一种从伯克氏菌无细胞上清液中提取天然化合物的方法以及
在防治小麦赤霉病中的应用
技术领域
[0001] 本
发明属于天然活性化合物提取制备领域，具体涉及一种从伯克氏菌无细胞上清液中提取天然活性化合物的方法及该伯克氏菌和天然活性化合物在防治小麦赤霉病菌中的应用。
背景技术
[0002] 小麦赤霉病(Fusarium head blight)是世界性流行病害，我国是全球受害面积最大的国家之一，其致病原为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，该病害一旦发病危害极其严重。2011-2015年，我国小麦赤霉病年平均发生面积超8000万亩，约占总种植面积的25％，其中2012年发病尤其严重，发病面积接近1.5亿亩，经济损失达15亿美元。小麦赤霉病不仅能造成严重的产量损失，而且小麦赤霉病菌还会产生多种
真菌毒素，严重危害粮食安全，人畜生命健康。因此如何防控小麦赤霉病引起了重大关注。
[0003] 目前，对小麦赤霉病的
预防和
治疗，主要通过培育抗病新品种和利用化学合成
农药抑制杀灭病原菌，但都存在一定问题。
[0004] 在我国大面积种植的小麦品种中，仅扬麦、宁麦、鄂麦和部分淮麦系列的少数品种对赤霉病有较好的抗性，其它如郑麦、豫麦、烟农、皖麦系列及矮抗58等主导品种都对赤霉病表现感病。由于小麦对赤霉病抗性是由多基因控制的数量性状，赤霉病抗病育种存在很大的困难，至今也未能育成抗性相当、产量更高的新品种。
[0005] 在
化学防治方面，我国防治赤霉病的药剂种类比较单一，目前我国在防控小麦赤霉病上主要施用苯并咪唑类
杀菌剂、甾醇
生物合成
抑制剂类杀菌剂和氰基
丙烯酸酯类杀菌剂三大类。但这些药剂也存在一定问题，有研究表明，苯并咪唑类杀菌剂的作用靶标β-微管蛋白会发生点突变，
蛋白质三维构象随之发生变化，病原菌和药剂的亲和
力就会下降。且由于长期大规模不合理使用，药剂更新慢、成本高，病原菌抗药性不断增强，防治难度加大，造成环境污染。
[0006] 鉴于目前尚无高抗赤霉病的小麦品种，且缺乏高效低毒化学杀菌剂，
生物防治有广泛的实践意义。生物防治主要是指利用有益
微生物或其活性代谢产物等对
植物病害进行有效防治。对小麦赤霉病进行合理的生物防治不仅避免了上述弊端，还可以维持生态平衡、降低成本、易于同其他防治措施协调配合并且防效更加稳定持久，展现了良好的应用前景。
[0007] 近年来，国内外对小麦赤霉病生防因子的研究已取得很大进展。研究者们陆续发现了木霉，
酵母和其他细菌均对小麦赤霉病有防治效果。2003年，研究人发现枯草芽孢杆菌BS3-1对小麦赤霉菌有很强的拮抗活性，并发现其发挥拮抗作用的物质是一种
水溶性拮抗蛋白。目前已分离到对小麦赤霉病原菌有拮抗作用的菌株多为芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomons Migula)、放线菌(Actinomycetes)和真菌(Fungi)等。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供了一种从伯克氏菌无细胞上清液提取防治小麦赤霉病菌的天然活性化合物的方法，该提取工艺操作简单、成本较低，得到的化合物纯度较高，杀菌活性良好。
[0009] 本发明的另一目的在于提供了上述伯克氏菌和天然活性化合物在防治田间小麦赤霉病中的应用，尤其是提取得到的天然活性化合物对小麦赤霉病致病原禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)标准测序菌株PH-1具有较强抗菌活性，可作为一种新的防治方法应用。
[0010] 本发明的目的通过如下技术方案实现：
[0011] 一种从伯克氏菌无细胞上清液中提取天然活性化合物的方法，所述的天然活性化合物的结构如下式所示：
[0012]
[0013] 提取方法包括如下步骤：
[0014] (1)于LB液体培养基中培养伯克氏菌(Burkholderia seminalis)R456，保藏号为CCTCC NO:M2010207，收集细菌悬浮液，再离心收集上清液，得到无细胞上清液；
[0015] (2)用乙酸乙酯溶液萃取步骤(1)得到的无细胞上清液，得到乙酸乙酯提取液，再经过离心、过滤、
蒸发得到固体物质；
[0016] (3)用乙酸乙酯溶液溶解步骤(2)得到的固体物质，得到的溶液经过离心、过滤后，利用制备型液相色谱仪分离得到活性天然化合物。
[0017] 本发明方法利用特定的提取条件从伯克氏菌中提取到了能被应用于防治小麦赤霉病菌的天然活性化合物，该天然活性化合物的分子式为C14H16N2O2，其结构稳定、杀菌活性较强。
[0018] 步骤(1)中，将伯克氏菌涂板活化培养，再以1％～5％的转接量转接至LB培养基放大培养，培养条件为：转速为180～220rpm，
温度为30～32℃。
[0019] 所述LB培养基的配方为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，调节PH值为7～7.5。即配制1L的LB培养基需称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl并调节PH值为7～7.5。
[0020] 步骤(1)中，所述的离心的转速为7000～12000rpm，离心时间为10～20min。离心时间过长、转速过快会造成
能源浪费；离心时间过短、转速过慢会导致上清液中含杂质，影响后面的萃取步骤。
[0021] 步骤(2)中，所述的乙酸乙酯溶液以等体积1:1萃取无细胞上清液。所述的蒸发为
旋转蒸发，加热水温为40～50℃，
真空度为0MPa。
[0022] 步骤(2)和步骤(3)中，所述离心的转速均为5000～10000rpm，离心时间5～10min，离心时间过长、转速过快会造成能源浪费；离心时间过短、转速过慢会导致上清液中含杂质，影响后面的液相色谱分离制备步骤。
[0023] 步骤(3)中，所述乙酸乙酯萃取液进样制备型液相色谱仪之前必须经0.45微米孔径或0.22微米孔径的有机系
过滤器过滤，否则杂质过多会影响峰型已经堵塞制备色谱柱。
[0024] 所述制备型液相色谱仪使用的检测
波长为210nm，流动相的A相为0.1％的
甲酸水溶液，B相为100％的乙腈，流动相配比为0～20min中B相由2％增加到40％，20～60min中B相由40％增加到95％。
[0025] 所述的流动相的A相经0.45微米或0.22微米的水系过滤
膜过滤，B相经0.45微米或0.22微米的有机系过滤膜过滤。
[0026] 本发明公开了上述伯克氏菌(Burkholderia seminalis)R456在防治小麦赤霉病中的应用。
[0027] 本发明还公开了上述从伯克氏菌无细胞上清液提取的天然化合物在防治小麦赤霉病中的应用。
[0028] 该天然化合物能有效抑制小麦赤霉病菌的活性，可用于防治田间小麦赤霉病。实验表明，本发明制备的天然活性化合物对小麦赤霉病致病原禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)标准测序菌株PH-1具有较强体外抗菌活性，有利于应对禾谷镰刀菌日益增强的抗药性，在农业生产领域中具有很好的推广前景。
[0029] 本发明与
现有技术相比，具有以下有益效果：
[0030] (1)本发明首次发现伯克氏菌(Burkholderia seminalis)R456对小麦赤霉病有明显的拮抗作用，本发明还公开了一种提取方法首次从伯克氏菌中提取得到了能被应用于防治小麦赤霉病菌的天然活性化合物，该天然活性化合物结构稳定，杀菌活性较强。
[0031] (2)本发明提取上述天然活性化合物的方法简单，制备得到的天然活性化合物纯度较高，其作为一种新的防治药剂用于防治小麦赤霉病，解决了目前尚无高抗赤霉病的小麦品种且缺乏高效低毒化学杀菌剂的问题，在农业生产领域中具有良好的推广前景。
附图说明
[0032] 图1为
实施例1中乙酸乙酯提取液的液相色谱图；
[0033] 图2为实施例1中提取得到的天然活性化合物的一级质谱图；
[0034] 图3为实施例1中提取得到的天然活性化合物的二级质谱图；
[0035] 图4为小麦赤霉病菌的自然生长照片；
[0036] 图5为伯克氏菌R456拮抗小麦赤霉病菌的照片；
[0037] 图6为实施例1中伯克氏菌R456无细胞上清液拮抗小麦赤霉病菌的照片；
[0038] 图7为实施例1中伯克氏菌R456无细胞上清液的乙酸乙酯提取液拮抗小麦赤霉病菌的照片；
[0039] 图8为实施例1中提取得到的天然活性化合物C14H16N2O2拮抗小麦赤霉病菌的照片。
具体实施方式
[0040] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
[0041] 下列实施例1～3所用的菌株为伯克氏菌(Burkholderia seminalis)R456，该伯克氏菌R456为
发明人发现，并将其保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2010年8月20日，保藏号为CCTCC NO：M 2010207，详见公开号为CN101985606B的中国
专利文献。
[0042] 下列实施例1～3所用的制备色谱柱为YMC公司生产的AA12S05-2510WT，YMC-Pack ODS-A S-5um 10*250mm 12nm，色谱柱。
[0043] 实施例1
[0044] (1)细菌培养：挑取LB琼脂板上伯克氏菌单菌落至5ml试管LB液体培养基中，30℃、200rpm过夜振荡培养后，按照1％比例转接至LB液体培养基中，培养温度为30℃，振荡速率
200rpm进行过夜培养；
[0045] (2)上清液收集：将步骤(1)得到的细菌悬浮液按照转速8000rpm，离心10min并收集上清，得到无细胞上清液(CFCS)；
[0046] (3)萃取蒸发：用乙酸乙酯溶液等体积萃取上述无细胞上清液，使用分液漏斗收集乙酸乙酯层，将得到的乙酸乙酯提取液经过5000rpm离心5min、0.22微米有机系滤膜过滤后，使用
旋转蒸发仪蒸发，真空度0MPa，温度45℃，旋转蒸发得到固体物质；
[0047] (4)分离纯化：用乙酸乙酯溶液溶解上述固体物质，得到的溶液经过5000rpm离心5min、0.22微米有机系滤膜过滤后，使用制备型液相色谱仪制备出该活性天然化合物，流动相为A相为0.1％的甲酸水溶液，B相为100％的乙腈，流动相配比为0min～20min中B相由2％增加到40％，20min～60min中B相由40％增加到95％，检测波长为UV 210nm，收集时间段为
14min～16min。
[0048] 步骤(3)制得的乙酸乙酯提取液的液相色谱图如图1所示，发现该天然活性化合物出峰时间为15.1min。
[0049] 上述方法制得的天然活性化合物的一级质谱图如图2所示，发现其分子量为245.12。该天然活性化合物的二级质谱图如图3所示，发现其共有7个碎片峰，分子量分别为
65.04、70.06、92.05、154.07、172.11、217.13、245.12。
[0050] 实施例2
[0051] (1)细菌培养：挑取LB琼脂板上伯克氏菌单菌落至5ml试管LB液体培养基中，30℃、200rpm过夜振荡培养后，按照1％比例转接至LB液体培养基中，培养温度为30℃，振荡速率
200rpm进行过夜培养；
[0052] (2)上清液收集：将步骤(1)得到的细菌悬浮液按照转速9000rpm，离心10min并收集上清，得到无细胞上清液(CFCS)；
[0053] (3)萃取蒸发：用乙酸乙酯溶液等体积萃取上述无细胞上清液，使用分液漏斗收集乙酸乙酯层，得到的乙酸乙酯提取液经过6000rpm离心5min、0.22微米有机系滤膜过滤后，使用旋转蒸发仪，真空度0MPa，温度45℃，旋转蒸发得到固体物质；
[0054] (4)分离纯化：用乙酸乙酯溶液溶解上述固体物质，得到的溶液经过6000rpm离心5min、0.22微米有机系滤膜过滤后，使用制备型液相色谱仪制备出该活性天然化合物，流动相为A相为0.1％的甲酸水溶液，B相为100％的乙腈，流动相配比为0min～20min中B相由2％增加到40％，20min～60min中B相由40％增加到95％，检测波长为UV 210nm，收集时间段为
14min～16min。
[0055] 实施例3
[0056] (1)细菌培养：挑取LB琼脂板上伯克氏菌单菌落至5ml试管LB液体培养基中，30℃、200rpm过夜振荡培养后，按照1％比例转接至LB液体培养基中，培养温度为30℃，振荡速率
200rpm进行过夜培养；
[0057] (2)上清液收集：将步骤(1)得到的细菌悬浮液按照转速10000rpm，离心10min并收集上清，得到无细胞上清液(CFCS)；
[0058] (3)萃取蒸发：用乙酸乙酯溶液等体积萃取上述无细胞上清液，使用分液漏斗收集乙酸乙酯层，得到的乙酸乙酯提取液经过7000rpm离心5min、0.22微米有机系滤膜过滤后，使用旋转蒸发仪，真空度0MPa，温度45℃，旋转蒸发得到固体物质；
[0059] (4)分离纯化：用乙酸乙酯溶液溶解上述固体物质，得到的溶液经过7000rpm离心5min、0.22微米有机系滤膜过滤后，使用制备型液相色谱仪制备出该活性天然化合物，流动相为A相为0.1％的甲酸水溶液，B相为100％的乙腈，流动相配比为0min～20min中B相由2％增加到40％，20min～60min中B相由40％增加到95％，检测波长为UV 210nm，收集时间段为
14min～16min。
[0060] 对实施例1中从伯克氏菌无细胞上清液提取得到的天然活性化合物抑菌效果进行检测，得到的结果如下所示：
[0061] (一)伯克氏菌对小麦赤霉病菌的抑制效果
[0062] 图4为小麦赤霉病菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)标准测序菌株PH-1在PDA培养基上的的自然生长照片，图5为在PDA培养基平板上滴加10μl伯克氏菌菌液，再接种小麦赤霉病菌，培养3d后，小麦赤霉病菌的菌丝生长照片。发现滴加伯克氏菌菌液后，小麦赤霉病菌的菌丝生长受到明显抑制，抑菌圈直径约为1.5cm。
[0063] (二)伯克氏菌上清液对小麦赤霉病菌的抑制效果
[0064] 将实施例1步骤(2)中得到的无细胞上清液以1:1等比例混入PDA培养基中，接种小麦赤霉病菌，培养3d后，菌丝生长情况如图6所示，发现小麦赤霉病菌的菌丝生长受到明显抑制，抑制效果与正常生长相比，下降约55％。
[0065] (三)伯克氏菌上清液的乙酸乙酯提取液对小麦赤霉病菌的抑制效果[0066] 将实施例1中步骤(3)的乙酸乙酯提取液加20μl在
滤纸片上，将滤纸片置于PDA培养基，接种小麦赤霉病菌培养3d后，菌丝生长情况如图7所示，现小麦赤霉病菌的菌丝生长受到明显抑制，抑菌圈直径约为5.0cm。
[0067] (四)提取制得的天然活性化合物对小麦赤霉病菌的抑制效果
[0068] 将实施例1中最终制得的天然活性化合物水溶液以1:1等比例混入PDA培养基中，接种小麦赤霉病菌，培养3d后，菌丝生长情况如图8所示，发现小麦赤霉病菌的菌丝生长受到明显抑制，抑制效果与正常生长相比，下降约85％。
