技术领域
[0001] 本
发明涉及一种高效低耗的喜树组织培养和移栽方法，属于
植物组织培养技术领域。
背景技术
[0002] 喜树(Camptotheca acuminata Decne)为珙桐科(Nyssaceae)喜树属(Camptotheca Decne)植物，是我国特有的多年生落叶乔木植物，主要分布于长江流域及西南各省，具有生长速度快和病虫害少等特点。喜树的不同部位均含有一种次生
代谢物质喜树
碱(Camptothecin，CPT)，喜树碱是迄今为止发现的唯一专
门通过抑制拓扑异构酶I发挥细胞毒性的天然植物活性成分，是一种广谱抗癌和抗
肿瘤药物。目前，喜树碱类药物己被誉为二十一世纪首选抗癌药物，而深得植物学界和医学界青睐。医学上对喜树碱的需求量越来越大，喜树也成为了一种非常有应用前景的药用植物。
[0003] 由于喜树碱在喜树中含量低，目前如果仅仅依靠从采伐天然喜树中提取喜树碱，既破坏生态环境又满足不了需求，而通过化学合成喜树碱非常困难。此外，野生状态下喜树资源不稳定，随着市场上喜树碱需求量的不断增加，导致喜树碱的价格昂贵，供应紧张。1999年喜树就被林业部列入国家Ⅱ级重点保护野生植物，但生产上消耗喜树的量也越来越大，致使我国野生喜树资源急剧减少。因此，大规模种植和栽培喜树已势在必行。
[0004] 喜树通常是用
种子进行繁殖，但由于其种子休眠作用强，萌发率不高。喜树扦插繁殖又会到受季节的影响。组织培养技术已为药用植物和濒危物种提供了低廉和快速繁殖的方式，为了大规模栽培利用喜树资源，喜树的组织培养和快繁将是大量繁殖喜树种苗的重要途径和方法之一，它不仅可实现喜树种质资源的保存和发展，同时也有利于对其进行分子遗传学等方面的
基础研究。
[0005] 喜树是一种木本植物，其组织培养相对较为困难。喜树组培苗直接移栽至
土壤也较难成活，成活率仅在10％左右。
发明内容
[0006] 本发明建立了高效和低耗的喜树组培苗快繁方法，提高其移栽成活率及适应性，保存、发展并大规模栽培利用喜树资源，实现喜树资源的药用和其它价值，克服了喜树组培苗困难的难题。
[0007] 本发明提供了一种高效低耗的喜树组织培养和移栽方法，所述方法包括组培喜树苗步骤、炼苗移栽至蛭石步骤、移栽至育苗杯步骤、移栽至大田建立叶用园步骤；所述炼苗移栽至蛭石步骤为：移栽前，每苗加10-15mL自来
水，置于室内自然光下炼苗5-7天后，用
自来水清洗苗根部的培养基，再将其移栽至蛭石，蛭石从小钵底部吸取自来水至饱和，每3-5天从小钵底部补充自来水一次，培养21-28天。
[0008] 本发明优选为所述移栽至育苗杯步骤为：育苗杯装入1/3-1/2的田土，田土从育苗杯底部吸取自来水至饱和，将苗连蛭石移栽至育苗杯，再加田土至育苗杯满后从育苗杯底部补充自来水，每3-5天从育苗杯底部补充0.5％尿素的自来水溶液一次，培养28-35天。
[0009] 本发明优选为所述移栽至大田建立叶用园步骤为：将育苗杯中苗移栽至室外或田间炼苗5-7天，移栽时除去育苗杯，再将苗带土直接移栽至大田，移栽规格0.45-0.50m×0.45-0.50m，施用喜树专用
肥料，建立喜树叶用园。
[0010] 本发明优选为所述组培喜树苗步骤包括外植体消毒和预培养、单株无菌苗培养、丛生芽诱导和培养、诱导不定根和壮苗培养；所述诱导不定根和壮苗培养为：切取生长到2-3cm带有2-3片幼叶的无根丛生芽，接入到生根和壮苗培养基：WPM培养基+
萘乙酸0.05mg/L+吲哚丁酸0.5mg/L+
蔗糖25g/L，诱导生根和壮苗28-35天。
[0011] 本发明优选为所述丛生芽诱导和培养为：将单株无菌苗切成1.5-2.0cm的小段，每段1-2个
腋芽，保留1-2片叶子，接入到丛生芽诱导培养基：WPM培养基+6-苄
氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L，诱导28-35天。
[0012] 本发明优选为所述单株无菌苗培养为：选取成活的茎段，在超净
工作台内，切取茎段叶腋处长出的新枝，接入到继代培养基：WPM培养基+吲哚乙酸0.1mg/L+吲哚丁酸0.5mg/L+蔗糖30g/L，培养28-35天。
[0013] 本发明优选为所述外植体消毒和预培养为：选取喜树新发枝条，将其横切成2-2.5cm的小段，每段带1-2个腋芽，作为外植体进行消毒，消毒方法为：先用自来水冲洗，然后在超净工作台内，用70％的酒精浸泡，再用无菌水冲洗-0.1％升汞浸泡-无菌水冲洗，晾干，
切除0.1％升汞
接触过的切口，接入到初始培养基：MS培养基+萘乙酸0.1mg/L+蔗糖30g/L，置于光照培养室预培养21-28天。
[0014] 本发明优选为培养基用水均为自来水。
[0015] 本发明优选为人工光照均为LED光照，光照强度为1000-1500lx，每天光照12h。
[0016] 本发明有益效果为：
[0017] 目前喜树资源十分有限，通过采伐野生喜树资源提取药用成分会致使成本过高，并破坏生态环境。采取组织培养法进行喜树苗的快速繁殖，不仅有利于扩大喜树繁殖系数，可获得了大量的优质种苗，可实现规模化、规范化和产业化的种植，还可保证周年供应，也为今后
加速喜树的人工繁殖及喜树药用林培育提供了一条新途径，解决喜树资源短缺的问题。同时
无性繁殖可高效地保持母株的各种优良性状，并为喜树这一濒危物种遗传工程的研究打下材料的基础。
[0018] 在生产实践中用自来水代替蒸馏水配制培养基不仅降低了成本，且自来水比蒸馏水含有较多的离子等营养成分，更有利于喜树试管苗的生长。
LED灯作为一种新型的
光源，主要由
波长400-500的蓝光和被蓝
光激发的
荧光粉所发的黄光组合而成。而植物光合作用主要吸收400-500nm波长的蓝光和600-700nm的红光，传统的日光灯的波长在520-610nm，LED灯不仅省电，节约成本，更有利于喜树的光合作用和生长。
[0019] 本发明中主要应用的WPM培养基是根据木本植物特点，创出的一种高效固体粉末型培养基，在市场上很容易购买和方便配制。
具体实施方式
[0020] 下述非限制性
实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0021] 下述MS培养基购于青岛海博
生物技术有限公司；
[0022] 下述萘乙酸购于北京索莱宝科技有限公司；
[0023] 下述WPM培养基购于青岛海博生物技术有限公司；
[0024] 下述吲哚乙酸购于北京索莱宝科技有限公司；
[0025] 下述吲哚丁酸购于北京索莱宝科技有限公司；
[0026] 下述6-苄氨基嘌呤购于北京索莱宝科技有限公司；
[0027] 下述蛭石购于河北德沃多肥料有限公司，产品规格：1-3mm；
[0028] 下述喜树专用肥料购于河南誉中奥农业科技有限公司；
[0029] 下述培养基按所提供的
说明书配制时，以8g/L琼脂
固化；
[0030] 下述培养基用水均为自来水；
[0031] 下述培养基用1mol/L NaOH或HCl调pH至5.8；
[0032] 下述培养基每瓶20-25mL，121℃高压湿热灭菌20min；
[0033] 下述除自然光外，人工光照均为LED光照，光照强度为1000-1500lx，每天光照12h。
[0034] 实施例1
[0035] 一种高效低耗的喜树组织培养和移栽方法，所述方法包括如下步骤：
[0036] 一、高效优质组培喜树苗步骤：
[0037] 外植体消毒和预培养
[0038] 选取喜树新发枝条，将其横切成2-2.5cm的小段，每段带1-2个腋芽，作为外植体进行消毒处理；
[0039] 先在自来水下流水反复冲洗50min，流水冲洗干净后，在超净工作台上，用70％的酒精浸泡45s，接着用无菌水冲洗3次，再立即放入0.1％的升汞(HgCl2)浸泡消毒10min后倒去消毒液，期间不断摇动充分消毒，然后用无菌水冲洗3次，冲洗干净后，放在无菌
滤纸上吸水晾干，切除消毒液HgCl2接触过的切口，切时上切口平切、下切口45°斜切以扩大与培养基的接触面积，留下1.5-2cm的小茎段，下切口垂直插入接种到初始培养基MS培养基+萘乙酸(0.1mg/L)+蔗糖30g/L的固体培养基上，置于光照培养室培养，进行预培养25d；
[0040] 单株无菌苗培养
[0041] 选取上述消毒彻底干净、无污染的成活茎段，在超净工作台上，切取茎段叶腋处长出的新枝，接入继代培养基WPM培养基+吲哚乙酸(0.1mg/L)+吲哚丁酸(0.5mg/L)+蔗糖30g/L中进行继代培养，培养35d，可得到生长旺盛，状态好的有根单株
幼苗，苗高可达6-8cm，根数可达5-10条，但根均较细，茎杆纤弱，
叶片可达8-12叶，表现为节多、腋芽多，因而，此时的小苗形态更有利于增殖培养；
[0042] 丛生芽诱导和培养
[0043] 芽的诱导是获得喜树再生苗的关键，选用高浓度的细胞分裂素有利于丛生芽的诱导，快速获得大量无菌喜树芽苗；
[0044] 将上述单株苗切成1.5-2.0cm的小段，每段1-2腋芽，保留1-2片叶子，接入至丛生芽诱导培养基WPM培养基+6-苄氨基嘌呤(0.5mg/L)+蔗糖30g/L上培养，进行丛生芽的诱导，每瓶1段，此时主要是进行大量丛生芽的诱导和促进其生长，苗高均较小，最高仅达4.0cm，一般在3.0cm，不定根生长较少或没有，30d后，每苗可生长20-30个丛生芽，繁殖系数可达30-40；
[0045] 诱导不定根和壮苗培养
[0046] 不定根的形成是喜树组织培养苗过程中一个非常关键环节，它直接影响到组培苗移栽成活率的高低，关系到组织培养成败；
[0047] 切取上述生长到2-3cm带有2-3片幼叶的无根丛生单芽，转入到生根和壮苗培养基WPM培养基+萘乙酸(0.05mg/L)+吲哚丁酸(0.5mg/L)+蔗糖25g/L中进行培养，诱导生根和壮苗，每瓶1芽，1个月后即可获得发育良好和健壮的根系，丛生芽的新长出的不定根色白，生根百分率为95.0％，平均生根数为5.4条/株，最短的根诱导期为20d；
[0048] 经过35d的生根和壮苗培养，无菌苗叶多叶色绿，根部伸长到2-5cm，根粗根系发达，茎杆粗壮，茎粗可达1.5-2.0mm，株高可达4-6cm，叶片数可达7-10叶，进行炼苗移栽；
[0049] 二、炼苗移栽至蛭石步骤
[0050] 喜树的组培苗从无菌的培养基和光照培养的环境中移栽到外界环境中，需要适应
温度、湿度和自然光照的变化，为了更好的适应外界环境，提高成活率，移栽前要进行炼苗，移栽前选择生长健壮，长势旺盛，叶色浓绿的小苗，打开组培瓶盖，每瓶加10-15mL自来水，置于室内自然光下炼苗5-7d后，将芽苗取出，用自来水冲洗干净组培苗根部的培养基，再将其移栽至蛭石的小钵(7×7cm)中，一钵一苗，小钵可重复利用，移栽前将小钵灌满蛭石并放置于托盘中，并让蛭石从托盘底部里充分吸取自来水至饱和，而不直接从小钵上部浇水，移栽过程可先将蛭石钵中掏成一个3-4cm深小洞，将所有根系轻轻放置在一起，并轻轻放入洞中，再用
镊子等工具轻压覆上蛭石将根全部盖住，操作过程中一定要小心，做到一栽到位，尽量做到不要损伤每一个根，每4d从托盘中浇自来水一次，保持小钵的湿润，培养20d，成活率可达95％；
[0051] 三、移栽至育苗杯步骤
[0052] 先将育苗杯(9×9cm)装入1/3的田土，置于托盘上，并从托盘底部吸取自来水至充分饱和，移栽时可沿四边轻轻
挤压小钵，方便小钵中的蛭石连苗整体一起移走，将上述蛭石苗连蛭石一起整钵移栽入装有田土的小杯中，再加田土至杯满后，及时从托盘底部补充自来水，一杯一苗，移栽的过程中，尽可能全蛭石移栽，并尽量不要伤到根系，每4d从托盘中浇尿素的自来水溶液(0.5％)一次，保持小钵的田土湿润并促进小苗生长，育苗杯移入
温室中培育，培养1个月，成活率可达98％；
[0053] 四、移栽至大田建立叶用园步骤
[0054] 将育苗杯中的小苗移至田间，先放置7d，进行室外和田间炼苗，移栽时除掉育苗杯，将喜树苗带土直接移至大田，并按说明施用喜树专用肥料，建立喜树叶用园，移栽规格0.5m×0.5m，每亩2660株，移植后组织培养幼苗的存活率超过95％，此时单位面积上喜树的叶片产量最大，因此可获得更高产量的喜树碱，此后的栽培管理同正常的喜树管理，不需特殊管理。
