一种夏枯草和/或山菠菜优效组分及其在糖尿病、糖尿病肾病药物中的用途
阅读：739发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种夏枯草和/或山菠菜优效组分及其在糖尿病、糖尿病肾病药物中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种夏枯草和/或山菠菜优效组分及其在糖尿病、糖尿病肾病药物中的用途，该活性组分包括 熊果酸 、 齐墩果酸 、科罗索酸，特征为齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.10-0.38：0.70-0.95：0.05-0.25。实验证明，该优效组分对糖尿病肾病大鼠具有较好的降血糖及增加体重的作用；可明显降低糖尿病肾病大鼠的血肌酐、血尿素氮及24小时尿蛋白的含量；而且可显著抑制糖尿病肾病大鼠的肾脏细胞因子TGF-β1、FN蛋白和ColⅣ蛋白的表达。本发明组分可以制成胶囊剂、片剂、丸剂或颗粒剂等剂型来使用，在 治疗 糖尿病及糖尿病肾病方面具有广阔的使用前景。，下面是一种夏枯草和/或山菠菜优效组分及其在糖尿病、糖尿病肾病药物中的用途专利的具体信息内容。
1.一种夏枯草和/或山菠菜优效组分，其主要活性成分为齐墩果酸、熊果酸和科罗索酸，其特征在于齐墩果酸：熊果酸：科罗索酸的重量比为0.10-0.38：0.70-0.95：0.05-0.25。
2.如权利要求1所述的夏枯草和/或山菠菜优效组分在制备治疗糖尿病药物中的应用。
3.如权利要求1所述的夏枯草和/或山菠菜优效组分在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
4.根据权利要求2-3任一项所述的应用，其特征在于将所述的夏枯草和/或山菠菜优效组分与药学上可接受的辅料混合，制成胶囊剂、片剂、丸剂或者颗粒剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述药学上可接受的辅料选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、溶剂或矫味剂中的一种或几种。
6.一种如权利要求1所述的夏枯草和/或山菠菜优效组分的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)采唇形科植物夏枯草和/或山菠菜的干燥果穗，洗净；
(2)加热回流提取；
(3)将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、35-45％乙醇、70-
80％乙醇溶液洗脱，收集70-80％乙醇洗脱部位；
(4)将步骤3中70-80％乙醇洗脱部位浓缩后，真空干燥至浸膏状态，获得优效组分。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中加热回流提取两次，第一次加15-25倍量90-99.8％乙醇，回流提取1-2h，第二次加15-25倍量90-99.8％乙醇，回流提取
0.5-1.5h，合并两次的提取液。
一种夏枯草和/或山菠菜优效组分及其在糖尿病、糖尿病肾病
药物中的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种天然成分的应用，具体为一种夏枯草和/或山菠菜优效组分及其在糖尿病、糖尿病肾病药物中的用途。
背景技术
[0002] 糖尿病是一种严重的代谢性疾病，是世界性的重大健康问题。糖尿病影响了全球大约4％的人口，预计到2025年将增加到5.4％。据统计，我国是糖尿病患者最多的国家之一，而糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见的微血管并发症之一，也是糖尿病中致死率最高的一种并发症，对人体伤害极大，其中，约有30％-45％的患者最终导致终末期肾病(ESRD)；其早期病理表现为肾小球滤过率增加，肾小球系膜区增宽和肾小球毛细血管基膜增厚；后期表现为肾小球滤过率下降，肾小球、肾小管间质纤维化等。据统计，到21世纪中叶，全世界糖尿病患者将达到3.66亿，DN患者将超过1亿，糖尿病肾病发病率也逐年上升，因此，找到能够有效治疗糖尿病及糖尿病肾病的药物显得十分重要。
[0003] 中药制剂作为一个复杂的体系，其物质基础并非某单一成分起作用，而是通过多成分，多靶点以实现协同作用来发挥药效。中药物质基础“组分结构理论”认为中药的物质基础从微观到宏观分为三个层次，其中单体成分是组成物质基础的最基本单元，由同一化学类别的单体成分构成组分，不同的组分相互作用形成的整体即构成了中药制剂的物质基础。每一组分中的多个成分具有一定的构成配比，以此来控制中药制剂的质量，即实现了中药制剂的可控性，又体现了中药的整体性。只有在最佳的组分/成分组合量比范围内，多成分药物才能发挥最佳效应。
[0004] 夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgarisL.的干燥果穗，山菠菜为夏枯草属Prunella植物，常将夏枯草和山菠菜作为类似药材使用。研究发现它们具有良好的降糖作用。夏枯草和/或山菠菜乙醇提取物中含有丰富的三萜类化合物，以齐墩果酸和熊果酸含量最高，另外还含有少量的科罗索酸，近代药理证明它们具有良好的抗糖尿病效果。齐墩果酸能通过减弱机体对葡萄糖的吸收和转运、减少内源性葡萄糖的产生、增加受体细胞的胰岛素敏感性来直接降低血糖含量，可提高糖尿病肾病大鼠的抗氧化功能；与齐墩果酸类似，熊果酸可降低STZ诱导的糖尿病肾病大鼠的FBG、KW/BW、BUN、SCr水平，可增强肾脏功能，减轻氧化性损伤，通过抑制肾脏TNF-α、MCP-1和IL-1β的表达以减轻肾脏的炎症损伤，达到治疗糖尿病肾病的效果；科罗索酸可通过抑制肾小球系膜细胞的增殖从而降低糖尿病对肾脏的损伤。因此从夏枯草和/或山菠菜中提取这些活性组分，按照一定的成分配比用于治疗糖尿病肾病，具有重大的意义。
[0005] 在文献报道方面，有过将夏枯草用于治疗糖尿病的案例，但其报道的活性成分主要为咖啡酸、迷迭香酸或其它三萜类成分。
发明内容
[0006] 发明目的：本发明的目的在于提供一种基于组分结构特征的夏枯草和/或山菠菜优效组分。本发明的另一个目的在于公开该优效组分在制备治疗糖尿病药物中的应用。本发明还有一个目的在于公开该优效组分在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
[0007] 技术方案：本发明所述的夏枯草和/或山菠菜优效组分，其主要活性成分为齐墩果酸、熊果酸和科罗索酸，齐墩果酸：熊果酸：科罗索酸的重量比为0.10-0.38：0.70-0.95：0.05-0.25。
[0008] 所述的夏枯草和/或山菠菜优效组分在制备治疗糖尿病药物中的应用。
[0009] 所述的夏枯草和/或山菠菜优效组分在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
[0010] 将所述的夏枯草和/或山菠菜优效组分与药学上可接受的辅料混合，制成胶囊剂、片剂、丸剂或者颗粒剂。
[0012] 所述的夏枯草和/或山菠菜优效组分的制备方法，包括以下步骤：
[0013] (1)采唇形科植物夏枯草和/或山菠菜的干燥果穗，洗净；
[0014] (2)加热回流提取；
[0015] (3)将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、35-45％乙醇、70-80％乙醇溶液洗脱，收集70-80％乙醇洗脱部位；
[0016] (4)将步骤3中70-80％乙醇洗脱部位浓缩后，真空干燥至浸膏状态，获得优效组分。
[0017] 所述的制备方法，步骤(2)中加热回流提取两次，第一次加15-25倍量90-99.8％乙醇，回流提取1-2h，第二次加15-25倍量90-99.8％乙醇，回流提取0.5-1.5h，合并两次的提取液。
[0018] 有益效果：本发明公开了夏枯草和/或山菠菜优效组分对糖尿病肾病大鼠具有较好的降血糖及增加体重的作用；可明显降低糖尿病肾病大鼠的血肌酐、血尿素氮及24小时尿蛋白的含量；而且可显著抑制糖尿病肾病大鼠的肾脏细胞因子TGF-β1、FN蛋白和ColⅣ蛋白的表达，有良好的应用前景。附图说明
[0019] 图1为夏枯草和/或山菠菜优效组分HPLC图谱；
[0020] 图2为各组大鼠体重变化过程，图示为各组大鼠给药1至8的体重减去给药前的体重的变化情况；
[0021] 图3为各组大鼠给药期间血糖的变化过程；
[0022] 图4为给药优效组分后大鼠24h尿蛋白含量图(与空白组比，####P＜0.0001；与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)；
[0023] 图5为给药优效组分后大鼠血肌酐含量图(与空白组比，####P＜0.0001；与模型组** *** ****比，P＜0.01， P＜0.001, P＜0.0001)；
[0024] 图6为给药优效组分后大鼠血尿素氮含量图(与空白组比，##P＜0.01；与模型组比，*P＜0.05)；
[0025] 图7为给药优效组分后大鼠AGEs含量图(与空白组比，###P＜0.001；与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01)；
[0026] 图8为给药优效组分后大鼠RAGE含量图(与空白组比，###P＜0.001；与模型组比，**P＜0.01)；
[0028] 图10为大鼠肾脏PAS染色(a为空白组、b为模型组、c为氨基胍组、d为夏枯草和/或山菠菜醇提物高剂量组、e为夏枯草和/或山菠菜醇提物低剂量组、f为夏枯草和/或山菠菜优效组分组)；
[0029] 图11大鼠肾脏组织TGF-β1免疫组化图(a：空白组、b：模型组、c：氨基胍组、d：夏枯草和/或山菠菜醇提物高剂量组、e：夏枯草和/或山菠菜醇提物低剂量组、f:夏枯草和/或山菠菜优效组分组)；
[0030] 图12大鼠肾脏组织FN免疫组化图(a：空白组；b：模型组；c：氨基胍组；d：夏枯草和/或山菠菜醇提物高剂量组；e：夏枯草和/或山菠菜醇提物低剂量组；f:夏枯草和/或山菠菜优效组分组)；
[0031] 图13大鼠肾脏组织ColⅣ免疫组化图；其中：a为空白组、b为模型组、c为氨基胍组、d为夏枯草和/或山菠菜醇提物高剂量组、e为夏枯草和/或山菠菜醇提物低剂量组、f为夏枯草和/或山菠菜优效组分组(a：空白组；b：模型组；c：氨基胍组；d：夏枯草和/或山菠菜醇提物高剂量组；e：夏枯草和/或山菠菜醇提物低剂量组；f:夏枯草和/或山菠菜优效组分组)；
[0032] 图14大鼠肾脏组织中TGF-β1、FN、ColⅣ蛋白变化情况，其中：1为空白组；2为模型组；3为阳性组；4为夏枯草和/或山菠菜醇提物高剂量组；5为夏枯草和/或山菠菜醇提物低剂量组、6为夏枯草和/或山菠菜优效组分组(1：空白组；2：模型组；3：氨基胍组；4：夏枯草和/或山菠菜醇提物高剂量组；5：夏枯草和/或山菠菜醇提物低剂量组；6：夏枯草和/或山菠菜优效组分组)。
具体实施方式
[0033] 实施例1夏枯草和/或山菠菜活性组分的制备方法
[0034] 取夏枯草500g，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.22：0.70：0.25。
[0035] 取山菠菜500g，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.15：0.95：0.21。
[0036] 取夏枯草和山菠菜的混合药材共500g，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.10：0.95：0.08。
[0037] 实施例2
[0038] 取夏枯草1kg，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.38：0.72：0.18。
[0039] 取山菠菜1kg，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.37：0.89：0.05。
[0040] 取夏枯草和山菠菜的混合药材共1kg，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.30：0.75：0.24。
[0041] 实施例3
[0042] 取夏枯草1kg，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，经HPLC检测，浸膏中活性组分含量为65.2％，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.26：0.78：0.25。
[0043] 取山菠菜1kg，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，经HPLC检测，浸膏中活性组分含量为65.2％，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.16：0.70：0.24。
[0044] 取夏枯草和山菠菜的混合药材共1kg，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，经HPLC检测，浸膏中活性组分含量为65.2％，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.23：0.76：0.23。
[0045] 实施例4
[0046] 取夏枯草1kg，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，经HPLC检测，浸膏中活性组分含量为66.4％，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.17：0.94：0.18。
[0047] 取山菠菜1kg，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，经HPLC检测，浸膏中活性组分含量为66.4％，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.38：0.72：0.16。
[0048] 取夏枯草和山菠菜的混合药材共1kg，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，经HPLC检测，浸膏中活性组分含量为66.4％，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.37：0.92：0.21。
[0049] 实施例5
[0050] 取夏枯草1kg，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，经HPLC检测，浸膏中活性组分含量为67.5％，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.25：0.82：0.10。
[0051] 取山菠菜1kg，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，经HPLC检测，浸膏中活性组分含量为67.5％，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.35：0.88：0.13。
[0052] 取夏枯草和山菠菜的混合药材共1kg，加热回流提取两次，第一次加20倍量95％乙醇，回流提取1.5h，第二次加20倍量95％乙醇，回流提取1h，合并两次的提取液，将提取液浓缩后，用纯水稀释，上AB-8型大孔树脂，依次用纯水、40％乙醇、75％乙醇溶液以8倍柱体积洗脱，收集75％乙醇洗脱部位，将75％乙醇洗脱部位浓缩至无流动性，真空干燥至干浸膏状态，经HPLC检测，浸膏中活性组分含量为67.5％，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸的重量比为0.33：0.85：0.19。
[0053] 实施例6
[0054] 不同配伍比例活性组分的活性评价
[0055] 1.仪器与试剂：
[0056] 大鼠系膜细胞(HBZY-1)；DMEM(低糖、高糖)培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、CO2细胞培养箱、倒置显微镜、全自动酶标仪、低温超速离心机、超净工作台、微量移液器、数显恒温搅拌循环水浴锅。
[0057] 2.实验方法：
[0058] (1)HBZY-1细胞体外培养
[0059] 高糖模型对照组及给药组用高糖DMEM+10％PBS培养基进行培养，空白对照组用低糖DMEM+10％PBS培养基培养，在37℃、5％CO2条件下生长至80％-90％汇合时进行细胞传代。倾倒去除培养器皿内的培养基，用PBS洗涤细胞1次，弃去PBS，根据培养基面积加入适量0.1％胰酶溶液消化，37℃放置3-5min，并在倒置显微镜下观察，待到绝大部分细胞变圆并悬浮后即加入培养基终止消化，吹吸几次已离散成团的细胞，按1:3比例进行细胞传代，传代后的细胞24h后全数换液一次。
[0060] (2)MTT检测HBZY-1细胞活力
[0061] 取对数生长期的HBZY-1细胞，将其消化后调整到一定细胞浓度，均匀接种于96孔板上，在37℃，5％CO2的培养箱培养24h，弃去培养基，空白组和高糖模型对照组不做处理，给药组分别给予实施例3-5中的优效组分，阳性对照组孔给予氨基胍，5％CO2条件下培养48h，弃去药液，每孔加入20μL(5mg/mL)MTT，培养4h，终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入
150μL DMSO，37℃孵育10min，全自动酶标仪在波长570nm处测定各孔OD值。按以下公式计算细胞存活率：
150μL DMSO，37℃孵育10min，全自动酶标仪在波长570nm处测定各孔OD值。按以下公式计算细胞存活率：
[0062]
[0063] (3)实验结果
[0064] 用MTT法检测不同配比夏枯草和/或山菠菜优效组分的细胞存活率，结果如下表，不同配比的夏枯草和/或山菠菜优效组分均可抑制系膜细胞的增值，其中齐墩果酸、熊果酸、科罗索酸(0.25：0.82：0.10)抑制效果最为显著，其抑制效果接近阳性药氨基胍的效果，故夏枯草和/或山菠菜优效组分的最佳配比为齐墩果酸：熊果酸：科罗索酸＝0.25：0.82：0.10。
[0065]
[0066]
[0067] 实施例7夏枯草和/或山菠菜活性组分成分的确定
[0068] 将制得的夏枯草和/或山菠菜活性组分用甲醇溶解，甲醇稀释后用HPLC法测定其中活性组分的含量。
[0069] 仪器：ThermoFisher U3000 HPLC(美国ThermoFisher公司)、SVEA C18 Gold 5μm250*4.6mm色谱柱。
[0070] 色谱条件：乙腈：0.1％磷酸水(90:10)等度洗脱；时间:30min；柱温25℃；波长210nm；流速1.0mL/min。
[0071] 夏枯草活性组分的成分见图1。
[0072] 实施例8药效学实验
[0073] 1.造模及分组
[0074] 选用8周龄的SPF级SD雄性大鼠共36只，6只作为空白组大鼠给予正常饮食，其余大鼠给予高糖高脂饲料4周后腹腔注射STZ(35mg/kg)溶液进行二型糖尿病造模，空白组大鼠腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲溶液。腹腔注射STZ溶液72h、120h、168h后剪尾采血测定大鼠血糖，以血糖值≥16.7mmol/L的大鼠为糖尿病模型成功，用代谢笼法收集大鼠24h尿液，测定大鼠尿蛋白含量，以24h尿蛋白含量≥20g为肾病模型成功。
[0075] 2.给药及处理
[0076] 造模结束后将糖尿病肾病模型成功的大鼠分为模型组(n＝6)、氨基胍组(100mg/kg/d，n＝6)、夏枯草和/或山菠菜醇提物高剂量组(6g饮片/kg/d，n＝6)、夏枯草醇/山菠菜提物低剂量组(3g饮片/kg/d，n＝6)、夏枯草和/或山菠菜优效组分组(纯度90％以上的科罗索酸、熊果酸、齐墩果酸以实施例6中最佳比例混合，100mg/kg/d，n＝6)、空白组和模型组给予纯水，每组大鼠灌胃给药8周。给药期间每周测量大鼠体重和血糖。给药8周后，代谢笼法接取大鼠尿液，记录大鼠尿量；10％水合氯醛溶液麻醉，腹主动脉取血，分离血清，-80℃冰箱保存；快速摘取大鼠双肾，左肾用10％福尔马林溶液固定，用于HE病理切片染色、免疫组织化学的分析，右肾存于-80℃超低温冰箱中，用于Western Blot相关组织蛋白指标的检测。
[0077] 3.指标及实验方法
[0078] (1)采用尾尖采血法，使用血糖仪测定大鼠血糖值；使用尿蛋白定量测试盒测定大鼠尿蛋白浓度，计算大鼠24h尿蛋白含量；使用肌酐测试盒和血尿素氮测试盒测定大鼠血清中血肌酐和血尿素氮的含量；使用ELISA试剂盒测定大鼠血清中AGEs和RAGE含量。
[0079] (2)HE染色按照下列步骤进行：取材大鼠肾脏组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片；切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min；苏木素染色5分钟，自来水冲洗；盐酸乙醇分化30秒；自来水浸泡15分钟或温水(约50℃)5分钟；
置伊红液2分钟；常规脱水，透明，封片：95％乙醇(I)min→95％乙醇(Ⅱ)1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封固，显微镜下观察组织形态。
置伊红液2分钟；常规脱水，透明，封片：95％乙醇(I)min→95％乙醇(Ⅱ)1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封固，显微镜下观察组织形态。
[0080] (3)PAS染色按照下列步骤进行：常规固定，常采用10％的福尔马林，常规脱水包埋；石蜡切片脱蜡入蒸馏水；冰冻切片直接入蒸馏水；自来水冲洗2～3min，再用蒸馏水浸洗2次；然后入过碘酸溶液，室温放置5～8min，自来水冲洗1次，再用蒸馏水浸洗2次，然后入Schiff试剂，置于室温阴暗处浸染10～20min，自来水冲洗10min，入苏木素染色液，染细胞核1～2min，酸性乙醇分化液分化2～5s，自来水冲洗10～15min，更换蒸馏水清洗，使其返蓝，逐级常规乙醇脱水。二甲苯透明，中性树胶封固，倒置显微镜下观察切片。
[0081] (4)Western Blot法测定大鼠肾脏组织中TGF-β1、FN、ColⅣ蛋白变化情况，取超低温冰箱中保存的肾脏组织100mg，用预冷的生理盐水冲洗后，在冰上研磨。利用蛋白提取试剂盒提取全蛋白，Bradford法定量测定蛋白浓度，将各组样本总蛋白变性后进行SDS-PAGE凝胶垂直电泳进行蛋白质分离。然后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，将膜室温封闭2h，与特异性一抗4℃过夜孵育，与二抗室温孵育2h后显色，以GAPDH蛋白作为内参标准，使用G:BOX chemiXR5成像，采用ImageJ图像分析软件对蛋白条带进行分析。蛋白的相对表达量以目的蛋白条带的灰度值与内参蛋白条带的灰度值的比值表示。
[0082] (5)采用免疫组化的方法测定糖尿病肾病大鼠肾脏中TGF-β1、FN、ColⅣ蛋白变化情况。按照以下步骤进行：取大鼠肾脏组织小于0.5cm×0.5cm×0.1cm的组织块，PBS清洗；用4％多聚甲醛进行固定，经70％乙醇30分钟、80％乙醇30分钟、90％乙醇30分钟两次、95％乙醇30分钟两次、100％乙醇30分钟两次、二甲苯透明15分钟两次、55℃石蜡中1小时三次，用不锈钢模具包埋组织块；将厚度5um的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60℃过夜；将切片浸于二甲苯中5分钟两次、100％乙醇5分钟两次、95％乙醇5分钟两次、90％乙醇5分钟两次、85％乙醇5分钟次、70％乙醇5分钟两次，自来水冲洗，PBS洗两次；柠檬酸缓冲液，热修复20分钟，PBS洗3次×5分钟；3％双氧水，室温10分钟，PBS洗3次×5分钟；切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，不洗；切片上滴加第一抗体，4℃过夜，PBS洗3次×5分钟；切片上滴加生物素化第二抗体(IgG)，37℃20分钟，PBS洗3次×5分钟；切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃20分钟，PBS洗3次×5分钟；使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上，显色6分钟，充分水洗；
苏木素1分钟，充分水洗，1％盐酸酒精分化，1％胺水反蓝，充分水洗；经70％乙醇5分钟、
80％乙醇5分钟、90％乙醇5分钟两次、95％乙醇5分钟两次、100％乙醇5分钟两次脱水、二甲苯透明5分钟两次、中性树脂封片，显微镜下观察。
苏木素1分钟，充分水洗，1％盐酸酒精分化，1％胺水反蓝，充分水洗；经70％乙醇5分钟、
80％乙醇5分钟、90％乙醇5分钟两次、95％乙醇5分钟两次、100％乙醇5分钟两次脱水、二甲苯透明5分钟两次、中性树脂封片，显微镜下观察。
[0083] 4.统计方法
[0084] ˉ
[0085] 实验数据以x±s表示，应用Graphpad prism 6.01软件进行统计学处理，组件比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。
[0086] 5.药效学实验结果(1)夏枯草和/或山菠菜醇提物及优效组分对糖尿病肾病大鼠体重的影响
[0087] 造模结束后，造模成功大鼠出现体重明显减轻，体型明显变得瘦弱，出现毛色发黄，精神萎靡等现象；实验过程中，模型组大鼠体重出现下降趋势，阳性组和夏枯草醇提物低剂量组下降趋势有所减弱，夏枯草醇/山菠菜提物高剂量组和夏枯草和/或山菠菜优效组分组体重则出现上升趋势，说明高剂量夏枯草和/或山菠菜醇提物和优效组分单体具有有效缓解糖尿病肾病大鼠体重减轻，形态消瘦的作用。给药期间大鼠体重变化见图2。(2)夏枯草和/或山菠菜醇提物及优效组分对糖尿病肾病大鼠血糖的影响
[0088] 造模结束后，造模大鼠按血糖随机分组，给药前模型组、氨基胍组、夏枯草和/或山菠菜醇提物高、低剂量组各组大鼠血糖水平无明显差异。给药期间每周测定一次血糖，模型组大鼠血糖保持平稳，在给药期间血糖变化不大，氨基胍组、夏枯草和/或山菠菜醇提物高、低剂量组、夏枯草和/或山菠菜优效组分组均呈现下降趋势，说明夏枯草醇提物高、低剂量和活性组分均有降低糖尿病肾病大鼠血糖的作用，且高剂量夏枯草和/或山菠菜醇提物、活性组分降血糖作用与阳性药氨基胍相似。(见表1、表2、图3)
[0089] 表1给药期间各组大鼠血糖变化情况(mmol/L)
[0090]
[0091]
[0092] 表2给药期间各组大鼠血糖变化情况(mmol/L)
[0093]
[0094] 注：与空白组比较，####P＜0.0001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001,****P＜0.0001
[0095] (3)夏枯草和/或山菠菜醇提物及优效组分对糖尿病肾病大鼠24h尿蛋白的影响[0096] 造模结束后，造模大鼠按24h尿蛋白含量随机分组，给药前模型组、氨基胍组、夏枯草和/或山菠菜醇提物高、低剂量组各组大鼠尿蛋白水平无明显差异。给药8周后，各组大鼠尿蛋白含量见图4，与空白组大鼠相比，模型组大鼠尿蛋白含量显著增加，给药结束后，夏枯草和/或山菠菜醇提物高剂量组和夏枯草和/或山菠菜优效组分组大鼠尿蛋白含量有一定程度降低，而夏枯草和/或山菠菜醇提物低剂量组大鼠尿蛋白含量与模型组大鼠相比无显著相差异。
[0097] (4)夏枯草和/或山菠菜醇提物及优效组分对糖尿病肾病大鼠血肌酐、血尿素氮含量的影响
[0098] 结果见表3、图5、图6，从表中可以看出高剂量的夏枯草和/或山菠菜醇提物和优效组分可显著降低大鼠血肌酐含量，对血尿素氮也有一定的而降低作用；低剂量的夏枯草和/或山菠菜醇提物也对血肌酐含量有显著影响，但是对血尿素氮含量影响不大。
[0099] 表3各组大鼠血清中血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)含量(mmol/L)
[0100]
[0101] 注：与空白组比较，####P＜0.0001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001,****P＜0.0001
[0102] (5)夏枯草和/或山菠菜醇提物及优效组分对糖尿病肾病大鼠AGEs、RAGE含量的影响
[0103] 结果见表4、图7、图8，从表中可以看出高剂量的夏枯草和/或山菠菜醇提物和优效组分对大鼠血清AGEs以及RAGE均有一定的降低作用，低剂量夏枯草和/或山菠菜醇提物则无明显效果。
[0104] 表4各组大鼠血清中AGEs(ng/L)和RAGE(pg/L)含量
[0105]
[0106]
[0107] 注：与空白组比较，####P＜0.0001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001,****P＜0.0001
[0108] (6)HE(见图9)、PAS(见图10)染色和显示，空白组(a)大鼠肾小管上皮细胞排列整齐，肾小体质地均匀，肾小囊腔清晰可见，未见明显的系膜增生或毛细血管变性，无炎症；模型组(b)大鼠部分肾小球缺失，系膜基质增生明显，肾小管上皮细胞空泡化，部分肾小管上皮细胞脱落坏死，肾小管的管腔不同程度缩小，管腔变窄，炎性浸润明显，形态影响最为严重；氨基胍组(c)大鼠肾小管腔不同程度缩小，管腔变窄，肾小体囊腔面积增大，上皮细胞崩解，较模型组大鼠有明显改善；给药组大鼠上述病变较模型组大鼠有明显的改善，表现为系膜基质增生、肾小管上皮细胞空泡化、脱落坏死现象较模型组较轻，尤其是高剂量组(d)，相较于低剂量组(e)又有明显的改善，而高剂量组与夏枯草和/或山菠菜优效组分组(f)相似，且给药组大鼠炎性浸润也没有模型组大鼠明显。
[0109] (7)细胞因子TGF-β1可以通过调节纤连蛋白(FN)以及Ⅳ胶原蛋白的合成，促进细胞外基质的大量沉积，造成肾小球硬化；采用Western Blot检测大鼠肾脏组织中TGF-β1、FN以及ColⅣ蛋白的表达情况，结果如图14、表5所示，与空白组大鼠相比模型组大鼠肾脏组织中，TGF-β1、FN以及ColⅣ蛋白表达显著上调，夏枯草和/或山菠菜醇提物则可显著下调这些蛋白的表达，且高剂量组下调趋势较低剂量组明显。
[0110] 表5夏枯草和/或山菠菜提取物优效组分对TGF-β1、FN、ColⅣ表达[0111]
[0112]
[0113] 注：与空白组比较，###P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
[0114] (8)免疫组化法测定糖尿病肾病大鼠肾脏中TGF-β1、FN、ColⅣ蛋白变化情况。结果如图11-13。与空白组相比，模型组大鼠肾脏的TGF-β1、FN及ColⅣ蛋白表达显著增加，夏枯草和/或山菠菜醇提物高低剂量给药组、夏枯草优效组分组均能不同程度抑制TGF-β1、FN及ColⅣ蛋白的表达，且高剂量组效果与优效组分相似，均优于低剂量组。
[0115] 实施例9
[0116] 将实施例5中干浸膏粉碎后，取药粉加适量微晶纤维素充分混匀，加适量淀粉浆制软材，用造粒机制成湿粒，干燥后进行整粒，加适量滑石粉和硬脂酸镁混合均匀，压制成片，制成片剂，每片含活性成分相当于9g夏枯草生药量，用法用量：口服，每次1片，一日两次，小儿酌减。
[0117] 实施例10
[0118] 将实施例5中干浸膏粉碎后，取药粉加适量淀粉，充分混匀后加适量淀粉糊精和聚乙二醇6000制成软材，用造粒机制成湿粒，干燥后进行整粒，袋装，制成颗粒剂，每袋含活性成分相当于9g夏枯草生药量，用法用量：口服，每次1袋，一日两次，小儿酌减。
[0119] 实施例11
[0120] 将实施例5中干浸膏粉碎后，取药粉加适量淀粉，充分混匀后加适量淀粉糊精和聚乙二醇6000制成软材，用造粒机制成湿粒，干燥后进行整粒，填入胶囊囊壳中，制成胶囊，每粒含活性成分相当于9g夏枯草生药量，用法用量：口服，每次1粒，一日两次，小儿酌减。
[0121] 实施例12
[0122] 将实施例5中干浸膏粉碎后，取药粉加适量炼蜜，充分混匀制成软硬适宜，可塑性好的丸块，丸块放置一段时间后搓成丸条，用轧丸机制丸，制成丸剂，每丸含活性成分相当于9g夏枯草生药量，用法用量：口服，每次1丸，一日两次，小儿酌减。
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