技术领域
[0001] 本
发明涉及一种
植物快速繁殖技术，尤其涉及的是一种南京椴株系高效繁育的方法。
背景技术
[0002] 南京椴(TiliamiquelianaMaxim)为椴树科，椴树属落叶乔木，我国特有树种。其树形美观，
姿态雄伟，夏日黄花满树，花芳香郁，病虫害少，对
烟尘及有害气体抗性强，是优良的园林观赏树种和蜜源植物；此外，南京椴木材材质优良，花和树皮均可入药，是一种集园林观赏、蜜源植物、用材树种和药用等多功能于一身的优良树种。南京椴产于我国江苏、浙江、安徽、江西等省份，但由于繁殖困难且生境遭到破坏，使得南京椴种群数量和个体数量己经逐渐衰减，甚至处于野生资源稀缺的状态。因此，开展南京椴繁殖技术研究迫在眉睫。
[0003] 目前，南京椴繁殖多以
种子和扦插繁殖为主，但由于南京椴种子产量低，种壳坚硬且种子深度休眠，致使种子发芽率低，且种子收集非常困难,使得种子繁殖在南京椴生产中的应用受到很大限制。此外，相关研究表明，南京椴的扦插繁殖也十分困难，插条易腐烂，扦插成活率较低，目前尚无扦插繁殖技术可以直接应用于南京椴生产上。植物组织培养技术因其具有繁育周期短，繁殖系数高，所需要的外植体材料少等优势，在植物的繁育中起着重要作用。目前，有关南京椴组培繁育的研究已有报道，但多以南京椴一到三年生实生苗茎段为材料，繁殖过程存在污染严重，繁殖效率低，组培苗后期驯化移栽过程繁琐且成活率低等问题，很难满足南京椴繁育的需求。针对南京椴繁育中所存在的诸多问题，急需开发一种南京椴株系高效繁育的方法。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服
现有技术的不足，提供了一种南京椴株系高效繁育的方法，能够有效的提高繁育效率，缩短生产周期。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：
[0006] (1)以多年生南京椴的枝条为材料，剪取带
腋芽的茎段作为外植体，经表面消毒后，接种于初代培养基中，培养5～10d，至腋芽萌发至长度0.5～1.0cm；
[0007] (2)剪取步骤(1)中的腋芽，转接于增殖培养基中，培养20～30d，至腋芽诱导出高度为1～2cm的不定芽；
[0008] (3)将步骤(2)中的不定芽分离成单个芽，然后转接于伸长培养基中，培养15～20d，至不定芽高度为3～5cm；
[0009] (4)将步骤(3)中伸长的不定芽移出组培室，在自然光照条件下炼苗5～7d；
[0010] (5)将步骤(4)中炼苗后的伸长芽用流
水冲洗后，剪成适宜大小的微切段，然后置于生根促进液中进行生根预处理；
[0011] (6)将步骤(5)中经生根促进液处理后的茎段形态学的下端，定植于喷施有MS基本培养液的营养基质中，以互不重叠为原则，在
温室大棚中进行南京椴植株的成苗培养。
[0012] 所述步骤(1)中，南京椴的带腋芽的茎段取材于野外多年生南京椴植株的当年生幼嫩枝条的未木质化茎段。
[0013] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，初代培养基为添加有0.1～1.0mg/L TDZ、0.05～0.5mg/L ZT、30g/L
蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。
[0014] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，增殖培养基为添加有0.5～2.0mg/L TDZ、0.1～1.0mg/L ZT、0.1～2.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。
[0015] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，不定芽伸长培养基为添加有0.2～1.0mg/LTDZ、0.1～0.5mg/L IBA、0.05～0.5mg/L GA3、20g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的1/2MS培养基。
[0016] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)至步骤(3)中，培养条件为
温度为24±2℃，光照强度为2500～3000lx，光照周期为13～15h光照/9～11h黑暗。
[0017] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中，适宜大小的微切段是指将驯化后的伸长芽剪切成至少带有1个腋芽或顶芽、长度为0.5～2.0cm的茎段。
[0018] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)，生根预处理为：将切段的形态学下端置于含有200～2000mg/L亚精胺、100～500mg/LIAA和250～1000mg/L VC的生根促进液中浸泡10～80s。
[0019] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(6)中，营养基质成分为营养土、蛭石、
河沙按照4:1:1的比例混合而成。
[0020] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(6)中，
温室大棚培养条件为：温度24～28℃，湿度为80～90％。
[0021] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明以野外多年生南京椴植株当年生枝条为外植体，进行组培再生，具有取材方便、材料丰富，且能保持南京椴母本株系的优良性状；
[0022] 本发明直接将伸长后的南京椴组培苗通过生根促进液处理后，直接移植于温室大棚的基质中生根成苗，简化了整个繁育环节，提高了组培苗的
质量，缩短了生产时间，节省了组培培养空间，降低了生产成本；
[0023] 本发明将南京椴伸长苗的扩大繁育过程、生根过程与驯化过程结合到一起，扩大了南京椴的繁育系数，提高了组培苗的存活率，
加速了种苗繁殖的
进程，有利于实现南京椴的工厂化育苗。
附图说明
[0024] 图1是接种于腋芽萌发培养基中的南京椴茎段图；
[0025] 图2是南京椴茎段腋芽萌发图；
[0026] 图3是南京椴腋芽增殖图；
[0027] 图4是南京椴不定芽伸长图；
[0028] 图5是用于生根繁育的南京椴组培微茎段图；
[0029] 图6是定植于营养基质中的微茎段图；
[0030] 图7是微茎段体外生根成苗图。
具体实施方式
[0031] 下面对本发明的
实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0032] 实施例1
[0033] 本实施例的南京椴株系高效繁育的方法，具体步骤如下：
[0034] (1)如图1所示，以野外多年生南京椴的当年生枝条为材料，剪取半木质化茎段作为外植体；经表面消毒后，切成1.0cm大小的带有腋芽的切段，接种于初代培养基中，在温度为25℃，光照强度为2500lx，光照周期为15h光照/9h黑暗的恒温培养室中进行腋芽的萌发诱导；培养10d后，腋芽萌发至1.0cm左右，如图2所示，腋芽萌发率为100％；其中初代培养基为添加有0.5mg/L TDZ、0.25mg/L ZT、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。
[0035] (2)剪取步骤(1)中的腋芽，转接于增殖培养基中，在温度为25℃，光照强度为2500lx，光照周期为15h光照/9h黑暗的恒温培养室中进行腋芽的增殖培养；培养30d后，腋芽诱导出高度为2cm左右的不定芽，不定芽诱导率为94.7％，平均每个外植体产生4.8个不定芽，如图3所示；其中增殖培养基为添加有1.0mg/L TDZ、0.6mg/L ZT、0.5mg/L IAA、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。
[0036] (3)将步骤(2)中获得的不定芽分离成单个芽，然后转接于伸长培养基中，在温度为25℃，光照强度为2500lx，光照周期为15h光照/9h黑暗的恒温培养室中进行不定芽的伸长培养；培养20d后，芽伸长至3～5cm并带有3～5个完整
叶片，如图4所示，其中，不定芽伸长培养基为添加有0.75mg/L TDZ、0.25mg/L IBA、0.2mg/L GA3、20g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的1/2MS培养基。
[0037] (4)将步骤(3)中伸长的芽移出组培室，在自然光照条件下炼苗7d；
[0038] (5)将步骤(4)中驯化后的伸长芽用流水冲洗后，剪切成至少带有1个腋芽或顶芽、长为0.5cm左右的微茎段，如图5所示，并将切段的形态学下端置于含有1000mg/L亚精胺、300mg/L IAA和500mg/L VC的生根促进液中浸泡30s进行生根预处理；
[0039] (6)将步骤(5)中经生根促进液处理后的茎段形态学下端，定植于喷施有MS基本培养液的混合营养基质(营养土：蛭石:河沙＝4:1:1)中，如图6所示，以互不重叠为原则，在温度为26℃，湿度为80％的温室大棚中进行南京椴植株的成苗培养；培养4周后，获得根系健壮的南京椴再生植株，且营养基质中芽的生根率高达100％，如图7所示。
[0040] 实施例2
[0041] 本实施例的南京椴株系高效繁育的方法，具体步骤如下：
[0042] (1)以野外多年生南京椴的当年生枝条为材料，剪取半木质化茎段作为外植体；经表面消毒后，切成1.0cm大小的带有腋芽的切段，接种于初代培养基中，在温度为26℃，光照强度为3000lx，光照周期为14h光照/10h黑暗的恒温培养室中进行腋芽的萌发诱导；培养8d后，腋芽萌发至1.0cm左右，腋芽萌发率为100％；其中初代培养基为添加有1.0mg/LTDZ、0.5mg/L ZT、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。
[0043] (2)剪取步骤(1)中的腋芽，转接于增殖培养基中，在温度为26℃，光照强度为3000lx，光照周期为14h光照/10h黑暗的恒温培养室中进行腋芽的增殖培养；培养25d后，腋芽诱导出高度为2cm左右的不定芽，不定芽诱导率为93.6％，平均每个外植体产生4个不定芽；其中增殖培养基为添加有2.0mg/L TDZ、1.0mg/L ZT、2.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。
[0044] (3)将步骤(2)中获得的不定芽分离成单个芽，然后转接于伸长培养基中，在温度为26℃，光照强度为3000lx，光照周期为14h光照/10h黑暗的恒温培养室中进行不定芽的伸长培养；培养18d后，芽伸长至3～5cm并带有3～5个完整叶片，其中，不定芽伸长培养基为添加有1.0mg/L TDZ、0.5mg/L IBA、0.5mg/L GA3、20g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的1/2MS培养基。
[0045] (4)将步骤(3)中伸长的芽移出组培室，在自然光照条件下炼苗7d；
[0046] (5)将步骤(4)中驯化后的伸长芽用流水冲洗后，剪切成至少带有1个腋芽或顶芽、长为2cm左右的微茎段，并将切段的形态学下端置于含有2000mg/L亚精胺、500mg/L IAA和1000mg/L VC的生根促进液中浸泡80s进行生根预处理；
[0047] (6)将步骤(5)中经生根促进液处理后的茎段形态学下端，定植于喷施有MS基本培养液的混合营养基质(营养土：蛭石:河沙＝4:1:1)中，以互不重叠为原则，在温度为28℃，湿度为90％的温室大棚中进行南京椴植株的成苗培养；培养4周后，获得根系健壮的南京椴再生植株，且营养基质中芽的生根率高达100％。
[0048] 实施例3
[0049] 本实施例的南京椴株系高效繁育的方法，具体步骤如下：
[0050] (1)以野外多年生南京椴的当年生枝条为材料，剪取半木质化茎段作为外植体；经表面消毒后，切成1.0cm大小的带有腋芽的切段，接种于初代培养基中，在温度为23℃，光照强度为2700lx，光照周期为13h光照/11h黑暗的恒温培养室中进行腋芽的萌发诱导；培养5d后，腋芽萌发至1.0cm左右，腋芽萌发率为100％；其中初代培养基为添加有0.1mg/L TDZ、0.05mg/L ZT、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。
[0051] (2)剪取步骤(1)中的腋芽，转接于增殖培养基中，在温度为23℃，光照强度为2700lx，光照周期为13h光照/11h黑暗的恒温培养室中进行腋芽的增殖培养；培养20d后，腋芽诱导出高度为2cm左右的不定芽，不定芽诱导率为92.1％，平均每个外植体产生3.8个不定芽；其中增殖培养基为添加有0.5mg/L TDZ、0.1mg/L ZT、0.1mg/L IAA、30g/L蔗糖和
7.0g/L琼脂的MS培养基。
[0052] (3)将步骤(2)中获得的不定芽分离成单个芽，然后转接于伸长培养基中，在温度为23℃，光照强度为2700lx，光照周期为13h光照/11h黑暗的恒温培养室中进行不定芽的伸长培养；培养15d后，芽伸长至3～5cm并带有3～5个完整叶片，其中，不定芽伸长培养基为添加有0.2mg/L TDZ、0.1mg/L IBA、0.2mg/L GA3、20g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的1/2MS培养基。
[0053] (4)将步骤(3)中伸长的芽移出组培室，在自然光照条件下炼苗7d；
[0054] (5)将步骤(4)中驯化后的伸长芽用流水冲洗后，剪切成至少带有1个腋芽或顶芽、长为1.0cm左右的微茎段，并将切段的形态学下端置于含有200mg/L亚精胺、100mg/L IAA和250mg/L VC的生根促进液中浸泡20s进行生根预处理；
[0055] (6)将步骤(5)中经生根促进液处理后的茎段形态学下端，定植于喷施有MS基本培养液的混合营养基质(营养土：蛭石:河沙＝4:1:1)中，以互不重叠为原则，在温度为24℃，湿度为85％的温室大棚中进行南京椴植株的成苗培养；培养4周后，获得根系健壮的南京椴再生植株，且营养基质中芽的生根率高达100％。
[0056] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
