齐墩果酸提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的用途
阅读：63发布：2020-05-12
专利汇可以提供齐墩果酸提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了 齐墩果酸 或其药学上可接受的盐、酯、 水 合物、糖苷衍 生物 提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的用途；所述生殖细胞标志基因是Stra8、Itgb1和/或Itga6。本发明还提供了齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物作为提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的诱导分化剂的用途；所述生殖细胞标志基因是Stra8、Itgb1和/或Itga6。本发明研究表明，齐墩果酸可以体外提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平，可以将齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物作为诱导人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平提高的诱导分化剂使用，为不孕不育 疾病 的 治疗 提供了新的思路，具有重要的临床应用价值。，下面是齐墩果酸提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的用途专利的具体信息内容。
齐墩果酸提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表
达水平的用途
技术领域
背景技术
[0002] 自从人类进入工业化社会以来，由于受到环境污染、人们生活节奏加快等因素的影响，世界范围内不孕不育夫妇的总发病率明显升高。在不孕不育的相关因素中，生殖细胞(精子或卵母细胞)数量和质量缺陷所占比例正逐年上升。另外，一些肿瘤患者由于放疗和化疗而失去了生殖能力，不能产生健康的生殖细胞。近年来辅助生殖技术(ART)的发展和应用，使许多不孕不育患者受益匪浅，但是对于卵巢功能早衰的女性及不能产生精子或精子畸形的男性，要想生育具有自身遗传信息的后代只依靠ART和药物治疗是远远不够的，因此寻找一种新的细胞治疗手段非常迫切。
[0003] 干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，所以成为细胞治疗中理想的种子细胞来源。胚胎干细胞具有全能性，能分化为各个胚层来源的细胞，但由于存在移植后免疫排斥、致瘤性和伦理问题等，限制了其在干细胞领域的应用。成体干细胞避免了上述胚胎干细胞的缺点，且具有多向分化的潜能，在一定条件下也能分化为各个胚层来源的细胞。间充质干细胞作为成体干细胞家族的重要成员，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、肌肉、神经、肝、心肌、胰岛、内皮等多种组织细胞，正日益受到人们的关注。
[0004] 人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是存在于新生儿脐带中的间充质干细胞，在个体出生时获得，被认为是个体的健康保险，其优势在于：能稳定扩增80代不发生变化，比骨髓间充质干细胞具有更强的增殖能力和分化潜能；来源丰富、取材方便，获取时不会对捐献者造成新的痛苦和创伤；具有较低的免疫原性。近年来在体外条件下用干细胞诱导向生殖细胞方向分化的报道屡见不鲜，但是用hUC-MSCs诱导向生殖细胞方向分化的报道较少。2009年黄鹏【黄鹏，人脐带华尔通氏胶源间充质干细胞向男性生殖细胞诱导分化的研究，汕头大学，2010年】证实，hUC-MSCs在维甲酸(retinoic acid，RA)、睾酮及睾丸细胞培养液中能向精原细胞诱导分化；2010年Li Cai-xia等【Li Cai-xia etal，In vitro female germline potential of human umbilical cord-derived matrix stem cells，Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2010，14(40)：7583-7587】用卵泡液诱导hUC-MSCs分化为卵样结构的细胞。但是已有的报道中诱导hUC-MSCs向生殖细胞方向分化的方法诱导时间久、诱导过程复杂、诱导效率不高，至今尚缺乏简单易行、诱导效果好的定向诱导hUC-MSCs向生殖细胞方向分化的方法。
[0005] 齐墩果酸(Oleanolic acid，OA)是五环三萜类化合物，以游离或结合成苷的形式存在于白花蛇舌草、山楂、丁香、大枣、女贞子、枇杷叶、橡木及夏枯草等植物中，齐墩果酸具有保肝、降糖、降血脂和抗肿瘤等生物活性。目前关于齐墩果酸诱导干细胞分化的研究仅是针对小鼠胚胎干细胞分化或大鼠骨髓间充质干细胞分化，未见齐墩果酸体外诱导人脐带间充质干细胞分化的报道，更未见齐墩果酸体外提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的报道。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的用途及方法；所述生殖细胞标志基因是Stra8、Itgb1和/或Itga6。
[0007] 本发明提供了齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物作为提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的诱导分化剂的用途；所述生殖细胞标志基因是Stra8、Itgb1和/或Itga6。
[0008] 诱导分化剂，即诱导细胞分化的物质，这种物质可以是单一化合物，也可以是多种成分的组合，其存在或使用的形式可以是固体、半固体，也可以是液体。
[0009] 本发明还提供了一种提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因Stra8、Itgb1和/或Itga6的表达水平的方法，它是利用齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物或糖苷衍生物进行诱导的，包括如下步骤：
[0010] (1)取人脐带间充质干细胞，置于间充质干细胞培养液中培养；
[0011] (2)加入齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物，诱导培养72小时，即可。
[0012] 其中，步骤(1)中，所述人脐带间充质干细胞培养液是含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液。
[0013] 其中，步骤(2)中，在细胞汇合度为60～70％时，加入齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物。
[0014] 进一步地，步骤(2)中，加入的齐墩果酸的终浓度为3.0μg/ml。
[0015] “齐墩果酸的终浓度”，是指齐墩果酸加入到人脐带间充质干细胞培养液后，在培养液中所占的浓度。
[0016] 本发明还提供了上述方法制备得到的细胞。
[0017] 其中，所述细胞中，Stra8、Itgb1、Itga6相对于内参基因GAPDH的表达量分别是2.34E-04、3.7400、0.0807。
[0018] 根据公知常识，干细胞分化为生殖细胞需要经过标志基因表达模式改变、细胞形态变化、减速分裂、最终成形等阶段。标志基因表达模式改变的具体表现就是生殖细胞标志基因的高表达，这个阶段是整个分化过程最为重要的阶段之一，非常重要，此阶段相当于给干细胞的分化定下了轨迹，在后期只要给予合适的条件，就能最终分化得到生殖细胞。
[0019] 本发明的齐墩果酸可以显著提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平：Stra8、Itgb1、Itga6，且效果优于现有的阳性药物——维甲酸，可以促进人脐带间充质干细胞的标志基因表达模式向着生殖细胞的方向转变，促使人脐带间充质干细胞向生殖细胞方向定向分化；本发明方法制备得到的细胞具有分化为生殖细胞的潜力，有可能制备成为体外受精技术的原材料，为不孕不育疾病的治疗提供了新的思路，具有重要的临床应用价值。
[0022] 图1干预前人脐带间充质干细胞的细胞形态，图中标尺代表200μm。
[0023] 图2齐墩果酸(OA)干预72小时后人脐带间充质干细胞的细胞形态，图中标尺代表200μm。
[0024] 图3维甲酸(RA)干预72小时后人脐带间充质干细胞的细胞形态，图中标尺代表200μm。
[0025] 图4阴性对照DMSO干预72小时后人脐带间充质干细胞的细胞形态，图中标尺代表200μm。
具体实施方式
[0026] 本发明所用的仪器、耗材及试剂如表1所示：
[0027] 表1本发明所用的仪器、耗材、试剂
[0028] 仪器/耗材/试剂名称 公司及产地涡旋混匀器 IHA
实时荧光定量qPCR仪 Bio-Rad,USA
5％CO2恒温培养箱 Thermo,USA
BR41高速冷冻离心机 Thermo,USA
DMI4000B倒置荧光显微镜 Leica,German
超净工作台 苏州净化设备厂，China
420型三用水浴箱 金坛市富华仪器厂，China
培养皿、培养板 Corning，USA
离心管、EP管 Corning，USA
齐墩果酸(OA) Sigma，USA
全反式维甲酸(RA) Sigma，USA
DMSO Ameresco，China
L-谷氨酰胺 Gibco，USA
胎牛血清 Gibco，USA
0.05％Trpsin/EDTA Gibco,USA
双抗(青霉素+链霉素) Gibco,USA
RNA提取试剂盒Tri Reagent Molecular Research Center，USA
反转录试剂盒iSCRIPT Bio-Rad，USA
qPCR试剂盒iQ SYBR GRN Bio-Rad，USA
异丙醇 成都科龙，China
氯仿 成都科龙，China
PBS、PBST、1N HCL及2N HCL 均是由自己配制
实时荧光定量qPCR仪 Bio-Rad,USA
5％CO2恒温培养箱 Thermo,USA
BR41高速冷冻离心机 Thermo,USA
DMI4000B倒置荧光显微镜 Leica,German
超净工作台 苏州净化设备厂，China
420型三用水浴箱 金坛市富华仪器厂，China
培养皿、培养板 Corning，USA
离心管、EP管 Corning，USA
齐墩果酸(OA) Sigma，USA
全反式维甲酸(RA) Sigma，USA
DMSO Ameresco，China
L-谷氨酰胺 Gibco，USA
胎牛血清 Gibco，USA
0.05％Trpsin/EDTA Gibco,USA
双抗(青霉素+链霉素) Gibco,USA
RNA提取试剂盒Tri Reagent Molecular Research Center，USA
反转录试剂盒iSCRIPT Bio-Rad，USA
qPCR试剂盒iQ SYBR GRN Bio-Rad，USA
异丙醇 成都科龙，China
氯仿 成都科龙，China
PBS、PBST、1N HCL及2N HCL 均是由自己配制
[0029] 实施例1人脐带间充质干细胞的体外诱导
[0030] (1)取人脐带间充质干细胞，置于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养；
[0031] (2)在培养液中加入齐墩果酸，齐墩果酸终浓度3.0μg/ml，诱导培养72小时即可。
[0032] 下面以具体试验数据说明本发明的有益效果。
[0033] 试验例1人脐带间充质干细胞的体外诱导
[0034] 一、试验用细胞
[0035] 人脐带间充质干细胞由新生命干细胞科技股份有限公司提供。
[0036] 二、试验方法(诱导分化)
[0037] 1、试剂配制：OA粉末、RA粉末分别以DMSO为溶剂配制3.0mg/ml的母液。
[0038] 2、试验方法：
[0039] 取人脐带间充质干细胞，分为三组(OA组，RA组以及DMSO组)，加入六孔板中培养，培养液是10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，培养至60～70％汇合度时，分别加入不同试剂干预，干预72h。
[0040] 其中：OA组：加入3.0mg/ml的OA母液，按与培养液比例1:1000加入，使其终浓度为3.0μg/ml；
[0041] RA组：加入3.0mg/ml的RA母液，按与培养液比例1:1000加入，使其终浓度为3.0μg/ml；
[0042] 阴性对照DMSO组：加入DMSO，加入量为OA、RA的母液等体积的量。
[0043] 三、实时荧光定量PCR分析(qPCR)
[0044] 人脐带间充质干细胞被干预72h后，检测5种与生殖分化相关的基因：利用RNA提取试剂盒Tri Reagent提取各孔的总RNA，而后以提取的RNA为模板利用cDNA合成试剂盒合成cDNA，最后以cDNA为模板利用Sybr Green Qpcr试剂盒进行qPCR分析。检测以GAPDH为内参基因，同一实验条件下做了5个复孔。具体基因名称和各引物序列见表2。
[0045] 表2qPCR分析中的相关基因名称及引物序列
[0046]
[0047] 上表所列基因的功能可描述如下：GDF-9是向雌性生殖细胞分化的早期关键的标志性启动基因；Stra8是向雄性生殖细胞分化的早期关键的标志性启动基因；ZP3是卵子细胞形成的标志基因；Itga6和Itgb1是精子细胞形成的标志基因；GAPDH被作为qPCR检测的内参基因。
[0050] 五、试验结果
[0051] 1、人脐带间充质干细胞的形态
[0052] 显微镜观察从脐带中分离出来的细胞，见图1：可见细胞呈长梭形，为人脐带间充质干细胞的典型形态。
[0053] 最后对得到的人脐带间充质干细胞进行分化潜能的鉴定，结果表明：得到的人脐带间充质干细胞能顺利地向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞分化。
[0054] 2、人脐带间充质干细胞体外诱导后检测
[0055] (1)体外诱导72小时后的形态
[0056] 人脐带间充质干细胞体外诱导72小时后的形态见图2-图4：三种干预条件下(OA、RA、DMSO)，细胞被干预72小时后仍然呈健康的长梭形，且相关三种干预物的细胞形态之间无明显差别。
[0057] (2)以GAPDH作为内参基因，实时荧光定量PCR(qPCR)法考察OA和RA对各生殖分化相关基因的影响。
[0058] 考察的基因及其作用分别为：
[0059] GDF-9：促进细胞向雌性配子分化的早期关键标志基因；
[0060] Stra8：促进细胞向雄性配子分化的早期关键标志基因；
[0061] ZP3：细胞向雌性配子分化的晚期标志基因；
[0062] Itga6：细胞向雄性配子分化的晚期标志基因；
[0063] Itgb1：细胞向雄性配子分化的晚期标志基因。
[0064] 结果见表3、表4。
[0065] 表3OA的qPCR结果(内参基因为GAPDH)
[0066]
[0067] 注：OA干预组的数据与相应的DMSO溶剂对照的数据进行比较。
[0068] EAOA为OA干预下的基因表达量；EADMSO为DMSO干预下的基因表达量。
[0069] 表4RA的qPCR结果(内参基因为GAPDH)
[0070]
[0071] 注：RA干预组的数据与相应的DMSO溶剂对照的数据进行比较。
[0072] EARA为RA干预下的基因表达量；EADMSO为DMSO干预下的基因表达量。
[0073] 由表3、表4可见：OA上调Stra8表达69倍，而RA上调Stra8表达13倍；同时在此实验条件下OA显著上调了Itga6和Itgb1的表达，而RA不显著上调甚至下调Itga6和Itgb1的表达。
[0074] 进一步专门比较了OA和RA对Stra8、Itga6和Itgb1表达的上调作用，结果见表5。
[0075] 表5OA和RA的qPCR结果比较(内参基因为GAPDH)
[0076]
[0077] 注：EAOA为OA干预下的基因表达量；EARA为RA干预下的基因表达量。
[0078] 由表5可见：OA相对RA显著上调了Stra8和Itga6的表达，而且对Itgb1的上调也表现出强于RA的趋势。
[0079] 综合表3-表5，可以看出，OA能诱导人脐带间充质干细胞高表达生殖细胞标志基因，且诱导效果强于RA。
[0080] 综上所述，齐墩果酸可以体外提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平，可以将齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物作为诱导人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平提高的诱导分化剂使用，为不孕不育疾病的治疗提供了新的思路，具有重要的临床应用价值。
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