【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗腫瘍剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】癌は、日本人の死亡原因の約１／４を占め、癌の治療法の確立は緊急の課題となっている。 薬剤による癌の治療法としては、化学療法と免疫療法が一般的である。 しかし、合成抗癌剤を用いる化学療法においては、抗癌剤が正常細胞をも損傷するため、重篤な副作用を引き起こし、効果的な治療法とはなっていない。 このため、インターフェロンに代表される免疫療法が注目された。 しかしながら、免疫療法による癌の治癒率は低く、癌を克服するには至っていない。

【０００３】ところで、植物由来のトリテルペン類およびこれらを骨格として配糖位を有するサポニン類は、例えば、ミシマサイコに含有されるオレアナン系トリテルペンであるサイコゲン類およびこれらを骨格として配糖位を有するサイコサポニンのように、抗腫瘍作用を有することが知られている（特開昭６２−１８７４０８）。

【０００４】オレアナン系トリテルペンとしては、上記サイコゲニン類の他、オレアノール酸、グリチルレチン酸、ウルソール酸およびこれらの３ケト体があり、これらは、発ガンプロモーター類の阻害剤であることが公知である（H,Ohigashi et al.Cancer Letters,30,143-15
1,1986)。 また、ウルソール酸が抗白血病作用を有することも公知である。 しかしながら、これらの化合物の3-
ケト体が癌化した細胞の増殖抑制作用を有することについては知られていない。

【０００５】また、薬用ニンジン等に含有されるダンマラン系トリテルペンおよびその配糖体も、抗腫瘍剤として公知である（特公平１−２８７５９、特開昭５８−１
３１９９、特開昭５９−１０５４８、特開昭５９−１８
１２１７、特開昭５９−１８４１９８、特開昭６３−９
９０９４）。

【０００６】また、ブラジルニンジンに含有されるパフ酸およびこれを骨格として配糖位を有するパフオサイド類も、抗腫瘍作用剤として知られている（特開昭５９−
１０５４８、特開昭５９−１８４１９８）。

【０００７】さらに、薬用人参であるオタネニンジン（パナックス・ギンセング、シー・エー・メイヤー、Pa
nax ginseng CAMayer ）とその類縁植物及びアマチャズル（（ギノステムマ・ペンタフィルルム、マキノ、Gy
nostemma pentphyllum Makino ）に含有されるダンマラン系サポニン類が種々の薬効を有することは公知である。

【０００８】また、このダンマラン系サポニンを加水分解して得られるプロトパナキサジオール類やプロトパナキサトリオール類が強い抗腫瘍性を有することが知られている（特開昭５８−１３１９９９）。

【０００９】更に、ダンマラン系サポニンを加水分解することによって、微量生成するパナキサジオールも強い抗腫瘍性を有することが知られている（特開昭５９−１
８１２１７）。

【００１０】しかしながら、これらの抗腫瘍剤は、一般に抗腫瘍作用が弱く、臨床上に頻用されるには至っていない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、トリテルペン類の抗腫瘍剤の効果を著しく向上させることを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記従来技術に鑑み、研究を重ねた結果、オレアナン系トリテルペン類及びダンマラン系トリテルペン類の３ケト体が、強い抗腫瘍作用を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。

【００１３】即ち、本発明は、トリテルペン類の３ケト体を有効成分として含有する抗腫瘍剤である。

【００１４】また、本発明は、上記トリテルペン類がオレアナン系トリテルペン類である抗腫瘍剤である。

【００１５】さらに、本発明は、上記トリテルペン類が、ダンマラン系トリテルペン類である抗腫瘍剤でもある。

【００１６】本発明において、トリテルペン類とは、フシダン、ラノスタン、ダンマラン、ユーファン、シオナン、バッカラン等の四環式及び、ルパン、オレアナン、
ウルサン、ホパン等の五環式を基本骨格とする化合物をいう。

【００１７】本発明において、オレアナン系トリテルペン類の３ケト体とは、オレアナン骨格を有するトリテルペンの３ケト体であれば、特に限定されるものではない。

【００１８】上記一般式（１）〜（３）のオレアナン系トリテルペン類の３ケト体の化合物中、Ｒは水素、アルキルまたは糖であり、アルキルとしては、炭素数１〜２
６個を有する直鎖又は分枝鎖を有するアルキルであり、
好ましくは、炭素数１〜２０個を有する直鎖又は分枝鎖を有するアルキルである。

【００１９】より具体的には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、t-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシルであることが好ましい。

【００２０】上記Ｒで表わされる糖としては、ガラクトース、グルコース、マンノース、フルクトース等の六炭糖及び、アラビノース、キシロース、リボース等の五炭糖も挙げられ、好ましい糖としては、六炭糖、より好ましくは、グルコースである。

【００２１】尚、上記Ｒで表わされる糖は、１位の炭素にエステル結合を形成する。

【００２２】上記のオレアナン系トリテルペン類の３−
ケト体の原料としては、オレアナン系トリテルペン、または、これらを骨格として配糖位を有するサポニンを含有する植物が用いられる。

【００２３】例えば、オレアノール酸を骨格として配糖位を有するサポニンは、オタネニンジン（パナックス・
ジンセング・シー・エー・メイヤー、Panax ginseng C.
A.Mayer ）、トチバニンジン（パナックス・ヤポニカス・シ・エー・メイヤー(Panaxjaponicus CAMayer)
）、ヒマラヤニンジン（パナックス・シュードジンセング・サブスペンシーズ・ヒマライカス、パル、アングステイフロリウス(Panax pseudoginseng subsp.himalai
cus car.angstifolius) ）、アメリカニンジン（パナックス・キンキュホリウム、リンネ(Panax quinquefolium
LINNE) ）等の薬用ニンジンの地上部および地下部、テンサイ(Beta vulgaris var.altissima) の前草、オリーブ(Olea europaea L.)の葉、リンゴ(Mulus pumila Mil
l.var.domestica Schneid) 果皮、青紫蘇(Perilla fult
escens Brit.var.Decne.f.purpurea Makino) 葉およびチョウジ(Syzygium aromaticum Merr.et Perry) の芽が挙げられる。

【００２４】また、グリチルレチン酸を骨格とするサポニンを含有する植物としては、甘草(Glycyrrhiza gkabr
a L.）が挙げられ、ウルソル酸を含有する植物としては、リンゴ、サクランボ(Prunus avinum L.)等が挙げられる。

【００２５】上記オレアナン系トリテルペンは、一般的な方法に従って、上記の植物から抽出する。

【００２６】即ち、先ず最初に上記原料を乾燥するか、
適宜処理して乾燥したものを適切な溶媒で抽出し、粗抽出物が得られる。 次いで、これらの粗抽出物を化学的処理及び酵素的処理を行い、各種トリテルペンを得る。

【００２７】これらのトリテルペンを有機溶剤に溶解し、適当な酸化剤を添加して撹拌する。 酸化生成物をカラムクロマトグラフィー及び／又は再結晶により分離し、３ケト体を得る。

【００２８】上記トリテルペンが、３位以外に水酸基を有する場合には、これらを保護した後、３位の酸化反応を行なえばよい。

【００２９】アルコール、糖との結合は、常法に従い行なえる。 例えば、Ｒがグルコースの場合、得られた３ケト体と、２，３，４，６−アセチルグルコースを適当な溶媒に溶解し、酸触媒による脱水反応によりエステル化を行なう。

【００３０】トリテルペンを溶解するための有機溶剤としては、エーテル、アセトン、クロロホルム、塩化メチレン等を用い、酸化剤としては、ジクロム酸ピリジニウム、ジョーンズ試薬（クロム酸、濃硫酸に水を加えたもの）等を用いる。

【００３１】反応は、通常、室温で２〜３時間行い、得られた生成物は、ＨＰＬＣやＴＬＣ分析により確認する。

【００３２】本発明において、ダンマラン系トリテルペン類の３ケト体とは、ダンマラン骨格を有するトリテルペンの３ケト体であれば、特に限定されるものではない。

【００３３】本発明のダンマラン系トリテルペンの３−
ケト体を生産するための原料は、プロトパナキサジオール核及び／又はプロトパナキサトリオール核、或いは、
これらを骨格として類似した配糖位を有するサポニンを含有する植物が用いられる。

【００３４】例えば、上記オタネニンジンやアマチャズルの他、三七ニンジン（パナックス・シュードギンゼング、ワーリッヒ、Panax pseudoginseng WALICHまたは、
パナックス・ノトギンゼング・バーキル、Panax notogi
nseng BURKILL ）、アメリカニンジン（パナックス・キンキユホリウム、リンネ、Panax quinqufolim LINN
E）、トチバニンジン（パナックス・ヤポニカス・シー・エー・メイヤー、Panaxjaponicus CAMayer ）、ヒマラヤニンジン（パナックス・シュードギンゼング、サブスペシーズ、ヒマライカス、バル、アングステイフロリウス、Panax pseudoginseng subsp.himalaicus var.a
ngstifolius ）等の地上部および地下部：シラカンバ（ベツーラ・プラチフィラ、スカチェフ、バル、ジャポニカ、Butula pulatyphylla Sukacthev var.japonica）
等のカンバ類の緑葉等が挙げられる。

【００３５】これら植物から、ダンマラン系トリテルペンの３−ケト体を生産するための原料を得るためには、
まず、最初に上記植物原料を、適切な溶媒で抽出し、粗抽出物を得る。

【００３６】次いで、この粗抽出物を、プロトパナキサジオール骨格を有するものと、プロトパナキサトリオール骨格を有するものとに分別し、前記オレアナン系トリテルペン類の場合と同様に、それぞれに化学的処理及び／又は酵素的処理を行い、ダンマラン系トリテルペンを得る。 これを酸化処理することによって、３−ケト体を得る。

【００３７】尚、３位の水酸基をケト化することにより、抗腫瘍活性が増強するトリテルペン類は、前記で示した、20(S)-プロトパナキサジオール、20(R)-プロトパナキサジオール、20(S)-プロトパナキサトリオール、20
(R)-プロトパナキサトリオール、ベツーラフォリエントリオール、パナキサジオール、パナキサトリオール、オレアノール酸、グリチルレチン酸、ウルソール酸の他に、エキノシスト酸、バヨゲニン、ジプソゲニンヘデラゲニン、メジコゲニン酸、パフ酸、キラ酸、ジヒドロウルビタシンＦ、サイコゲニン類、アブルソサイドＡのアグリコン部、アセシン、ギムネマ酸及びシーサポニンのアグリコン部、アルベノサイドＡのアグリコン部、アストラガラサイドIII のアグリコン部、アベナシンＡ１のアグリコン部、アベナシンＢ２のアグリコン部、アズキサポニンのアグリコン部、カメリジンＩ及びIIのアグリコン部、シミシフコサイドのアグリコン部、コルブリンのアグリコン部、コルブノサイドのアグリコン部、シダミンのアグリコン部、シクロホエサイドＢのアグリコン部、ジアノサイドのアグリコン部、ジペノサイドのアグリコン部、ヘキソライドのアグリコン部、ハセオロサイドのアグリコン部、プロパピリオゲニンのアグリコン部、ソヤサポニンのアグリコン部、サリコサイドのアグリコン部、ビルギアウレアサポニンのアグリコン部、チチフィンのアグリコン部、ネオアルソサイドのアグリコン部、アクチノステモサイドのアグリコン部が含まれる。

【００３８】尚、上記トリテルペン中、トリテルペンのアグリコン部は、その配糖体であってもよい。

【００３９】本発明の抗腫瘍剤により抑制される細胞としては、マウスのメラノーマ細胞、子宮頸部癌細胞、肺癌細胞、腹水癌細胞、モリス肝癌細胞が挙げられる。

【００４０】

【発明の効果】本発明の抗腫瘍剤は、臨床上に用いることができ、著しい抗腫瘍効果が得られる。

【００４１】以下、本発明を実施例により具体的に説明する。

【００４２】

【実施例】

実施例１ ５ｍｌ用ナスフラスコにオレアノール酸５０．０ｍｇ
（ｃａ．０．１１ｍｍｏｌ）、シリカゲル０．２ｇ、ジクロム酸ピリジニウム８５ｍｇ（２等量）、塩化メチレン３ｍｌを採取し、室温で２時間撹拌した。 反応液にエーテルを適宜加えてシリカゲル（ワコーゲルＣ２００）
を通過させ、減圧下に流出液の溶媒を留去して粗生成物３５ｍｇを得た。 粗生成物をメタノールから再結晶して、３−ケトオレアノリック酸１１ｍｇを得た。

【００４３】実施例２ ５ｍｌ用ナスフラスコにグリチルレチン酸５０．０ｍｇ
（ｃａ．０．１１ｍｍｏｌ）、アセトン２ｍｌ、クロロホルム１ｍｌを採取し、室温にて撹拌しながらジョーンズ試薬（クロム酸２６．７ｇ、濃硫酸２３ｍｌに水を加えて１００ｍｌとしたもの）４５μｌ（１．１等量）をマイクロシリンジで滴下した。 室温で２時間撹拌した後、亜硫酸水素ナトリウム溶液１５ｍｌを添加し、エーテルで抽出した。 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、減圧下に溶媒を除去して粗生成物４９ｍｇを得た。 粗生成物をアセトンから再結晶して、３−ケトグリチルレチン酸２５ｍｇを得た。

【００４４】実施例３ ５ｍｌ用ナスフラスコにウルソール酸５０．０ｍｇ（ｃ
ａ． ０．１１ｍｍｏｌ）を採取し、実施例２と同様の操作により、３−ケトウルソール酸２５ｍｇを得た。

【００４５】実施例４ ＨＡＭの合成培地Ｆ−１０およびＬ−１５の７：３混液に、牛胎児血清１０％を添加して用いた。

【００４６】Coster 96 well plates の各wellにマウスのメラノーマ細胞(B16BL6)の懸濁液０．１ｍｌ（１×１
０ ³ cells）を採取した。 ２〜３時間後、所定の３−ケトオレアノール（Ｉ）を含有する培地０．１ｍｌを添加し、５％ＣＯ ₂インキュベーター内で４日間、３７℃にて培養した。 培養終了後、WST-１を用いたMTT アッセイにより細胞数を測定した。

【００４７】図１から明らかなように、３−ケトオレアノール酸は腫瘍細胞の増殖を強く抑制した。

【００４８】比較例１ オレアノール酸（II）について、実施例４と同じ操作によってマウスのメラノーマ細胞に対する作用を検討した。

【００４９】図１から明らかなように、オレアノール酸はメラノーマ細胞の増殖を全く抑制しなかった。

【００５０】実施例５ シラカンバの緑葉２２．２６ｋｇを、エーテル８０Ｌに３日間浸漬し、濾過した後、減圧下溶媒を留去し、約１
Ｌに濃縮した。 更にシラカバ葉にエーテル４０Ｌを加えて７日間放置し、濾過した後、減圧下溶媒を留去して、
約１Ｌに濃縮した。

【００５１】これらのエーテル層を合し、減圧下、約１
Ｌに濃縮した後、メタノール２Ｌ、水酸化カリウム２０
０ｇ、水５００ｍｌを加えて３時間還流した。 放冷後、
２Ｌの分液漏斗に反応溶液８００ｍｌと食塩水５００ｍ
ｌをとり、エーテルで抽出した。 同様の操作を５回繰り返して全反応液を処理した後、抽出液に無水硫酸ナトリウム１ｋｇを加えて一夜放置し、濾過後、溶媒を留去して、黒緑色粘稠な油状物質５２０ｇを得た。

【００５２】上記けん化生成物を、エーテル：ヘキサン（１：４）混合溶媒に溶解した後、シリカゲル（ワコーゲルC-200 、和光純薬社製）１．８ｋｇを充填したカラム用ガラス管に添加した。 次いで、エーテル：ヘキサン（１：４）混合溶媒１０Ｌ、エーテル１０Ｌ、メタノール：エーテル（１：１９）混合溶媒８Ｌで展開した。 エーテルで溶離した分画を留去して、茶色油状物１２２ｇ
を得た。

【００５３】これにアセトン約５００ｍｌを加えて溶解した後、冷所に放置したところ、微淡黄色結晶１２．０
ｇが析出した。 さらに、アセトンから再結晶を行い、１
１．０ｇのベツーラフォリエントリオール（３−α−２
０（Ｓ）−プロトパナキサジオール）を得た。

【００５４】５０ｍｌナスフラスコにＰＤＣ１．８０
ｇ、シリカゲル（ワコーゲル Ｃ−２００）４ｇ、塩化メチレン４０ｍｌを採取し、撹拌しながらベツーラフォィエントリオール２．００ｇを徐々に加え、室温で２時間撹拌した。 反応物をシリカゲル（ワコーゲル Ｃ−２
００、２０ｇ：溶出溶媒、エーテル１００ｍｌ）で分離溶出し、減圧下に留去して無色結晶１．９２ｇを得た。
生成物をメタノール：エーテル（１：９）混合溶媒から再結晶することにより、３−ケト−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール０．６５ｇを得た。

【００５５】１０ｍｌナスフラスコに、３−ケト−２０
（Ｓ）−プロトパナキサジオール３６０ｍｇ、エーテル５ｍｌを採取し、撹拌しながら水素化ホウ素ナトリウムを加え、２時間撹拌した。 反応溶液に水５０ｍｌを加え、エーテルで抽出し、食塩水で洗浄した。 抽出液に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水し、濾過した後、減圧下に溶媒を留去して無色結晶３３７ｍｇを得た。 エーテルから２回再結晶して、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール１３７ｍｇを得た。

【００５６】実施例６ ３０ｍｌのナスフラスコにベツーラフォリエントリオール３００ｍｇ、エタノール１０ｍｌ、２Ｎ塩酸５ｍｌを採り、１００℃にて２０時間撹拌した。 反応後に水を加えてエーテルで抽出し、食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、流去して、無色結晶２９２ｍｇを得た。 この粗成物をシリカゲル（ワコーゲル Ｃ−２０
０）５ｇを充填したカラム（口径：１０ｍｍ、高さ：１
３０ｍｍ）を用いて分離し、３αパナキサジオール１３
０ｍｇを得た。

【００５７】２０ｍｌナスフラスコに、３αパナキサジオール９３．２ｍｇ、シクロヘキサノン１．０５ｍｌ、
トルエン１０ｍｌを採り、防湿下還流撹拌しながら、Ａ
ｌ（Ｏ−ｉ−Ｐｒ） ₃ １２３．９ｍｇをトルエンに溶かした溶液を１時間かけて滴下した。 引き続き１時間還流した後放冷し、エーテルでシリカゲルのショートカラムを通し、適宜、水及びベンゼンを加えながら留去して淡黄色油状結晶１０１．６ｍｇを得た。

【００５８】同様の操作で得た粗成物１３２．３ｍｇ
を、ワコーゲルＣ−２００ ４ｇを充填したカラム（口径：１０ｍｍ、高さ：１００ｍｍ）により分離し、３−
ケトパナキサジオール７８．６ｍｇを得た。

【００５９】１ｍｌナスフラスコに３−ケトパナキサジオール２０ｍｇ、アセトン１ｍｌ、ジョーンズ試薬（クロム酸２６．７ｇ、硫酸２３ｍｌ、蒸留水１００ｍｌ）
２０μｌを採取し、室温で３時間撹拌した。 亜硫酸水素ナトリウムを加えてエーテルで抽出し、食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥、留去して無色結晶１
５．７ｍｇを得た。 メタノール／エーテル＝１：１から再結晶して、３，１２−ケトパナキサジオール８．１ｍ
ｇを得た。

【００６０】１ｍｌのナスフラスコに３−ケトパナキサジオール２２．２ｍｇ、水素化ホウ素ナトリウム４ｍ
ｇ、エタノール１ｍｌを採り、室温で１時間撹拌した。
水を加えてエーテルで抽出し、食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥、留去して、無色結晶１７．２ｍ
ｇを得た。 更に、２０％水−メタノールから再結晶して、パナキサジオール１０ｍｇを得た。

【００６１】実施例７ ＨＡＭの合成培地Ｆ−１０およびＬ−１５の７：３混液に、牛胎児血清２％を添加して用いた。

【００６２】Coster 96 well plates の各wellにマウスのメラノーマ細胞(B16BL6)の懸濁液０．１ｍｌ（１×１
０ ³ cells）を採取した。 ２〜３時間後、０〜４０μＭ
の３−ケトプロトパナキサジオール（Ｉ）を含有する培地０．１ｍｌを添加し、５％ＣＯ ₂インキュベーター内で４日間、３７℃にて培養した。 培養終了後、WST-１を用いたMTT アッセイにより細胞数を測定した。

【００６３】比較例として、上記と同じ操作により、プロトパナキサジオール（II）がマウスのメラノーマ細胞（B16BL6）に及ぼす作用について検討した。

【００６４】図２から明らかなように、３−ケトプロトパナキサジオールは、プロトパナキサジオールよりも強く腫瘍細胞の増殖抑制することが分かる。

【００６５】実施例８ 実施例として、３−ケトパナキサジオール(IＩI)、比較例としてパナキサジオール（IV）及び３，１２−ケトパナキサジオール（Ｖ）を用いて、これらの化合物がマウスのメラノーマ細胞（B16BL6）の増殖に及ぼす影響を検討した。 牛胎児血清を１０％添加した以外は、実施例７
と同様の操作を実施した。

【００６６】図３から明らかなように、３−ケトパナキサジオールは、パナキサジオールよりも腫瘍細胞の増殖を強く抑制することが分かる。

【図面の簡単な説明】

【図１】オレアノール酸のメラノーマ細胞に対する増殖抑制を示す。

【図２】３−ケト−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールによるマウスのメラノーマ細胞（B16BL6）の増殖抑制を示す。

【図３】３−ケトパナキサジオールによるマウスのメラノーマ細胞（B16BL6）の増殖抑制を示す。

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