白鹤灵芝愈伤组织的萃取物的用途、用于诱导及增殖白鹤灵芝愈伤组织的方法及培养基专利检索-蔗糖合成酶生物化学专利检索查询-专利查询网

白鹤灵芝愈伤组织的萃取物的用途、用于诱导及增殖白鹤灵芝愈伤组织的方法及培养基

阅读：870发布：2020-05-08

专利汇可以提供白鹤灵芝愈伤组织的萃取物的用途、用于诱导及增殖白鹤灵芝愈伤组织的方法及培养基专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及植物提取物领域，尤其是关于白鹤灵芝愈伤组织的萃取物的用途、用于诱导及增殖白鹤灵芝愈伤组织的方法及培养基。本发明的白鹤灵芝愈伤组织的萃取物是以水或醇类作为萃取溶剂对该白鹤灵芝愈伤组织进行萃取而制得，该白鹤灵芝愈伤组织与该萃取溶剂的体积比例为1∶5至1∶10，萃取的温度为60℃至80℃。其可用于提升胶原蛋白第I型基因、ELN基因、HAS3基因、XRCC1基因、MSH基因、SOD1基因、GPX1基因、CAT基因、TGM基因、AQP基因及GBA基因的表现量、促进胶原蛋白产生及抗氧化。本发明亦提供一种用于诱导及增殖白鹤灵芝愈伤组织的方法、及用于培养白鹤灵芝愈伤组织的培养基。，下面是白鹤灵芝愈伤组织的萃取物的用途、用于诱导及增殖白鹤灵芝愈伤组织的方法及培养基专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种白鹤灵芝(Rhinacanthus communis)愈伤组织的萃取物用于制备一提升胶原蛋白第I型(collagen type I)基因、弹力蛋白(elastin，ELN)基因、玻尿酸合成酶3(hyaluronan synthase 3，HAS3)基因、X射线修复交叉互补蛋白1(X-ray repair cross complementary protein 1，XRCC1)基因、MSH基因、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)基因、谷胱甘肽过氧化酶1(glutathione peroxidase 1，GPX1)基因、氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)基因、转谷胺酰胺酶(transglutaminase，TGM)基因、水通道蛋白(aquaporin，AQP)基因，及GBA基因的表现量的医药品、化妆品或保养品的用途，其中所述白鹤灵芝愈伤组织的萃取物是以水或醇类作为萃取溶剂对所述白鹤灵芝愈伤组织进行萃取而制得，所述白鹤灵芝愈伤组织与所述萃取溶剂的体积比例介于1∶5至1∶10，且所述萃取的温度介于60℃至80℃。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述白鹤灵芝愈伤组织是经由添加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid)及6-苯胺嘌呤(6-benzyladenine)的MS培养基(Murashige and Skoog medium)培养而得。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述MS培养基包含3％蔗糖及0.8％琼脂。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胶原蛋白第I型基因为胶原蛋白第I型，α1(collagen type I，alpha 1，COL1A1)基因或胶原蛋白第I型，α2(collagen type I，alpha 2，COL1A2)基因。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述MSH基因为MSH2基因或MSH6基因。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述TGM基因为TGM1基因。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述AQP基因为AQP3基因。
8.一种白鹤灵芝愈伤组织的萃取物用于制备一促进胶原蛋白产生及抗氧化的医药品、化妆品或保养品的用途，其中所述白鹤灵芝愈伤组织的萃取物是以水或醇类作为萃取溶剂对所述白鹤灵芝愈伤组织进行萃取而制得，所述白鹤灵芝愈伤组织与所述萃取溶剂的体积比例介于1∶5至1∶10，且所述萃取的温度介于60℃至80℃。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述白鹤灵芝愈伤组织是经由添加2，4-二氯苯氧乙酸及6-苯胺嘌呤的MS培养基培养而得。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述MS培养基包含3％蔗糖及0.8％琼脂。
11.一种用于诱导及增殖一白鹤灵芝愈伤组织的方法，包含使用一添加2，4-二氯苯氧乙酸及6-苯胺嘌呤的MS培养基来培养该白鹤灵芝愈伤组织。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.5mg/L至5mg/L，所述6-苯胺嘌呤的浓度为0.1mg/L至1mg/L。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述MS培养基包含3％蔗糖及0.8％琼脂。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述白鹤灵芝愈伤组织具有一至少4倍的生长量。
15.一种用于培养一白鹤灵芝愈伤组织的培养基，包含2，4-二氯苯氧乙酸及6-苯胺嘌呤。
16.根据权利要求15所述的培养基，其特征在于，其为一MS培养基。

说明书全文

白鹤灵芝愈伤组织的萃取物的用途、用于诱导及增殖白鹤灵

芝愈伤组织的方法及培养基

技术领域

[0001] 本发明涉及植物提取物领域，尤其是有关于一种白鹤灵芝(Rhinacanthus communis)愈伤组织的萃取物的用途、用于诱导及增殖白鹤灵芝愈伤组织的方法及培养基。

背景技术

[0002] 皮肤组织是由表皮、真皮及皮下组织所构成，其中真皮含有大量胶原蛋白及玻尿酸，而与皮肤的保水性及弹力息息相关。人类皮肤会随着年纪、生理因素或环境因素，而有老化、肤质粗糙或产生皱纹等现象，如正常年轻人的皮肤都具一定的弹性和张力，当表情肌松弛后，皮肤会很快复原，使皱纹消失；但进入中年后，皮肤开始明显老化，皮肤变薄、变硬、干燥、张力降低；真皮胶原蛋白减少、弹力纤维变性、断裂，使皮肤的张力和弹性降低，因此，当表情肌松弛后，皮肤不能很快复原，久之则使皱纹成形；且随年龄的增大，皮肤和皮下组织更加松弛，加上面部支持组织的萎缩或缺失，以及肌肉的松软，皮肤会在重力的作用下发生滑坠，形成更深的皱纹。而肌肤粗糙是由于干燥、紫外线、清洁剂或化学物质等刺激性物质等外在重要因素，或激素平衡的紊乱等内在重要因素而产生的肌肤困扰，并伴随角质层屏障功能的下降、角质层水分量的下降、表皮代谢回转的亢进、鳞屑的产生而角质粗糙化等现象。因此皮肤上的细胞若失去弹性及保湿功能，会引起皮肤褶皱、干燥及失去光泽等现象。

[0003] 目前常见用来解决皮肤问题的方式大多为利用涂抹于皮肤表面的化妆品、保养品，或口服具有抗氧化效用的健康食品。然而，习知的化妆品、保养品及健康食品大多由化学成分所制成，长期使用不但对人体健康有害无益，且这些产品往往价格昂贵，并非为一般使用者所能负担。

[0004] 为了解决上述问题，本领域的技术人员亟需研发出具有促进胶原蛋白产生、抗氧化、保湿、及抗老化等功效的新颖医药品、化妆品或保养品以造福有此需求的广大族群。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的为提供一种白鹤灵芝(Rhinacanthus communis)愈伤组织的萃取物用于制备一提升胶原蛋白第I型(collagen type I)基因、弹力蛋白(elastin，ELN)基因、玻尿酸合成酶3(hyaluronan synthase 3，HAS3)基因、X 射线修复交叉互补蛋白1(X-ray repair cross complementary protein 1，XRCC1) 基因、MSH基因、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)基因、谷胱甘肽过氧化酶1(glutathione peroxidase
1，GPX1)基因、氯霉素乙酰基转移酶 (chloramphenicol acetyltransferase，CAT)基因、转谷胺酰胺酶(transglutaminase， TGM)基因、水通道蛋白(aquaporin，AQP)基因，及GBA基因的表现量的医药品、化妆品或保养品的用途，其中白鹤灵芝愈伤组织的萃取物是以水或醇类作为萃取溶剂对白鹤灵芝愈伤组织进行萃取而制得，白鹤灵芝愈伤组织与萃取溶剂的体积比例介于1∶5至1∶10，且萃取的温度介于60℃至80℃。

[0006] 本发明的另一目的为提供一种白鹤灵芝愈伤组织的萃取物用于制备一促进胶原蛋白产生及抗氧化的医药品、化妆品或保养品的用途，其中白鹤灵芝愈伤组织的萃取物是以水或醇类作为萃取溶剂对白鹤灵芝愈伤组织进行萃取而制得，白鹤灵芝愈伤组织与萃取溶剂的体积比例介于1∶5至1∶10，且萃取的温度介于60℃至80℃。

[0007] 本发明的另一目的为提供一种用于诱导及增殖一白鹤灵芝愈伤组织的方法，包含使用一添加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid)及6-苯胺嘌呤(6-benzyladenine)的MS培养基(Murashige and Skoog medium)来培养白鹤灵芝愈伤组织。

[0008] 本发明的另一目的为提供一种用于培养一白鹤灵芝愈伤组织的培养基，包含2，4-二氯苯氧乙酸及6-苯胺嘌呤。

[0009] 在本发明的一实施例中，白鹤灵芝愈伤组织是经由添加2，4-二氯苯氧乙酸及6-苯胺嘌呤的MS培养基培养而得。

[0010] 在本发明的一实施例中，MS培养基包含3％蔗糖及0.8％琼脂。

[0011] 在本发明的一实施例中，胶原蛋白第I型基因为胶原蛋白第I型，α1 (collagen type I，alpha 1，COL1A1)基因或胶原蛋白第I型，α2(collagen type I， alpha 2，COL1A2)基因。

[0012] 在本发明的一实施例中，MSH基因为MSH2基因或MSH6基因。

[0013] 在本发明的一实施例中，TGM基因为TGM1基因。

[0014] 在本发明的一实施例中，AQP基因为AQP3基因。

[0015] 在本发明的一实施例中，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.5mg/L至5mg/L， 6-苯胺嘌呤的浓度为0.1mg/L至1mg/L。

[0016] 在本发明的一实施例中，白鹤灵芝愈伤组织具有一至少4倍的生长量。

[0017] 在本发明的一实施例中，培养基为一MS培养基。

[0018] 综上所述，本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物的功效在于：可藉由提升胶原蛋白第I型基因、ELN基因、HAS3基因、XRCC1基因、MSH基因、SOD1 基因、GPX1基因、CAT基因、TGM基因、AQP基因及GBA基因的表现量来达到保湿及抗老化的功效；促进皮肤细胞胶原蛋白产生；及藉由降低皮肤受到氧化的伤害来达到抗氧化的功效。另一方面，本发明利用变化的MS培养基配方，以达到大量培养白鹤灵芝愈伤组织的效果，使本发明的白鹤灵芝愈伤组织的萃取物更有利于产业利用。

[0019] 以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。附图说明

[0020] 图1是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在促进胶原蛋白产生上的效用的数据图，其中“*”表示与对照组比较，p＜0.05；

[0021] 图2是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在皮肤细胞抗氧化上的效用的数据图，其中“***”表示与过氧化氢组比较，p＜0.001；

[0022] 图3是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在调控与皮肤细胞弹力相关的基因(包括COL1A1基因、COL1A2基因、ELN基因及HAS3基因)表现上的功效的数据图；

[0023] 图4是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在调控与皮肤细胞抗光老化相关的基因(包括XRCC1基因、MSH2基因、MSH6基因、SOD1基因、GPX1 基因及CAT基因)表现上的功效的数据图；

[0024] 图5是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在调控TGM1基因表现上的功效的数据图；

[0025] 图6是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在调控AQP3基因表现上的功效的数据图；

[0026] 图7是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在调控GBA基因及HAS3基因表现上的功效的数据图。

具体实施方式

[0027] 定义

[0028] 本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

[0029] 依据本发明，白鹤灵芝(Rhinacanthus communis)别名为仙鹤草或灵芝草，为爵床科(Acanthaceae)、白鹤灵芝属(Rhinacanthus)的灌木植物，多年生，亦为中国珍贵的中药材，原产于中国云贵山区，多分布于平原荒地，适合温暖、潮湿的环境。野生的白鹤灵芝含有许多活性成分，包括羽扇豆醇(lupeol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)及白鹤灵芝醌A(rhinacanthin A)。白鹤灵芝已知可用来治疗高血压、糖尿病、肝病、及肺结核。

[0030] 依据本发明，愈伤组织(callus)是植物原始尚未分化的状态，来自于茎与根的顶端分生组织(apical meristem)或是体细胞(somatic cell)。愈伤组织具有超基因(epigentic)作用与全能分化能力(totipotent)能够分化成植物胚胎细胞进而形成新的植株，并有帮助细胞代谢新生、推迟老化与赋予活力等功效。近代利用植物组织培养方法，已经成功发展出一套属于植物愈伤组织增殖的技术，然而对于不同品种的植株尚须经由详尽实验找出适合的培养配方，方能产出有利用价值的植物愈伤组织，提供产业利用。

[0031] 如本文中所使用的，用语「抗老化(anti-aging)」意指预防、减缓人类皮肤外观的老化现象，例如：皱纹的产生及失去弹性等。评量实现此目的的程度将根据熟悉此项技艺者已知的诸多因素来决定，诸如消费者的全身状态、年龄、性别等。

[0032] 依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液 (dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(extemal preparation)以及类似物。

[0033] 依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂 (disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂 (excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂 (lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

[0034] 依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。

[0035] 依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射 (intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射 (intralesional injection)。

[0036] 依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(extemal preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆 (serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve) 以及绷带(bandage)。

[0037] 依据本发明，该外部制剂是藉由将本发明的医药品与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而被制备。

[0038] 依据本发明，该基底可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡 (yellow wax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂 (surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸如卡波普微结晶纤维素
(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料 (fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、螯合剂(chelating agents)、乳化剂 (emulsifiers)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂 (anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propenants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

[0039] 依据本发明，化妆品可进一步包含有一被广泛地使用于化妆品制造技术的化妆品上可接受的佐剂(cosmetically acceptable adjuvant)。例如，该化妆品上可接受的佐剂可包含有一或多种选自于下列的试剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂 (coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

[0040] 依据本发明，化妆品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansing products)等。

[0041] 依据本发明，化妆品亦可与一或多种选自于下列的已知活性的外用剂 (external use agents)一起合并使用：美白剂(whitening agents)[诸如维生素A酸 (tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素C]、保湿剂、抗发炎剂(anti-inflammatory agents)、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[诸如芦荟萃取物(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂 (antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂 (antipsoriatic agents)、抗老化剂(antiaging agents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

[0042] 实施例1.白鹤灵芝愈伤组织的萃取物的制备

[0043] 首先，取白鹤灵芝作为培植体并将白鹤灵芝进行灭菌处理以除去植物表面的微生物，可以任意方式使白鹤灵芝产生伤口，举例而言，可以割划、撕裂或剪切的方式，获得带有伤口的白鹤灵芝。

[0044] 接着，使用MS培养基，加入0.5～5mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸 (2，4-dichlorophenoxyacetic acid)、0.1～1mg/L的6-苯胺嘌呤(6-benzyladenine)、 3％蔗糖及0.8％琼脂至MS培养基，并均匀混合。之后，以0.1N氢氧化钠溶液来调整pH值至5.7～5.8，接而进行白鹤灵芝愈伤组织增殖培养，经由30天培养周期后可以得到4倍的愈伤组织生长量。

[0045] 接着，将经培养的白鹤灵芝愈伤组织以冷冻干燥机于-40℃进行干燥16小时，接而收取产物确保水分低于5％，得到干燥的白鹤灵芝愈伤组织。之后，以75％乙醇于70℃下对干燥的白鹤灵芝愈伤组织(白鹤灵芝愈伤组织与乙醇的重量比例介于1∶5至1∶10)进行萃取20～40分钟(较佳为30分钟)，得到本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物。

[0046] 实施例2.白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在促进胶原蛋白产生上的效用评估

[0047] 首先，以添加有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素(penicillin)/链霉素 (streptomycin)及1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)的最低必需培养基 (MEM)(Gibco)培养人类皮肤纤维母细胞(human skin fibroblast)CCD-966SK (ATCC CRL-1881)于24-孔盘，
500μL培养基的细胞浓度为2×104细胞/孔，接而于37℃进行培养24小时，并以PBS清洗。接着，将经培养的细胞分成2 组，其中包括1个对照组及1个实验组。将实施例1得到的白鹤灵芝愈伤组织的萃取物以无血清培养基稀释为具有2％浓度的稀释液，继而添加500μL的稀释液至实验组的细胞中，至于对照组的细胞则添加500μL的无血清培养基。之后，收取1,000μL的培养基并转移至1.5mL微量离心管中，接而添加200μL 的胶原蛋白分离&浓缩试剂(collagen isolation&concentration reagent)，并翻转离心管6～8次。接着，于4℃进行培养隔夜。之后，取出离心管并以12,000rpm 离心10分钟，接而移除1,000μL的上清液。接着，以SircolTM可溶性胶原蛋白分析套组(SircolTM Soluble Collagen Assay Kit)(Biocolor Life Science Assays， Northem Ireland，UK)来分析各组的胶原蛋白相对百分比。添加1,000μL的染剂至离心管中，并轻微振荡30分钟，接而以12,000rpm离心
10分钟，并移除上清液。接着，添加750μL的酸-盐类清洗试剂(acid-salt washing reagent)，并以12,000rpm离心10分钟。之后，移除上清液并翻转离心管，接而以棉花棒移除离心管中的液体。接着，添加250μL的碱性试剂并充分振荡混合，继而以光谱讯号传感器测量波长555nm的吸光值，藉此计算出胶原蛋白分泌率，其中以对照组的胶原蛋白分泌率作为
100％的基准。本实施例的结果显示于图 1。

[0048] 图1是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在促进胶原蛋白产生上的效用的数据图。由图1可见，与对照组相较之下，实验组所测得的胶原蛋白相对百分比有提升的现象。本实施例的结果显示，本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物确实具有促进胶原蛋白产生的功效。

[0049] 实施例3.白鹤灵芝愈伤组织萃取物在皮肤细胞抗氧化上的效用评估

[0050] 首先，以添加有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素(penicillin)/链霉素 (streptomycin)及1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)的最低必需培养基 (MEM)(Gibco)培养人类皮肤纤维母细胞CCD-966SK(BCRC 60153)于6-孔盘， 2mL培养基的细胞浓度为2×105细胞/孔，接而于37℃进行培养24小时，并移除培养基。接着，将经培养的细胞分成4组，其中包括1个对照组、1个过氧化氢组，及2个实验组(亦即实验组1与2)。将实施例1得到的白鹤灵芝愈伤组织的萃取物以培养基稀释为具有2％及1％浓度的稀释液，继而分别将2％稀释液及1mM过氧化氢(Sigma)添加至实验组1的细胞中，以及将1％稀释液及1mM过氧化氢添加至实验组2的细胞中。过氧化氢组的细胞被添加以1mM 过氧化氢，至于对照组的细胞则添加培养基。之后，添加5μg/mL二氯二氢荧光黄二乙酸酯(Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate， DCFH-DA)(Sigma/SI-D6883-50MG)(储备溶液为5mg/mL溶于DMSO中)并于 37℃反应1小时，接而以1mL的1X PBS(Gibco)清洗每孔两次。接着，添加 200μL胰蛋白酶(trypsin)并于避光环境反应5分钟，接而将细胞培养物收集至 1.5mL体积的离心管，并以
400×g进行离心10分钟。之后，移除上清液并以1X PBS清洗一次，接而以400×g进行离心10分钟。接着，移除上清液并以1mL的1X PBS再悬浮细胞沉淀物。之后，以流式细胞仪(BD Accuri)藉由激发波长(excitation wavelength)450～490nm及放射波长(emission wavelength) 510～550nm来侦测DCFH-DA的荧光讯号，藉此计算出受到活性含氧物 (reactive oxygen species，ROS)伤害的细胞百分比。各组之间的统计学显著差异是藉由史徒登氏t-检定(Student’s t-test)来决定。本实施例的结果显示于图2。

[0051] 图2是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在皮肤细胞抗氧化上的效用的数据图。由图2可见，与对照组相较之下，过氧化氢组测得的受到ROS伤害的细胞百分比有显著提升，这表示过氧化氢会对细胞产生大量ROS伤害；而与过氧化氢组相较之下，实验组1及实验组2测得的受到ROS伤害的细胞百分比有显著降低。本实施例的结果显示，本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物确实具有抗氧化的功效。

[0052] 实施例4.白鹤灵芝愈伤组织萃取物在抗老化上的效用评估

[0053] 4.1与皮肤细胞弹力相关的基因表现分析

[0054] 首先，以添加有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素(penicillin)/链霉素 (streptomycin)及1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)的最低必需培养基 (MEM)(Gibco)培养人类皮肤纤维母细胞CCD-966SK(BCRC 60153)于6-孔盘， 2mL培养基的细胞浓度为2×105细胞/孔，接而于37℃进行培养24小时，并移除培养基。

[0055] 之后，将经培养的细胞分成2组，其中包括1个对照组及1个实验组。将实施例1得到的白鹤灵芝愈伤组织的萃取物以培养基稀释为具有2％浓度的稀释液，继而将的添加至实验组1的细胞中并静置24小时，至于对照组的细胞则添加培养基。接着，收取各组细胞培养物并拿来进行基因表现分析。

[0056] 在本实施例中，用来分析与皮肤细胞弹力相关的基因包括胶原蛋白第I型，α1(collagen type I，alpha 1，COL1A1)基因、胶原蛋白第I型，α2(collagen type I，alpha 2，COL1A2)基因、弹力蛋白(elastin，ELN)基因，及玻尿酸合成酶3 (hyaluronan synthase
3，HAS3)基因。

[0057] 以RNA萃取套组(RNA extraction kit)(Geneaid)对上面所得到的各组细胞培养物进行RNA的萃取。之后，以 III反转录酶( III Reverse Transcriptase)(Invitrogen)将萃取出的RNA反转录为cDNA。接着，以 cDNA作为模版(template)，并且使用用来扩增目标基因的引物对[包括COL1A1、 COL1A2、ELN、HAS3，及GAPDH(作为内部对照组)，它们的核苷酸序列显示于下面表1]，利用KAPA CYBR FAST qPCR套组(2x)(KAPA Biosystems)来进行定量实时聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，以下简称定量实时PCR)，俾以对目标基因进行扩增及定量。
PCR产物的熔化曲线(melting curve)是在定量实时PCR反应期间进行确认。

[0058] 表1

[0059]

[0060]

[0061] 目标基因的相对表现量是推导自方程式2-ΔΔCt，并利用GAPDH基因(作为内部对照组)及基准基因(reference gene)的循环阈值[cycle threshold(Ct)value] 及藉由标准偏差(standard deviation，STDEV)来计算相对倍数变化，其中ΔCt＝Ct 目标基因/基准基因-CtGAPDH，ΔΔCt＝ΔCt目标基因-ΔCt基准基因，以对照组的目标基因表现量作为1.00的比较基准。各组的间的统计学显著差异是藉由单尾史徒登氏t-检定(single tailed Student’s t-test)来决定。本实施例的结果显示于图3。

[0062] 图3是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在调控与皮肤细胞弹力相关的基因(包括COL1A1基因、COL1A2基因、ELN基因及HAS3基因)表现上的功效的数据图。由图3可见，无论是COL1A1基因、COL1A2基因、ELN基因，或是HAS3基因，与对照组相较的下，实验组测得与皮肤细胞弹力相关的基因相对表现量有显著提升。这个实验结果显示，本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物可藉由调控与皮肤细胞弹力相关的基因表现来达到抗老化的功效。

[0063] 4.2与皮肤细胞抗光老化相关的基因表现分析

[0064] 首先，以添加有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素(penicillin)/链霉素 (streptomycin)及1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)的最低必需培养基 (MEM)(Gibco)培养人类皮肤纤维母细胞CCD-966SK(BCRC 60153)于6-孔盘， 2mL培养基的细胞浓度为2×105细胞/孔，接而于37℃进行培养24小时，并移除培养基。

[0065] 的后，将经培养的细胞分成3组，其中包括1个对照组、1个UVA组及1 个实验组。将实施例1得到的白鹤灵芝愈伤组织的萃取物以培养基稀释为具有 2％浓度的稀释液，继而将的添加至实验组的细胞中并静置24小时，UVA组的细胞被处理以5J/cm2UVA，及对照组的细胞则不做任何处理。接着，收取各组细胞培养物并拿来进行基因表现分析。

[0066] 在本实施例中，用来分析与皮肤细胞抗光老化相关的基因包括X射线修复交叉互补蛋白1(X-ray repair cross complementary protein 1，XRCC1)基因、 MSH2基因、MSH6基因、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1) 基因、谷胱甘肽过氧化酶1(glutathione peroxidase 1，GPX1)基因，及氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)基因。

[0067] 以RNA萃取套组对上面所得到的各组细胞培养物进行RNA的萃取。对由此所得到的各组RNA取2,000ng并以 III反转录酶将萃取出的 RNA反转录为cDNA。接着，以cDNA作为模版，并且使用用来扩增目标基因的引物对[包括XRCC1、MSH2、MSH6、SOD1、GPX1、CAT，及GAPDH (作为内部对照组)，它们的核苷酸序列显示于下面表2]，在StepOne Plus实时 PCR系统(StepOne Plus Real Time PCR system)(ABI)中利用KAPA SYBR FAST qPCR套组(2x)来进行定量实时PCR，俾以对目标基因进行扩增及定量。PCR 产物的熔化曲线是在定量实时PCR反应期间进行确认。

[0068] 表2

[0069]

[0070] 目标基因的相对表现量是推导自方程式并利用GAPDH基因(作为内部对照组)及基准基因的循环阈值及藉由标准偏差来计算相对倍数变化，其中ΔCt＝
Ct目标基因/基准基因-CtGAPDH，ΔΔCt＝ΔCt目标基因-ΔCt基准基因，以对照组的目标基因表现量作为1.00的比较基准。各组之间的统计学显著差异是藉由单尾史徒登氏t-检定来决定。本实施例的结果显示于图4。

[0071] 图4是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在调控与皮肤细胞抗光老化相关的基因(包括XRCC1基因、MSH2基因、MSH6基因、SOD1基因、GPX1 基因及CAT基因)表现上的功效的数据图。由图4可见，无论是XRCC1基因、 MSH2基因、MSH6基因、SOD1基因、GPX1基因，或是CAT基因，与对照组及UVA组相较之下，实验组测得与皮肤细胞抗光老化相关的基因相对表现量有显著提升。这个实验结果显示，本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物可藉由调控与皮肤细胞抗光老化相关的基因表现来达到抗老化的功效。

[0072] 实施例5.白鹤灵芝愈伤组织萃取物在保湿上的效用评估

[0073] 在本实施例中，申请人探讨白鹤灵芝愈伤组织萃取物可否藉由调控与皮肤细胞保湿相关的基因表现来达到保湿的功效。

[0074] 于角质细胞专用的无血清培养基(Keratinocyte-SFM；购自Thermo，产品编号：17005042)中培养人类表皮角质细胞(HPEK-50；购自CELLnTEC)于 6-孔盘，2mL培养基的细
5
胞浓度为1×10细胞/孔，接而于37℃进行培养24 小时，并移除培养基。

[0075] 之后，将经培养的细胞分成3组，其中包括1个对照组及2个实验组(亦即实验组1与2)。将实施例1得到的白鹤灵芝愈伤组织的萃取物以培养基稀释为具有0.5mg/mL及1mg/mL浓度的稀释液，继而分别将0.5mg/mL稀释液添加至实验组1的细胞中，及将1mg/mL稀释液添加至实验组2的细胞中，至于对照组的细胞则添加培养基。接着，收取各组细胞培养物并拿来进行基因表现分析。

[0076] 在本实施例中，用来分析与皮肤细胞保湿相关的基因包括转谷胺酰胺酶1 (transglutaminase 1，TGM1)基因、水通道蛋白3(aquaporin 3，AQP3)基因、GBA 基因，及HAS3基因。

[0077] 以RNA萃取套组对上面所得到的各组细胞培养物进行RNA的萃取。对由此所得到的各组RNA取2,000ng并以 III反转录酶将萃取出的 RNA反转录为cDNA。接着，以cDNA作为模版，并且使用用来扩增目标基因的引物对[包括TGM1、AQP3、GBA、HAS3，及TBP(作为内部对照组)，它们的核苷酸序列显示于下面表3]，在StepOne Plus实时PCR系统中利用KAPA SYBR FAST qPCR套组(2x)来进行定量实时PCR，俾以对目标基因进行扩增及定量。
PCR产物的熔化曲线是在定量实时PCR反应期间进行确认。

[0078] 表3

[0079]

[0080] 目标基因的相对表现量是推导自方程式并利用TBP基因(作为内部对照组)及基准基因的循环阈值及藉由标准偏差来计算相对倍数变化，其中ΔCt＝
Ct目标基因/基准基因-CtGAPDH，ΔΔCt＝ΔCt目标基因-ΔCt基准基因，以对照组的目标基因表现量作为1.00的比较基准。各组之间的统计学显著差异是藉由单尾史徒登氏t-检定来决定。本实施例的结果显示于图5至图7。

[0081] 图5是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在调控TGM1基因表现上的功效的数据图；图6是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在调控AQP3基因表现上的功效的数据图；图7是本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物在调控GBA基因及HAS3基因表现上的功效的数据图。由图5至图7可见，无论是TGM1 基因、AQP3基因、GBA基因，或是HAS3基因，与对照组相较之下，实验组1与实验组2测得与皮肤细胞保湿相关的基因相对表现量有显著提升。本实施例的结果显示，本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物可藉由调控与皮肤细胞保湿相关的基因表现来达到保湿的功效。

[0082] 综上所述，本发明白鹤灵芝愈伤组织的萃取物可藉由提升胶原蛋白第I型基因、ELN基因、HAS3基因、XRCC1基因、MSH基因、SOD1基因、GPX1 基因、CAT基因、TGM基因、AQP基因及GBA基因的表现量来达到保湿及抗老化的功效；促进皮肤细胞胶原蛋白产生；及藉由降低皮肤受到氧化的伤害来达到抗氧化的功效。另一方面，本发明利用变化的MS培养基配方，以达到大量培养白鹤灵芝愈伤组织的效果，使本发明的白鹤灵芝愈伤组织的萃取物更有利于产业利用。

[0083] 以上所述仅为举例性，而非为限制性者。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于后附的申请专利范围中。

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