技术领域
[0001] 本
发明涉及黄柏碱体内代谢产物的分离方法。
背景技术
[0002] 黄柏为芸香科
植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮，性味苦寒，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效。黄柏碱(Phellodendrine) 则是黄柏中主要的化学成分之一，在降血压、抗肾炎、抑制细胞免疫反应、中枢神经抑制等方面的药理活性显著。黄柏碱在体内还显示出良好的抗
氧化作用，能够通过降低AKT，IKK，NF-KB磷
酸化和COX-2表达，下调由AAPH诱导的
活性氧增加、脂质过氧化等，改善ROS介导的
炎症反应。黄柏碱是一种四氢异喹啉型季铵盐类
生物碱，分子式为C20H24NO4，分子量为[M-H]+ m/z＝342.17，结构式为：
[0003]
[0004] 黄柏碱有2位活泼羟基和11位活泼羟基，黄柏碱进入体内发生Ⅱ相代谢反应主要为葡萄糖醛酸化，单葡萄糖醛酸化反应可能结合在2位羟基或者11位羟基，双葡萄糖醛酸化反应可能结合在2位羟基和11位羟基两个位点上。存在同分异构体化合物不易用普通方法进行分离，为了更好的分析追踪并获得黄柏碱的代谢产物，建立快速、准确、可靠的分析方法以及简单高效的分离制备方法尤为重要。
[0005] 目前对于黄柏碱的体内研究较少，而其在体内代谢情况也未曾有研究报道，从体内分离提取目标代谢产物，有利于进一步定量地研究黄柏碱的体内变化和动
力学过程，阐明黄柏碱在体内的代谢过程和途径，更全面的了解黄柏碱发挥作用的机理。
发明内容
[0006] 本发明首次公开了一种黄柏碱体内代谢产物黄柏碱葡萄糖醛酸结合物的分离方法。该方法
摘要包括以下步骤：
[0007] 1、AB-8大孔
吸附树脂初步分离：除杂质后的黄柏碱代谢尿样，用1倍尿样体积的AB-8大孔吸附树脂处理，上样流速为2BV/h；用2BV
水洗脱，再用4BV的20％
乙醇洗脱，收集流份，用LC-MSn法检测，分别合并含有黄柏碱-2,11-O-D-二葡萄糖醛酸苷的流份和含有黄柏碱-2-O-D-葡萄糖醛酸苷、黄柏碱-11-O-D-葡萄糖醛酸苷混合物的流份，浓缩至1/10体积，保存备用；
[0008] 2、AB-8大孔吸附树脂进一步分离：
[0009] (1)黄柏碱-2,11-O-D-二葡萄糖醛酸苷浓缩液用AB-8大孔吸附树脂层析柱处理，1BV水洗脱杂质，2BV的20％乙醇再洗脱，流份采用LC-MSn法检测，合并目标流份，浓缩至1/
10体积，保存备用；
[0010] (2)黄柏碱-2-O-D-葡萄糖醛酸苷、黄柏碱-11-O-D-葡萄糖醛酸苷混合物浓缩液用AB-8大孔吸附树脂层析柱处理，2BV水洗脱杂质，4BV的20％乙醇再洗脱，流份采用LC-MSn法检测，合并目标流份，浓缩至1/10体积，保存备用；
[0012] (1)将步骤2所得的黄柏碱-2,11-O-D-二葡萄糖醛酸苷目标流份，用ODS 层析柱处理，上样量为柱体积的1/10，用1.5BV的10％甲醇水洗脱，流份采用LC-MSn法检测，合并目标流份，浓缩至1/10体积，保存备用；
[0013] (2)将步骤2所得的黄柏碱-2-O-D-葡萄糖醛酸苷、黄柏碱-11-O-D-葡萄糖醛酸苷混合物目标流份，用ODS开放柱处理，上样量为柱体积的1/10，用 2BV的10％甲醇水洗脱，再用3BV的20％甲醇水洗脱，流份采用LC-MSn法检测，分别合并分离所得的黄柏碱-2-O-D-葡萄糖醛酸苷及黄柏碱-11-O-D-葡萄糖醛酸苷流份，浓缩至1/10体积，保存备用；
[0014] 4、Sephadex LH20凝胶柱对代谢产物进行纯化：
[0015] (1)将步骤3所得的黄柏碱-2,11-O-D-二葡萄糖醛酸苷浓缩液用Sephadex LH20凝胶柱处理，用50％甲醇水洗脱，采用LC-MSn法分析，流份浓缩至1/10 体积，保存备用；
[0016] (2)将步骤3所得的黄柏碱-2-O-D-葡萄糖醛酸苷及黄柏碱-11-O-D-葡萄糖醛酸苷浓缩液，分别用Sephadex LH20凝胶柱处理，用50％甲醇水洗脱，采用 LC-MSn法分析，合并流份，浓缩至1/10体积，保存备用；
[0017] 5、Agilent 1200型制备液相制备代谢产物：
[0018] 黄柏碱-2,11-O-D-二葡萄糖醛酸苷制备条件：采用菲罗
门Polar-RP-80A半制备柱，流速为4mL/min；流动相为甲醇：超纯水，体积比5:95；进样时间为15min，检测
波长为234nm，进样量80μL，收集时间为4-4.5min，RT＝4.25min，制备后合并所有收集液浓缩至干，用超纯水溶解，于-80℃保存，
冷冻干燥，得目标产物；
[0019] 黄柏碱-2-O-D-葡萄糖醛酸苷制备条件：采用菲罗门Polar-RP-80A半制备柱，流速为4mL/min；流动相为甲醇：超纯水，体积比25:75；进样时间为16min，检测波长为234nm，进样量80μL，收集时间为12.6-13.1min， RT＝12.8min，制备后合并所有收集液浓缩至干，用超纯水溶解，于-80℃保存，最后采用冷冻干燥处理，得目标产物；
[0020] 黄柏碱-11-O-D-葡萄糖醛酸苷制备条件：采用菲罗门Polar-RP-80A半制备柱，流速为4mL/min；流动相为甲醇：超纯水，体积比25:75，进样时间为 12min，检测波长为234nm，进样量80μL，收集时间8.6-9.5min，RT＝9min，制备后合并所有收集液浓缩至干，超纯水溶解，于-80℃保存，冷冻干燥，得目标产物；
[0021] 6、黄柏碱葡萄糖醛酸结合物的结构鉴定：
[0022] 步骤5所得产物，用40％乙腈水溶解，进行LC-MSn分析验证，确认为对应目标产物。
[0023] 本发明的浓缩
温度优选50℃-60℃；保存温度优选-85℃至-75℃。所述步骤4中用Sephadex LH20凝胶柱处理的上样体积以不超过柱体积10％为佳。
[0024] 所述步骤4的具体方法优选：Sephadex LH20凝胶柱的柱体积为1.2L，上样体积不超过柱体积的10％，上样完毕后，用50％甲醇水洗脱，待有
颜色部分接近层析柱底部10cm处开始收集洗脱液，每25mL收集一次，收集完后稀释10倍采用LC-MSn法进行检测，合并目标流份，55℃浓缩至10mL后-80℃保存备用。
[0025] 本发明首次公开了体内黄柏碱的代谢产物—黄柏碱葡萄糖醛酸结合物的分离方法。该方法操作简单、成本低，效率高。本方法可分离提取体内黄柏碱代谢产物，并确定其化学结构及定量分析。为分析黄柏碱代谢产物的裂解规律，转化关系，体内药代动力学研究，药理作用机理研究提供了可行性条件及实验依据。
附图说明
[0026] 图1为黄柏碱葡萄糖醛酸结合物M1、M2、M3LC-MSn分析图谱；
[0027] 图2为大鼠单次灌胃黄柏碱低、中、高剂量后黄柏碱-11-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的平均血药浓度-时间曲线(n＝6)；
[0028] 图3为大鼠单次灌胃黄柏碱低、中、高剂量黄柏碱-2,11-O-β-D-二葡萄糖醛酸苷的平均血药浓度-时间曲线(n＝6)。
具体实施方式
[0029] 下面结合具体的
实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于此。
[0030] 实施例1：黄柏碱葡萄糖醛酸结合物的分离
[0031] 18只SD大鼠按80mg/kg黄柏碱剂量灌胃给予黄柏碱部位溶液，每天灌胃一次，收集0～24h尿样，持续
给药两周。将收集到的尿样合并离心除去残渣，-80℃冷冻保存，待分离用。
[0032] 分离过程中各个洗脱流份采用已建立的LC-MSn法进行分析，根据出峰时间区分代谢物M1、M2、M3，如图1。M1为黄柏碱-2,11-O-D-二葡萄糖醛酸苷，M2为黄柏碱-2-O-D-葡萄糖醛酸苷，M3为黄柏碱-11-O-D-葡萄糖醛酸苷。
[0033] 1.1AB-8大孔吸附树脂初步分离：
[0034] 共收集尿样4.5L，先将尿样抽滤除去杂质沉淀，再用1倍尿样体积的AB-8 大孔吸附树脂处理，尿样上样流速为2BV/h。上样完毕后先用2BV水洗脱除去杂质，再用4BV的20％乙醇洗脱，每500mL收集一次。收集后的流份使用已建立的LC-MSn法检测，分别合并含有单葡萄糖醛酸结合物(M2和M3 未能分离)和双葡萄糖醛酸结合物(M1)的流份，浓缩至1/10体积，待进一步分离。
[0035] 1.2AB-8大孔吸附树脂进一步分离：
[0036] (1)取AB-8大孔吸附树脂层析柱，柱体积均为1L，上样代谢物M1的浓缩液，上样完后用1BV水洗脱杂质，再用2BV的20％乙醇洗脱，每250mL 收集一次，收集后的流份采用LC-nMS法分析后合并含有代谢物M1的流份， 55℃浓缩至1/10后-80℃保存。
[0037] (2)另取AB-8大孔吸附树脂层析柱，柱体积均为1L，上样代谢物M2 和M3混合物浓缩液，上样完后用2BV水洗脱杂质，再用4BV的20％乙醇洗脱，每250mL收集一次，收集后的流份采用LC-MSn法检测后分别合并含有代谢物M2和M3流份(M2和M3未能完全分离)，浓缩至1/10体积，待ODS 分离。
[0038] 1.3ODS开放柱对代谢物进行富集
[0039] (1)AB-8大孔吸附树脂分离的代谢物M1浓缩液上样于ODS层析柱，柱体积为500mL，上样量为柱体积的1/10，上样完毕后，用1.5BV的10％甲醇水洗脱，每50mL收集一次，收集后的洗脱液采用LC-MSn法分析后合并含有代谢物M1的流份，55℃浓缩至1/10后-80℃保存。
[0040] (2)AB-8大孔吸附树脂分离的代谢物M2和M3混合物浓缩液上样于 ODS开放柱，上样量为柱体积的1/10，上样完毕后，先用2BV的10％甲醇水洗脱，50mL收集一次，再用3BV的20％甲醇水洗脱，50mL收集一次，收集后的洗脱液采用LC-MSn法分析后分别合并含有代谢物M3和代谢物M2的流份，55℃浓缩至1/10后-80℃保存。其中同分异构体M2和M3能初步分离，代谢物M3的含量较多，先洗脱出来，但M2流份中还混杂着部分M3。
[0041] 1.4 Sephadex LH20凝胶柱对代谢产物进行纯化
[0042] (1)ODS富集的代谢物M1浓缩液上样于Sephadex LH20凝胶柱，柱体积为1.2L，上样体积不超过柱体积的10％，上样完毕后，用50％甲醇水洗脱，待有颜色部分接近层析柱底部10cm处开始收集洗脱液，每25mL收集一次，收集完后稀释10倍采用LC-MSn法进行分析，合并含有代谢物M1的流份，55℃浓缩至10mL后-80℃保存。
[0043] ODS富集的代谢物M3浓缩液以及代谢物M2、M3混合物浓缩液，分别按上述相同方法采用Sephadex LH20凝胶柱进行纯化，所得流份55℃浓缩至 10mL后-80℃保存。
[0044] 所述的LC-MSn法分析方法具体为：采用UPLC-LTQ-Orbitrap XL髙分辨质谱，色谱柱为依利特Hypersil-C18柱(4.6×250mm，10μm)，流动相为0.1％
甲酸水-乙腈(65:35)，等度洗脱，流速400μL·min-1，柱温30℃，检测波长为284nm，进样量为10μL。离子源为电喷雾离子源(ESI)，使用正离子碰撞解离诱导(CID)模式，喷雾
电压为4kV，鞘气为45arb，雾化温度为350℃，辅助气为10arb，碰撞能为35eV。一级质谱采用傅里叶变换质谱(FTMS)扫描模式，
分辨率为30000，分子
质量扫描范围是140～1000；二级和三级质谱采用数据依赖扫描分辨率为15000。黄柏碱-2,11-O-二葡萄糖醛酸苷、黄柏碱 -2-O-葡萄糖醛酸苷和黄柏碱-11-O-葡萄糖醛酸苷保留时间分别为16.05、24.84 和27.15min。
[0045] 实施例2：黄柏碱葡萄糖醛酸结合物的制备：
[0046] 代谢物M1制备条件：采用菲罗门Polar-RP-80A半制备柱(10×250mm， 4μm)，流速为4mL/min；流动相为甲醇：超纯水(5:95)，进样时间为15min，检测波长为234nm，进样量80μL，收集时间为4-4.5min，RT＝4.25min，制备后合并所有收集液浓缩至干，用5mL超纯水溶解，于-80℃保存，最后采用冷冻干燥处理，得类白色粉末10mg。
[0047] 代谢物M2制备条件：采用菲罗门Polar-RP-80A半制备柱(10×250mm， 4μm)，流速为4mL/min；流动相为甲醇：超纯水(25:75)，进样时间为16min，检测波长为234nm，进样量80μL，收集时间为12.6-13.1min，RT＝12.8min，制备后合并所有收集液浓缩至干，用5mL超纯水溶解，于-80℃保存，最后采用冷冻干燥处理，得类白色粉末2mg。
[0048] 代谢物M3制备条件：采用菲罗门Polar-RP-80A半制备柱(10×250mm， 4μm)，流速为4mL/min；流动相为甲醇：超纯水(25:75)，进样时间为12min，检测波长为234nm，进样量80μL，收集时间8.6-9.5min，RT＝9min，制备后合并所有收集液浓缩至干，用10mL超纯水溶解，于-80℃保存，最后采用冷冻干燥处理，得类白色粉末17mg。
[0049] 实施3：黄柏碱葡萄糖醛酸结合物的结构鉴定：
[0050] 代谢物M1为白色无定形粉末，粉末用40％乙腈水溶解，进行LC-MSn分析验证。由LC-MSn一级全扫描质谱得出准分子离子m/z 694[M+H]+，比原形药黄柏碱相对分子质量多352Da。二级扫描质谱中可得碎片离子m/z 518、 m/z 342和m/z 368，三级扫描质谱中可得碎片离子m/z 342、m/z 368和m/z 192，由MS确定m/z 694.23416[M+H]+的分子式为C32H40NO16，PDA吸收波长为234nm，284nm。
[0051] 取8mg代谢物M1粉末用DMSO-d6溶解，在600M条件下进行1H-NMR 谱检测以及150M条件下进行13C-NMR谱检测。1H-NMR谱中高场区给出δ3.20 (3H，s，7-NCH3)氮甲基质子
信号和δ3.77(3H，s)甲氧基质子信号，低场区给出4个芳香质子信号：δ7.07，6.93，6.90，6.77，推测其分别为两个苯环上的4个对位质子信号。13C-NMR谱中给出δ171.82，171.84两个羧基信号，δ148.96，148.14，146.69，145.38为苯环上4个含氧取代
碳信号(C-3， 10，11，2)，δ123.02，122.85，121.21，119.49为苯环上4个季碳信号(C-1a， 12a，4a，8a),δ114.85，
112.86，112.76，110.30为苯环上4个CH信号(C-12， 1，4，9)，δ100.67，100.05和δ4.81，4.75得知有两个端基碳和端基质子，且根据葡萄糖醛酸端基氢的耦合常数J＝6，可以确定葡萄糖醛酸的构型是β型。 HMBC谱显示葡萄糖醛酸端基质子δ4.75与C-2(δ145.38)，δ4.83与C-2(δ 146.69)有远程相关性，最终确定代谢物M1的结构为黄柏碱-2,11-O-β-D-二葡萄糖醛酸苷(Phellodendrine-2,11-di-O-β-D-glucuronide)。
[0052] 代谢物M2为白色无定形粉末，粉末用40％乙腈水溶解，进行LC-MSn分析验证。由一级全扫描质谱得出准分子离子m/z 518[M+H]+，比原形药黄柏碱相对分子质量多176Da，二级扫描质谱中可得碎片离子m/z 368，m/z 342， m/z 192，三级扫描质谱中可得碎片离子m/z 192，由MS确定m/z 518.20083 [M+H]+的分子式为C26H32NO10，PDA吸收波长为234nm，284nm，验证信息和第二章结果一致。因M2分子量为518，且有m/z 368特征离子碎片，则葡萄糖醛酸是和2位羟基相结合，综合质谱信息初步鉴定代谢物M2的结构为黄柏碱-2-O-葡萄糖醛酸苷(Phellodendrine-2-O-glucuronide)。
[0053] 代谢物M3为白色无定形粉末，粉末用40％乙腈水溶解，进行LC-MSn分析验证。由一级全扫描质谱得出准分子离子m/z 518[M+H]+，比原形药黄柏碱相对分子质量多176Da，二级扫描质谱中可得碎片离子m/z 342，m/z 192，三级扫描质谱中可得碎片离子m/z 192。由MS确定m/z 518.20374[M+H]+的分子式为C26H32NO10，PDA吸收波长为234nm，284nm。
[0054] 取12mg代谢物M3粉末用DMSO-d6溶解，在600M条件下进行1H-NMR 谱检测以及150M条件下进行13C-NMR谱检测。从1H-NMR和13C-NMR信息推得葡萄糖醛酸的存在，端基H信号δ4.91，1H，d，J＝6.0Hz，葡萄糖醛酸的构型是β型；C信号δ99.51(C-1’)，73.11(C-2’)，77.07(C-3’)，72.09 (C-4’)，73.74(C-5’)，171.57(C-6’)。代谢物M3的
苷元结构的1H-NMR 和13C-NMR数据与原形药相一致。HMBC谱显示葡萄糖醛酸端基质子δ4.91 与C-11(δ146.39)有远程相关性，推测葡萄糖醛酸与黄柏碱的连接
位置在 C-11上。HMBC谱中H-12与C-10(148.09)和C-13(32.37)相关，H-1与C-3 (148.28)和C-13a(64.45)相关，H-4与C-2(146.2)、C-5(22.65)和C-1a (123.51)相关，H-9与C-8(61)和C-11(146.39)相关。根据1H-NMR、13C-NMR、 HSQC、HMBC谱信号，并结合文献，最终确定代谢物M3的结构为黄柏碱-11-O- β-D-葡萄糖醛酸苷(Phellodendrine-11-O-β-D-glucuronide)。
[0055] 实施4：黄柏碱葡萄糖醛酸结合物的裂解途径：
[0056] 代谢物M1的裂解途径：
[0057]
[0058] 代谢物M3的裂解途径：
[0059]
[0060] 实施例5：黄柏碱葡萄糖醛酸结合物的药代动力学研究
[0061] 以制备得到的黄柏碱葡萄糖醛酸结合物为对照品。
[0062] 血浓测定方法：以乌头碱为内标，生物样品采用甲醇:甲酸(9:1)沉淀法 处理。色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(150mm×2.1mm，3.5μ m)；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱，0～1min： 5％B相；1～6min：5％～95％B相；6～8min，95％B相；8～8.5min，95％～ 5％B相；8.5～10min，5％B相；总分析时间为10min；流速为300μL·min-1； 柱温为35℃；进样量为5μL；进样器温度设置为4℃。采用电喷雾(ESI) 离子源；
检测方式为正离子多离子反应(MRM)；雾化温度为600℃；喷雾 电压(IS)为5000V；碰撞气(CAD)为6psi；气帘气(CUR)为25psi；雾化气1 (GS1)为60psi；雾化气2(GS2)为50psi。黄柏碱-11-O-β-D-葡萄糖醛酸 苷和黄柏碱-2,11-O-β-D-二葡萄糖醛酸苷的线性范围分别是1～1200、10～ 1000ng·mL-1；定量下限分别是1、10ng·mL-1；提取回收率为(71.93±
3.87)％～(87.86±4.05)％；基质效应为(105.04±1.76)％～(127.69± 4.84)％；准确度在(96.08±1.88)％～(110.20±4.97)％；日内、日间精
密度RSD≤8.99％；在室内4h、进样器4℃下24h、-80℃下30d、冻融3次 等条件下稳定。
[0063] 药动学研究：SD雄性大鼠随机分为3组，分别灌胃黄柏碱
单体20、40 和80mg·kg-1剂量后，定时眼眶
采血，制备
血浆，采用已建立的LC-MS/MS 法测定血浆中黄柏碱葡萄糖醛酸结合物的浓度，绘制药时曲线，如如图2和图3，计算药物动力学参数，并对主要药动学参数进行统计分析。黄柏碱 -11-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，在0.7～0.9h达到浓度峰值，其中Cmax在低、中、高剂量下分别是(602±132)、(921±113)、(1263±243)ng·mL-1，AUC0～t分别是(2300±509)、(4149±863)、(7451±2412)ng·h·mL-1。黄柏碱 -2,11-O-β-D-二葡萄糖醛酸苷，在1.1～1.6h达到浓度峰值，其中Cmax在低、中、高剂量下分别是(82.7±20.0)、(146±30)、(237±66)ng·mL-1，AUC0～t分别是(355±140)、(523±125)、(1187±440)ng·h·mL-1。
