技术领域
[0001] 本
发明涉及
植物组织培养技术领域，更具体地，涉及一种观赏水草南极杉的组织培养方法。
背景技术
[0002] 南极杉，是一种较常用的观赏水草。南极杉为沉水草本植物，车前科，双子叶植物，挺水性水草。野生情况下，每到花期，水面如花海般美丽，草缸培育也能看到它开花的情形。这种水草在水中颇能适应广泛的水质变化，在弱光下也能生长，但仍以较强光线培育为佳。
南极杉在形态上比较像绿
羽毛，区别在于前者是针状叶，后者是羽状叶。南极杉目前繁殖方式为插枝、侧芽繁殖。
[0003] 但是，目前尚缺乏成熟的技术用于大规模繁殖优质的南极杉植株。
发明内容
[0004] 针对
现有技术存在的技术问题，本发明提出了一种观赏水草南极杉的组织培养方法，该方法是在无菌条件下，采取适宜培养环境、给予固定光照，诱导南极杉新的
幼苗，逐步形成无菌苗体系，后期可常年提供大量
无菌幼苗。该方法易行，操作方便，产量高，克服了南极杉在水族缸中不易繁殖、繁殖速度慢、植物种苗获得困难的问题。
[0005] 为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006] 一种观赏水草南极杉的组织培养方法，包括以下步骤：
[0007] (1)预处理：选择健康、无病虫害的南极杉植株经灭菌处理、清洗，得到消毒灭菌后的无菌外植体；
[0008] (2)初代培养：将消毒后的无菌外植体在无菌培养皿中切割成1-1.5cm长的外植体，切割后的每个外植体至少带一个
腋芽；将切割后的外植体转接入初代培养基进行初代培养10-20天；
[0009] (3)增殖培养：分离初代培养基中的初代不定芽，使初代不定芽长度控制在2cm以内；将分离后的初代不定芽转入增殖培养基中进行增殖培养22-30天；
[0010] (4)生根培养：将增殖培养基中长度大于3-4cm的植株转入生根培养基，进行生根培养；
[0011] (5)移栽：将带有完整根系的南极杉植株从生根培养基中取出，清水冲洗后移栽到生态缸中。
[0012] 进一步地，步骤(1)中外植体灭菌处理、清洗的具体方法为：流水冲洗外植体30min，75％酒精消毒15-30s，冲洗3次；1％
次氯酸钠消毒10-20min，再用无菌水冲洗5次。
[0013] 进一步地，所述初代培养基为：MS培养基+6-10g/L琼脂+10-30g/L
蔗糖+0.5-1.5mg/L激动素+0.05-0.5mg/L
萘乙酸。
[0014] 进一步地，所述增殖培养基为：MS培养基+6-10g/L琼脂+10-30g/L蔗糖+1-2.5mg/L 6-BA+0.5-1mg/L萘乙酸。
[0015] 进一步地，所述生根培养基为：MS培养基+6-10g/L琼脂+10-30g/L蔗糖+0.1-0.5mg/L生长素。
[0016] 更进一步地，所述生根培养基为：MS培养基+6-10g/L琼脂+10-30g/L蔗糖+0.1-0.5mg/L吲哚乙酸。
[0017] 进一步地，所述初代培养条件为：光照周期为14h/d，
温度25±2℃，光照2500Lux。
[0018] 进一步地，所述增殖培养条件为：光照周期为14h/d，温度25±2℃，光照2500Lux。
[0019] 进一步地，所述生根培养条件为：光照周期为14h/d，温度25±2℃，光照2500Lux。
[0020] 因此，与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0021] (1)本发明提出的一种观赏水草南极杉的组织培养方法，是在无菌条件下，采取适宜培养环境，给予固定光照，直接诱导南极杉幼芽的生长，可不受季节、温度、地域影响，获得大量的新植株，快速建立南极杉无菌繁殖体系，为保持南极杉优良的种性提供技术支持，为广大的爱好者提供源源不断地优质无菌种苗。
[0022] (2)本发明的组织培养方法中所采用的各组培配方协同配合，组织繁殖周期短，繁殖率高，且通过本发明的组织培养方法无菌培养的南极杉苗，在自然
水体中生根率达100％，植物成活率高达98％以上，实现了南极杉有效快速的
无性繁殖，对于促进观赏水草的生产和新品种的培育、加快水族观赏水草产业的快速发展具有重要作用。
[0023] (3)本发明的南极杉无菌苗的组织培养方法简单易行，操作方便，产量高，克服了水族缸中不易繁殖、繁殖速度较慢、植物种苗获得困难的问题。
具体实施方式
[0024] 展示一下实例来具体说明本发明的某些
实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所述
试剂和
生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0025] 实施例1
[0026] 步骤1：配制初代培养基、增殖培养基、生根培养基
[0027] 1、本实施例中使用的初代培养基、增殖培养基和生根培养基均是采用的MS培养基作为
基础培养基，MS培养基配方如下：mg/L
[0028] 表1 MS培养基配方
[0029]序号 组分 含量(mg/L) 序号 组分 含量(mg/L)
1 KNO3： 1900 11 CuSO4.5H2O 0.025
2 NH4NO3 1650 12 CoCL2.6H2O 0.025
3 MgSO4·7H2O 370 13 Na2-EDTA 37.3
4 KH2PO4 170 14 FeSO4·7H2O 27.8
5 CaCl2·2H2O 440 15 甘
氨酸 2.0
6 MnSO4·4H2O 22.3 16
盐酸吡哆醇 0.5
7 ZnSO4·7H2O 8.6 17 盐酸硫铵素 0.1
8 H3BO3 6.2 18 烟酸 0.5
9 KI 0.83 19 肌酸 100
10 Na2MoO4·7H2O 0.25
[0030] 2、初代培养基配制
[0031] 1L上述MS培养基中添加琼脂7g、蔗糖30g、激动素(KT)0.5mg、萘乙酸(NAA)0.1mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。
[0032] 3、增殖培养基配制
[0033] 1L上述MS培养基中添加琼脂7g、蔗糖30g、6氨基嘌呤(6BA)1.0mg、萘乙酸(NAA)0.5mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。
[0034] 4、生根培养基配制
[0035] 1L上述MS培养基中添加琼脂7g、蔗糖30g、吲哚乙酸0.1mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。
[0036] 步骤2：外植体的清洗与消毒
[0037] 从花
鸟市场购买南极杉植株，带回实验室用
洗涤剂简单清洗掉表面污渍和灰尘，在
自来水下冲洗半小时；于超净
工作台上，选用健康、无病虫害的植株作为外植体，用
镊子剃掉大部分
叶片后，经体积浓度为75％的酒精消毒15s，冲洗三次，然后用
质量浓度为1％的次氯酸钠溶液消毒15min，再用无菌水冲洗5次待用。
[0038] 步骤3：初代培养
[0039] 将消毒后的外植体用灭菌纸片吸掉表面水分，转接入步骤1制备的初代培养基，置于
培养箱中诱导培养16天，诱导培养条件为：光照2500Lux，光照周期为14h/d，温度23℃。
[0040] 步骤4：增殖培养
[0041] 分离初代培养基中的不定芽，切割长度为2cm以内为宜，转入步骤1制备的增殖培养基中，增殖培养22天，增殖培养条件为：光照2500Lux，光照周期为14h/d，温度25℃。
[0042] 步骤5：生根培养
[0043] 经过22天增殖培养后，将长度大于3-4cm的南极杉新植株切割下来，转入生根培养基生根。生根培养条件为：光照2500Lux，光照周期为12h/d，温度25℃。
[0044] 步骤6：
[0045] 待长出根长超过2cm，取出，用清水冲洗后，移栽到生态缸中，植物全部成活，成活率达到100％。
[0046] 本实施例可以由一个外植体直接诱导出新植株，通过不断的分离增殖培养供应源源不断的南极杉种苗，一棵南极杉经过30天可以诱导出6棵新的子代植株，转入水族箱后存活率为100％。
[0047] 实施例2
[0048] 步骤1：配制初代培养基和增殖培养基、生根培养基
[0049] 1、本实施例中配制的初代、增殖、生根培养基是采用的MS培养基作为基础培养基，MS培养基配方同实施例1所示。
[0050] 2、初代培养基配制
[0051] 1L上述MS培养基中添加琼脂6g、蔗糖20g、激动素(KT)1.0mg、萘乙酸(NAA)0.05mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。
[0052] 3、增殖培养基配制
[0053] 1L上述MS培养基中添加琼脂6g、蔗糖20g、6氨基嘌呤(6BA)2.5mg、萘乙酸(NAA)0.75mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。
[0054] 4、生根培养基配制
[0055] 1L上述MS培养基中添加琼脂6g、蔗糖20g、吲哚乙酸0.5mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。
[0056] 步骤2：外植体的清洗与消毒
[0057] 从花鸟市场购买南极杉植株，带回实验室用洗涤剂简单清洗掉表面污渍和灰尘，在自来水下冲洗半小时；于超净工作台上，选用健康、无病虫害的植株作为外植体，用镊子剃掉大部分叶片后，经体积浓度为75％的酒精消毒30s，冲洗三次，然后用质量浓度为1％的次氯酸钠溶液消毒12min，再用无菌水冲洗5次待用。
[0058] 步骤3：初代培养
[0059] 将消毒后的外植体用灭菌纸片吸掉表面水分，转接入步骤1制备的初代培养基，置于培养箱中诱导培养20天，诱导培养条件为：光照2500Lux，光照周期为14h/d，温度23℃。
[0060] 步骤4：增殖培养
[0061] 分离初代培养基中的不定芽，切割长度为2cm以内为宜，转入步骤1制备的增殖培养基中，增殖培养26天，增殖培养条件为：光照2500Lux，光照周期为14h/d，温度25℃。
[0062] 步骤5：生根培养
[0063] 经过4周培养后，将长度大于3-4cm的南极杉新植株切割下来，转入生根培养基生根。生根培养条件为：光照2500Lux，光照周期为12h/d，温度25℃。
[0064] 步骤6：待长出根长超过2cm，取出，用清水冲洗后，移栽到生态缸中，植物全部成活，成活率达到98％。
[0065] 本方法可以由一个外植体直接诱导出新植株，通过不断的分离增殖培养供应源源不断的南极杉种苗，一棵南极杉经过30天可以诱导出10棵新的子代植株，转入水族箱后存活率大于98％。
[0066] 实施例3
[0067] 步骤1：配制初代培养基和增殖培养基、生根培养基
[0068] 1、本实施例中配制的初代、增殖、生根培养基是采用的MS培养基作为基础培养基，MS培养基配方同实施例1所示。
[0069] 2、初代培养基配制
[0070] 1L上述MS培养基中添加琼脂10g、蔗糖10g、激动素(KT)1.5mg、萘乙酸(NAA)0.5mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。
[0071] 3、增殖培养基配制
[0072] 1L上述MS培养基中添加琼脂10g、蔗糖10g、6氨基嘌呤(6BA)1.75mg、萘乙酸(NAA)1.0mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。
[0073] 4、生根培养基配制
[0074] 1L上述MS培养基中添加琼脂10g、蔗糖10g、吲哚乙酸0.3mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。
[0075] 步骤2：外植体的清洗与消毒
[0076] 从花鸟市场购买南极杉植株，带回实验室用洗涤剂简单清洗掉表面污渍和灰尘，在自来水下冲洗半小时；于超净工作台上，选用健康、无病虫害的植株作为外植体，用镊子剃掉大部分叶片后，经体积浓度为75％的酒精消毒30s，冲洗三次，然后用质量浓度为1％的次氯酸钠溶液消毒20min，再用无菌水冲洗5次待用。
[0077] 步骤3：初代培养
[0078] 将消毒后的外植体用灭菌纸片吸掉表面水分，转接入步骤1制备的初代培养基，置于培养箱中诱导培养10天，诱导培养条件为：光照2500Lux，光照周期为14h/d，温度23℃。
[0079] 步骤4：增殖培养
[0080] 分离初代培养基中的不定芽，切割长度为2cm以内为宜，转入步骤1制备的增殖培养基中，增殖培养30天，增殖培养条件为：光照2500Lux，光照周期为14h/d，温度25℃。
[0081] 步骤5：生根培养
[0082] 经过30天培养后，将长度大于3-4cm的南极杉新植株切割下来，转入生根培养基生根。生根培养条件为：光照2500Lux，光照周期为12h/d，温度25℃。
[0083] 步骤6：待长出根长超过2cm，取出，用清水冲洗后，移栽到生态缸中，植物全部成活，成活率达到95％。
[0084] 本方法可以由一个外植体直接诱导出新植株，通过不断的分离增殖培养供应源源不断的南极杉种苗，一棵南极杉经过30天可以诱导出8棵新的子代植株，转入水族箱后存活率大于95％。
[0085] 对比例
[0086] 目前南极杉的培育主要集中在观赏植物培育基地或者商店，主要方法为在透明玻璃水缸中扦插入一定长度的植株，加水淹没植物至少5厘米，给予一定光照，通过水
泵保持缸内水体的流动性，待植物长到一定长度后，通过打顶、截短的方式获得新的无形枝条，进行下一轮繁殖，经过一轮生长的时间范围在30-50天之间，植物约生长出3个新的侧芽，在扦插15天后开始生根，生根数4根左右，根长度不一，经过30天生长，根平均长度可以达到3厘米左右。将该方法培育的南极杉苗移栽到生态缸中后的成活率是90％。
[0087] 实施例1-3的试验结果详见表2。
[0088] 表2实施例1-3和对比例的试验结果
[0089]
[0090] 由表2可知，本发明的组织培养方法中所采用的各组培配方协同配合，组织繁殖周期短，繁殖率高，且通过本发明的组织培养方法无菌培养的南极杉苗，在自然水体中生根率达100％，植物成活率高达95％以上，实现了南极杉有效快速的无性繁殖。
[0091] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉
本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
