六月雪提取物的制备方法及其应用
阅读：1025发布：2020-10-26
专利汇可以提供六月雪提取物的制备方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种六月 雪 提取物的制备方法及其应用，将六月雪药材经30％～60％的 乙醇 提取、醇沉过柱后可得到六月雪提取物，本发明提取物与 现有技术 相比，六月雪提取物中的抗 肝炎 有效成分 齐墩果酸 、乌索酸等三萜类成分转移率得到较大的提高，最终药用提取物纯度较现有技术好，用药量大大减少。，下面是六月雪提取物的制备方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种六月雪提取物，其特征在于是通过如下方法得到：
(1)取六月雪干燥茎叶，粉碎，以30％～60％的乙醇回流提取，过滤，合并提取液，减压浓缩至每毫升药液含0.9～1.1g药材，得浓缩液I；
(2)在步骤(1)中所得的浓缩液I中加95％的乙醇，充分搅拌，调节浓缩液乙醇含量，使最终药液的乙醇浓度为50％～70％，室温静置，离心，取上清液，上清液减压浓缩至无醇，至相对密度为1.05～1.30，得浓缩液II；
(3)浓缩液II上已处理好的大孔吸附树脂柱，先以低于15％的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，改用大于60％的乙醇洗脱，收集此部分乙醇洗脱液，合并，减压浓缩，干燥，粉碎，得六月雪提取物。
2.如权利要求1所述的六月雪提取物，其特征是所述的六月雪提取物中，乌索酸的含量不低于0.75％，齐墩果酸的含量不低于0.25％。
3.一种含有如权利要求1所述的六月雪提取物的药物。
4.如权利要求3所述的药物，其特征是为口服药物。
5.如权利要求1所述的六月雪提取物在制备具有治疗乙型肝炎及急慢性肝损伤药物中的应用。
六月雪提取物的制备方法及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 六月雪又名白马骨、满天星，为茜草科植物六月雪Serissa Serissoides(DC.)Druce的干燥全草，分布于我国东南部及东部各省区，为民间常用药，早在《本草拾遗》中就有记载；能活血、凉血、疏肝泄湿、消肿止痛。主要用于急慢性肝炎、黄疸、流行性腮腺炎、肾性水中、血尿及高血压等症。据药理及临床报道，六月雪对急性黄疸型肝炎及高血压有明显的疗效，并物毒性反应。六月雪含车叶草苷、齐墩果酸、齐墩果酸乙酰化物、乌索酸、β-谷甾醇等成分，车叶草苷具有降压作用，而齐墩果酸、乌索酸等甾体类化物则为本品治疗肝炎的主要有效成分。
[0003] 现阶段，对六月雪用于治疗肝炎类疾病的提取物中，普遍采用水煎煮提取法，煎煮后所得到的提取物直接用药或者经过简单的醇沉处理。由于六月雪中治疗肝炎的有效成分齐墩果酸等一些甾体类化合物极性较小，用水煎煮提取损失大，提取不完全，且提取物中存有很多一些无效的水溶性成分，直接用药，给药量大。
发明内容
[0005] 具体地，本发明提取六月雪有效成分的方案为：六月雪干燥全草经粉碎成粗粉，以30％～60％的乙醇为提取溶媒，回流提取2～4次，过滤合并乙醇提取液，减压浓缩后，往浓缩液中加入95％的乙醇，边加边充分搅拌，调节药液乙醇量，使最终药液中乙醇浓度为
50％～70％，静置，室温放置约24小时，离心或过滤，取上清液或滤液，减压浓缩至浓缩液相对密度为1.05～1.30，无醇味，浓缩液上已处理好的大孔吸附树脂柱，先用低于15％的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，弃此部分洗脱液，改用大于60％的乙醇洗脱4～8个柱体积，收集此部分洗脱液，合并，减压浓缩，干燥，粉碎，得六月雪提取物。
50％～70％，静置，室温放置约24小时，离心或过滤，取上清液或滤液，减压浓缩至浓缩液相对密度为1.05～1.30，无醇味，浓缩液上已处理好的大孔吸附树脂柱，先用低于15％的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，弃此部分洗脱液，改用大于60％的乙醇洗脱4～8个柱体积，收集此部分洗脱液，合并，减压浓缩，干燥，粉碎，得六月雪提取物。
[0006] 本发明中，提取溶媒乙醇优选50％的乙醇，提取次数为3次，每次提取溶媒用量为10倍、8倍、8倍。
[0007] 洗脱大孔吸附树脂柱时，起始洗脱溶媒优选10％的乙醇，第二次洗脱溶媒优选75％的乙醇。
[0008] 本发明技术与现有技术相比，六月雪中的抗肝炎有效成分齐墩果酸、乌索酸等三萜类成分转移率得到较大的提高，最终药用提取物纯度较现有技术好，用药量大大减少。
[0009] 为说明上述有益效果，可以从实验数据加于说明，需要说明的是，下述的对比方案仅是为了说明本发明所取得的进步，而不是为了限制本发明。
[0010] 1、有效成分的转移率
[0011] 取100g干燥六月雪全草，分别采用水煎煮提取、50％的乙醇回流提取方案(即本发明提取方案)，对比其中齐墩果酸、乌索酸的转移率，结果见表1
[0012] 表1不同方案提取六月雪的结果比较
[0013]水煎煮提取法 50％乙醇回流提取 本发明最终提取物
干浸膏量g 30.72 33.36 8.78
乌索酸量mg 50.27 91.35 66.85
齐墩果酸量mg 15.49 27.21 22.73
干浸膏量g 30.72 33.36 8.78
乌索酸量mg 50.27 91.35 66.85
齐墩果酸量mg 15.49 27.21 22.73
[0014] 从上表结果可以看出，采用50％的乙醇回流提取法，其中乌索酸和齐墩果酸的提取转移率较水煎煮法明显要高，本发明六月雪最终提取物中，乌索酸和齐墩果酸的绝对量较水煎煮提取法高，而浸膏量却明显要少，两成分在浸膏中的含量为：水煎煮法，乌索酸0.164％，齐墩果酸0.0504％；本发明提取物，乌索酸0.76％，齐墩果酸0.26％。
[0015] 2、体外抗HBV活性
[0016] 试药：本发明六月雪提取物、六月雪水煎煮提取物。
[0017] 细胞株：2.2.15细胞株：中国医学科学研究院药物研究所药理室提供。
[0019] 将本发明提取物用双蒸水配成200μg/mL的水溶液，过0.22μm的微孔滤膜除菌，4℃保存，用时用RPMI1640稀释成200、160、100、50、25、13μg/mL的溶液。将2.2.15细胞解冻后常法接种到96孔板上，37℃5％CO2条件下培养4天，换含叶下珠13、25、50、100、160、
200μg/mL的RPMI1640完全培养基，每个浓度接种6孔，继续培养10天后测定(第5天时换液1次)，结果取平均值，求出对细胞无明显毒性作用的最高药物浓度为160μg/mL，选用对细胞基本无毒性的浓度80μg/mL，六月雪水煎煮提取物选用260μg/mL浓度(两个给药剂量折合生药量计算均为890μg药材/mL)，均设4个复孔，并设不加药物的对照，结果取平均值。将2.2.15细胞按常规方法传入24孔板，5％CO2条件下培养4天后，各孔分别换以不同浓度药物培养基，继续培养10天并分别收集药物作用后5天和10天的培养上清液，分别作HBsAg和HBeAg测定。操作按试剂盒说明书进行，结果见表2
200μg/mL的RPMI1640完全培养基，每个浓度接种6孔，继续培养10天后测定(第5天时换液1次)，结果取平均值，求出对细胞无明显毒性作用的最高药物浓度为160μg/mL，选用对细胞基本无毒性的浓度80μg/mL，六月雪水煎煮提取物选用260μg/mL浓度(两个给药剂量折合生药量计算均为890μg药材/mL)，均设4个复孔，并设不加药物的对照，结果取平均值。将2.2.15细胞按常规方法传入24孔板，5％CO2条件下培养4天后，各孔分别换以不同浓度药物培养基，继续培养10天并分别收集药物作用后5天和10天的培养上清液，分别作HBsAg和HBeAg测定。操作按试剂盒说明书进行，结果见表2
[0020]
[0021] 表2六月雪提取物对2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的体外抑制作用
[0022]剂量 HBsAg抑制率(％) HBeAg抑制率(％)
组别
μg/mL 5天 10天 5天 10天
水煎煮提取物组 890 43.27 21.36 52.56 63.95
本发明提取物组 80 52.25 30.62 67.31 79.62
组别
μg/mL 5天 10天 5天 10天
水煎煮提取物组 890 43.27 21.36 52.56 63.95
本发明提取物组 80 52.25 30.62 67.31 79.62
[0023] 上表结果表明，六月雪提取物对HepG2.2.15细胞株中HBV的HBeAg的表达均具有一定的抑制作用，在生药剂量相等的情况下，本发明精制提取物的体外抑制作用要强于水煎煮提取物。
[0024] 3、对CCl4所致肝损伤保护作用
[0025] 将40只小鼠随机分为对照组、CCl4模型组、本发明提取物组(给药量：0.27g提取物/kg，相当于原药材3g/kg)、六月雪水煎煮提取物组(1.5g水煎物/kg，相当于原药材5g/kg)，每组10只。实验室饲养2天后，除对照组及模型组小鼠用蒸馏水0.5ml/鼠灌胃外，其余各组均按剂量灌胃，1次/天，连续1周。末次给药后2h，除对照组小鼠外，均按10ml/kg一次性腹腔注射0.1％CCl4花生油溶剂，禁食不禁水，16h后眼眶取血，离心取血清，测定血清谷丙转氨酶(ALT)、血清谷草转氨酶(AST)的活性，结果见表3，本发明提取物对CCl4致小鼠肝损伤血清ALT、AST活性的升高有明显的拮抗作用。
[0026] 表3六月雪提取物对CCl4致小鼠肝损伤的影响
[0027]组别 剂量(g/kg) AST(U/dl) ALT(U/dl)
对照组 0.5ml水 105.9±11.8 86.9±10.1
模型组 0.5ml水 1085.4±131.34 1337.6±121.3
水煎提取组 1.5 594.2±76.5* 812.4±88.5*
本发明提取物组 0.27 483.7±69.8** 598.2±76.1**
对照组 0.5ml水 105.9±11.8 86.9±10.1
模型组 0.5ml水 1085.4±131.34 1337.6±121.3
水煎提取组 1.5 594.2±76.5* 812.4±88.5*
本发明提取物组 0.27 483.7±69.8** 598.2±76.1**
[0028] 与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01
[0029] 从上表结果可以看出，六月雪提取物对由CCl4所致的肝损伤的ALT、AST升高有明显的抑制作用，其中本发明提取物的作用效果较水煎煮提取物强(按生药量计，六月雪水煎煮提取物给药量大于本发明提取物给药量，而降酶效果不如本发明方法所得的提取物)。
[0030] 本发明的再一目的在于提供一种含有依本发明方法所得六月雪提取物的制剂。本发明提取物可以与其它具有类似作用的药物联合使用组成复方制剂，类似的其它药物可以是化学药，也可以是其它中药提取物，如可以在本发明提取物中加入拉米夫定，或将本发明提取物与青叶胆提取物、黄芪提取物等合用以用于制备抗乙型肝炎和治疗急慢性肝损伤的药物。
[0031] 本发明制剂中，所述的口服制剂可以是以胶囊或片剂形式或液体形式给药的口服制剂。本发明中除含有活性成分六月雪提取物外，还含有其它制药上可接受的赋形剂，这些赋形剂可以是填充剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、骨架材料、阻滞剂等中的一种或多种的组合，这些赋形剂为本领域技术人员所熟知的。
[0032] 本发明的还一目的在于提供本发明所得的六月雪提取物在制备具有治疗肝炎和急慢性肝损伤作用的药物中的应用。
[0033] 具体实施例
[0034] 以下从本发明具体制备实施例来说明本发明
[0035] 实施例1
[0036] 取六月雪干燥全草10kg，粉碎成粗粉，以50％的乙醇回流提取3次，每次溶剂用量为100L、80L、80L，提取时间分别为2小时、1小时、1小时，过滤，合并提取液，60℃下减压
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