一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂及制
备方法
技术领域
背景技术
[0002] 白色念珠菌是一种条件致病菌,念珠菌病是由念珠菌属引起的感染,可能发生在
皮肤、眼睛、
口腔、食道、胃肠道、阴道和血管系统。外阴阴道念珠菌病(VVC)是常见的女性阴道
疾病。据统计,在全球范围内,VVC是人类最常见的
真菌感染,超过75%的女性在她们的一生中至少发作一次,5%-8%的女性则会反复发作。外阴阴道炎念珠菌病(VVC)临床表现为阴道和外阴组织
瘙痒,
疼痛和灼热感,阴道分泌物增多,从而影响女性
生活质量。
[0003] 目前,以阴道内局部
给药或口服制剂形式提供唑类抗真菌剂通常被推荐为首选治疗方法。然而,这类抗真菌剂谱窄和较大的毒性作用,且由于过度使用抗真菌剂存在潜在耐药性威胁,低剂量或单剂量治疗等因素导致外阴阴道炎念珠菌病(VVC)复发率上升。因此,天然来源物质抗菌治疗VVC已成为越来越多阴道炎药物开发的方向。
[0004] 无患子,亦称洗手果、油罗树,一种生长于热带地区的落叶乔木,具有抗炎、
镇痛、抗
肿瘤活性等功能,其根、皮、叶、
果皮、
种子等均具有很强的药用价值,是不可多得的自然资源。无患子果皮中含有丰富的皂苷,已有研究表明无患子皂苷体外具有抗菌活性,且无患子取材便利,具有良好的产品开发前景。
[0005] 温控型原位凝胶,是一类以溶液状态给药,能在一定的
温度下在用药部位发生相转变,由液态转
化成非化学交联半固体凝胶的制剂。温控型原位凝胶具有很好的
生物相容性,在给药部位能够具有有效的
停留时间,从而保证药物的作用,是一种新型的给药系统。
[0006] 本
申请制备的温控型凝胶,是以泊洛沙姆407作为凝胶基质,泊洛沙姆188作为温度调节器,聚乙二醇400为附加剂配制而成的。泊洛沙姆407随着温度升高,其凝胶温度降低;泊洛沙姆188随着温度升高,其凝胶温度升高,聚乙二醇400,随着温度升高,其凝胶温度升高。通过调整不同的比例,配方可以在不同的温度下凝胶,以实现温控的技术创新效果。
[0007] 将无患子
水提
发酵液通过AB-8大孔
吸附树脂进行进一步的分离纯化,收集70%
乙醇洗脱部分得到的无患子皂苷液,经体外抑制白色念珠菌试验证明,其抑菌效果(
最低抑菌浓度)较无患子水提发酵液要低4倍,显著增强了抑制白色念珠菌的作用;体内动物实验证明该无患子皂苷液温控凝胶具有显著的治疗外阴阴道炎的效果。
发明内容
[0008] 本发明的首要目的是针对现有治疗白色念珠菌性阴道炎药物的不足,在于提供一种制备简单,毒
副作用小,抗白色念珠菌效果显著的治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控凝胶制剂及制备方法。
[0009] 本发明的另一目的是,针对现有治疗白色念珠菌的产品存在的给药方式的局限性,在于提供上述温控型凝胶制剂的新型阴道给药系统。
[0010] 本发明的技术方案:
[0011] 一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂的制备方法,主要通过以下步骤实现:
[0012] (1)无患子皂苷液的制备:
[0013] 大孔吸附树脂(AB-8)预处理:将大孔树脂放入四倍体积的氢
氧化钠(质量分数为3%)搅拌浸泡4h,用蒸馏水冲洗至中性。
[0014] 装柱:将冲洗好的大孔树脂装入柱中,并用去离子水冲洗到层析柱中,将大孔树脂压紧至稳定为止。
[0015] 上样:将成品无患子水提发酵浓缩液通过装填好的大孔吸附树脂(AB-8),进行分离,流速20mL/min。
[0016] 洗脱:分别用去离子水和不同浓度梯度的乙醇溶液洗脱,收集70%(体积百分比)乙醇洗脱部分。
[0017] 浓缩:将收集得到的70%乙醇洗脱部分
蒸发浓缩得到无患子皂苷液。
[0018] (2)无患子皂苷液皂苷含量测定:
[0019] (2.1)标准曲线的制作:配置1mg/mL
齐墩果酸标准溶液。取干燥洁净的试管,分别加入0,30,60,90,120,150μL齐墩果酸标准溶液,置于50℃水浴烘干,先后加入5%(wt%)香草
醛-
冰醋酸溶液和1.4mL分析纯高氯酸为
显色剂,震荡混匀。置于70℃水浴中加热20min,冰水浴冷却至室温,再加入10mL冰醋酸作为
溶剂,充分混匀。用紫外分光光度计在540nm处测定吸光度;
[0020] (2.2)样品测定:将无患子皂苷液稀释适当倍数,取100μL稀释液于试管中,重复步骤(2.1)操作,并测定540nm下的吸光度。
[0021] (3)无患子温控型原位凝胶制剂制备步骤:在20-25℃下,按重量份数称取泊洛沙姆407,泊洛沙姆188和聚乙二醇400混合,溶解至100份无患子皂苷液中,在500r/min的转速下混合均匀,于4℃下静置直至溶胀完全,无气泡的澄清液体,即得到无患子温控型凝胶制剂。
[0022] 所述泊洛沙姆407的添加量为20-24份,例如可以是20份、21份、22份、23份或24份等。
[0023] 所述泊洛沙姆188的添加量为2-6份,例如可以是2份、3份、4份、5份或6份等。
[0024] 所述聚乙二醇400的添加量为0.5-1.5份,例如可以是0.5份、0.75份、1份、1.25份或1.5份等。
[0025] 所述的成品无患子水提发酵浓缩液提取方法为:将无患子干果皮
粉碎至20-60目,在40℃的条件下将此粉末与水按质量比1:3提取6h,过滤得到第一次滤液和滤渣。在同样的温度条件下,将滤渣再与水按1:2的比例提取4h,过滤得到第二次滤液,弃去滤渣,合并两次滤液,得到无患子皂苷粗滤液。将粗滤液以5000r/min离心10min得到无患子水提液,于蒸发设备中浓缩6-7倍得到无患子皂苷浓缩液。选择
酵母菌(例如安琪葡萄酒干酵母BV818)为发酵菌株,以1.0%接种量,在30℃下发酵四天得到无患子水提发酵浓缩液。
[0026] 所述的一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂,其特征在于无患子温控型凝胶制剂制备温度为20-25℃,可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等。
[0027] 所述的一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂,其特征在于它所含的活性成分为无患子皂苷,其皂苷浓度为10-80mg/mL,例如可以是10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL或80mg/mL等。
[0028] 本发明的有益效果:
[0029] 1.本发明直接采用无患子果皮进行提取,操作步骤简单易行,效率高,且无患子果皮取材方便,简单易得。
[0030] 2.本发明得到的一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂,具有制备简单,毒副作用小,抗白色念珠菌效果显著的特点,其作用于白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)可低至15.626μg/mL(以皂苷含量计)。
[0031] 3.本发明得到的一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂,能够弥补抗生素类药物的不足,降低白色念珠菌性阴道炎的复发率。
[0032] 4.本发明得到的一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂,能够实现原位治疗,延长药物有效停留时间,是一种新型阴道给药系统。
[0033] 5.本发明得到的一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂,药理实验证明对白色念珠菌具有显著抑制作用,经动物实验证明,能够明显改善阴道炎小鼠感染情况且具有效应-剂量关系。
附图说明
[0034] 图1是感染白色念珠菌ATCC10231后的小鼠阴道灌洗液真菌载量。
具体实施方式
[0035] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施方式做进一步的详细描述,但这些
实施例不得理解为任何意义上的对本发明
权利要求的限制。
[0036] 无患子皂苷液的制备:
[0037] 大孔树脂(A-8)预处理:将大孔树脂放入四倍体积的氢氧化钠(质量分数为3%)搅拌浸泡4h,用蒸馏水冲洗至中性。
[0038] 装柱:将冲洗好的大孔树脂装入柱中,并用去离子水冲洗到层析柱中,将大孔树脂压紧至稳定为止。
[0039] 上样:将成品无患子水提发酵浓缩液通过装填好的AB-8大孔吸附树脂,进行分离,流速20mL/min。
[0040] 洗脱:分别用去离子水和不同浓度梯度的乙醇溶液洗脱,收集70%(体积百分比)乙醇洗脱部分。
[0041] 浓缩:将收集得到的70%乙醇洗脱部分蒸发浓缩得到无患子皂苷液。
[0042] 实施例1
[0043] 本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂及制备方法。其中,无患子温控型凝胶制剂包括如下重量的组分:无患子皂苷液100份,泊洛沙姆407 21份,泊洛沙姆188 2.7份,聚乙二醇400 0.6份,无患子皂苷浓度为10mg/mL(以皂苷记)。
[0044] 本实施例无患子原位凝胶制剂的制备方法如下:
[0045] 在20℃下,按重量份数称取泊洛沙姆407,泊洛沙姆188和聚乙二醇400溶解到100份无患子皂苷液中,在500r/min的转速下混合均匀,于4℃下静置直至溶胀完全,无气泡的澄清液体,即得到无患子温控型凝胶制剂。
[0046] 实施例2
[0047] 本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂及制备方法。其中,无患子温控型凝胶制剂包括如下重量的组分:无患子水提发酵液100份,泊洛沙姆407 20份,泊洛沙姆188 3份,聚乙二醇400 1份,无患子皂苷浓度为15mg/mL(以皂苷记)。
[0048] 本实施例无患子温控型凝胶制剂的制备方法如下:
[0049] 在20℃下,按重量份数称取泊洛沙姆407,泊洛沙姆188和聚乙二醇400溶解到100份无患子皂苷液中,在500r/min的转速下混合均匀,于4℃下静置直至溶胀完全,无气泡的澄清液体,即得到无患子温控型凝胶制剂。
[0050] 实施3
[0051] 本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂及制备方法。其中,无患子温控型凝胶制剂包括如下重量的组分:无患子水提发酵液100份,泊洛沙姆407 20份,泊洛沙姆188 2.5份,聚乙二醇400 1.25份,无患子皂苷浓度为30mg/mL(以皂苷记)。
[0052] 本实施例无患子温控型凝胶制剂的制备方法如下:
[0053] 在22℃下,按重量份数称取泊洛沙姆407,泊洛沙姆188和聚乙二醇400溶解到100份无患子皂苷液中,在500r/min的转速下混合均匀,于4℃下静置直至溶胀完全,无气泡的澄清液体,即得到无患子温控型凝胶制剂。
[0054] 实施例4
[0055] 本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂及制备方法。其中,无患子温控型凝胶制剂包括如下重量的组分:无患子水提发酵液100份,泊洛沙姆407 22份,泊洛沙姆188 2份,聚乙二醇400 1.5份,无患子皂苷浓度为30mg/mL(以皂苷记)。
[0056] 本实施例无患子温控型凝胶制剂的制备方法如下:
[0057] 在20℃下,按重量份数称取泊洛沙姆407,泊洛沙姆188和聚乙二醇400溶解到100份无患子皂苷液中,在500r/min的转速下混合均匀,于4℃下静置直至溶胀完全,无气泡的澄清液体,即得到无患子温控型凝胶制剂。
[0058] 实施例5
[0059] 本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂及制备方法,与实施例1的区别仅在于,无患子皂苷液为30mg/mL(以皂苷记)。
[0060] 实施例6
[0061] 本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂及制备方法,与实施例1的区别仅在于,无患子皂苷液40mg/mL(以皂苷记)。
[0062] 实施例7
[0063] 本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂及制备方法,与实施例1的区别仅在于,无患子皂苷液50mg/mL(以皂苷记)。
[0064] 实施例8
[0065] 本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂及制备方法,与实施例1的区别仅在于,无患子皂苷液60mg/mL(以皂苷记)。。
[0066] 实施例9
[0067] 本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂及制备方法,与实施例1的区别仅在于,无患子皂苷液70mg/mL(以皂苷记)。
[0068] 实施例10
[0069] 本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂及制备方法,与实施例1的区别仅在于,无患子皂苷液80mg/mL(以皂苷记)。
[0070] 对比例1
[0071] 本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂及制备方法,与实施例4的区别仅在于,未添加无患子皂苷液。
[0072] 按如下方法,对本发明实施例1-10和对比例1提供的温控型凝胶制剂的性能进行测试:
[0073] 无患子皂苷液皂苷含量测定:
[0074] 标准曲线的制作:配置1mg/mL齐墩果酸标准溶液。取干燥洁净的试管,分别加入0,30,60,90,120,150μL齐墩果酸标准溶液,置于50℃水浴烘干,先后加入5%(wt%)香草醛-冰醋
酸溶液和1.4mL分析纯高氯酸为显色剂,震荡混匀。置于70℃水浴中加热20min,冰水浴冷却至室温,再加入10mL冰醋酸作为溶剂,充分混匀。用紫外分光光度计在540nm处测定吸光度;得到齐墩果酸含量y(μg)的计算方程,y(μg)=0.005*OD-0.0271,R2=0.9995。
[0075] 无患子皂苷含量的测定:将无患子皂苷液稀释50倍,取100μL稀释液于20mL比色管中,然后将该稀释液按照上述方法测定吸光度,计算齐墩果酸含量y(μg),,样品重复测定三次。将三次测定结果计算算术平均值,代入如下方程计算出无患子皂苷的含量。
[0076] 无患子皂苷含量与齐墩果酸含量的计算方程:皂苷的含量=y(μg)×2.3。
[0077] 无患子水提发酵液最低抑菌浓度测定(MIC测定)
[0078] 方法:实验菌株采用标准菌株白色念珠菌ATCC10231,挑取菌落采用麦氏比浊法用无菌生理盐水稀释成菌液浓度约为106cfu/mL的菌液待用。
[0079] 将12支试管排成一列、编号,各加入双倍营养的固体培养基(SDA培养基)1mL,在第一管内加入1mL待测样品(浓度为10mg/mL,溶剂为蒸馏水),混匀后吸取1mL到第2管,混匀再取1mL到第3管,依次类推到第9管,弃去1mL,第11管以生理盐水作空白对照,第12管加氟康唑作阳性对照。121℃高压
蒸汽灭菌,待培养基
凝固后,每管加入上述配制好的菌悬液20μL,置于30℃
培养箱中静置培养24-48h。观察结果判定:培养基表面无菌落表示无细菌生长,有菌落表示有细菌生长,以能抑制细菌生长的无患子皂苷提取液最高稀释度作为其最低抑菌浓度(MIC)。
[0080] 无患子温控型凝胶制剂最低抑菌浓度测定(MIC测定)
[0081] 方法:实验菌株采用标准菌株白色念珠菌ATCC10231,挑取菌落采用麦氏比浊法用无菌生理盐水稀释成菌液浓度约为106cfu/mL的菌液待用。
[0082] 将12支试管排成一列、编号,各加入双倍营养的固体培养基(SDA培养基)1mL,在第一管内加入1mL凝胶液体(浓度为10mg/mL,溶剂为蒸馏水),混匀后吸取1mL到第2管,混匀再取1mL到第3管,依次类推到第9管,弃去1mL,第11管以生理盐水作空白对照,第12管加氟康唑作阳性对照。121℃高压蒸汽灭菌,待培养基凝固后,每管加入上述配制好的菌悬液20μL,置于30℃培养箱中静置培养24-48h。观察结果判定:培养基表面无菌落表示无细菌生长,有菌落表示有细菌生长,以能抑制细菌生长的无患子皂苷提取液最高稀释度作为其最低抑菌浓度(MIC)。
[0083] 无患子温控型凝胶制剂体内抑菌效果评价(以实施案例1为例)
[0084] 无患子温控型凝胶制剂体内动物实验
[0085] (1)小鼠念珠菌型阴道炎模型建立
[0086] 取70只八周龄C57BL/6小鼠,随机挑出10只作为空白对照组,剩余60只隔天皮下注射苯
甲酸雌二醇(0.1mg/只)刺激假发情,连续注射一周。最后一次刺激后,小鼠感染由PBS8
缓冲液配置的白色念珠菌菌悬液(10 CFU/mL),通过移液枪靠近阴道口的方式感染,每只20μL,连续感染两天。然后,小鼠恢复48h以利于白色念珠菌的感染定植。48h后用PBS缓冲液灌洗阴道,取阴道灌洗液涂布SDA琼脂平板确定真菌载量,根据平板计数结果随机将小鼠分为
6组,即模型对照组,凝胶空白组,阳性对照(市售联苯卡唑凝胶)组,无患子温控型凝胶组(高剂量组),无患子温控型凝胶组(中剂量组),无患子温控型凝胶组(低剂量组)。
[0087] (2)分组给药
[0088] 通过阴道灌注的方式,空白对照组和模型对照组灌注50μL PBS缓冲液,凝胶空白组无患子灌注空白凝胶制剂,阳性对照组灌注50μL市售联苯卡唑凝胶,无患子温控型凝胶组(高剂量组)灌注5mg/mL的无患子凝胶制剂,无患子温控型凝胶组(中剂量组)灌注2.5mg/mL的无患子凝胶制剂,无患子温控型凝胶组(低剂量组)灌注1.25mg/mL的无患子凝胶制剂,每天一次,持续11天,并在第0,3,6,9,11天用50μL PBS缓冲液灌洗阴道三次,涂布于SDA琼脂平板确定真菌载量。上述性能测试的结果如下所示:
[0089] 表1实施例1-14最低抑菌浓度MIC
[0090] 最低抑菌浓度MIC
实施例1 15.625μg/mL
实施例2 15.625μg/mL
实施例3 15.625μg/mL
实施例4 15.625μg/mL
实施例5 15.625μg/mL
实施例6 15.625μg/mL
实施例7 15.625μg/mL
实施例8 15.625μg/mL
实施例9 15.625μg/mL
实施例10 15.625μg/mL
[0091] 真菌载量
[0092] 在VVC小鼠感染后治疗的11天中,测定了在0,3,6,9,11天的真菌载量,具体见图1。模型组的真菌载量在11天中都没有显著性差异,说明白色念珠菌定植成功;阳性对照组(联苯卡唑凝胶)真菌载量在治疗第六天开始与模型组相比显著性下降(p<0.0001),说明VVC小鼠模型建模成功。
[0093] 第6天开始,高剂量组和中剂量组温控型凝胶与模型组之间呈现显著性差异,高剂量组的真菌载量显著低于中剂量组(p<0.01),与阳性对照组(联苯卡唑凝胶)无显著性差异,表明高剂量组和中剂量组温控型凝胶皆能有效抑制白色念珠菌,且高剂量组治疗效果优于中剂量组,与市售联苯卡唑凝胶相当;第十一天,高剂量组,中剂量组和低剂量组温控型凝胶与模型组之间呈现显著性差异,高剂量组的真菌载量显著低于中剂量组和低剂量组(p<0.05),表明高剂量组治疗效果最好。该动物实验模型证实了无患子温控型凝胶具有效应-剂量关系,以及与市售联苯卡唑凝胶相当的治疗效果,是一款理想的替代唑类抗白色念珠菌型阴道炎的天然制剂。
[0094] 综上所述,本发明的一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子温控型凝胶制剂,在体外对白色念珠菌具有显著抑制作用,在体内能够有效降低阴道炎模型小鼠的真菌载量,是一种优良的代替抗生素治疗阴道炎的药物,且制备简单,毒副作用小,无耐药性威胁。