者生物燃料生产途径。
[0040] 图3B说明利用设计者生物安全机制从二氧化碳(CO2)和水(H2O)光生物生产丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)的细胞分裂可控型设计者生物体。
[0041] 图3C说明用于从二氧化碳(CO2)和水(H2O)生物安全守护性地光生物生产其它生物燃料如乙醇(CH3CH2OH)的细胞分裂可控型设计者生物体。
[0042] 设计者光合生物体,例如设计者转基因植物(例如藻类和生氧光细菌)或植物细胞。设计者植物和植物细胞是使用基因工程技术来产生,使得内源光合调控机制被驯化,并且从光合水裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程获得的还原力(NADPH)和能量(ATP)可立即用于根据以下过程反应从二氧化碳(CO2)和水(H2O)直接合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH):
[0043] 4CO2+5H2O→CH3CH2CH2CH2OH+6O2 [2]
[0044] 本发明的光生物丁醇生产方法通过避免生物质技术的瓶颈问题完全消除了顽抗性木质纤维素的问题。如图1所示,设计者生物体中的光合过程有效地利用来自光合水裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程的还原力(NADPH)和能量(ATP),以便立即从二氧化碳(CO2)和水(H2O)直接合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH),而不会排入用于合成非常难以且通常不能用于生物精炼工业的不合需要的木质纤维素材料的其它途径中。这种方法与现有的“玉米淀粉丁醇生产”方法也有所不同。根据本发明,丁醇可直接从二氧化碳(CO2)和水(H2O)生产,而无需经历玉米淀粉丁醇生产方法必须经历的许多耗能步骤,包括玉米作物培育、玉米谷物收获、玉米谷物玉米淀粉加工和淀粉制糖制丁醇发酵。因此,预期本发明的光合丁醇生产技术具有显著高于(超过10倍)当前技术的太阳能至丁醇能源转化效率。假定所提议的光合丁醇生产方法的太阳能转化效率为10%,那么最大理论生产力(产量)可为每年每英亩约72,700kg丁醇,这可维持约70辆汽车(每年每英亩)。因此,本发明可为社会带来重要的能力以帮助确保能源安全。本发明也可帮助保护地球环境,避免大气中CO2的危险积聚,因为本发明方法将CO2直接转化为清洁的丁醇能源。
[0045] 本发明方法的基本特征是利用植物(例如藻类或生氧光细菌)或植物细胞,将编码一组酶的核酸分子引入植物或植物细胞中,所述酶可作用于卡尔文循环的中间产物并将中间产物转化为丁醇,如图1所示,而不是通过野生型光合途径制造淀粉和其它复杂细胞(生物质)材料作为终产物。因此,本发明尤其提供生产丁醇的方法,其是基于设计者植物(例如设计者藻类和设计者生氧光细菌)、设计者植物组织或设计者植物细胞、编码设计者丁醇生产途径的基因的DNA构建体,以及所产生的设计者藻类、设计者生氧光细菌(包括设计者蓝藻)、设计者植物、设计者植物组织和设计者植物细胞。本发明的各个方面在下文得到更详细的描述。
[0046] 宿主光合生物体
[0047] 根据本发明,本发明的用于光合生产丁醇的设计者生物体或细胞可利用任何具有光合能力(即通过光合作用捕获光能,使用所述能量将无机物转化为有机物的活性光合装置和酶促途径)的植物(包括藻类和生氧光细菌)、植物组织或植物细胞作为宿主来产生。优选地,宿主生物体应具有足够的光合CO2固定率,例如以支持从CO2和H2O光合生产丁醇,产率为每年每英亩至少约1,450kg丁醇,更优选为每年每英亩7,270kg丁醇,或甚至更优选为每年每英亩72,700kg丁醇。
[0048] 在一优选实施方案中,利用水生植物来产生设计者植物。水生植物,也称为水栖植物,是生活在水生环境中或水生环境上的植物,例如水中(包括水面上或水面下)或永久饱和土壤中。如本文所用,水生植物包括例如藻类、蓝绿藻(蓝藻和原绿球藻)、水下水草(黑藻、水蕴草、杉叶藻(Hippuris vulgaris)、气泡草、硬叶浪草(Aponogeton Rigidifolius)、大卷浪草(AponogetonLongiplumulosus)、顿草(Didiplis Diandra)、新加坡莫丝(Vesicularia Dubyana)、小柳(Hygrophilia Augustifolia)、珍珠金线(Micranthemum Umbrosum)、大克草(Eichhornia Azurea)、美洲三白草(Saururus Cernuus)、舌头椒草(CryptocoryneLingua)、北极杉百叶草(Hydrotriche Hottoniiflora Eustralis Stellata)、红 苦 草 (Vallisneria Rubra)、柳 叶 水 蓑 衣 (Hygrophila Salicifolia)、泰国水剑(CyperusHelferi)、培茜椒草(Cryptocoryne Petchii)、美洲苦草(Vallisneria americana)、托塔苦草(Vallisneria Torta)、北极杉(Hydrotriche Hottoniiflora)、黑乐草(CrassulaHelmsii)、石龙尾(Limnophila Sessiliflora)、穿叶眼子菜(PotamogetonPerfoliatus)、红松尾(Rotala Wallichii)、贝克椒草(Cryptocoryne Becketii)、无尾水筛(Blyxa Aubertii)、水罗兰)、浮萍(紫萍、无根萍、品藻(Lemna trisulca)、卵叶青萍(Lemna gibba)、青萍(Lemna minor)、紫萍(Landoltia punctata))、水芙蓉、毛茛、菱角(四角菱和乌菱)、睡莲(齿叶睡莲、睡莲科(Nymphaeaceae)和莲科(Nelumbonaceae))、水葫芦(Eichhornia crassipes)、黑木蕨(Bolbitisheudelotii)、水盾草(Cabomba sp.)、海藻(小竹叶、波喜荡草科(Posidoniaceae)、大叶藻科(Zosteraceae)、水鳖科(Hydrocharitaceae)和丝粉藻科(Cymodoceaceae))。从水生植物产生的丁醇可扩散到水里,从而允许植物的正常生长和植物更稳定地产生丁醇。水生植物组织(包括(但不限于)多细胞藻类)或细胞(包括(但不限于)单细胞藻类)的液体培养物也非常适合使用,因为从设计者丁醇生产途径生产的丁醇分子可容易地从细胞或组织扩散到液体水介质中,其可充当储存产物丁醇的巨大的池,产物丁醇随后可通过过滤和/或蒸馏/蒸发技术收集。
[0049] 虽然水生植物或细胞是用于本发明方法的优选宿主生物体,但是具有光合能力且可在液体培养基中培养的非水生植物的组织和细胞也可用于产生设计者组织或细胞以供光合生产丁醇。举例来说,也可选择以下非水生植物组织或细胞用作本发明的宿主生物体:木苹果(Feronia limonia)的光自养幼苗组织培养物、玉米植物(Zea mays)的叶绿素愈伤组织培养物、菊科(Asteraceae)和茄科(Solanaceae)物种的绿色根培养物、甘蔗茎杆薄壁组织的组织培养物、小立碗藓(Physcomitrella patens)的组织培养物、大豆植物(Glycme max)的光合细胞悬浮培养物、绿色普通烟草(Nicotiana tabacum L.)细胞的光自养和光混合营养培养物、针晶粟草(Gisekia pharnaceoides)(C4植物)的细胞悬浮培养物,和鲍威尔苋(Amaranthus powellii Wats.)、毛曼陀罗(Datura innoxia Mill.)、陆地(Gossypium hirsutum L.)和普通烟草(Nicotiana tabacum)x心叶烟(Nicotianaglutinosa L.)融合杂交体的光合悬浮培养细胞系。
[0050] “液体培养基”意谓液态水加上相对少量的无机营养物(例如N、P、K等,通常呈盐形式),用于光自养培养物;有时候也包括某些有机底物(例如蔗糖、葡萄糖或乙酸盐),用于光混合营养和/或光异养培养物。
[0051] 在一特别优选的实施方案中,本发明的丁醇生产方法所用的植物是藻类或蓝绿藻。藻类和/或蓝绿藻的使用具有一些优势。其可在开放池塘中大量且低成本地生长。丁醇从水相中的收集和纯化也可通过蒸馏/蒸发或膜分离容易地实现。
[0052] 适用于本发明的藻类包括单细胞藻类和多细胞藻类。可被选择用于本发明的多细胞藻类包括(但不限于)海藻,例如青海苔(海白菜)、褐藻、刺松藻(Codiumfragile)、墨角藻(Fucus vesiculosus)、细齿麒麟菜(Eucheuma denticulatum)、细江蓠(Gracilaria gracilis)、水网藻(Hydrodictyon reticulatum)、海带(Laminariajaponica)、裙带菜(Undaria pinntifida)、昆布(Saccharina japonica)、条斑紫菜(Porphyra yezoensis)和紫菜。合适的藻类也可选自以下藻类门:绿藻(绿藻门)、红藻(红藻门)、褐藻(褐藻门)、硅藻(硅藻门)和蓝绿藻(生氧光细菌,包括蓝藻和原绿球藻)。合适的绿藻目包括石莼目(Ulvales)、丝藻目(Ulotrichales)、团藻目(Volvocales)、小球藻目(Chlorellales)、裂体藻目(Schizogoniales)、鞘藻目(Oedogoniales)、双星藻目(Zygnematales)、刚毛藻目(Cladophorales)、管藻目(Siphonales)和绒枝藻目(Dasycladales)。合适的红藻属是紫菜属(Porphyra)、角叉菜属(Chondrus)、红藻属(Cyanidioschyzon)、紫球藻属(Porphyridium)、江蓠属(Gracilaria)、卡帕藻属(Kappaphycus)、石花菜属(Gelidium)和Agardhiella。合适的褐藻属有昆布属(Laminaria)、裙带菜属(Undaria)、巨藻属(Macrocystis)、尾藻属(Sargassum)和网管藻属(Dictyosiphon)。合适的蓝藻属(也称为蓝细菌)包括(但不限于)席藻属(Phoridium)、集胞藻属(Synechocystis)、聚球藻属(Syncechococcus)、颤藻属(Oscillatoria)和鱼腥藻属(Anabaena)。合适的原绿球藻属(也称为原绿球藻)包括(但不限于)原绿藻属(Prochloron)、原绿毛菌属(Prochlorothrix)和原核绿藻属(Prochlorococcus)。合适的硅藻属有小环藻属(Cyclotella)、筒柱藻属(Cylindrotheca)、舟形藻属(Navicula)、海链藻属(Thalassiosira)和褐指藻属(Phaeodactylum)。用于本发明的优选藻类物种包括莱茵衣藻、亚心形扁藻、小球藻、耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)、寻常小球藻(Chlorella vulgaris)、椭圆小球藻(′Chlorella′ellipsoidea)、小球藻(Chlorella spp.)、杜氏盐藻、韦氏杜氏藻(Dunaliella viridis)、巴氏杜氏藻(Dunaliella bardowil)、雨生血球藻(Haematococcus pluvialis);Parachlorella kessleri、琼枝(Betaphycus gelatinum)、皱波角叉菜(Chonrus crispus)、原始红藻(Cyanidioschyzon merolae)、Cyanidiumcaldarium、Galdieria sulphuraria、匐枝凝花菜(Gelidiella acerosa)、张氏江蓠(Gracilaria changii)、长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)、Porphyra miniata、Ostreococcus tauri、条斑紫菜(Porphyra yezoensis)、紫球藻(Porphyridium sp.)、掌状红皮藻(Palmaria palmata)、江蓠(Gracilaria spp.)、球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、卡帕藻(Kappaphycus spp.)、海带(Laminaria japanica)、海带(Laminariaspp.)、礁膜(Monostroma spp.)、微拟球藻(Nannochloropsis oculata)、紫菜(Porphyra spp.)、紫球藻(Porphyridium spp.)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、石莼(Ulva lactuca)、石莼(Ulva spp.)、裙带菜(Undaria spp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum Tricorntum)、舟形藻(Navicula saprophila)、寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)、隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)、纤细眼虫(Euglena gracilis)、前沟藻(Amphidinium sp.)、单细胞双鞭毛藻(Symbiodinium microadriaticum)、巨藻(Macrocystis pyrifera)、布朗纤维藻和斜生栅藻。
[0053] 用于本发明的优选蓝绿藻(生氧光细菌,包括蓝藻和原绿球藻)物种包括细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)BP-1、发菜(Nostoc sp.)PCC 7120、细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 6301、聚球藻PCC 7942株、聚球藻PCC 7002株、集胞藻PCC 6803株、海洋原绿球藻(Prochlorococcus marinus)MED4、海洋原绿球藻MIT 9313、海洋原绿球藻NATL1A、原绿球藻SS120、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)(钝顶节旋藻(Arthrospira platensis))、太平洋螺旋藻(Spirulina pacifica)、巨大鞘丝藻(Lyngbya majuscule)、鱼腥藻(Anabaenasp.)、集胞藻(Synechocystis sp.)、细长聚球藻(Synechococcus elongates)、聚球藻(Synechococcus)(MC-A)、束毛藻(Trichodesmium sp.)、胞内植生藻(Richeliaintracellularis)、聚球藻WH7803、聚球藻WH8102、念珠藻(Nostoc punctiforme)、聚球藻PCC 7943株、集胞藻(Synechocyitis)PCC 6714藻蓝蛋白缺陷型突变株PD-1、蓝杆菌(Cyanothece)51142株、蓝杆菌CCY0110、丰裕颤藻(Oscillatoria limosa)、巨大鞘丝藻(Lyngbya majuscula)、藓生束藻(Symploca muscorum)、无类囊体蓝藻(Gloeobacter violaceus)、原绿藻(Prochloron didemni)、荷兰原绿丝蓝细菌(Prochlorothrix hollandica)、聚球藻(MC-A)、束毛藻、胞内植生藻、海洋原绿球藻、原绿球藻SS120、聚球藻WH8102、巨大鞘丝藻、藓生束藻、Synechococcusbigranulatus、嗜 冷 颤藻(cryophilic Oscillatoria sp.)、席 藻(Phormidium sp.)、发菜-1、墙壁眉藻(Calothrix parietina)、嗜热Synechococcus bigranulatus、灰蓝聚球藻(Synechococcus lividus)、嗜热层理鞭枝藻(Mastigocladus laminosus)、佛氏拟绿胶蓝细菌(Chlorogloeopsis fritschii)PCC 6912、瓦氏聚球藻(Synechococcus vulcanus)、聚球藻MA4株、聚球藻MA19株和细长嗜热聚球藻。
[0054] 适当选择宿主光合生物体的遗传背景和某些特殊特征也是有利的。举例来说,从可在中生长的嗜冷藻类(嗜冷生物)和/或从耐冷宿主菌株(例如衣藻(Chlamydomonas)冷菌株CCMG1619——其已被表征为能在低达4℃执行光合水裂解(Lee,Blankinship和Greenbaum(1995),″Temperature effect onproduction of hydrogen and oxygen by Chlamydomonas cold strain CCMP1619 andwild type 137c,″Applied Biochemistry and Biotechnology 51/52:379-386))——产生的光合产丁醇设计者藻类即使在寒冷季节或区域如加拿大也可允许光生物丁醇生产。同时,从嗜热/耐热光合生物体(例如嗜热藻类如Cyanidium caldarium和Galdieria sulphuraria,和/或嗜热蓝藻(蓝绿藻)如细长嗜热聚球藻BP-1和Synechococcus bigranulatus)产生的设计者藻类可允许本发明在天气通常炎热的炎热季节或区域(例如墨西哥和美国西南地区,包括内华达、加利福尼亚、亚利桑那、新墨西哥和德克萨斯)良好实施。此外,从海洋藻如亚心形扁藻产生的光合产丁醇设计者藻类允许使用海水实施本发明,而从淡水藻如莱茵衣藻产生的设计者藻类则可使用淡水。光合产丁醇设计者藻类的其它可选特征包括:减小的叶绿素天线尺寸,其已被证实可提供较高的光合生产率(Lee,Mets和Greenbaum(2002).“Improvement of photosynthetic efficiency at high lightintensity through reduction of chlorophyll antenna size,”Applied Biochemistry andBiotechnology,98-100:37-48);和丁醇耐受性,其允许从CO2和H2O更耐久且更有效地光合生产丁醇。通过使用集胞藻PCC 6714的藻蓝蛋白缺陷型突变株,已在实验上证明了光抑制也可通过降低捕光色素的含量来减轻(Nakajima,Tsuzuki和Ueda(1999)“Reduced photoinhibition of a phycocyanin-deficient mutant ofSynechocystis PCC 6714”,Journal of Applied Phycology 10:447-452)。这些可选特征可例如通过使用丁醇耐受性和/或叶绿素天线缺陷型突变株(例如莱茵衣藻DS521株)作为用设计者丁醇生产途径基因进行基因转化的宿主生物体而并入设计者藻类中。因此,在各种实施方案之一中,宿主藻类选自:绿藻、红藻、褐藻、蓝绿藻(生氧光细菌,包括蓝藻和原绿球藻)、硅藻、海洋藻、淡水藻、单细胞藻类、多细胞藻类、海藻、耐冷藻株、耐热藻株、捕光天线色素缺陷型突变株、耐丁醇藻株和其组合。
[0055] 在宿主中产生设计者丁醇生产途径
[0056] 选择适当的设计者酶
[0057] 本发明的关键特征之一是产生设计者丁醇生产途径,以便驯化天然光合机制并与其合作,从而符合需要地直接从CO2和H2O合成丁醇。天然光合机制包括(1)光合水裂解和穿过类囊体膜的与质子梯度偶联的电子传递过程,其产生还原力(NADPH)和能量(ATP),和(2)卡尔文循环,其通过消耗还原力(NADPH)和能量(ATP)来还原CO2。
[0058] 根据本发明,使用一系列酶来产生设计者丁醇生产途径,其采用卡尔文循环的中间产物并将中间产物转化为丁醇,如图1所示。“设计者丁醇生产途径酶”在此处是定义为用作设计者丁醇生产途径的至少一个步骤的催化剂的酶。根据本发明,可利用卡尔文循环的许多中间产物来产生设计者丁醇生产途径;且设计者丁醇生产途径所需的酶的选择是取决于设计者丁醇生产途径在卡尔文循环的何种中间产物处开始从卡尔文循环分叉。
[0059] 在一个实例中,产生设计者途径,其采用甘油醛-3-磷酸,并通过使用例如由甘油醛-3-磷酸脱氢酶01、磷酸甘油酸激酶02、磷酸甘油酸变位酶03、烯醇化酶04、丙酮酸激酶05、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶06、硫解酶07、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶08、巴豆酸酶
09、丁酰辅酶A脱氢酶10、丁醛脱氢酶11和丁醇脱氢酶12组成的一组酶(如图1中的数字标识01-12所示),将其转化为丁醇。在此甘油醛-3-磷酸分叉的设计者途径中,为了将两分子的甘油醛-3-磷酸转化为丁醇,在由甘油醛-3-磷酸脱氢酶01催化的甘油醛-3-磷+
酸生成1,3-二磷酸甘油酸的步骤从NAD 产生两个NADH分子;同时两分子的NADH转化为+
NAD :一个是在由3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶08催化的将乙酰乙酰辅酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A的步骤中,另一个是在由丁酰辅酶A脱氢酶10催化的将巴豆酰辅酶A还原为丁酰辅酶A的步骤中。因此,在此甘油醛-3-磷酸分叉的设计者途径(01-12)中,所消耗NADH分子的数量与所产生NADH分子的数量保持平衡。此外,由丁醛脱氢酶11催化的途径步骤(将丁酰辅酶A还原为丁醛)和由丁醇脱氢酶12催化的最终步骤(将丁醛还原为丁醇)皆可使用NADPH,所述NADPH可通过光合水裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程再生。因此,此甘油醛-3-磷酸分叉的设计者丁醇生产途径可连续工作。
[0060] 在另一实例中,产生设计者途径,其采用中间产物3-磷酸甘油酸,并通过使用例如由磷酸甘油酸变位酶03、烯醇化酶04、丙酮酸激酶05、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶06、硫解酶07、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶08、巴豆酸酶09、丁酰辅酶A脱氢酶10、丁醛脱氢酶11和丁醇脱氢酶12组成的一组酶(如图1中的数字标识03-12所示)将其转化为丁醇。值得注意的是,甘油醛-3-磷酸分叉的设计者丁醇生产途径(01-12)中的最后10种酶(03-12)与3-磷酸甘油酸分叉的设计者途径(03-12)所用的酶相同。换句话说,甘油醛-3-磷酸分叉的途径的设计者酶(01-12)允许从卡尔文循环的3-磷酸甘油酸点和甘油醛-3-磷酸点生产丁醇。然而,这两种途径具有不同的特征。与甘油醛-3-磷酸分叉的丁醇生产途径不同,仅由10种酶(03-12)的活性组成的3-磷酸甘油酸分叉的途径自身无法产生在以下两个位置使用所必需的任何NADH:一个是在由3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶08催化的将乙酰乙酰辅酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A的步骤中,另一个是在由丁酰辅酶A脱氢酶
10催化的将巴豆酰辅酶A还原为丁酰辅酶A的步骤中。也就是说,如果(或当)使用只能严格利用NADH而不能利用NADPH的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和/或丁酰辅酶A脱氢酶,那么3-磷酸甘油酸分叉的途径(03-12)的工作将需要NADH供应。因此,为了3-磷酸甘油酸分叉的丁醇生产途径能够工作,使用可利用NADPH的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶08和丁酰辅酶A脱氢酶10非常重要,NADPH可由光驱动的电子传递过程供应。因此,对于此3-磷酸甘油酸分叉的设计者丁醇生产途径(图1中的03-12),优选使用可利用NADPH或NADPH与NADH两者(即NAD(P)H)的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和丁酰辅酶A脱氢酶。可选地,当使用只能利用NADH的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和丁酰辅酶A脱氢酶时,此处优选使用另一种实施方案,其可在设计者生物体中赋予NADPH/NADH转化机制(以通过将NADPH转化为NADH来供应NADH,更多细节参看下文),以便于通过3-磷酸甘油酸分叉的设计者途径光合生产丁醇。
[0061] 在另一个实例中,产生设计者途径,其采用果糖-1,6-二磷酸,并通过使用由醛缩酶20、磷酸丙糖异构酶21、甘油醛-3-磷酸脱氢酶22、磷酸甘油酸激酶23、磷酸甘油酸变位+酶24、烯醇化酶25、丙酮酸激酶26、丙酮酸-NADP 氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)27、硫解酶28、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶29、巴豆酸酶30、丁酰辅酶A脱氢酶31、丁醛脱氢酶32和丁醇脱氢酶33组成的一组酶(如图1中的数字标识20-33所示)将其转化为丁醇,其中仅有醛缩酶20和磷酸丙糖异构酶21相对于甘油醛-3-磷酸分叉的设计者+
途径是额外的酶。使用丙酮酸-NADP 氧化还原酶27(而不是丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)催化丙酮酸分子转化为乙酰辅酶A可产生NADPH,其可用于丁醇生产途径的一些其它步骤。在设计者生物体中添加另一种酶——即磷酸果糖激酶19可允许产生另一种设计者途径,其从卡尔文循环的果糖-6-磷酸点分叉以生产丁醇。与甘油醛-3-磷酸分叉的丁醇生产途径类似,果糖-1,6-二磷酸分叉的途径(20-33)和果糖-6-磷酸分叉的途径(19-33)自身皆可产生NADH,以用于所述途径中由3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶29催化的将乙酰乙酰辅酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A的步骤和由丁酰辅酶A脱氢酶31催化的将巴豆酰辅酶A还原为丁酰辅酶A的步骤。在这些设计者丁醇生产途径的每一种中,所消耗NADH分子的数量与所产生NADH分子的数量保持平衡;并且丁醛脱氢酶32(催化将丁酰辅酶A还原为丁醛的步骤)和丁醇脱氢酶33(催化将丁醛还原为丁醇的最终步骤)皆可利用NADPH,其可通过光合水裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程再生。因此,这些设计者丁醇生产途径可连续工作。
[0062] 表1列举包括上文所鉴别的用于构建设计者丁醇生产途径的酶的实例。在本说明书中,当提及酶时,例如表1所列举的任何酶,其包括其同工酶、功能类似物和经修饰的设计者酶和其组合。这些酶可被选择用于构建设计者丁醇生产途径(例如图1所示的那些途径)。“同工酶或功能类似物”是指具有相同催化功能,但可能具有或可能不具有完全相同的蛋白质结构的某些酶。酶最基本的特征在于其催化酶促反应的活性位点。因此,也可选择含有此类活性催化位点的某些酶-蛋白质片段或亚基用于本发明。出于各种原因,一些天然酶不仅含有必需催化结构,而且还含有对于指定应用可能需要或可能不需要的其它结构组分。使用生物信息学辅助的分子设计技术,可以选择用于构建编码期望设计者酶的设计者DNA构建体的必需催化结构。因此,在各种实施方案之一中,通过根据生物信息学辅助的分子序列设计而人工合成DNA构建体来产生设计者酶基因。使用计算机辅助的合成生物方法,可选择性地修饰设计者酶的任何DNA序列(因此可选择性地修饰其蛋白质结构)以通过设计获得更期望的结果。因此,术语“经修饰的设计者序列”和“经修饰的设计者酶”在本文中被定义为用生物信息学辅助的分子设计修饰的DNA序列和酶蛋白。举例来说,当从线粒体酶的序列设计叶绿体靶向的设计者酶的DNA构建体时,优选例如通过选择性地切除掉不适用于指定应用的某些结构组分(例如其线粒体转运肽序列),和/或通过添加为了赋予设计者蛋白质的叶绿体靶向插入能力所需的某些肽结构(例如外源叶绿体转运肽序列(例如135-bp Rubisco小亚基转运肽(RbcS2))),修饰一些蛋白质结构。因此,各种实施方案之一灵活使用所述酶、其同工酶、功能类似物、经修饰的设计者酶和/或其组合构建设计者丁醇生产途径。
[0063] 如表1所示,上文鉴别的酶的许多基因已经从各种生物体克隆和/或测序。可使用基因组DNA和/或mRNA序列数据设计和合成设计者DNA构建体,以用于转化宿主藻类、生氧光细菌、植物、植物组织或细胞,从而产生用于光生物丁醇生产的设计者生物体(图1)。然而,因为各种来源生物体和细胞区室相对于特定宿主生物体和其叶绿体/类囊体环境(其中丁醇生产途径被设计成与卡尔文循环一起工作)通常存在可能的变化,所以在DNA构建体设计中的某些分子工程技术,包括密码子使用优化和序列修饰,通常是设计者DNA构建体(图2)良好工作所必需的。举例来说,在产生产丁醇设计者真核藻类中,如果源序列是来自细胞溶质酶(序列),那么可添加功能叶绿体靶向序列,以便使由未知基因编码的设计者酶能够插入宿主叶绿体中,从而将其功能赋予设计者丁醇生产途径。此外,为了对设计者丁醇生产途径提供切换能力,如图2A所示在某些设计者DNA构建体中包含功能诱导型启动子序列,例如氢化酶(Hyd1)或硝酸还原酶(Nia1)基因或亚硝酸还原酶(nirA)基因的启动子,以控制设计者基因的表达,这也是重要的。此外,如先前所述,这些酶(序列)、叶绿体靶向转运肽序列和诱导型启动子序列的某些功能衍生物或片段也可被选择使用,以全部、部分或组合形式用于产生根据本发明的各种实施方案的设计者生物体。产生和使用设计者生物体的技术在下文进一步描述。
[0064] 表1列举用于构建设计者丁醇生产途径的酶的实例。
[0065]
[0066]
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]
[0071]
[0072] 将设计者酶靶向到叶绿体基质区域
[0073] 已知上文讨论的一些设计者酶(例如丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶)可在某些特定细菌如梭菌中工作,但野生型植物叶绿体一般不具有与卡尔文循环一起工作的这些酶。因此,在产生产丁醇真核设计者生物体的各种实施方案之一中,编码这些酶的设计者核酸在宿主细胞叶绿体中表达。这可通过典型地使用基因枪将设计者丁醇生产途径基因递送到真核宿主细胞的叶绿体基因组中来实现。叶绿体的分子遗传学在某种程度上类似于蓝藻。在递送到叶绿体中之后,可通过同源DNA双重重组的天然过程将如图2F所示的含有一对适当重组位点的设计者DNA构建体掺入叶绿体基因组中。
[0074] 在另一个实施方案中,对编码这些酶的核酸进行基因工程改造,使得表达的酶插入叶绿体中以与其中的卡尔文循环一起工作。视特定宿主生物体的遗传背景而定,上文讨论的一些设计者酶,例如磷酸甘油酸变位酶和烯醇化酶,可在一定背景水平上以天然形式存在于野生型叶绿体中。然而,出于通常包括缺乏可控制性的各种原因,一些叶绿体背景酶可能足以或可能不足以充当设计者丁醇生产途径的重要部分。此外,许多可用的诱导型启动子正好在核基因组中工作。举例来说,可用于控制设计者丁醇生产途径表达的氢化酶(Hyd1)启动子和硝酸还原酶(Nia1)启动子位于基因组最近已被测序的莱茵衣藻的核基因组中。因此,在各种实施方案之一中,优选使用核基因组可编码的设计者基因以赋予可切换的丁醇生产途径。因此,编码这些酶的核酸也需要用适当序列修饰进行基因工程改造,使得酶可控地表达并插入叶绿体中以产生设计者丁醇生产途径。
[0075] 根据各种实施方案之一,最好只在叶绿体(在基质区域)中表达设计者丁醇生产途径酶,确切地说是在需要所述酶的作用以实现丁醇光合生产的地方。如果在没有叶绿体靶向插入机制的情况下表达,那么酶只能停留在细胞溶质中且无法直接与卡尔文循环相互作用以便生产丁醇。因此,除了途径设计和相关方法中的明显独特特征外,另一种显著区别在于各种实施方案之一创新地使用叶绿体靶向机构,以将许多设计者丁醇生产途径酶遗传插入叶绿体中,以便直接与卡尔文循环相互作用以用于光生物丁醇生产。
[0076] 使用叶绿体基质靶向机构,细胞不仅能生产丁醇,而且当其返回设计者途径被关闭的某些条件下时,例如在使用设计者氢化酶启动子控制型丁醇生产途径基因的有氧条件下,能自我生长和再生。含有正常线粒体的设计者藻类、植物或植物细胞应能利用来自有机储备物(和/或一些外源有机底物,例如乙酸盐或糖)的还原力(NADH),以便在返回有氧条件之后立即对细胞供能。因此,当设计者藻类、植物或植物细胞在厌氧条件下用于光合生产丁醇之后返回有氧条件时,细胞将会停止产生丁醇生产途径酶,并通过合成新的功能性叶绿体开始恢复正常光自养能力。因此,此类经基因工程改造的设计者藻类/植物生物体可在正常有氧条件下重复多个光自养生长循环,并在某些特定设计者丁醇生产条件下,例如在厌氧条件下和/或在硝酸盐存在下(当使用Nia1启动子控制型丁醇生产途径时),直接从CO2和H2O有效地生产丁醇。
[0077] 设计者丁醇生产途径酶的靶向插入可经由使用编码基质“信号”肽的DNA序列来实现。基质-蛋白质信号(转运)肽引导新合成的蛋白质转运和插入到基质中。根据各种实施方案之一,特定靶向DNA序列优选放置于启动子与设计者丁醇生产途径酶序列之间,如设计者DNA构建体中所示(图2A)。此靶向序列编码作为细胞溶质中酶的载脂蛋白的部分而合成的信号(转运)肽。转运肽指导设计者丁醇生产途径酶的载脂蛋白从细胞溶质插入叶绿体中。在载脂蛋白插入叶绿体之后,转运肽从载脂蛋白裂解,然后载脂蛋白变为活性酶。
[0078] 许多转运肽序列都适合用于设计者丁醇生产途径酶靶向插入叶绿体中,包括(但不限于)以下蛋白质的转运肽序列:氢化酶载脂蛋白(例如HydA1(Hyd1)和HydA2,GenBank登记号AJ308413、AF289201、AY090770)、铁氧还蛋白载脂蛋白(Frx1,登记号L10349、P07839)、硫氧还蛋白m载脂蛋白(Trx2,X62335)、谷氨酰胺合成酶载脂蛋白(Gs2,Q42689)、LhcII载脂蛋白(AB051210、AB051208、AB051205)、PSII-T载脂蛋白(PsbT)、PSII-S载脂蛋白(PsbS)、PSII-W载脂蛋白(PsbW)、CF0CF1亚基-γ载脂蛋白(AtpC)、CF0CF1亚基-δ载脂蛋白(AtpD,U41442)、CF0CF1亚基-II载脂蛋白(AtpG)、光系统I(PSI)载脂蛋白(例如基因PsaD、PsaE、PsaF、PsaG、PsaH和PsaK的PSI载脂蛋白)、Rubisco SSU载脂蛋白(例如RbcS2,X04472)。在本说明书中,当提及转运肽序列例如上文所述的任何转运肽序列时,其包括其功能类似物、经修饰的设计者序列和其组合。此情形下的“功能类似物”或“经修饰的设计者序列”是指基于天然转运肽序列(例如上文所鉴别的)而衍生或修饰(通过例如保守取代、适度缺失或添加氨基酸,或修饰氨基酸侧链)的肽序列,其具有与天然转运肽序列相同的功能,即实现期望酶的靶向插入。
[0079] 在某些特定实施方案中,使用以下转运肽序列指导设计者丁醇生产途径酶插入叶绿体的基质区域:Hyd1转运肽(具有氨基酸序列:msalvlkpca avsirgsscrarqvaprapl aastvrvala tleaparrlg nvacaa(SEQ ID NO:54))、RbcS2转运肽(具有氨基酸序列:maaviakssv saavarpars svrpmaalkp avkaapvaap aqanq(SEQ ID NO:55))、铁氧还蛋白转运肽(具有氨基酸序列:mamamrs(SEQ ID NO:56))、CF0CF1亚基-δ转运肽(具有氨基酸序列:mlaaksiagp rafkasavra apkagrrtvv vma(SEQ IDNO:57))、其类似物、功能衍生物、设计者序列和其组合。
[0080] 使用基因开关控制设计者丁醇生产途径的表达
[0081] 本发明的另一个关键特征是应用基因开关来控制设计者丁醇生产途径的表达,如图1所示。此切换能力是经由使用外部诱导型启动子使得设计者转基因在某些特定诱导条件下诱导性地表达来实现。用于控制宿主中设计者基因表达的启动子优选是来源于宿主自身或密切相关的生物体。启动子在宿主细胞中的活性和可诱导性可通过将启动子放置在报告基因前面,利用任何已知的DNA递送技术将该报告基因构建体引入宿主组织或细胞中,并评定报告基因的表达来测试。
[0082] 在一优选实施方案中,用于控制设计者基因表达的诱导型启动子是可由厌氧生活诱导的启动子,即在厌氧条件下具有活性但在有氧条件下不具活性。设计者藻类/植物生物体可使用CO2作为碳源在有氧条件下执行自养光合作用,并且当设计者生物体培养物生长且准备用于光合丁醇生产时,应用厌氧条件来开启启动子和编码设计者丁醇生产途径的设计者基因。
[0083] 在厌氧条件下变得具有活性的许多启动子都适合用于本发明。举例来说,莱茵衣藻的氢化酶基因(HydA1(Hyd1)和HydA2,GenBank登记号:AJ308413、AF289201、AY090770)的启动子在厌氧条件下具有活性但在有氧条件下不具活性,其可用作有效的基因开关以控制宿主藻类如莱茵衣藻中设计者基因的表达。事实上,衣藻细胞含有一些在厌氧条件下协同诱导的核基因。这些核基因包括氢化酶结构基因自身(Hyd1)、编码细胞色素C6的载脂蛋白的Cyc6基因和编码粪生素氧化酶的Cpx1基因。后两种基因的调控区已经得到充分表征,且约100bp的区域被证实足以在合成基因构建体中通过厌氧生活实现调控(Quinn,Barraco,Ericksson和Merchant(2000).″Coordinate copper-and oxygen-responsive Cyc6 andCpxl expression in Chlamydomonas is mediated by the same element.″J Biol Chem275:6080-6089)。虽然上述诱导型藻类启动子可能适合用于其它植物宿主,特别是与藻类密切相关的植物,但是也可获得这些其它植物(包括高等植物)的同源基因的启动子,并使用其控制设计者基因在那些植物中的表达。
[0084] 在另一个实施方案中,用于本发明的诱导型启动子是藻类硝酸还原酶(Nia1)启动子,其可通过在含硝酸盐的培养基中生长来诱导且在缺乏硝酸盐但含铵的培养基中受到阻遏(Loppes和Radoux(2002)“Two short regions of thepromoter are essential for activation and repression of the nitrate reductase gene inChlamydomonas reinhardtii,”Mol Genet Genomics 268:42-48)。因此,Nia1(基因登记号AF203033)启动子可被选择用于根据培养基中硝酸盐和铵的浓度水平控制设计者基因在藻类中的表达。可被选择用于本发明的其它诱导型启动子包括例如热休克蛋白启动子HSP70A(登记号:
DQ059999、AY456093、M98823;Schroda,Blocker,Beek(2000)The HSP70A promoter as a tool for the improvedexpression of transgenes in Chlamydomonas.Plant Journal
21:121-131)、CabII-1基因的启动子(登记号M24072)、Ca1基因的启动子(登记号P20507)和Ca2基因的启动子(登记号P24258)。
[0085] 在蓝绿藻(生氧光细菌,包括蓝藻和原绿球藻)的情况下,也有很多诱导型启动子可被选择用于本发明。举例来说,发菜PCC 7120(GenBank:BA000019)、荷兰原绿丝蓝细菌(GenBank:U88400;hoxUYH操纵子启动子)、集胞藻PCC 6803株(CyanoBase:sll1220和sll1223)、细长聚球藻PCC 6301(CyanoBase:syc1235_c)、钝顶节旋藻(GenBank:ABC26906)、蓝 杆 菌CCY0110(GenBank:ZP_01727419)和 聚 球 藻 PCC 7002(GenBank:
AAN03566)的厌氧反应性双向氢化酶hox基因的启动子在厌氧条件下有活性但在有氧条件下无活性(Sjoholm,Oliveira和Lindblad(2007)“Transcription and regulation of the bidirectionalhydrogenase in the Cyanobacterium Nostoc sp.strain PCC
7120,”Applied andEnvironmental Microbiology,73(17):5435-5446),它们可用作有效的基因开关以控制设计者基因在宿主生氧光细菌如发菜PCC 7120、集胞藻PCC 6803株、细长聚球藻PCC 6301、蓝杆菌CCY0110、钝顶节旋藻或聚球藻PCC 7002中的表达。
[0086] 在产生可切换的丁醇生产设计者生物体(例如可切换的设计者生氧光细菌)的另一个实施方案中,被选择使用的诱导型启动子是亚硝酸还原酶(nirA)启动子,其可通过在含硝酸盐的培养基中生长来诱导且在缺乏硝酸盐但含铵的培养基中受到阻遏(Qi,Hao,Ng,Slater,Baszis,Weiss和Valentin(2005)“Applicationof the Synechococcus nirA promoter to establish an inducible expression system forengineering the Synechocystis tocopherol pathway,”Applied and EnvironmentalMicrobiology,71(10):5678-5684;Maeda,Kawaguchi,Ohe 和 Omata(1998)“cis-Acting sequences required for NtcB-dependent,nitrite-responsive positiveregulation of the nitrate assimilation operon in the Cyanobacterium Synechococcussp.strain PCC
7942,”Journal of Bacteriology,180(16):4080-4088)。因此,nirA启动子序列可被选择用于根据培养基中硝酸盐和铵的浓度水平控制设计者基因在许多生氧光细菌中的表达。
可被选择和修饰以供使用的nirA启动子序列包括(但不限于)以下生氧光细菌的nirA启动子:细长聚球藻PCC 6301(GenBank:AP008231,区域355890-255950)、聚球藻(GenBank:
X67680.1、D16303.1、D12723.1 和 D00677)、集 胞 藻 PCC 6803(GenBank:NP_442378、BA000022、AB001339、D63999-D64006、D90899-D90917)、鱼 腥 藻(GenBank:X99708.1)、发菜PCC 7120(GenBank:BA000019.2和AJ319648)、鲍氏织线藻(Plectonemaboryanum)(GenBank:D31732.1)、细长聚球藻PCC 7942(GenBank:P39661、CP000100.1)、细长嗜热聚球藻BP-1(GenBank:BAC08901、NP_682139)、层理席藻(Phormidium laminosum)(GenBank:
CAA79655、Q51879)、层理鞭枝藻(GenBank:ABD49353、ABD49351、ABD49349、ABD49347)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)ATCC 29413(GenBank:YP_325032)、海洋原绿球藻MIT9303株(GenBank:YP_001018981)、聚球藻WH 8103(GenBank:AAC17122)、聚球藻WH
7805(GenBank:ZP_01124915)和蓝杆菌CCY0110(GenBank:ZP_01727861)。
[0087] 在另一个实施方案中,被选择使用的诱导型启动子是光反应性和热反应性伴侣基因groE启动子,其可被热和/或光诱导(Kojima和Nakamoto(2007)“A novellight-and heat-responsive regulation of the groE transcription in the absence of HrcAor CIRCE in cyanobacteria,”FEBS Letters 581:1871-1880)。许多groE启动子如groES和groEL(伴侣基因)动子可用作诱导型启动子以控制设计者丁醇生产途径酶的表达。可被选择和修饰以用于各种实施方案之一中的groE启动子序列包括(但不限于)以下生氧光细菌的groES和/或groEL启动子:集胞藻(GenBank:D12677.1)、集胞藻PCC 6803(GenBank:BA000022.2)、细长聚球藻PCC 6301(GenBank:AP008231.1)、聚球藻(GenBank:M58751.1)、细长聚球藻PCC 7942(GenBank:CP000100.1)、发菜PCC 7120(GenBank:BA000019.2)、多变鱼腥藻ATCC 29413(GenBank:CP000117.1)、鱼腥藻L-31(GenBank:AF324500)、细长嗜热聚球藻BP-1(CyanoBase:tll0185,tll0186)、瓦氏聚球藻(GenBank:D78139)、颤藻NKBG091600(GenBank:AF054630)、海洋原绿球藻MIT9313(GenBank:BX572099)、海洋原绿球藻MIT 9303株(GenBank:CP000554)、海洋原绿球藻MIT 9211株(GenBank:
ZP_01006613)、聚球藻WH8102(GenBank:BX569690)、聚球藻CC9605(GenBank:CP000110)、海洋原绿球藻海洋亚种CCMP1375株(GenBank:AE017126)和海洋原绿球藻MED4(GenBank:
BX548174)。
[0088] 也可被选择用于本发明的其它诱导型启动子包括:例如,聚球藻PCC 7942的金属(锌)-诱导型smt启动子(Erbe,Adams,Taylor和Hall(1996)“Cyanobacteriacarrying an smt-lux transcriptional fusion as biosensors for the detection of heavymetal cations,”Journal of Industrial Microbiology,17:80-83);细长聚球藻PCC7942的铁反应性idiA启动子(Michel,Pistorius和Golden(2001)“Unusual regulatoryelements for iron deficiency induction of the idiA gene of Synehococcus elongatusPCC7942”Journal of Bacteriology,183(17):5015-5024);氧化还原反应性蓝藻crhR启动子(Patterson-Fortin,Colvin 和 Owttrim(2006)“A LexA-related proteinregulates redox-sensitive expression of the cyanobacterial RNA helicase,crhR”,Nucleic Acids Research,34(12):3446-3454);集胞藻PCC 6803的热休克基因hsp16.6启动子(Fang 和 Barnum(2004)“Expression ofthe heat shock gene hsp16.6and promoter analysis in the Cyanobacterium,Synechocystis sp.PCC 6803,”CurrentMicrobiology
49:192-198);小分子热休克蛋白(Hsp)启动子如瓦氏聚球藻基因hspA启动子(Nakamoto,Suzuki和Roy(2000)“Constitutive expression of a smallheat-shock protein confers cellular thermotolerance and thermal protection to thephotosynthetic apparatus in cyanobacteria,”FEBS Letters 483:169-174);生氧光细菌碳酸酐酶基因的CO2反应性启动子(GenBank:EAZ90903,EAZ90685,ZP_01624337,EAW33650,ABB17341,AAT41924,CAO89711,ZP_00111671,YP_400464,AAC44830;和CyanoBase:all2929,PMT1568 slr0051,slr1347和syc0167_c);硝酸还原酶基因(narB)启动子(例如GenBank登记号:BAC08907,NP_682145,AAO25121;ABI46326,YP_732075,BAB72570,NP_484656);绿光/红光反应性启动子,例如Fremyella diplosiphon的光调控cpcB2A2启动子(Casey和Grossman(1994)“In vivo and in vitro characterization of the light-regulatedcpcB242 promoter of Fremyella diplosiphont”Journal of Bacteriology,176(20):6362-6374);
和蓝藻基因lexA、recA和ruvB的UV光反应性启动子(Domain,Houot,Chauvat和Cassier-Chauvat(2004)“Function and regulation of thecyanobacterial genes lexA,recA and ruvB:LexA is critical to the survival of cellsfacing inorganic carbon starvation,”Molecular Microbiology,53(1):65-80)。
[0089] 此外,在各种实施方案之一中,某些“半诱导型”或组成型启动子也可被选择结合诱导型启动子使用以构建设计者丁醇生产途径。举例来说,生氧光细菌Rubisco操纵子如rbcL基因的启动子(GenBank:X65960,ZP_01728542,Q3M674,BAF48766,NP_895035,0907262A;CyanoBase:PMT1205,PMM0550,Pro0551,tll1506,SYNW1718,glr2156,alr1524,slr0009)具有某些光依赖性但几乎可以视作组成型启动子,其也可被选择结合诱导型启动子如nirA、hox和/或groE启动子使用以构建设计者丁醇生产途径。
[0090] 在本说明书中,当提及诱导型启动子如上文描述的任何诱导型启动子时,其包括其类似物、功能衍生物、设计者序列和其组合。此情形下的“功能类似物”或“经修饰的设计者序列”是指基于天然启动子序列(例如上文所鉴别的)衍生或修饰(通过例如取代、适度缺失或添加,或修饰核苷酸)的启动子序列,其保留天然启动子序列的功能。
[0091] DNA构建体和宿主生物体中的转化
[0092] 产生DNA构建体以便向宿主藻类、植物、植物组织或植物细胞中引入设计者丁醇生产途径基因。也就是说,将编码设计者丁醇生产途径酶的核苷酸序列放置在载体中,与启动子、优选诱导型启动子可操作地连接,并与编码适当叶绿体靶向转运肽序列的核苷酸序列可操作地连接。在一优选实施方案中,产生在以下5′(上游)至3′(下游)定向上放置有元件的核酸构建体:外部诱导型启动子、转运靶向序列和编码设计者丁醇生产途径酶的核酸,优选还有适当的转录终止序列。一个或一个以上设计者基因(DNA构建体)可放置于一个遗传载体中。图2A描绘此类构建体的一实例。如图2A所述的实施方案中所示,设计者丁醇生产途径转基因是包含以下序列的核酸构建体:a)PCR正向引物;b)外部诱导型启动子;c)转运靶向序列;d)具有适当转录终止序列的设计者丁醇生产途径酶编码序列;和e)PCR反向引物。
[0093] 根据各种实施方案,此DNA构建体的组分a)到e)中的任一种可经调节以便适用于某些特定条件。在实践上,此DNA构建体的组分a)到e)中的任一种可完整或部分应用,和/或以任何调节的组合形式使用,以便获得更理想的结果。举例来说,当使用藻类氢化酶启动子作为设计者丁醇生产途径DNA构建体中的诱导型启动子时,含有此DNA构建体的转基因设计者藻类能够使用环境空气CO2作为碳源来执行自养光合作用,并在有氧条件下(例如开放池塘中)正常生长。当藻类培养物生长且准备用于生产丁醇时,设计者转基因然后可通过厌氧条件下的诱导来表达,因为使用了氢化酶启动子。设计者基因的表达会产生一组设计者丁醇生产途径酶,其与卡尔文循环一起工作以用于光生物丁醇生产(图1)。
[0094] 两种PCR引物是位于DNA构建体开头(5’端)的PCR正向引物(PCR FD引物)和位于另一端(3’端)的PCR反向引物(PCR RE引物),如图2A所示。这对PCR引物是被设计成在需要时向设计者DNA构建体的相对容易PCR扩增提供某种便利,这不仅在为基因转化做准备而合成设计者DNA构建体期间和之后,而且在设计者DNA构建体递送到宿主藻类的基因组中以用于验证转化体中的设计者基因之后都有帮助。举例来说,在使用电穿孔和精氨酸琥珀酸裂解酶(arg7)互补筛选技术于莱茵衣藻-arg7宿主细胞中实现设计者基因的转化后,所得的转化体然后可通过使用这对PCR引物用PCR DNA分析其核DNA来进行分析,以验证完整设计者丁醇生产途径基因(DNA构建体)是否成功地掺入指定转化体的基因组中。当转化体的核DNA PCR分析可产生与根据设计者DNA构建体预测的DNA大小和序列相匹配的PCR产物时,验证了设计者基因成功地掺入到转化体的基因组中。
[0095] 因此,各种实施方案也教导用于有效产生设计者转基因藻类、植物或植物细胞以供光生物生产丁醇的相关方法。在一个实施方案中,这种方法包括以下步骤:a)根据与丁醇生产有关的遗传背景和特定特征选择适当的宿主藻类、植物、植物组织或植物细胞;b)将设计者基因的核酸构建体引入所述宿主藻类、植物、植物组织或植物细胞的基因组中;c)使用设计者DNA构建体的所述PCR引物,用DNA PCR分析验证被转化藻类、植物、植物组织或植物细胞中设计者基因的掺入情况;d)根据DNA构建体的特定设计者特征,通过mRNA、蛋白质和丁醇生产特征的分析来测量和验证设计者生物体特征,例如用于从二氧化碳和水光合生产丁醇的设计者丁醇途径基因的诱导型表达(图2A)。
[0096] 产生设计者转基因生物体以用于光生物生产丁醇的方法的以上实施方案也可反复应用于多个工作循环以获得更理想的结果。在各种实施方案中,上文描述的此方法的步骤a)到d)中的任一个都可经调节以便适用于某些特定条件。在各种实施方案中,所述方法的步骤a)到d)中的任一个可完整或部分应用,和/或以任何调节的组合形式使用。
[0097] 设计者丁醇生产途径基因(DNA构建体)的实施例示于序列表中。SEQ IDNO:1展现设计者丁醇脱氢酶基因的详细DNA构建体(1809bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、262-bp硝酸还原酶Nia1启动子(21-282)、135-bp RbcS2转运肽(283-417)、从丙酮丁醇发酵梭菌丁醇脱氢酶序列(AB257439)选择和修饰的酶编码序列(418-1566)、223-bp RbcS2终止子(1567-1789)和PCR RE引物(1790-1809)。262-bp Nia1启动子(DNA序列21-282)是用作控制设计者丁醇生产途径丁醇脱氢酶基因(DNA序列418-1566)表达的诱导型启动子的一个实例。135-bp RbcS2转运肽(DNA序列283-417)是用作指导设计者酶(DNA序列
418-1566)插入宿主生物体叶绿体中的一个实例。RbcS2终止子(DNA序列1567-1789)的使用是为了适当终止设计者基因的转录和翻译以根据需要生产设计者载脂蛋白(RbcS2转运肽-丁醇脱氢酶)。因为Nia1启动子是仅可控制核基因的表达的核DNA,所以根据衣藻核基因组的密码子使用设计此实例中的合成丁醇生产途径基因。因此,在这种情况下,设计者酶基因在核中转录。其mRNA天然移位到细胞溶质中,在那里mRNA被翻译成载脂蛋白,其是由在C端与丁醇脱氢酶蛋白(对应于DNA序列418-1566)的N端连接在一起的RbcS2转运肽(对应于DNA序列283-417)组成。载脂蛋白的转运肽指导其转运通过叶绿体膜并转运入基质区域,在那里转运肽被从载脂蛋白切除下来。所得的丁醇脱氢酶然后继续其作为酶的功能以用于叶绿体中的设计者丁醇生产途径。这两种PCR引物(序列1-20和1790-1809)是从人类肌动蛋白基因序列选择和修饰,且可彼此配对。针对衣藻GenBank检索(blasting)所述序列未发现其同源序列。因此,其可用作验证被转化藻类中的设计者基因的DNA PCR分析的适当PCR引物。
[0098] SEQ ID NO:2展现设计者丁醛脱氢酶DNA构建体的实施例2(2067bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、262-bp硝酸还原酶Nia1启动子(21-282)、135-bpRbcS2转运肽(283-417)、从丙酮丁醇发酵梭菌丁醛脱氢酶序列(AY251646)选择和修饰的丁醛脱氢酶编码序列(418-1824)、223-bp RbcS2终止子(1825-2047)和PCR RE引物(2048-2067)。此DNA构建体类似于实施例1(SEQ ID NO:1),但使用从丙酮丁醇发酵梭菌丁醛脱氢酶序列(AY251646)选择和修饰的丁醛脱氢酶编码序列(418-1824)。
[0099] SEQ ID NO:3展现设计者丁酰辅酶A脱氢酶构建体的实施例3(1815bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、262-bp硝酸还原酶启动子(21-282)、9-bp Xho INdeI位点(283-291)、135-bp RbcS2转运肽(292-426)、从拜氏梭菌丁酰辅酶A脱氢酶序列(AF494018)选择/修饰的丁酰辅酶A脱氢酶编码序列(427-1563)、9-bp XbaI位点(1564-1572)、223-bp RbcS2终止子(1573-1795)和3’端的PCR RE引物(1796-1815)。此DNA构建体类似于实施例1(SEQ ID NO:1),但使用从拜氏梭菌丁酰辅酶A脱氢酶序列(AF494018)选择/修饰的丁酰辅酶A脱氢酶编码序列(427-1563),且添加Xho I NdeI和XbaI限制性位点以产生关键组件如靶向序列(292-426)和设计者酶序列(427-1563)作为模单元,其可在必要时灵活替换以节省基因合成成本并提高工作生产率。请注意,酶不必须是拜氏梭菌丁酰辅酶A脱氢酶;其它来源如溶纤维丁酸弧菌、产丁酸菌L2-50、热解糖高温厌氧杆菌的许多丁酰辅酶A脱氢酶(例如表1所列的),包括其同工酶、经修饰的设计者酶和功能类似物,也可被选择使用。
[0100] SEQ ID NO:4展现设计者巴豆酸酶DNA构建体的实施例4(1482bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、262-bp硝酸还原酶启动子(21-282)、9-bp Xho I NdeI位点(283-291)、135-bp RbcS2转运肽(292-426)、从拜氏梭菌巴豆酸酶序列(Genbank:AF494018)选择/修饰的巴豆酸酶编码序列(427-1209)、21-bp Lumio-标签编码序列(1210-1230)、含终止密码子的9-bp XbaI位点(1231-1239)、223-bpRbcS2终止子(1240-1462)和3’端的PCR RE引物(1463-1482)。此DNA构建体类似于实施例3(SEQ ID NO:3),但使用从拜氏梭菌巴豆酸酶的序列(Genbank:AF494018)选择/修饰的巴豆酸酶编码序列(427-1209),并在烯醇化酶序列的C端添加21-bp Lumio-标签编码序列(1210-1230)。此处使用21-bp Lumio-标签序列(1210-1230)编码Lumio肽序列Gly-Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys(SEQ ID NO:58),其在用目前可从Invitrogen[https://catalog.invitrogen.com]购得的Lumio试剂处理时可发荧光。Lumio分子标记技术是基于荧光素的EDT(1,2-乙二硫醇)偶联双砷衍生物(Lumio试剂),其结合于工程改造的四半胱氨酸序列(Keppetipola,Coffman等人TM
(2003).Rapid detection of in vitro expressed proteins using Lumio technology,Gene Expression,25.3:7-11)。四半胱氨酸序列是由Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(SEQ ID NO:59)组成,其中Xaa是任何非半胱氨酸氨基酸,例如此实例中的Pro或Gly。EDT连接的Lumio试剂允许砷原子自由旋转,这会淬灭荧光素的荧光。Lumio砷基的巯基与四半胱氨酸之间形成共价键可预防砷原子的自由旋转,从而释放荧光素的荧光(Griffin,Adams和Tsien(1998),″Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells″,Science,281:269-272)。这也允许通过荧光分子成像法显现四半胱氨酸标记的蛋白质。因此,以此方式使用Lumio标签可在设计者巴豆酸酶表达时对其进行监测和/或追踪,以验证设计者丁醇生产途径酶是否真的按照设计递送到宿主生物体的叶绿体中。此实例中连接到巴豆酸酶蛋白C端的Lumio标签(短的7氨基酸肽)应对设计者酶的功能具有最小影响,但允许在用Lumio试剂处理时显现设计者酶分子。Lumio标签的使用完全是可选的。如果Lumio标签以某种方式影响设计者酶功能,那么此标签可在DNA序列设计中缺失。
[0101] SEQ ID NO:5展现设计者3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶DNA构建体的实施例5(1367bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、84-bp硝酸还原酶启动子(21-104)、9-bp Xho I NdeI位点(105-113)、135-bp RbcS2转运肽(114-248)、从拜氏梭菌3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶序列(Genbank:AF494018)选择/修饰的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码序列(249-1094)、21-bp Lumio-标签序列(1095-1115)、9-bp XbaI位点(1116-1124)、
223-bp RbcS2终止子(1125-1347)和PCR RE引物(1348-1367)。此DNA构建体类似于实施例4(SEQ ID NO:4),但使用84-bp硝酸还原酶启动子(21-104)和从拜氏梭菌3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶序列(Genbank:AF494018)选择/修饰的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码序列(249-1094)。84-bp硝酸还原酶启动子是通过接合天然莱茵衣藻Nial启动子的两个部分同源序列区域(相对于起始转录位点的-231到-201和-77到-25)人工形成。实验研究证实了84-bp序列比天然Nial启动子活性更高(Loppes和Radoux(2002)″Two short regions of the promoter areessential for activation and repression of the nitrate reductase gene inChlamydomonas reinhardtii,″Mol Genet Genomics 268:
42-48)。因此,这也是一个实例,其中功能性合成序列、类似物、功能衍生物和/或经修饰的设计者序列如84-bp合成序列可根据本发明的各种实施方案被选择使用。
[0102] SEQ ID NO:6展现设计者硫解酶DNA构建体的实施例6(1721bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、84-bp硝酸还原酶启动子(21-104)、9-bp Xho I NdeI位点(105-113)、135-bp RbcS2转运肽(114-248)、从溶纤维丁酸弧菌硫解酶序列(AB190764)选择/修饰的硫解酶编码序列(248-1448)、21-bp Lumio-标签序列(1449-1469)、9-bp XbaI位点(1470-1478)、223-bp RbcS2终止子(1479-1701)和PCR RE引物(1702-1721)。此DNA构建体也类似于实施例4(SEQ ID NO:4),但使用硫解酶编码序列(249-1448)和84-bp合成Nia1启动子(21-104)。这是功能性合成序列也可被选择用于设计者DNA构建体中的另一个实例。
[0103] SEQ ID NO:7展现设计者丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶DNA构建体的实施例7(4211bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、2x84-bp硝酸还原酶启动子(21-188)、9-bp Xho I NdeI位点(189-197)、135-bp RbcS2转运肽(198-332)、从巴氏变形鞭毛虫丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶序列(GenBank:AY101767)选择/修饰的丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶编码序列(333-3938)、21-bp Lumio-标签序列(3939-3959)、9-bp XbaI位点(3960-3968)、223-bp RbcS2终止子(3969-4191)和PCR RE引物(4192-4211)。此DNA构建体也类似于实施例4(SEQID NO:4),但使用设计者2x84-bp Nia1启动子和从巴氏变形鞭毛虫丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶序列(GenBank:AY101767)选择/修饰的丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶编码序列(333-3938)。2x84-bp Nia1启动子是以上文SEQ ID NO:6展现的
84-bp合成Nia1启动子序列的串联重复形式构建。实验测试显示了2x84-bp合成Nia1启动子甚至比活性高于天然Nia1启动子的84-bp序列还要有效(Loppes和Radoux(2002)″Two short regions of the promoter are essential for activation andrepression of the nitrate reductase gene in Chlamydomonas reinhardtii,″Mol GenetGenomics 268:
42-48)。使用具有各种启动子强度的这种类型的诱导型启动子序列还可帮助调节丁醇生产途径的设计者酶的表达水平。
[0104] SEQ ID NO:8展现设计者丙酮酸激酶DNA构建体的实施例8(2021bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、84-bp硝酸还原酶启动子(21-104)、9-bp Xho I NdeI位点(105-113)、135-bp RbcS2转运肽(114-248)、从酿酒酵母丙酮酸激酶序列(GenBank:AY949876)选择/修饰的丙酮酸激酶编码序列(249-1748)、21-bpLumio-标签序列(1749-1769)、9-bp XbaI位点(1770-1778)、223-bp RbcS2终止子(1779-2001)和PCR RE引物(2002-2021)。此DNA构建体类似于实施例6(SEQID NO:6),但使用丙酮酸激酶编码序列(249-1748)。
[0105] SEQ ID NO:9展现设计者烯醇化酶基因的实施例9(1815bp),其是由PCRFD引物(序列1-20)、262-bp硝酸还原酶启动子(21-282)、9-bp Xho I NdeI位点(283-291)、135-bp RbcS2转运肽(292-426)、从莱茵衣藻细胞溶质烯醇化酶序列(Genbank:X66412,P31683)选择/修饰的烯醇化酶编码序列(427-1542)、21-bpLumio-标签编码序列(1507-1527)、含终止密码子的9-bp XbaI位点(1543-1551)、223-bp RbcS2终止子(1552-1795)和3’端的PCR RE引物(1796-1815)组成。此DNA构建体类似于实施例
3(SEQ ID NO:3),但使用从莱茵衣藻细胞溶质烯醇化酶序列选择/修饰的烯醇化酶编码序列(427-1542)。
[0106] SEQ ID NO:10展现设计者磷酸甘油酸变位酶DNA构建体的实施例10(2349bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、262-bp硝酸还原酶启动子(21-282)、9-bpXho I NdeI位点(283-291)、135-bp RbcS2转运肽(292-426)、从莱茵衣藻细胞溶质磷酸甘油酸变位酶序列(JGI Chlre2蛋白质ID161689,Genbank:AF268078)选择/修饰的磷酸甘油酸变位酶编码序列(427-2097)、9-bp XbaI位点(2098-2106)、223-bp RbcS2终止子(2107-2329)和3’端的PCR RE引物(2330-2349)。此DNA构建体类似于实施例3(SEQ ID NO:3),但使用从莱茵衣藻细胞溶质磷酸甘油酸变位酶序列选择/修饰的磷酸甘油酸变位酶编码序列(427-2097)。
[0107] SEQ ID NO:11展现设计者磷酸甘油酸激酶DNA构建体的实施例11(1908bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、262-bp硝酸还原酶Nia1启动子(21-282)、从包括其叶绿体信号肽和成熟酶序列的莱茵衣藻叶绿体磷酸甘油酸激酶序列(GenBank:U14912)选择的磷酸甘油酸激酶编码序列(283-1665)、223-bp RbcS2终止子(1666-1888)和PCR RE引物(1889-1908)。此DNA构建体类似于实施例1(SEQ ID NO:1),但使用从包括其叶绿体信号肽和成熟酶序列的莱茵衣藻叶绿体磷酸甘油酸激酶序列选择的磷酸甘油酸激酶编码序列(283-1665)。因此,这也是一个实例,其中核编码的叶绿体酶如莱茵衣藻叶绿体磷酸甘油酸激酶的序列也可用于在适当时具有适当诱导型启动子如Nia1启动子(DNA序列21-282)的设计者丁醇生产途径基因的设计和构建中。
[0108] SEQ ID NO:12展现设计者甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的实施例12(1677bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、262-bp硝酸还原酶Nia1启动子(21-282)、135-bpRbcS2转运肽(283-417)、从Mesostigma viride细胞溶质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(mRNA)序列(GenBank登记号DQ873404)选择和修饰的酶编码序列(418-1434)、223-bp RbcS2终止子(1435-1657)和PCR RE引物(1658-1677)。此DNA构建体类似于实施例1(SEQ ID NO:1),但使用从Mesostigma viride细胞溶质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(mRNA)序列(GenBank登记号DQ873404)选择和修饰的酶编码序列(418-1434)。
[0109] SEQ ID NO:13展现设计者HydA1启动子连接型磷酸甘油酸变位酶DNA构建体的实施例13(2351bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、282-bp HydA1启动子(21-302)、135-bp RbcS2转运肽(303-437)、从莱茵衣藻细胞溶质磷酸甘油酸变位酶序列(JGI Chlre2蛋白质ID161689,Genbank:AF268078)选择/修饰的磷酸甘油酸变位酶编码序列(438-2108)、223-bp RbcS2终止子(2109-2331)和PCR RE引物(2332-2351)。此设计者DNA构建体非常类似于实施例1(SEQ ID NO:1),但使用282-bp HydA1启动子(21-302)和从莱茵衣藻细胞溶质磷酸甘油酸变位酶序列选择/修饰的磷酸甘油酸变位酶编码序列(438-2108)。282-bp HydA1启动子(21-302)已经在发明人的实验室里通过实验分析被证实有活性。使用HydA1启动子(21-302)允许通过使用厌氧培养基条件激活设计者酶的表达。
[0110] 使用与SEQ ID NO:13(实施例13)所示相同的使用诱导型厌氧启动子和叶绿体靶向序列的原理,SEQ ID NO:14-23展示设计者基因实施例14-23。简言之,SEQ ID NO:14展现设计者HydA1启动子连接型烯醇化酶DNA构建体的实施例14(1796bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、282-bp HydA1启动子(21-302)、135-bp RbcS2转运肽(303-437)、从莱茵衣藻细胞溶质烯醇化酶序列(Genbank:X66412,P31683)选择/修饰的烯醇化酶编码序列(438-1553)、223-bp RbcS2终止子(1554-1776)和PCR RE引物(1777-1796)。
[0111] SEQ ID NO:15展现设计者HydA1启动子控制型丙酮酸激酶DNA构建体的实施例15,其包含PCR FD引物(序列1-20)、282-bp HydA1启动子(21-302)、135-bp RbcS2转运肽(303-437)、从莱茵衣藻细胞溶质丙酮酸激酶序列(JGI Chlre3蛋白质ID138105)选择/修饰的丙酮酸激酶编码序列(438-1589)、223-bp RbcS2终止子(1590-1812)和PCR RE引物(1813-1832)。
[0112] SEQ ID NO:16展现设计者HydA1启动子连接型丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶DNA构建体的实施例16(4376bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、282-bpHydA1启动子(21-302)、135-bp RbcS2转运肽(303-437)、从非洲脱硫弧菌丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶序列(GenBank登记号Y09702)选择/修饰的丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶编码序列(438-4133)、223-bp RbcS2终止子(4134-4356)和PCR RE引物(4357-4376)。
[0113] SEQ ID NO:17展现设计者HydA1启动子连接型丙酮酸-NADP+氧化还原酶DNA构建体的实施例17(6092bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、282-bpHydA1启动子(21-302)、+135-bp RbcS2转运肽(303-437)、从纤细眼虫丙酮酸-NADP 氧化还原酶序列(GenBank登记+
号AB021127)选择/修饰的丙酮酸-NADP 氧化还原酶编码序列(438-5849)、223-bp RbcS2终止子(5850-6072)和PCR RE引物(6073-6092)。
[0114] SEQ ID NO:18展现设计者HydA1启动子连接型硫解酶DNA构建体的实施例18(1856bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、282-bp HydA1启动子(21-302)、135-bp RbcS2转运肽(303-437)、从热解糖高温厌氧杆菌硫解酶序列(GenBankZ92974)选择/修饰的硫解酶编码序列(438-1613)、223-bp RbcS2终止子(1614-1836)和PCR RE引物(1837-1856)。
[0115] SEQ ID NO:19展现设计者HydA1启动子连接型3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶DNA构建体的实施例19(1550bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、282-bpHydA1启动子(21-302)、135-bp RbcS2转运肽(303-437)、从热解糖高温厌氧杆菌3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶序列(GenBank Z92974)选择/修饰的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码序列(438-1307)、223-bp RbcS2终止子(1308-1530)和PCR RE引物(1531-1550)。
[0116] SEQ ID NO:20展现设计者HydA1启动子连接型巴豆酸酶DNA构建体的实施例20(1457bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、282-bp HydA1启动子(21-302)、135-bp RbcS2转运肽(303-437)、从热解糖高温厌氧杆菌巴豆酸酶序列(GenBank Z92974)选择/修饰的巴豆酸酶编码序列(438-1214)、223-bp RbcS2终止子(1215-1437)和PCR RE引物(1438-1457)。
[0117] SEQ ID NO:21展现设计者HydA1启动子连接型丁酰辅酶A脱氢酶DNA构建体的实施例21(1817bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、282-bp HydA1启动子(21-302)、135-bp RbcS2转运肽(303-437)、从热解糖高温厌氧杆菌丁酰辅酶A脱氢酶序列(GenBank Z92974)选择/修饰的丁酰辅酶A脱氢酶编码序列(438-1574)、223-bp RbcS2终止子(1575-1797)和PCR RE引物(1798-1817)。
[0118] SEQ ID NO:22展现设计者HydA1启动子连接型丁醛脱氢酶DNA构建体的实施例22(2084bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、282-bp HydA1启动子(21-302)、135-bp RbcS2转运肽(303-437)、从丙酮丁醇发酵梭菌丁醛脱氢酶序列(GenBankAY251646)选择/修饰的丁醛脱氢酶编码序列(438-1841)、223-bpRbcS2终止子(1842-2064)和PCR RE引物(2065-2084)。
[0119] SEQ ID NO:23展现设计者HydA1启动子连接型丁醇脱氢酶DNA构建体的实施例23(1733bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、282-bp HydA1启动子(21-302)、135-bp RbcS2转运肽(303-437)、从拜氏梭菌丁醇脱氢酶序列(GenBank AF157307)选择/修饰的丁醇脱氢酶编码序列(438-1490)、223-bpRbcS2终止子(1491-1713)和PCR RE引物(1714-1733)。
[0120] 使用与先前所述相同的使用2x84合成Nia1启动子和叶绿体靶向机构的原理,SEQ ID NO:24-26展示设计者酶DNA构建体的更多实施例。简言之,SEQ IDNO:24展现设计者果糖二磷酸醛缩酶DNA构建体的实施例24,其包含PCR FD引物(序列1-20)、2x84-bp NR启动子(21-188)、从莱茵衣藻叶绿体果糖-1,6-二磷酸醛缩酶序列(GenBank:X69969)选择/修饰的果糖二磷酸醛缩酶编码序列(189-1313)、223-bp RbcS2终止子(1314-1536)和PCR RE引物(1537-1556)。
[0121] SEQ ID NO:25展现设计者磷酸丙糖异构酶DNA构建体的实施例24,其包含PCR FD引物(序列1-20)、2x84-bp NR启动子(21-188)、从拟南芥叶绿体磷酸丙糖异构酶序列(GenBank:AF247559)选择和修饰的磷酸丙糖异构酶编码序列(189-1136)、223-bp RbcS2终止子(1137-1359)和PCR RE引物(1360-1379)。
[0122] SEQ ID NO:26展现设计者磷酸果糖激酶DNA构建体的实施例26,其包含PCR FD引物(序列1-20)、2x84-bp NR启动子(21-188)、135-bp RbcS2转运肽(189-323)、从拟南芥6-磷酸果糖激酶序列(GenBank:NM_001037043)选择/修饰的磷酸果糖激酶编码序列(324-1913)、223-bp RbcS2终止子(1914-2136)和PCR RE引物(2137-2156)。
[0123] 核酸构建体,如上文实施例中所展现者,可包含其它适当序列,例如选择标记基因和可选的生物分子标签序列(例如实施例4(SEQ ID NO:4)所述的Lumio标签)。可被选择用于构建体中的可选择标记包括赋予卡那霉素(kanamycin)、潮霉素(hygromycin)、壮观霉素(spectinomycin)、链霉素、磺酰脲、庆大霉素(gentamycin)、氯霉素(chloramphenicol)等抗性的标记,所有这些标记已被克隆且可为所属领域技术人员获得。可选地,选择标记是营养标记基因,其可补充宿主生物体的某种缺陷。举例来说,编码精氨酸琥珀酸裂解酶(arg7)的基因可用作设计者构建体中的选择标记基因,其允许在使用莱茵衣藻arg7-(负)细胞作为宿主细胞时鉴别转化体。
[0124] 携带设计者基因的核酸构建体可使用可用的基因转化技术递送到宿主藻类、蓝绿藻、植物或植物组织或细胞中,例如电穿孔、PEG诱导的摄入、DNA的基因枪递送和农杆菌介导的转化。出于递送设计者构建体到藻类细胞中的目的,可选择电穿孔、玻璃珠和基因枪技术作为优选方法;且具有单细胞或简单扁平体结构的藻类优选用于转化。转化体可基于常规技术鉴别和测试。
[0125] 各种设计者基因可以逐步方式依次引入宿主细胞,或使用一个构建体或在一个转化中同时引入宿主细胞。举例来说,针对10种酶、3-磷酸甘油酸分叉的丁醇生产途径,在SEQ ID NO:13-16(或17)和18-23中所示的10种DNA构建体可放入遗传载体中,例如具有单一选择标记(Arg7)的p389-Arg7。因此,通过以这种方式使用质粒,可在一个转化中递送所有10种DNA构建体(设计者基因)到精氨酸必需型莱茵衣藻-arg7宿主(CC-48)中,以用于3-磷酸甘油酸分叉的丁醇生产途径(图1中的03-12)的表达。必要时,含有10种DNA构建体的转化体可被进一步转化,以使更多设计者基因和其它选择标记如链霉素进入其基因组DNA。通过使用基因转化中的各种设计者酶DNA构建体(例如SEQ ID NO:1-26所展现者)与适当宿主生物体的组合,可构建各种丁醇生产途径,例如图1所示者。举例来说,SEQ ID NO:1-12的设计者DNA构建体可被选择用于构建甘油醛-3-磷酸分叉的丁醇生产途径(图1中的01-12),SEQ ID NO:1-12、24和25的设计者DNA构建体可被选择用于构建果糖-1,6-二磷酸分叉的丁醇生产途径(20-33);且SEQ ID NO:1-12和24-26的设计者DNA构建体可被选择用于构建果糖-6-磷酸分叉的丁醇生产途径(19-33)。
[0126] 用于增强光合丁醇生产的其它宿主修饰
[0127] NADPH/NADH转化机制
[0128] 根据光合丁醇生产途径,从4CO2和5H2O生产1分子的丁醇可能需要14ATP和12NADPH,其皆由光合水裂解和跨类囊体膜的光合磷酸化产生。为了3-磷酸甘油酸分叉的丁醇生产途径(图1中的03-12)能够工作,优选使用可利用由光驱动的电子传递过程产生的NADPH的丁醇生产途径酶。丙酮丁醇发酵梭菌丁醇脱氢酶(GenBank登记号:AB257439)和丁醛脱氢酶(GenBank:AY251646)是能接受NADP(H)或NAD(H)的丁醇生产途径酶的实例。此类可利用NADPH和NADH(即NAD(P)H)的丁醇生产途径酶也可被选择用于此3-磷酸甘油酸分叉的设计者丁醇生产途径和任何其它的设计者丁醇生产途径(图1)。拜氏梭菌丁酰辅酶A脱氢酶(GenBank:AF494018)和3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(GenBank:AF494018)是只能接受NAD(H)的丁醇生产途径酶的实例。当使用只能利用NADH的丁醇生产途径酶时,其可能需要NADPH/NADH转化机制,以便此3-磷酸甘油酸分叉的丁醇生产途径能良好工作。然而,取决于宿主生物体的遗传背景,NADPH与NADH的转化机制可存在于宿主中,使得NADPH和NADH可互换地用于生物体中。此外,已知NADPH可通过NADPH-磷酸酶活性转化为NADH(Pattanayak和Chatterjee(1998)“Nicotinamide adenine dinucleotide phosphatephosphatase facilitates dark reduction of nitrate:regulation by nitrate and ammonia,”Biologia Plantarium 41(1):75-84),且NAD可通过NAD激酶活性转 化为NADP(Muto,Miyachi,Usuda,Edwards和 Bassham(1981)“Light-induced conversion ofnicotinamide adenine dinucleotide to nicotinamide adenine dinucleotide phosphate inhigher plant leaves,”Plant Physiology 68(2):324-328;
+ +
Matsumura-Kadota,Muto,Miyachi(1982)“Light-induced conversion of NADto NADPin Chlorella cells,”Biochimica Biophysica Acta 679(2):300-300)。因此,当需要增强NADPH/NADH转化时,宿主可经遗传修饰以提高NADPH磷酸酶和NAD激酶活性。因此,在各种实施方案之一中,光合产丁醇设计者植物、设计者藻类或植物细胞进一步在藻类叶绿体的基质区域含有其它设计者转基因(图2B)以诱导性地表达一种或一种以上酶,从而促进NADPH/NADH相互转化,例如NADPH磷酸酶和NAD激酶(GenBank:XM_001609395,XM_001324239)。
[0129] 可提供NADPH/NADH转化机制的另一个实施方案是正确选择卡尔文循环中用于设计者丁醇生产途径分叉的适当分叉点。为了通过根据此实施方案的途径设计赋予此NADPH/NADH转化机制,优选如图1所示在卡尔文循环的甘油醛-3-磷酸点上或之后分叉设计者丁醇生产途径。在这些途径设计中,NADPH/NADH转化基本上通过两步机制实现:1)使用卡尔文循环的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的步骤,其利用NADPH将1,3-二磷酸甘油酸还原为甘油+醛-3-磷酸;和2)使用设计者途径的NAD 依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶01的步骤,其在将甘油醛-3-磷酸氧化为1,3-二磷酸甘油酸中产生NADH。上文描述的两个步骤的最终结果是NADPH转化为NADH,这可为设计者丁醇生产途径供应NADH形式的所需还原力。对于步骤
1),使用宿主生物体中天然存在的卡尔文循环的NADPH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶通常+
是足够的。因此,引入设计者NAD 依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶01与卡尔文循环的NADPH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶一起工作可赋予NADPH/NADH转化机制的功能,这是3-磷酸+
甘油酸分叉的丁醇生产途径(图1中的03-12)良好工作所必需的。为此,设计者NAD 依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA构建体(实施例12,SEQ ID NO:12)也可用作NADPH/NADH转化设计者基因(图2B),以支持各种实施方案之一中的3-磷酸甘油酸分叉的丁醇生产途+
径(图1中的03-12)。这也解释了为什么使用NAD 依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶01赋予设计者丁醇生产途径这种两步NADPH/NADH转化机制是重要的。因此,在各种实施方案之一+
中,也优选在如图1所示的设计者丁醇生产途径中使用NAD 依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶、其同工酶、功能衍生物、类似物、经修饰的设计者酶和/或其组合。
[0130] 用于进一步驯化光合调控机制的iRNA技术
[0131] 在本发明的另一个实施方案中,进一步修饰宿主植物或细胞以驯化卡尔文循环,使得宿主可直接生产液态燃料丁醇,而不是合成通常低效且很难供生物精炼工业使用的淀粉(在生氧光细菌的情况下是糖原)、纤维素和木质纤维素。根据各种实施方案之一,淀粉合成活性的失活是通过抑制与卡尔文循环(图1)有关的淀粉合成途径的任何关键酶(例如淀粉合成酶(在生氧光细菌的情况下是糖原合成酶)13、葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)腺苷酰转移酶14、磷酸葡萄糖变位酶15和磷酸己糖异构酶16)的表达来实现。
[0132] 引入可抑制淀粉合成活性的可遗传传递的因子会进一步增强光合丁醇生产,所述淀粉合成活性与设计者丁醇生产途径对于卡尔文循环产物存在竞争关系。在一特定实施方案中,竞争性淀粉合成途径的可遗传编码的抑制剂(图2C)是干扰RNA(iRNA)分子,其特异性地抑制淀粉合成途径酶的合成,例如图1的数字标识13-16所示的淀粉合成酶16、葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)腺苷酰转移酶15、磷酸葡萄糖变位酶14和/或磷酸己糖异构酶13。分别编码淀粉合成酶iRNA、葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)腺苷酰转移酶iRNA、磷酸葡萄糖变位酶iRNA和/或G-P-异构酶iRNA的DNA序列可基于所属领域技术人员已知的RNA干扰技术进行设计和合成(Liszewski(2003年6月1日)Progress in RNA interference,GeneticEngineering News,第23卷,第11期,第1-59页)。一般来说,干扰RNA(iRNA)分子是反义的,但与特定蛋白质(基因)的正常mRNA互补,使得此类iRNA分子可特异性地结合特定基因的正常mRNA,从而抑制(阻断)基因特异mRNA翻译为蛋白质(Fire,Xu,Montgomery,Kostas,Driver,Mello(1998)“Potent andspecific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans”.Nature 391(6669):806-11;
Dykxhoorn,Novina,Sharp(2003)“Killing the messenger:short RNAs that silence gene expression”,Nat Rev Mol Cell Biol.4(6):457-67)。
[0133] 列举的SEQ ID NO:27和28展示设计者淀粉合成iRNA DNA构建体(图2C)的实施例。简言之,SEQ ID NO:27展现设计者Nia1启动子控制型淀粉合成酶iRNADNA构建体的实施例27(860bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、262-bpNia1启动子(21-282)、由起始密码子atg和莱茵衣藻淀粉合成酶mRNA序列(GenBank:AF026422)的两个单一序列片段的反向互补序列组成的淀粉合成酶iRNA序列(283-617)、223-bp RbcS2终止子(618-850)和PCR RE引物(851-860)。因为使用了Nia1启动子(21-282),所以此设计者淀粉合成iRNA-基因被设计成仅在需要时表达,以便在其特异性诱导物硝酸盐(NO3)的存在下增强光生物丁醇生产,硝酸盐可添加到培养基中作为肥料以诱导设计者生物体。淀粉合成酶iRNA序列(283-617)被设计成与淀粉合成酶基因的正常mRNA结合,因此阻断其翻译成功能淀粉合成酶。以此方式抑制16处的淀粉/糖原合成酶活性是为了将卡尔文循环的更多光合产物导向卡尔文循环分叉的丁醇生产途径,例如如图1所示的甘油醛-3-磷酸分叉的丁醇生产途径01-12。
[0134] SEQ ID NO:28展现设计者HydA1启动子控制型淀粉合成酶iRNA DNA构建体的实施例28(1328bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、282-bp HydA1启动子(21-302)、设计者淀粉合成酶iRNA序列(303-1085)、223-bp RbcS2终止子(1086-1308)和PCR RE引物(1309-1328)。设计者淀粉合成酶iRNA序列(303-1085)是由从莱茵衣藻淀粉合成酶mRNA序列(GenBank:AF026422)的前300-bp单一编码序列选择的300-bp有义片段(303-602)、183-bp设计者内含子样环(603-785)和与莱茵衣藻淀粉合成酶mRNA序列(GenBank:
AF026422)的前300-bp编码序列互补的300-bp反义序列(786-1085)组成。此设计者淀粉合成酶iRNA序列(303-1085)被设计以通过以下两种机制抑制淀粉合成酶的合成。第一,
300-bp反义互补iRNA序列(对应于DNA序列786-1085)与淀粉合成酶基因的正常mRNA结合,因此阻止其翻译成功能淀粉合成酶。第二,300-bp反义互补iRNA序列(对应于DNA序列786-1085)也可与同一设计者iRNA分子中的300-bp有义搭配序列(counterpart)(对应于DNA序列303-602)结合,从而形成以183-bp设计者内含子样序列(603-785)作为环的发夹状双链RNA结构。实验研究已经显示这种类型的发夹状双链RNA也可触发转录后基因沉默(Fuhrmann,Stahlberg,Govorunova,Rank和Hegemann(2001)Journal of Cell Science114:3857-3863)。因为使用了HydA1启动子(21-302),所以此设计者淀粉合成iRNA基因被设计成仅在需要时于厌氧条件下表达,以便通过将卡尔文循环的更多光合产物导向丁醇生产途径(例如如图1所示的01-12、03-12和/或20-33)来增强光生物丁醇生产。
[0135] 设计者淀粉降解和糖酵解基因
[0136] 在本发明的另一个实施方案中,光生物丁醇生产是通过掺入可促进淀粉/糖原降解和糖酵解的另一组设计者基因(图2D)连同设计者丁醇生产途径(图2A)来增强。此类用于淀粉降解的其它设计者基因包括例如编码17:淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶的基因,和编码18:葡萄糖-磷酸-异构酶(G-P-异构酶)的基因,如图1所示。设计者糖酵解基因编码叶绿体靶向的糖酵解酶:磷酸葡萄糖异构酶18、磷酸果糖激酶19、醛缩酶20、磷酸丙糖异构酶21、甘油醛-3-磷酸脱氢酶22、磷酸甘油酸激酶23、磷酸甘油酸变位酶24、烯醇化酶25和丙酮酸激酶26。设计者淀粉降解和糖酵解基因组合图1所示的任何丁醇生产途径可形成从淀粉/糖原产生丁醇的其它途径(17-33)。因此,设计者淀粉降解和糖酵解基因与丁醇生产途径基因的共表达也可增强丁醇的光生物生产。因此,此实施方案代表驯化卡尔文循环以增强丁醇的光生物生产的另一种方法。在这种情况下,一些卡尔文循环产物流过淀粉合成途径(13-16),随后流过淀粉/糖原制丁醇途径(17-33),如图1所示。在这种情况下,淀粉/糖原充当着卡尔文循环产物在可转化为丁醇之前的暂时储存池。这种机制在最大化某些情况下的丁醇生产产率方面可非常有用。举例来说,在高太阳光强度下,例如正午前后,卡尔文循环光合CO2固定速率可高至超过丁醇生产途径的最大速率能力;使用淀粉合成机制允许过量光合产物的暂时储存,以便在以后也可用于丁醇生产。
[0137] 图1也说明了使用具有设计者酶(如17到33所标记)的设计者淀粉/糖原制丁醇途径连同卡尔文循环分叉的设计者丁醇生产途径,例如甘油醛-3-磷酸分叉的丁醇生产途径01-12,以便增强光生物丁醇生产。类似于使用卡尔文循环分叉的设计者丁醇生产途径的好处,使用设计者淀粉/糖原制丁醇途径(17-33)也可在糖可转化为不能由生物精炼工业便捷地使用的其它复杂生物分子如木质纤维素生物质之前,帮助光合产物转化为丁醇。因此,卡尔文循环分叉的设计者丁醇生产途径(例如01-12、03-12和/或20-33)和/或设计者淀粉/糖原制丁醇途径(17-33)的适当使用可尤其代表革命性技术,其可有效地避免当前生物质技术的瓶颈问题,包括“木质纤维素顽抗性”问题。
[0138] 另一个特征是卡尔文循环分叉的设计者丁醇生产途径活性(例如01-12、03-12和/或20-33)可主要在有光的白天发生,因为其利用卡尔文循环的中间产物,这需要由光合水裂解和光驱动的质子移位偶联的经由藻类类囊体膜系统的电子传递过程所产生的还原力(NADPH)和能量(ATP)供应。可利用已经在光合期间作为淀粉/糖原储存的盈余糖的设计者淀粉/糖原制丁醇途径(17-33)不仅可在白天工作,也可在夜间工作。因此,如图1所示使用卡尔文循环分叉的设计者丁醇生产途径(例如01-12、03-12和/或20-33)连同设计者淀粉/糖原制丁醇途径(17-33)可在白天和夜间生产丁醇。
[0139] 因为设计者淀粉/糖原制丁醇途径和卡尔文循环分叉的设计者丁醇生产途径的表达是通过使用诱导型启动子如厌氧氢化酶启动子控制,所以这种类型的设计者生物体也能在有氧(正常)条件下光自养生长。当设计者光合生物体生长且准备用于光生物丁醇生产时,细胞然后放在特定诱导条件如厌氧条件下[或肥料由铵变为硝酸盐,如果使用设计者Nia1/nirA启动子控制型丁醇生产途径的话]以增强丁醇生产,如图1和3所示。
[0140] 所列举的SEQ ID NO:29-33展示设计者淀粉(糖原)降解基因的实施例。简言之,SEQ ID NO:29展现设计者淀粉酶DNA构建体的实施例29(1889bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、2x84-bp NR启动子(21-188)、9-bp Xho I NdeI位点(189-197)、135-bp RbcS2转运肽(198-332)、从大麦α-淀粉酶(GenBank:J04202A,my46表达在糊粉细胞中测试)选择和修饰的淀粉酶编码序列(333-1616)、21-bp Lumio-标签序列(1617-1637)、9-bp XbaI位点(1638-1646)、223-bp RbcS2终止子(1647-1869)和PCR RE引物(1870-1889)。
[0141] SEQ ID NO:30展现设计者淀粉磷酸化酶DNA构建体的实施例30(3089bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、2x84-bp NR启动子(21-188)、135-bp RbcS2转运肽(189-323)、从柑橘根淀粉磷酸化酶序列(GenBank:AY098895,表达在柑橘根中测试)选择和修饰的淀粉磷酸化酶编码序列(324-2846)、223-bp RbcS2终止子(2847-3069)和PCR RE引物(3070-3089)。
[0142] SEQ ID NO:31展现设计者己糖激酶DNA构建体的实施例31(1949bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、2x84-bp NR启动子(21-188)、135-bp RbcS2转运肽(189-323)、从荚膜阿耶罗菌己糖激酶mRNA序列(Genbank:XM_001541513)选择和修饰的己糖激酶编码序列(324-1706)、223-bp RbcS2终止子(1707-1929)和PCR RE引物(1930-1949)。
[0143] SEQ ID NO:32展现设计者磷酸葡萄糖变位酶DNA构建体的实施例32(2249bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、2x84-bp NR启动子(21-188)、135-bp RbcS2转运肽(189-323)、从树干毕赤酵母磷酸葡萄糖变位酶序列(GenBank:XM_001383281)选择和修饰的磷酸葡萄糖变位酶编码序列(324-2006)、223-bpRbcS2终止子(2007-2229)和PCR RE引物(2230-2249)。
[0144] SEQ ID NO:33展现设计者磷酸葡萄糖异构酶DNA构建体的实施例33(2231bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、2x84-bp NR启动子(21-188)、135-bp RbcS2转运肽(189-323)、从酿酒酵母磷酸葡萄糖异构酶序列(GenBank:M21696)选择和修饰的磷酸葡萄糖异构酶编码序列(324-1988)、223-bp RbcS2终止子(1989-2211)和PCR RE引物(2212-2231)。
[0145] 设计者淀粉降解基因如SEQ ID NO:29-33所示者可被选择与各种设计者丁醇生产途径基因组合使用,以便构建各种设计者淀粉降解丁醇生产途径,例如图1所示的途径。举例来说,SEQ ID NO:1-12、24-26和29-33所示的设计者基因可被选择用于构建Nia1启动子控制型淀粉制丁醇生产途径,其是由以下设计者酶组成:淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激+
酶、丙酮酸-NADP 氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶。该淀粉/糖原制丁醇途径17-33可单独使用和/或与其它丁醇生产途径如3-磷酸甘油酸分叉的丁醇生产途径03-12组合使用,如图1所示。
[0146] 在叶绿体与细胞质之间分配设计者丁醇生产途径
[0147] 在本发明的另一个实施方案中,光生物丁醇生产率是通过在真核植物细胞的叶绿体与细胞质之间设计者丁醇生产途径的选择分布来提高。也就是说,不是所有的设计者丁醇生产途径(图1)都必须在叶绿体中工作;必要时,部分设计者丁醇生产途径也可在细胞质中工作。举例来说,在各种实施方案之一中,来自二羟基丙酮磷酸的设计者淀粉制丁醇途径活性的一大部分(21-33)被设计成在细胞质中发生,而从淀粉生产二羟基丙酮磷酸的步骤(17-20)是在叶绿体中。在此实例中,设计者途径的叶绿体部分与细胞质部分之间的联系是通过使用促进二羟基丙酮转运通过叶绿体膜的磷酸丙糖-磷酸转运器来实现。通过使用磷酸丙糖-磷酸转运器,甘油醛-3-磷酸分叉的设计者丁醇生产途径不仅可在叶绿体中工作,也可在细胞质中工作。设计者丁醇生产途径的细胞质部分可通过使用叶绿体靶向序列如图2E所示被省略的设计者丁醇生产途径基因(图2A的DNA构建体)来构建。
[0148] 在细胞质中具有设计者丁醇生产途径的设计者生氧光细菌
[0149] 在典型地含有光合类囊体膜而不是叶绿体结构的原生光合生物体如蓝绿藻(生氧光细菌,包括蓝藻和原绿球藻)中,卡尔文循环位于细胞质中。在这种特殊情况下,完整设计者丁醇生产途径(图1),包括(但不限于)甘油醛-3-磷酸分叉的丁醇生产途径(01-12)、3-磷酸甘油酸分叉的丁醇生产途径(03-12)、果糖-1,6-二磷酸分叉的途径(20-33)、果糖-6-磷酸分叉的途径(19-33)和淀粉(或糖原)制丁醇途径(17-33),在设计中被调节以便与卡尔文循环在蓝绿藻的细胞质中一起工作。细胞质设计者丁醇生产途径可通过使用叶绿体靶向序列均被省略的设计者丁醇生产途径基因(图2A的DNA构建体)来构建。当如图2E所示在设计者DNA构建体中省略叶绿体靶向序列时,设计者基因在细胞质中被转录并翻译为设计者酶,借此赋予设计者丁醇生产途径。设计者基因可通过使用所属领域技术人员已知的基因转化技术掺入宿主蓝绿藻(生氧光细菌,包括蓝藻和原绿球藻)的染色体DNA和/或质粒DNA中。优选通过整合式转化将设计者基因整合到染色体DNA中,这可通常为设计者基因提供较好的遗传稳定性。在生氧光细菌如蓝藻中,整合式转化可通过使用如图2F所示的设计者DNA构建体将同源DNA双重重组到宿主染色体DNA中的过程来实现,所述设计者DNA构建体从5’上游到3’下游典型地由重组位点1、设计者丁醇生产途径基因和重组位点2组成。这种类型的DNA构建体(图2F)可用包括电穿孔、天然转化和/或接合的许多可用基因转化技术递送到生氧光细菌(蓝绿藻)中。从蓝绿藻产生的转基因设计者生物体也被称为设计者蓝绿藻(设计者生氧光细菌,包括设计者蓝藻和设计者原绿球藻)。
[0150] 所列举的SEQ ID NO:34-45展示设计者生氧光细菌丁醇生产途径基因的实施例。简言之,SEQ ID NO:34展现设计者生氧光细菌丁醇脱氢酶DNA构建体的实施例34(1709bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、细长嗜热聚球藻BP-1的400-bp亚硝酸还原酶(nirA)启动子(21-420)、从丙酮丁醇发酵梭菌丁醇脱氢酶序列(AB257439)选择和修饰的酶编码序列(421-1569)、细长嗜热聚球藻BP-1的120-bp rbcS终止子(1570-1689)和
3’端的PCR RE引物(1690-1709)。
[0151] SEQ ID NO:35展现设计者生氧光细菌丁醛脱氢酶DNA构建体的实施例35(1967bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、400-bp细长嗜热聚球藻BP-1亚硝酸还原酶nirA启动子(21-420)、从丙酮丁醇发酵梭菌丁醛脱氢酶序列(AY251646)选择和修饰的酶编码序列(421-827)、细长嗜热聚球藻BP-1的120-bp rbcS终止子(1828-1947)和3’端的PCR RE引物(1948-1967)。
[0152] SEQ ID NO:36展现设计者生氧光细菌丁酰辅酶A脱氢酶DNA构建体的实施例36(1602bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、305-bp细长嗜热聚球藻BP-1硝酸还原酶启动子(21-325)、从拜氏梭菌丁酰辅酶A脱氢酶序列(AF494018)选择/修饰的丁酰辅酶A脱氢酶编码序列(326-1422)、120-bp细长嗜热聚球藻BP-1rbcS终止子(1423-1582)和3’端的PCR RE引物(1583-1602)。
[0153] SEQ ID NO:37展现设计者生氧光细菌巴豆酸酶DNA构建体的实施例37(1248bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、305-bp细长嗜热聚球藻BP-1硝酸还原酶启动子(21-325)、从拜氏梭菌巴豆酸酶序列(GenBank:AF494018)选择/修饰的巴豆酸酶编码序列(326-1108)、120-bp细长嗜热聚球藻BP-1 rbcS终止子(1109-1228)和PCR RE引物(1229-1248)。
[0154] SEQ ID NO:38展现设计者生氧光细菌3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶DNA构建体的实施例38(1311bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、305-bp nirA启动子(21-325)、从拜氏梭菌3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶序列巴豆酸酶(GenBank:AF494018)选择/修饰的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码序列(326-1171)、120-bp细长嗜热聚球藻BP-1 rbcS终止子(1172-1291)和PCR RE引物(1292-1311)。
[0155] SEQ ID NO:39展现设计者生氧光细菌硫解酶DNA构建体的实施例39(1665bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、细长嗜热聚球藻BP-1的305-bp nirA启动子(21-325)、从溶纤维丁酸弧菌硫解酶序列(AB190764)选择/修饰的硫解酶编码序列(326-1525)、细长嗜热聚球藻BP-1的120-bp rbcS终止子(1526-1645)和PCR RE引物(1646-1665)。
[0156] SEQ ID NO:40展现设计者生氧光细菌丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶DNA构建体的实施例40(4071bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、细长嗜热聚球藻BP-1的305-bp nirA启动子(21-325)、从巴氏变形鞭毛虫丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶(GenBank:AY101767)选择/修饰的丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶编码序列(326-3931)、细长嗜热聚球藻BP-1的120-bp rbcS终止子(3932-4051)和PCR RE引物(4052-4071)。
[0157] SEQ ID NO:41展现设计者生氧光细菌丙酮酸激酶DNA构建体的实施例41(1806bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、细长嗜热聚球藻BP-1的305-bp nirA启动子(21-325)、从Thermoproteus tenax丙酮酸激酶(GenBank:AF065890)选择/修饰的丙酮酸激酶编码序列(326-1666)、120-bp细长嗜热聚球藻BP-1 rbcS终止子(1667-1786)和
3’端的PCR RE引物(1787-1806)。
[0158] SEQ D NO:42展现设计者生氧光细菌烯醇化酶DNA构建体的实施例42(1696bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、细长嗜热聚球藻BP-1的231-bp nirA启动子(21-251)、从莱茵衣藻细胞溶质烯醇化酶序列(GenBank:X66412,P31683)选择/修饰的烯醇化酶编码序列(252-1556)、细长嗜热聚球藻BP-1的120-bp rbcS终止子(1557-1676)和3’端的PCR RE引物(1677-1696)。
[0159] SEQ ID NO:43展现设计者生氧光细菌磷酸甘油酸变位酶DNA构建体的实施例43(2029bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、细长嗜热聚球藻BP-1的231-bpnirA启动子(21-251)、从喜温发酵菌(Pelotomaculum thermopropionicum)SI磷酸甘油酸变位酶序列(GenBank:YP_001213270)选择/修饰的磷酸甘油酸变位酶编码序列(252-1889)、120-bp细长嗜热聚球藻BP-1 rbcS终止子(1890-2009)和3’端的PCR RE引物(2010-2029)。
[0160] SEQ ID NO:44展现设计者生氧光细菌磷酸甘油酸激酶DNA构建体的实施例44(1687bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、细长嗜热聚球藻BP-1的231-bpnirA启动子(21-251)、从喜温发酵菌SI磷酸甘油酸激酶(BAF60903)选择的磷酸甘油酸激酶编码序列(252-1433)、234-bp细长嗜热聚球藻BP-1rbcS终止子(1434-1667)和PCR RE引物(1668-1687)。
[0161] SEQ ID NO:45展现设计者生氧光细菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA构建体的实施例45(1514bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、305-bp细长嗜热聚球藻BP-1nirA启动子(21-325)、从绿色芽生绿菌(Blastochloris viridis)NAD依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(CAC80993)选择和修饰的酶编码序列(326-1260)、细长嗜热聚球藻BP-1的234-bp rbcS终止子(1261-1494)和PCR RE引物(1495-1514)。
[0162] 设计者生氧光细菌基因如SEQ ID NO:34-45所示者可被选择以供完全或部分使用,和/或与各种其它设计者丁醇生产途径基因组合使用,以便构建各种设计者生氧光细菌丁醇生产途径,例如图1所示的途径。举例来说,SEQ ID NO:34-45所示的设计者基因可被选择用于构建生氧光细菌nirA启动子控制型和甘油醛-3-磷酸分叉的丁醇生产途径(01-12),其是由以下设计者酶组成:NAD依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶01、磷酸甘油酸激酶02、磷酸甘油酸变位酶03、烯醇化酶04、丙酮酸激酶05、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶+(或丙酮酸-NADP 氧化还原酶)06、硫解酶07、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶08、巴豆酸酶09、丁酰辅酶A脱氢酶10、丁醛脱氢酶11和丁醇脱氢酶12。在嗜热和/或耐热蓝藻中使用这些设计者生氧光细菌丁醇生产途径基因(SEQ ID NO:34-45)可代表嗜热和/或耐热产丁醇生氧光细菌。举例来说,在嗜热/耐热蓝藻如细长嗜热聚球藻BP-1中使用这些设计者基因(SEQ ID NO:34-45)可代表设计者嗜热/耐热产丁醇蓝藻,例如设计者产丁醇嗜热聚球藻。
[0163] 用于帮助确保生物安全的其它宿主修饰
[0164] 本发明还提供生物安全防护型光合生物燃料生产方法,其是基于细胞分裂可控型设计者转基因植物(例如藻类和生氧光细菌)或植物细胞。细胞分裂可控型设计者光合生物体(图3)是通过使用设计者生物安全控制基因(图2G)连同设计者丁醇生产途径基因(图2A-2F)来产生,使得其细胞分裂和杂交功能可被可控地停止以提供更好的生物安全特征。
[0165] 在各种实施方案之一中,基本特征是设计者细胞分裂可控型光合生物体(例如藻类、植物细胞或生氧光细菌)含有两种关键功能(图3A):设计者生物安全机制和设计者生物燃料生产途径。如图3B所示,设计者生物安全特征是由包括以下的许多机制赋予:(1)设计者质子通道可诱导地插入细胞质膜以使任何细胞分裂和杂交能力永久丧失,(2)选择性地应用设计者细胞分裂周期调控蛋白或干扰RNA(iRNA)以永久抑制细胞分裂周期且优选使细胞保持在G1期或G0状态,和(3)创新使用高CO2需求的宿主光合生物体以便表达设计者生物燃料生产途径。设计者生物燃料生产途径的实例包括设计者丁醇生产途径,其与卡尔文循环一起工作以从二氧化碳(CO2)和水(H2O)直接合成生物燃料如丁醇。设计者细胞分裂控制技术可帮助确保使用设计者生物体来光合生产生物燃料中的生物安全。因此,此实施方案尤其提供基于细胞分裂可控型设计者产生物燃料藻类、蓝藻、原绿球藻、植物或植物细胞而生产生物燃料的生物安全防护型方法。
[0166] 在各种实施方案之一中,细胞分裂可控型设计者产丁醇真核藻类或植物细胞是通过引入设计者质子通道基因(图2H)到宿主藻类或植物细胞中来产生(图3B)。SEQ ID NO:46展现设计者Nia1启动子控制型质子通道基因的详细DNA构建体的实施例46(609bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、262-bp硝酸还原酶Nia1启动子(21-282)、蜂毒肽(Melittin)质子通道编码序列(283-366)、223-bpRbcS2终止子(367-589)和PCR RE引物(590-609)。
[0167] 设计者质子通道基因(图2H)的表达是由诱导型启动子如硝酸还原酶(Nia1)启动子控制,所述诱导型启动子也可用于控制设计者生物燃料生产途径基因的表达。因此,在诱导设计者基因表达之前,设计者生物体可使用CO2作为碳源和H2O作为电子源,与野生型生物体类似地光自养生长。当设计者生物体培养物生长且准备用于光生物生产生物燃料时,细胞培养物然后放在特定诱导条件下(例如通过添加硝酸盐到培养基中,如果使用硝酸还原酶(Nia1)启动子作为诱导型启动子的话)以诱导设计者质子通道基因和设计者生物燃料生产途径基因的表达。质子通道基因的表达被设计成通过其在核中的转录和在细胞溶质中的翻译来进行。因为特定分子设计,被表达的质子通道自动插入细胞质膜,但光合类囊体膜保持完好。设计者质子通道插入细胞质膜破坏横跨细胞质膜的质子梯度,使得细胞分裂和杂交功能永久丧失。然而,叶绿体内部的光合类囊体膜保持完好(功能),使得表达到基质区域中的设计者生物燃料生产途径酶可与卡尔文循环一起工作,以便从CO2和H2O光生物生产生物燃料。也就是说,当设计者质子通道基因和设计者生物燃料生产途径基因被开启时,设计者生物体变成用于生物燃料的专用光合生产的不可繁殖细胞。因为细胞分裂和杂交功能在此阶段永久丧失(杀死),所以设计者生物体培养物不再是活物,但其用于CO2和H2O光生物转化为生物燃料的催化功能得到保留。任何遗传物质不再能与任何其它细胞配对或交换,即使其不知何故接触野生型细胞,如在偶然释放到环境中的情况下。
[0168] 根据各种实施方案之一,硝酸还原酶(Nia1)启动子或亚硝酸还原酶(nirA)启动子是用于控制设计者基因表达的优选诱导型启动子。在培养基中存在铵(而不是硝酸盐)的情况下,例如,具有Nia1启动子控制型设计者质子通道基因和生物燃料生产途径基因的设计者生物体可使用CO2作为碳源和H2O作为电子源,与野生型生物体类似地光自养生长。当设计者生物体培养物生长且准备用于光生物生产生物燃料时,设计者质子通道基因和设计者生物燃料生产途径基因的表达则可通过添加一些硝酸盐肥料到培养基中来诱导。硝酸盐广泛存在于地球的土壤和几乎所有地表水中。因此,即使Nia1启动子控制型设计者生物体偶然释放到天然环境中,其也会很快死亡,因为环境中的硝酸盐会遏制Nia1启动子控制型设计者质子通道基因的表达,这会将质子通道插入细胞质膜中,从而杀死细胞。也就是说,具有Nia1启动子控制型质子通道基因的设计者光合生物体被设计成一旦遇到环境中的硝酸盐就会死亡。具有Nia1启动子控制型质子通道基因的细胞分裂可控型设计者生物体的这种特征提供附加的生物安全特征。
[0169] 构建具有类囊体膜靶向序列的质子通道基因(图2H)的技术最近已有公开[James W.Lee(2007).Designer proton-channel transgenic algae for光生物hydrogen production,PCT国际公开案第WO 2007/134340A2号]。在产生细胞分裂可控型设计者生物体的本发明中,质子通道基因设计中必须省略类囊体膜靶向序列。举例来说,Nia1启动子控制型设计者质子通道基因的必需组分可简单地是与质子通道编码序列(无任何类囊体膜靶向序列)连接的Nia1启动子,使得质子通道将插入细胞质膜而不是光合类囊体膜中。
[0170] 根据各种实施方案之一,优选使用相同的诱导型启动子如Nia1启动子来控制设计者质子通道基因和设计者生物燃料生产途径基因的表达。以这种方式,设计者生物燃料生产途径可与终止某些细胞功能(包括细胞分裂和杂交)的设计者质子通道基因的表达同时诱导性地表达。
[0171] 在各种实施方案之一中,可用于此设计者生物安全实施方案中的诱导型启动子选自由以下组成的组:氢化酶启动子[HydA1(Hyd1)和HydA2,登记号:AJ308413、AF289201、AY090770]、Cyc6基因启动子、Cpx1基因启动子、热休克蛋白启动子HSP70A、CabII-1基因(登记号M24072)启动子、Ca1基因(登记号P20507)启动子、Ca2基因(登记号P24258)启动子、硝酸还原酶(Nia1)启动子、亚硝酸还原酶基因(nirA)启动子、双向氢化酶基因hox启动子、光反应性和热反应性groE启动子、Rubisco操纵子rbcL启动子、金属(锌)诱导型smt启动子、铁反应性idiA启动子、氧化还原反应性crhR启动子、热休克基因hsp16.6启动子、小分子热休克蛋白(Hsp)启动子、CO2反应性碳酸酐酶基因启动子、绿光/红光反应性cpcB2A2启动子、UV光反应性lexA、recA和ruvB启动子、硝酸还原酶基因(narB)启动子和其组合。
[0172] 在另一个实施方案中,细胞分裂可控型设计者光合生物体是通过使用碳酸酐酶缺陷型突变株或高CO2需求突变株作为宿主生物体以产生设计者生物燃料生产生物体来产生。可被选择用于本发明的高CO2需求突变株包括(但不限于):缺乏CO2浓缩机制的莱茵衣藻碳酸酐酶缺陷型突变株12-1C(CC-1219 cal mt-)、莱茵衣藻cia3突变株(Plant Physiology 2003,132:2267-2275)、聚球藻PCC 7942株的高CO2需求突变株M3或集胞藻PCC 6803的羧酶体缺陷型细胞(Plant biol(Stuttg)2005,7:342-347)只能在高CO2浓度水平如0.2-3%CO2下光自养生长。
[0173] 在大气CO2浓度水平(380ppm)下,碳酸酐酶缺陷型或高CO2需求突变株通常无法存活。因此,此处的关键构思是缺乏CO2浓缩机制的高CO2需求设计者产生物燃料生物体总是在高CO2浓度水平(0.2-5%CO2)下于具有CO2进料的密封生物反应器中生长并用于生物燃料的光生物生产。这类设计者转基因生物体在暴露于大气CO2浓度水平(380ppm=0.038%CO2)时无法存活,因为其用于有效光合CO2固定的CO2浓缩机制(CCM)已被突变损坏。即使此类设计者生物体偶然释放到天然环境中,其细胞也将很快不能分裂或杂交,但很快死于碳饥饿,因为其不能在大气CO2浓度(380ppm)下有效地进行光合CO2固定。因此,使用这类高CO2需求突变株作为设计者生物燃料生产途径基因的基因转化的宿主生物体代表另一种方法,用于产生设想的细胞分裂可控型设计者生物体,以便从CO2和H2O进行生物燃料的生物安全防护型光生物生产。此处不需要设计者质子通道基因。
[0174] 在另一个实施方案中,细胞分裂可控型设计者生物体(图3B)是通过使用设计者细胞分裂周期调控基因作为生物安全控制基因(图2G)来产生,所述生物安全控制基因可控制宿主生物体中细胞分裂周期(cdc)基因的表达,使得设计者基因在特定诱导后可诱导型关闭其繁殖功能,例如永久关闭细胞分裂和杂交能力。
[0175] 生物学上,天然cdc基因的表达控制蓝藻、藻类和高等植物细胞中的细胞生长和细胞分裂周期。细胞周期最基本的功能是在S期(S代表合成)精确复制染色体中大量的DNA,然后在M期(M代表有丝分裂)将拷贝精确分离入两个遗传上相同的子细胞中。有丝分裂典型地从染色体凝集开始:封装入拉长染色体中的复制DNA链凝集成其分离所必需的紧密得多的染色体。核被膜然后分解,各自由一对姐妹染色单体组成的复制染色体附着于有丝分裂纺锤体的微管。随着有丝分裂的进行,细胞在称为中期的状态下短暂停止,此时染色体在有丝分裂纺锤体的赤道线对齐,保持平衡以用于分离。姐妹染色单体的突然分离标志着后期的开始,在此期间染色体移动到纺锤体的对立两极,在那里它们解凝集并重组完整核。细胞然后被细胞质分裂(胞质分裂)夹成两个,细胞分裂这样便完成了。应注意,大多数细胞生长和倍增其蛋白质和细胞器物质所需的时间比复制其DNA(S期)和分裂(M期)所需的时间要长得多。因此,存在两个间期:在M期与S期之间的G1期,和在S期与有丝分裂之间的G2期。结果,真核细胞周期传统上分为四个连续期:G1、S、G2和M。生理学上,这两个间期还为细胞提供时间监测内部和外部环境,以在细胞于S期和有丝分裂期发生巨变之前确保条件合适且准备完全。G1期在这方面特别重要。其持续时间可显著变化,取决于外部条件和来自其它细胞的胞外信号。例如,如果胞外条件不适宜,那么细胞将通过G1延迟进展,甚至可能进入被称为G0的专门休止期,其中它们在继续增殖之前停留数天、数周或甚至数年。事实上,许多细胞直到死为止都永久停留在G0状态。
[0176] 在各种实施方案之一中,使用编码设计者cdc调控蛋白或特异性cdc-iRNA的设计者基因来诱导型抑制某些cdc基因的表达,以便在设计者基因被特定诱导条件触发时停止细胞分裂并使杂交能力丧失。当细胞分裂可控型设计者培养物生长且准备用于光合生产生物燃料时,例如,优选诱导特定设计者cdc-iRNA基因的表达并诱导设计者生物燃料生产途径基因,使得细胞将永久停滞在G1期或G0状态。如此,生长的设计者生物体细胞变成从CO2和H2O光合生产生物燃料的完美催化剂,而其细胞分裂和杂交功能则在G1期或G0状态被永久关闭以帮助确保生物安全。
[0177] 使用具有SEQ ID:1-45中列举的各种设计者生物燃料生产途径基因的生物安全实施方案可产生各种生物安全防护型光生物生物燃料生产者(图3A、3B和3C)。应注意,SEQ ID NO:46和1-12(实施例1-12)代表含有设计者Nia1启动子控制型质子通道基因(SEQ ID NO:46)和一组设计者Nia1启动子控制型丁醇生产途径基因(SEQ ID NO:1-12)的细胞分裂可控型设计者真核生物体如细胞分裂可控型设计者藻类(例如衣藻)的一个实例。因为设计者质子通道基因和设计者生物燃料生产途径基因均由相同的Nia1启动子序列控制,所以它们可在通过添加硝酸盐肥料到培养基中诱导后同时表达,以提供生物安全防护型光合生物燃料生产能力,如图3B所示。在高CO2需求的宿主光合生物体如莱茵衣藻碳酸酐酶缺陷型突变株12-1C(CC-1219 cal mt-)或莱茵衣藻cia3突变株中使用设计者Nia1启动子控制型丁醇生产途径基因(SEQ ID NO:1-12)代表着产生细胞分裂可控型设计者光合生物体以帮助确保生物安全的一个实例。
[0178] 此设计者生物安全特征还可用于生产其它生物燃料,例如生物油、生物氢、乙醇和中间产物。举例来说,此生物安全实施方案组合一组设计者乙醇生产途径基因(例如SEQ ID NO:47-53所示者)可代表细胞分裂可控型乙醇生产者(图3C)。简言之,SEQ ID NO:47展现nirA启动子控制型设计者NAD依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的详细DNA构建体的实施例47(1360基对(bp)),其包含:PCR FD引物(序列1-20)、从聚球藻PCC 7942株(淡水蓝藻)亚硝酸还原酶基因启动子序列选择的88-bp nirA启动子(21-108)、从Cyanidium caldarium细胞溶质NAD依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶序列(GenBank登记号:CAC85917)选择和修饰的酶编码序列(109-1032)、308-bp聚球藻PCC 7942株rbcS终止子(1033-1340)和3’端的PCR RE引物(1341-1360)。
[0179] SEQ ID NO:48展现nirA启动子控制型设计者磷酸甘油酸激酶DNA构建体的实施例48(1621bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、88-bp聚球藻PCC 7942株亚硝酸还原酶nirA启动子(21-108)、从Geobacillus kaustophilus HTA426磷酸甘油酸激酶序列(GenBank:BAD77342)选择的磷酸甘油酸激酶编码序列(109-1293)、308-bp聚球藻PCC7942株rbcS终止子(1294-1601)和PCR RE引物(1602-1621)。
[0180] SEQ ID NO:49展现设计者nirA启动子控制型磷酸甘油酸变位酶DNA构建体的实施例49(1990bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、88-bp聚球藻PCC 7942株亚硝酸还原酶nirA启动子(21-108)、9-bp Xho I NdeI位点(109-117)、从Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903磷酸甘油酸变位酶(GenBank:ABP67536)选择的磷酸甘油酸变位酶编码序列(118-1653)、9-bp XbaI位点(1654-1662)、308-bp聚球藻PCC 7942株rbcS终止子(1663-1970)和PCR RE引物(1971-1990)。
[0181] SEQ ID NO:50展现设计者nirA启动子控制型烯醇化酶DNA构建体的实施例50(1765bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、88-bp聚球藻PCC 7942株亚硝酸还原酶nirA启动子(21-108)、9-bp Xho I NdeI位点(109-117)、从蓝杆菌CCY0110烯醇化酶序列(GenBank:ZP_01727912)选择的烯醇化酶编码序列(118-1407)、21-bp Lumio-标签编码序列(1408-1428)、含有终止密码子的9-bpXbaI位点(1429-1437)、308-bp聚球藻PCC 7942株rbcS终止子(1438-1745)和3’端的PCR RE引物(1746-1765)。
[0182] SEQ ID NO:51展现设计者nirA启动子控制型丙酮酸激酶DNA构建体的实施例51(1888bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、88-bp聚球藻PCC 7942株亚硝酸还原酶nirA启动子(21-108)、9-bp Xho I NdeI位点(109-117)、从反刍兽月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)丙酮酸激酶序列(GenBank:AB037182)选择的丙酮酸激酶编码序列(118-1530)、21-bp Lumio-标签编码序列(1531-1551)、9-bp XbaI位点(1552-1560)、
308-bp聚球藻PCC 7942株rbcS终止子(1561-1868)和PCR RE引物(1869-1888)。
[0183] SEQ ID NO:52展现设计者nirA启动子控制型丙酮酸脱羧酶DNA构建体的实施例52(2188bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、88-bp聚球藻PCC 7942株亚硝酸还原酶nirA启动子(21-108)、9-bp Xho I NdeI位点(109-117)、从树干毕赤酵母丙酮酸脱羧酶序列(GenBank:XM_001387668)的序列选择的丙酮酸脱羧酶编码序列(118-1830)、21-bp Lumio-标签序列(1831-1851)、9-bp XbaI位点(1852-1860)、308-bp聚球藻PCC 7942株rbcS终止子(1861-2168)和3’端的PCRRE引物(2169-2188)。
[0184] SEQ ID NO:53展现nirA启动子控制型设计者NAD(P)H依赖性醇脱氢酶DNA构建体的实施例53(1510bp),其包含PCR FD引物(序列1-20)、88-bp聚球藻PCC 7942株亚硝酸还原酶nirA启动子(21-108)、从乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)醇脱氢酶(ADH3)基因序列(GenBank:X62766)选择/修饰(去除其线粒体信号肽序列)的NAD(P)H依赖性醇脱氢酶编码序列(109-1161)、21-bp Lumio-标签序列(1162-1182)、308-bp聚球藻PCC 7942株rbcS终止子(1183-1490)和3’端的PCR RE引物(1491-1510)。
[0185] 应注意,SEQ ID NO:47-53(DNA构建体实施例47-53)代表可用于生氧光细菌如聚球藻PCC 7942株中的一组设计者nirA启动子控制型乙醇生产途径基因。在高CO2需求蓝藻如聚球藻PCC 7942株突变株M3中使用这组设计者乙醇生产途径基因代表用于从CO2和H2O生物安全防护性地光合生产生物燃料的细胞分裂可控型设计者蓝藻的另一个实例。
[0186] 与光生物反应器-丁醇收集工艺一起使用设计者产丁醇生物体
[0187] 各种实施方案进一步教导包括设计者细胞分裂可控型生物体(图3)的设计者生物体如何可与光生物反应器和丁醇分离-收集工艺一起使用,以使用太阳光从CO2和H2O直接光合生产丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)和O2。关于设计者生物体如何可用于光生物丁醇生产存在很多实施方案。优选实施方案之一是将从CO2和H2O直接光合生产丁醇的设计者生物体与光生物反应器和丁醇收集(过滤和蒸馏/蒸发)系统一起使用,所述光生物反应器和丁醇收集系统包括被描述为一系列以下步骤的特定操作工艺:a)使设计者转基因生物体在基本培养基中,使用空气CO2作为碳源,在有氧(正常)条件下,在设计者丁醇生产途径基因的表达被诱导之前光自养生长;b)当设计者生物体培养物生长且准备用于丁醇生产时,将培养物密封入或放入特定条件中,例如可通过从光生物反应器中去除O2而产生的厌氧条件,以诱导设计者丁醇生产基因的表达;c)当设计者丁醇生产途径酶表达时,对用作从CO2和H2O光合生产丁醇的催化剂的表达设计者基因的细胞供应可见光能如太阳光;d)通过所属领域技术人员已知的任何方法收集产物丁醇。举例来说,通过膜过滤与蒸馏/蒸发丁醇收集技术的组合从光生物反应器收集丁醇产物,并从反应器灵活地收集O2气体产物。
[0188] 使用从CO2和H2O光合生产CH3CH2CH2CH2OH和O2的设计者生物体与生物反应器和丁醇收集和气体产物分离和收集系统的上述方法可重复多个工作循环以实现更理想的结果。上述方法的步骤a)到d)中的任何步骤也可根据本发明调节以便适用于某些特定条件。实践中,所述方法的步骤a)到d)中的任何步骤可全部或部分应用,和/或以任何调节组合形式应用以增强本发明的光生物丁醇生产。
[0189] 可用于此方法中的CO2源包括(但不限于)工业CO2、碳酸(氢)盐和大气CO2。举例来说,来自燃烧化石燃料和/或燃烧生物质工业设施的烟气CO2可通过管道送到此方法的光生物反应器中。可产生用于设计者光合丁醇生产方法的CO2供应的工业设施包括(但不限于):燃电厂、炼铁工业、水泥厂、炼油设施、化肥厂、生物质燃烧和/或化石燃料燃烧生物燃料(或中间产物)蒸馏/分离设施、生物质热解工艺、烟囱、发酵生物反应器、生物燃料精炼设施和其组合。
[0190] 可选地,此设计者光生物丁醇生产方法也可利用环境和大气中的CO2。气态CO2、溶解CO2、碳酸氢盐和碳酸盐皆可由设计者生物体光生物丁醇生产技术利用。
[0191] 此处使用设计者藻类作为一个实例更详细地说明此实施方案。如上所述,本发明的设计者藻类(例如含有一组设计者HydA1启动子控制型设计者丁醇生产途径基因(例如SEQ ID NO:13-16(或17)和18-23的DNA构建体)的藻类)可以与野生型藻类类似的方式,通过使用空气CO2的自养光合作用在有氧条件下正常生长。设计者藻类还可使用有机底物光异养生长。
[0192] 在一优选实施方案中,设计者藻类是使用空气CO2作为碳源,在有氧条件下,在含有必需矿物(无机)营养物的基本培养基中光自养生长。设计者藻类在设计者光合丁醇生产途径基因被表达之前于正常条件下的生长不需要有机底物如乙酸盐。大多数藻类可通过使用空气CO2的自养光合作用在水中快速生长,只要有足够的无机营养物即可。藻类生长通常要求的营养物元素是:约1-10mM浓度的N、P和K,和约0.5到1.0mM浓度的Mg、Ca、S和Cl,加上一些μM浓度水平的痕量元素Mn、Fe、Cu、Zn、B、Co、Mo等。所有的无机营养物都可在水性基本培养基中供应,所述培养基可用藻类培养基的已有配方,使用水(对于设计者淡水藻使用淡水;对于耐盐设计者海洋藻使用海水)和相对少量的廉价肥料和无机盐,例如碳酸氢铵(NH4HCO3)(或硝酸铵、尿素、氯化铵)、磷酸(K2HPO4和KH2PO4)、硫酸镁七水合物(MgSO4·7H2O)、氯化(CaCl2)、硫酸锌七水合物(ZnSO4·7H2O)、硫酸铁(II)七水合物(FeSO4·7H2O)和酸(HaBO3)等来制得。也就是说,大量的设计者藻类细胞可在短时间内廉价地生长,因为在有氧条件如开放池塘里,设计者藻类可通过自身利用空气CO2,与其野生型亲本株同样迅速地光自养生长。这是本发明的一个显著特征(益处),其可在产生光活性生物催化剂(设计者光合丁醇生长藻类)用于再生太阳能生产方面提供节省成本的解决方案。
[0193] 当藻类培养物生长且准备用于丁醇生产时,将生长的藻类培养物密封入或放入某些特定条件下,例如通过从密封光生物反应器中去除O2而产生的厌氧条件,以诱导设计者HydA1启动子控制型丁醇生产途径基因的表达。当设计者丁醇生产途径酶被表达时,对用作从CO2和H2O光合生产丁醇的催化剂的表达设计者基因的藻类细胞供应可见光能如太阳光。当设计者基因被表达时,藻类细胞可基本上变成有效且耐用的“绿色机器”,其可完美地用于从CO2和H2O光合生产丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)和O2。藻类光生物反应器的产物丁醇可通过膜过滤和蒸馏/蒸发丁醇收集技术(包括(但不限于)液液萃取、气提、膜蒸发、渗透汽化吸附技术)的组合来收集(Durre,P.1998 Appl Microbiol Biotechnol 49:639-648;Qureshi,Hughes,Maddox和Cotta 2005 Bioprocess Biosyst Eng 27:215-222)。
[0194] 根据本发明直接从CO2和H2O光合生产CH3CH2CH2CH2OH和O2原则上具有很高的量子产率。理论上,通过这种机制从水和二氧化碳生产1个CH3CH2CH2CH2OH和6个O2只需要48个光子。通过从CO2和H2O直接光合生产丁醇的方法将太阳光转化为丁醇能源的最大理论效率是约10%,这在所有的生物方法中可能是最高的。因此,这种方法当用藻类反应器和丁醇-氧气收集方法适当实施时具有很大潜力。
[0195] 使用从CO2和H2O光合生产CH3CH2CH2CH2OH和O2的设计者藻类与藻类反应器和丁醇收集和气体产物分离和收集系统的上述方法可重复多个工作循环以实现更理想的结果。
[0196] 另一个特征是可切换的设计者丁醇生产生物体可在正常有氧条件下以与野生型类似的方式重复进行多个光自养培养物生长循环,并在生物反应器中在某些特定诱导条件下(例如在厌氧条件下),当设计者丁醇生产途径被诱导型启动子(例如氢化酶启动子)开启时有效地光生物生产丁醇(图1和3)。举例来说,具有设计者氢化酶启动子控制型丁醇生产基因的可切换的设计者藻类含有正常线粒体,其使用来自有机储备物(和/或外源底物如乙酸盐)的还原力(NADH),在返回有氧条件后立即对细胞供能。因此,当藻类细胞在厌氧条件下用于生产丁醇之后返回有氧条件时,细胞将停止生产丁醇生产途径酶且通过合成正常功能叶绿体恢复其正常光自养能力。因此,这种类型的基因转化生物体可在正常有氧条件下重复进行多个光自养培养物生长循环,并在厌氧反应器中在厌氧条件下有效生产丁醇。也就是说,此光生物丁醇生产技术可通过在有氧条件下复原用过的培养物并在丁醇生产条件下可再生地使用复原的藻类培养物获得更理想的结果来工作多个工作循环。视情况,此光生物丁醇生产技术如下连续工作:从有氧反应器循环复原的藻类培养物到厌氧反应器中,同时从厌氧反应器循环用过的藻类培养物(在其用于生产丁醇后)到有氧反应器中以便通过光合CO2固定和光自养生长合成正常功能叶绿体来复原。
[0197] 一些设计者生物体甚至可在丁醇生产途径开启的情况下光自养生长。设计者生物体是否能在丁醇生产条件下生长或设计者生物体在丁醇生产条件下能以多快的速度生长可取决于其遗传背景和有多少的卡尔文循环产物在被设计者丁醇生产途径利用后仍能用于细胞生长。可在丁醇生产条件下维持基本细胞功能和适当生长速率的设计者生物体也可与生物反应器和丁醇收集方法一起用于从CO2和H2O连续光生物生产CH3CH2CH2CH2OH和O2。
[0198] 存在其它方式以供包括细胞分裂可控型设计者生物体(图3)的可切换设计者生物体用于生物燃料的生物安全防护型光生物生产。通过使用先前描述的设计者生物安全特征,例如,来自光生物丁醇生产反应器的用过的设计者藻类培养物不必须要循环回培养物生长反应器中。相反,用过的藻类培养物被取出以用作其它加工的肥料或生物质原料,因为可切换设计者藻类在培养物生长反应器中的光自养生长能向光生物丁醇生产反应器持续供应藻类细胞以用于生产生物燃料。此实施方案特别有助于使用一些只能在丁醇生产途径开启之前却不能在之后光自养生长的设计者生物体。举例来说,通过在培养物生长反应器中维持设计者藻类(只能在丁醇生产途径开启之前光自养生长)的连续生长培养物,可提供生长藻类细胞的连续供应以便用于光生物丁醇生产反应器中。此方法使得那些只能在丁醇生产途径开启之前生长的那些设计者生物体也可用于光生物丁醇生产。
[0199] 因为各种原因,一些设计者产丁醇生物体只能光异养或光混合营养生长,却不能光自养生长。使用培养物生长反应器也可令这种类型的设计者产丁醇生物体利用有机底物光异养或光混合营养生长,所述有机底物包括(但不限于)蔗糖、葡萄糖、乙酸盐、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙酮、淀粉、半纤维素、纤维素、脂质、蛋白质、有机酸、生物质材料和其组合。如此生长的培养物也可供应到光生物丁醇生产反应器中以诱导丁醇生产的设计者途径。关于培养物生长的这个被修改的实施方案使得利用那些只能光异养或光混合营养生长的设计者生物体也能进行光生物丁醇生产。
[0200] 对于具有设计者硝酸还原酶(Nia1)启动子控制型丁醇生产途径基因的某些特定设计者生物体,以上光生物反应器方法可经进一步调节以获得更有利的结果。举例来说,含有Nia1(或nirA)启动子控制型丁醇生产途径基因如DNA序列设计实施例1-12(SEQ ID NO:1-12)所示者的设计者藻类与具有SEQ ID NO:34-45所示的设计者nirA启动子控制型丁醇生产途径基因的设计者生氧光细菌皆可在含铵(而不是硝酸盐)培养基中通过使用空气CO2的自养光合作用,以与野生型藻类类似的方式正常生长。这是因为丁醇生产途径基因在设计者生物体中的表达只会在硝酸盐存在下被开启,需要硝酸盐是因为使用硝酸还原酶(Nia1)启动子或亚硝酸还原酶(nirA)启动子控制设计者途径表达。具有nirA或Nia1启动子控制型丁醇生产途径基因的设计者生物体的重要特征是设计者丁醇生产途径的表- +达可通过操纵培养基中硝酸盐(NO3)相对于铵(NH4)的浓度水平而无需任何厌氧条件来诱导。也就是说,设计者丁醇生产途径的表达可在有氧和厌氧条件下诱导。这使得设计者光生物丁醇生产方法甚至在有氧条件下使用大气CO2也能工作。同样地,具有Nia1启动子控制型丁醇生产途径基因的这种类型的设计者生物体也可在有氧和厌氧条件下光自养生长。
因此,作为另一个实施方案,使用具有硝酸还原酶(Nia1)启动子控制型丁醇生产途径基因的设计者生物体的操作方法可调节成下列步骤:a)使设计者转基因生物体在设计者丁醇+ -
生产途径基因的表达被诱导之前,在基本培养基中在存在铵(NH4)而不存在硝酸盐(NO3)的情况下光自养生长;b)当设计者生物体培养物生长且准备用于丁醇生产时,添加硝酸盐- - +
(NO3)肥料到培养基中以提高硝酸盐(NO3)相对于铵(NH4)的浓度,从而诱导设计者丁醇生产途径基因的表达;c)当设计者丁醇生产途径酶被表达时,对用作从CO2和H2O光合生产丁醇的催化剂的表达设计者基因的细胞供应可见光能如太阳光;d)通过膜过滤与丁醇收集技术的组合从光生物反应器中收集丁醇产物。
[0201] 除了丁醇生产外,也可以使用设计者生物体或其部分设计者丁醇生产途径生产某些中间产物,包括:丁醛、丁酰辅酶A、巴豆酰辅酶A、3-羟基丁酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A、乙酰辅酶A、丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸、2-磷酸甘油酸、1,3-二磷酸甘油酸、甘油醛-3-磷酸、二羟基丙酮磷酸、果糖-1,6-二磷酸、果糖-6-磷酸、6-磷酸葡萄糖、葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸。因此,进一步的实施方案包括收集也可从诱导的转基因设计者生物体生产的中间产物的额外步骤。中间产物的生产可通过关闭催化其在设计者途径中的消耗的设计者酶活性来选择性地提高。所述中间产物的生产也可通过使用在设计者丁醇生产途径中省略一种或一些设计者酶的设计者生物体来提高。举例来说,在图1的设计者途径中省略丁醇脱氢酶或丁醛脱氢酶的设计者生物体可用于分别生产丁醛或丁酰辅酶A。
[0202] 虽然已经通过描述一些实施方案说明了本发明且已经相当详细地描述了说明性实施方案,但申请人并不打算将随附权利要求书的范围限定或以任何方式限制于所述细节。其它优势和变化将容易被所属领域技术人员了解。因此,本发明在其更广泛的方面不限于特定细节、代表性装置和方法,以及所显示和描述的说明性实例。因此,可偏离所述细节,但这不会偏离申请人的总体发明构思的精神或范围。
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