技术领域
[0001] 本
发明属于药物分析化学领域，具体涉及两种潜在基因毒性杂质的分析测定方法，分别用于泮托拉唑钠及其合成起始原料5-二氟甲
氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑中潜在基因毒性杂质的分析和限度测定。
背景技术
[0002] 泮托拉唑钠(Pantoprazole Sodium)，化学名为5-二氟甲氧基-2-[[(3，4-二甲氧基-2-吡啶基)-甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑钠一
水合物，分子式为C16H14F2N3O4S·H2O，其结构式为：
[0003]
[0004] 泮托拉唑钠是一种质子
泵抑制剂，能高度选择性地作用于DA-2受体，选择性作用于胃粘膜壁细胞，抑制细胞壁中H+/K+-ATP酶活性，使壁细胞内的H+不能转运到胃中，从而抑制胃酸的分泌。泮托拉唑钠是
治疗消化性溃疡和急性胃黏膜病变所致出血的一种安全、有效的药物，对消化性溃疡和反流性食道炎有很高治愈率。该药在弱酸的条件下比奥美拉唑和兰索拉唑稳定，不影响其他药物在肝内的代谢。该药具有较高的选择性和
生物利用度，在国外已广泛应用于治疗消化性溃疡、卓-
艾氏综合征及反流性食管炎等酸相关性
疾病，并取得满意的疗效。泮托拉唑钠注射用粉针剂由德国百克顿(Byk Gulden)药厂(现更名为武田药厂)率先研制成功，于1994年10月在南非首次上市，商品名为潘妥洛克；并于1998年12月30日在我国获得行政保护，于2005年6月终止。到目前为止，SFDA已批准16家制药企业生产泮托拉唑钠
原料药，共有141家制药企业获准生产其肠溶片、肠溶胶囊、粉针制剂及肠溶微丸胶囊等多种剂型的制剂。
[0005] 关于泮托拉唑钠的合成，文献报道多数以2-氯甲基-3,4-二甲氧基吡啶
盐酸盐和5-二氟甲氧基-2-巯基苯并咪唑为起始原料。涉及本品的化合物及合成工艺
专利主要有：关于泮托拉唑钠的化合物专利是由BYK GULDEN LOMBERG公司于1984年6月16日
申请(
优先权日)，专利号为EP0166287；关于泮托拉唑钠一水合物的化合物专利为EP0533790。
[0006] 潜在基因毒性杂质(Potential Genotoxic Impuriti,PGI)是指具有遗传毒性警示结构的杂质，但并未经实验测试模型验证。在此所说的“潜在性”是指遗传毒性的潜在性，而非杂质的潜在性。在泮托拉唑钠的合成过程中，所采用的起始原料2-氯甲基-3,4-二甲氧基吡啶盐酸盐，以及合成过程中可能产生的副产物泮托拉唑砜N-氧化物，其化学结构中存在潜在基因毒性的警示结构
片段。同时我们还发现，泮托拉唑钠的另一起始原料5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑的合成路线中，涉及到多个化学结构中存在基因毒性警示结构片段的起始物、中间体和可能的副产物。这些具有潜在基因毒性的杂质结构及名称表示如下：
[0007] 泮托拉唑钠中潜在基因毒性杂质的结构(杂质A、杂质B)：
[0008]
[0009] 5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑及其潜在基因毒性杂质的结构(杂质C～杂质H)：
[0010]
[0011] 5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑
[0012]
[0013] 杂质A：2-氯甲基-3,4-二甲氧基吡啶盐酸盐 杂质B：泮托拉唑砜N-氧化物[0014] 杂质C：4-二氟甲氧基苯胺 杂质D：N-(4-二氟甲氧基苯基)乙酰胺
[0015] 杂质E：4-二氟甲氧基-1,2,-苯二胺 杂质F：N-[2-硝基-4-二氟甲氧基苯基]乙酰胺
[0016] 杂质G：2-硝基-4-二氟甲氧基苯胺 杂质H：4-
氨基
苯酚[0017] 为了更好地控制泮托拉唑钠成品的
质量，提高用药的安全性，需要对其中的潜在基因毒性杂质进行分离测定，按照指导原则ICH M7的相关规定，检查潜在基因毒性杂质是否超过限度。根据泮托拉唑钠制剂的每天服用最大量为80mg，以基因毒性杂质限度水平小于1.5μg/day计算，将泮托拉唑钠中的基因毒性杂质(杂质A和杂质B)的控制限度设定为0.001％，起始原料5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑中基因毒性杂质(杂质C～杂质H)的控制限度设定为0.002％。
[0018] 目前，关于分离测定泮托拉唑钠及其起始原料中基因毒性杂质的分离测定方法未见有公开的报道。因此，我们采用液质联用技术开发了两种分析方法，分别用于泮托拉唑钠及其合成起始原料5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑中潜在基因毒性杂质的分析和限度测定。对泮托拉唑钠的质量控制和药品的安全保证具有极其重要的意义。
发明内容
[0019] 本发明的目的在于提供两种潜在基因毒性杂质的分析测定方法，能够有效实现泮托拉唑钠及其合成起始原料5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑中潜在基因毒性杂质的分离测定和限量控制。这两种方法的灵敏性高，专属性强；同时实验操作方法简便、快速。
[0020] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0021] 分离测定泮托拉唑钠、5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑和潜在基因毒性杂质的方法，所述方法以十八
硅烷键合硅胶为固定相进行固液分离，所述流动相为含有乙腈、甲醇和乙酸铵的水溶液。
[0022] 所述泮托拉唑钠及其起始原料5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑的结构式如下：
[0023]
[0024] 潜在基因毒性杂质(PGI)是指具有遗传毒性警示结构的杂质，但并未经实验测试模型验证。在此所说的“潜在性”是指遗传毒性的潜在性，而非杂质的潜在性。在泮托拉唑钠的合成过程中，所采用的起始原料2-氯甲基-3,4-二甲氧基吡啶盐酸盐，以及合成过程中可能产生的副产物泮托拉唑砜N-氧化物，其化学结构
[0025] 中存在潜在基因毒性的警示结构片段。同时我们还发现，泮托拉唑钠的另一起始原料5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑的合成路线中，涉及到多个化学结构中存在基因毒性警示结构片段的起始物、中间体和可能的副产物。
[0026] 进一步，所述潜在基因毒性杂质包括卤代甲基吡啶类、氮杂芳基N-氧化物类、N-酰化氨基苯类、芳香胺类以及硝基苯类化合物的一种或多种。杂质结构式如下所示：
[0027] 泮托拉唑钠中潜在基因毒性杂质的结构(杂质A、杂质B)：
[0028]
[0029] 5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑中潜在基因毒性杂质的结构(杂质C～杂质H)：
[0030]
[0031] 进一步，用乙酸铵水溶液-乙腈的混合溶液作为流动相I进行等度洗脱，对泮托拉唑钠中的两种潜在基因毒性杂质进行分析；用含0.1％
甲酸的乙酸铵水溶液-甲醇的混合溶液作为流动相II进行等度洗脱，对起始原料5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑中的六种潜在基因毒性杂质进行分析。
[0032] 进一步，所述的流动相I中乙酸铵水溶液与乙腈的体积比例为30:70～50:50；流动相II中乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)与甲醇的体积比例为50:50～70:30。
[0033] 进一步，所述的流动相中乙酸铵水溶液的浓度为0.01mol/L～0.1mol/L。
[0034] 进一步，所述色谱柱的规格为150mm×4.6mm,5μm或250mm×4.6mm,5μm或150mm×3.0mm,3.5μm。
[0035] 进一步，所述方法的检测器为质谱检测器，采用电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式，MRM检测模式，根据各潜在基因毒性杂质的化学结构和裂解规律，采用各自专属的定量离子对进行定性和定量分析。
[0036] 各潜在基因毒性杂质的定量离子对及裂解途径如下所示：
[0037]
[0038] 进一步，所述的基因毒杂质的测定方法，包括以下步骤：
[0039] (1)取泮托拉唑钠样品适量，精密称定，用
溶剂溶解并稀释制成浓度为1mg/mL的溶液作为供试品溶液；另取杂质A和杂质B样品适量，用溶剂溶解并稀释制成浓度为10ng/mL的溶液作为对照溶液；分别取供试品溶液和对照溶液10uL进样，分别记录各杂质定量离子对下的离子流图，照外标法按峰面积计算杂质含量。
[0040] (2)取5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑样品适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释制成浓度为10mg/mL的溶液作为供试品溶液；另取杂质C～杂质H样品各适量，用溶剂溶解并稀释制成浓度为200ng/mL的溶液作为对照溶液；分别取供试品溶液和对照溶液10uL进样，分别记录各杂质定量离子对下的离子流图，照外标法按峰面积计算杂质含量。
[0041] 进一步，所述溶剂为甲醇或乙腈水溶液。
[0042] 进一步，所述流动相的流速为0.3ml/min～1.0ml/min。
[0043] 进一步，所述述色谱柱柱温箱
温度为30℃～50℃。
[0044] 本发明中的固定相和流动相在分离测定泮托拉唑钠及其合成起始原料(5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑)中潜在基因毒性杂质的色谱法中的应用，所述固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为含有乙腈、甲醇和有机铵盐的水溶液，所述色谱法具体包括高效液相色谱、液质联用色谱、薄层色谱等。
[0045] 本发明的有益效果在于：本发明提供了两种潜在基因毒性杂质的分析方法，分别用于泮托拉唑钠原料药及其合成起始原料5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑中潜在基因毒性杂质的分析和限度测定。所述潜在基因毒性杂质的结构类型包括卤代甲基吡啶类、氮杂芳基N-氧化物类、N-酰化氨基苯类、芳香胺类以及硝基苯类化合物。该方法不仅能够实现泮托拉唑钠及其合成起始原料中潜在基因毒性杂质的有效分离，并且能够对所述的基因毒性杂质进行准确的定量测定，方法的专属性强，准确度高；同时实验操作方法简便、快速，对泮托拉唑钠的质量控制和药品的安全保证具有极其重要的意义。
附图说明
[0046] 图1为
实施例1中泮托拉唑钠的HPLC-MS图(图1中的色谱峰为泮托拉唑钠的离子流峰，保留时间为4.1min左右)。
[0047] 图2为实施例1中杂质A的HPLC-MS图(图2中的色谱峰为杂质A的离子流峰，保留时间为5.1min左右)。
[0048] 图3为实施例1中杂质B的HPLC-MS图(图3中的色谱峰为杂质B的离子流峰，保留时间为3.2min左右)。
[0049] 图4为实施例1中泮托拉唑钠与杂质A和杂质B混合溶液的HPLC-MS图(图4中的色谱峰依次为杂质B、泮托拉唑钠和杂质A的离子流峰，保留时间依次为3.203min、4.135min和5.148min)。
[0050] 图5为实施例2中5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑的HPLC-MS图(图5中的色谱峰为5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑的离子流峰，保留时间为15.4min左右)。
[0051] 图6为实施例2中杂质C的HPLC-MS图(图6中的色谱峰为杂质C的离子流峰，保留时间为8.5min左右)。
[0052] 图7为实施例2中杂质D的HPLC-MS图(图7中的色谱峰为杂质D的离子流峰，保留时间为20.2min左右)。
[0053] 图8为实施例2中杂质E的HPLC-MS图(图8中的色谱峰为杂质E的离子流峰，保留时间为5.9min左右)。
[0054] 图9为实施例2中杂质F的HPLC-MS图(图9中的色谱峰为杂质F的离子流峰，保留时间为26.2min左右)。
[0055] 图10为实施例2中杂质G的HPLC-MS图(图10中的色谱峰为杂质G的离子流峰，保留时间为36.8min左右)。
[0056] 图11为实施例2中杂质H的HPLC-MS图(图11中的色谱峰为杂质H的离子流峰，保留时间为3.0min左右)。
[0057] 图12为实施例2中5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑及各杂质(杂质C～杂质H)混合溶液的HPLC-MS图(图12中的色谱峰依次为杂质H、杂质E、杂质C、5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑、杂质D、杂质F和杂质G的离子流峰，保留时间依次为3.005min、5.896min、8.484min、15.442min、20.099min、25.996min和36.177min)。
具体实施方式
[0058] 以下将参考附图，结合具体实施例对本发明作进一步阐述，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，而不是对本发明进行限制。实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、
试剂等如无特殊说明，均可以从商业途径得到。因此熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0059] 实施例1、泮托拉唑钠中潜在基因毒性杂质的分离测定方法
[0060] (1)仪器及条件
[0061] 岛津LC-MS/MS8050型高效液相色谱三重四级杆质谱联用仪；
[0062] 色谱柱：Alltima C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；
[0063] 流动相：0.02mol/L乙酸铵∶乙腈(40∶60)；
[0064] 流速：0.5ml/min；
[0065] 柱温：40℃；
[0066] 进样体积：10μL；
[0067] 溶剂：乙腈-水(50:50)。
[0068] 质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式；
[0069] 雾化气、干燥气、加热气为氮气，碰撞气为氩气；
[0070] 雾化气流速为3L/min；
[0071] 干燥气流速为10.0L/min；
[0072] 加热气流速为10.0L/min；
[0075] 加热阻温度为400℃；
[0076] 碰撞诱导解离(CID)气流为270Kpa；
[0077] MRM检测模式：杂质A定量离子对188.00→92.10，毛细管
电压(CE)：-23.0；杂质B定量离子对416.00→168.00，CE：-25.0；泮托拉唑钠定量离子对384.00→138.00，CE：-30.0。
[0078] (2)实验步骤
[0079] 泮托拉唑钠
定位溶液：精密称取泮托拉唑钠样品10.06mg，置10mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为泮托拉唑钠储备液；精密量取储备液10μL置100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0080] 杂质A定位溶液：精密称取杂质A样品10.01mg，置10mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质A储备液；精密量取10μL置100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0081] 杂质B定位溶液：精密称取杂质B样品10.03mg，置10mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质B储备液；精密量取10μL置100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0082] 混合溶液：精密量取泮托拉唑钠储备液、杂质A储备液和杂质B储备液各10μL，置同一100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0083] 供试溶液：同泮托拉唑钠储备液。
[0084] 对照溶液：精密量取杂质A储备液和杂质B储备液各10μL，置同一100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取1mL至10mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0085] 测定方法：精密量取供试溶液和对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中，记录离子对188.00→92.10和离子对416.00→168.00的离子流图，照外标法按峰面积计算杂质含量。
[0086] (3)实验结果
[0087] 由图4结果可知，泮托拉唑与杂质A和杂质B在此条件下能达到基线分离，方法的专属性良好。
[0088] 采用该方法对四批次的泮托拉唑钠中杂质A和杂质B的含量进行计算，由下表结果可知，各批泮托拉唑钠中杂质A和杂质B的含量均远远低于限度浓度(0.001％)，方法的灵敏度高，准确性好。
[0089]
[0090] 实施例2、5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑中潜在基因毒性杂质的分离测定方法
[0091] (1)仪器及条件
[0092] 岛津Agilent 6410B Triple Quadrupole LC-MS高效液相色谱-三重四极杆
串联质谱联用仪；
[0093] 色谱柱：Alltima C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；
[0094] 流动相：0.005Mol/L乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)：甲醇(60：40)
[0095] 流速：0.5ml/min；
[0096] 柱温：40℃；
[0097] 进样体积：10μL；
[0098] 溶剂：甲醇。
[0099] 质谱条件：离子源为电喷雾离子源，正离子扫描模式；
[0100] Gas Temp:300℃；
[0101] Gas Flow:10L/min；
[0102] Nebulizer:30psi；
[0103] Capillary:5500V。
[0104] MRM检测模式，参数如下表：
[0105]
[0106]
[0107] (2)实验步骤
[0108] 样品(5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑)定位溶液：精密称取样品100.04mg，置10mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品储备液；精密量取储备液20μL置
100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL置10mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0109] 杂质C定位溶液：精密称取杂质C样品19.98mg，置10mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质C储备液；精密量取10μL置100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0110] 杂质D定位溶液：精密称取杂质D样品20.01mg，置10mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质D储备液；精密量取10μL置100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0111] 杂质E定位溶液：精密称取杂质E样品20.03mg，置10mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质E储备液；精密量取10μL置100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0112] 杂质F定位溶液：精密称取杂质F样品20.05mg，置10mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质F储备液；精密量取10μL置100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0113] 杂质G定位溶液：精密称取杂质G样品19.96mg，置10mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质G储备液；精密量取10μL置100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0114] 杂质H定位溶液：精密称取杂质H样品20.01mg，置10mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质H储备液；精密量取10μL置100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0115] 混合溶液：精密量取样品储备液2mL置10mL容量瓶中，溶剂稀释至刻度摇匀；再精密量取10μL，以及各杂质(杂质C、D、E、F、G和H)储备液各10μL，置同一100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0116] 供试溶液：同5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑储备液。
[0117] 对照溶液：精密量取各杂质(杂质C、D、E、F、G和H)储备液各10μL，置同一100mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0118] 测定方法：精密量取供试溶液和对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中，记录各杂质定量离子对的谱图峰面积，照外标法按峰面积计算各杂质含量。
[0119] (3)实验结果
[0120] 由图12结果可知，5-二氟甲氧基-2-巯基-1H-苯并咪唑与各杂质(杂质C～杂质H)在此条件下能达到基线分离，方法的专属性高。
[0121] 采用该方法对三批次起始原料中各杂质的含量进行计算，由下表结果可知，各批起始原料中各杂质的含量均远远低于限度浓度(0.002％)，方法的灵敏度高，准确性好。
[0122]
[0123] 最后说明的是，以上实施例仅用以详细说明本发明的技术方案而非限制，本领域的专业技术人员可以对本发明的技术方案进行
修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的
权利要求范围当中。
