一种酥梨的种质资源保存方法
专利汇可以提供一种酥梨的种质资源保存方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种酥梨的种质资源保存方法，该方法的技术流程包括：1）酥梨外植体的取材与消毒；2）不定芽诱导培养；3）种质慢生长保存；4）种质恢复生长；5）生根培养；6）炼苗移栽。本发明通过对酥梨组培条件的有效调控，并采用两种不同的种质保存培养基交替继代，有效减缓了保存材料的生长繁殖，降低了继代次数，极大延长了保存时间；采用本发明长期保存的种质经过复壮环节可以在较短的时间内恢复活 力 ，移栽成活率高达95%以上，并且没有发生遗传变异，有效保持了酥梨种质的优良性状，为酥梨的良种繁育提供了有力的保障。，下面是一种酥梨的种质资源保存方法专利的具体信息内容。
1.一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，该方法的技术流程包括以下步骤：
1）酥梨外植体的取材与消毒
采集酥梨树当年生带芽且生长健壮无病虫的幼嫩枝条，小心摘除叶片，然后将枝条用洗衣粉水刷洗干净，切成 1-2 cm的茎段，每段含有 1个顶芽或腋芽，再将茎段用流水冲洗
20-30 min，之后在超净工作台上用70%酒精消毒1min，无菌蒸馏水冲洗 2-3次，再用0.6%的邻苯二甲醛消毒8-10min，期间需要不断地摇动使茎段充分接触溶液，无菌蒸馏水冲洗3次；
用滤纸吸干表面水分后备用；
2）不定芽诱导培养
将上述消过毒的茎段接种于不定芽诱导培养基中，置于温度23-27℃、光照强度1800-
2200lx、每天光照12-14h的条件下，培养27-35d诱导出不定芽；
3）种质慢生长保存
将诱导产生的高约1.5-2.0cm的不定芽从瓶中取出，切去基部褐化部分，转接到种质保存培养基①或种质保存培养基②上，用封口膜封闭瓶口，然后置于温度4-6℃、光照强度
700-900Lx、每天光照10-12h的培养条件下缓慢生长，每12个月继代一次，种质保存培养基①和种质保存培养基②继代时交替使用，然后继续进行慢生长保存；
4）种质恢复生长
酥梨种质保存期结束后，将步骤3）中缓慢生长的不定芽转接到复壮培养基中，置于温度23-27℃、光照强度1500-2000lx、每天光照12-14h的条件下恢复生长，培养15-25d可获得生长健壮的酥梨不定芽；
5）生根培养
将上述不定芽切成单个，转接到生根培养基中，置于温度23-27℃、光照强度2000-
2500lx、每天光照13-15h的条件下培养25-30天获得生根的组培苗；
6）炼苗移栽
当组培苗根系长至4-6条，根长3-5cm时，将组培苗移至大棚中利用自然光照进行炼苗，不打开瓶盖炼苗7d，打开瓶盖炼苗5d；将组培苗从瓶内移出，洗净附着在根部的培养基，将根部在5.5%高锰酸钾溶液中浸泡20min后，移栽入基质中，进行常规栽培管理。
2.根据权利要求1所述的一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，所述步骤1）中采集酥梨树枝条的时间为春季酥梨的盛花期。
3.根据权利要求1所述的一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，所述步骤2）中不定芽诱导培养基的配方为：1/2MS+2.0mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA+0.8mg/LZT+0.2%活性炭+ 甲基磺酸乙酯0.4g/L，pH 值为5.8 6.0。
~
4.根据权利要求1所述的一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，所述步骤3）中种质保存培养基①的配方为：KNO3 198 224mg/L，NH4NO3 815 835mg/L，KH2PO4 85 90mg/L，~ ~ ~
MgSO4·7H2O 174~180mg/L，CaCl2·2H2O 207~211mg/L，MnSO4·4H2O 20~23mg/L，ZnSO4·
7H2O 7~9mg/L，H3BO3 11~14mg/L，KI 0.6~0.7mg/L，CuSO4·5H2O 0.022~0.026mg/L，CoCl2·
6H2O 0.022 0.026mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.20 0.30mg/L，FeSO4·7H2O 27 28mg/L，Na2-EDTA ~ ~ ~
35 36mg/L，肌醇50 60mg/L，谷胱甘肽21 25mg/L，脯氨酸4 8mg/L，维生素B1 0.3 0.6mg/L，~ ~ ~ ~ ~
维生素B6 0.4 0.7mg/L，烟酸0.4 0.6mg/L，核黄素0.4 0.6mg/L，二硫基丙醇5.6 6.2mg/L，~ ~ ~ ~
氟节胺0.7 0.9mg/L，蔗糖27 32g/L，山梨醇29 33g/L， 海藻酸钠2.5 3.0mg/L，葡萄籽粉~ ~ ~ ~
2.3 2.9g/L，代森铵14 18 mg/L，卡拉胶6 7g/L，pH为5.6 6.0。
~ ~ ~ ~
5.根据权利要求1所述的一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，所述步骤3）中种质保存培养基②的配方为：KNO3 915 931mg/L，NH4NO3 815 835mg/L，KH2PO4 18 24mg/L，~ ~ ~
MgSO4·7H2O 174~180mg/L，CaCl2·2H2O 207~211mg/L，MnSO4·4H2O 20~23mg/L，ZnSO4·
7H2O 7~9mg/L，H3BO3 11~14mg/L，KI 0.6~0.7mg/L，CuSO4·5H2O 0.022~0.026mg/L，CoCl2·
6H2O 0.022~0.026mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.20~0.30mg/L，FeSO4·7H2O 53~58mg/L，Na2-EDTA
60 64mg/L，肌醇50 60mg/L，谷胱甘肽21 25mg/L，赖氨酸4 7mg/L，色氨酸3 5mg/L，维生素~ ~ ~ ~ ~
B1 0.3 0.6mg/L，维生素B6 0.4 0.7mg/L，柠檬酸1.2 1.4 mg/L，泛酸0.45 0.55mg/L，大豆~ ~ ~ ~
卵磷脂17 23 mg/L，乳酸链球菌素8.8 9.4mg/L，蔗糖27 32g/L，山梨醇29 33g/L，洋葱浸提~ ~ ~ ~
液40 46mL/L，活性炭0.4 0.6 g/L，卡拉胶6 7g/L，pH为5.6 6.0。
~ ~ ~ ~
6.根据权利要求1所述的一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，所述步骤3）中继代次数为不超过5次。
7.根据权利要求1所述的一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，所述步骤4）中复壮培养基的配方为：MS+谷胱甘肽3.3g/L+2,4-D 1.2mg/L+二苯基脲磺酸钙1.8mg/L+黄瓜汁
33mL/L+柠檬酸钛1.4g/L，pH为5.6 6.0。
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8.根据权利要求1所述的一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，所述步骤（5）中的生根培养基的配方为：1/2MS+IBA1.0mg/L+氯化胆碱0.3 mg/L，pH为5.8 6.0。
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一种酥梨的种质资源保存方法
技术领域
背景技术
发明内容
1）酥梨外植体的取材与消毒
采集酥梨树当年生带芽且生长健壮无病虫的幼嫩枝条，小心摘除叶片，然后将枝条用洗衣粉水刷洗干净，切成 1-2 cm的茎段，每段含有 1个顶芽或腋芽，再将茎段用流水冲洗
20-30 min，之后在超净工作台上用70%酒精消毒1min，无菌蒸馏水冲洗 2-3次，再用0.6%的邻苯二甲醛消毒8-10min，期间需要不断地摇动使茎段充分接触溶液，无菌蒸馏水冲洗3次；
用滤纸吸干表面水分后备用；
2）不定芽诱导培养
将上述消过毒的茎段接种于不定芽诱导培养基中，置于温度23-27℃、光照强度1800-
2200lx、每天光照12-14h的条件下，培养27-35d诱导出不定芽；
3）种质慢生长保存
将诱导产生的高约1.5-2.0cm的不定芽从瓶中取出，切去基部褐化部分，转接到种质保存培养基①或种质保存培养基②上，用封口膜封闭瓶口，然后置于温度4-6℃、光照强度
700-900Lx、每天光照10-12h的培养条件下缓慢生长，每12个月继代一次，种质保存培养基①和种质保存培养基②继代时交替使用，然后继续进行慢生长保存；
4）种质恢复生长
酥梨种质保存期结束后，将步骤3）中缓慢生长的不定芽转接到复壮培养基中，置于温度23-27℃、光照强度1500-2000lx、每天光照12-14h的条件下恢复生长，培养15-25d可获得生长健壮的酥梨不定芽；
5）生根培养
将上述不定芽切成单个，转接到生根培养基中，置于温度23-27℃、光照强度2000-
2500lx、每天光照13-15h的条件下培养25-30天获得生根的组培苗；
6）炼苗移栽
当组培苗根系长至4-6条，根长3-5cm时，将组培苗移至大棚中利用自然光照进行炼苗，不打开瓶盖炼苗7d，打开瓶盖炼苗5d；将组培苗从瓶内移出，洗净附着在根部的培养基，将根部在5.5%高锰酸钾溶液中浸泡20min后，移栽入基质中，进行常规栽培管理。
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0.30mg/L，FeSO4·7H2O 27~28mg/L，Na2-EDTA 35~36mg/L，肌醇50~60mg/L，谷胱甘肽21~
25mg/L，脯氨酸4 8mg/L，维生素B1 0.3 0.6mg/L，维生素B6 0.4 0.7mg/L，烟酸0.4 0.6mg/~ ~ ~ ~
L，核黄素0.4 0.6mg/L，二硫基丙醇5.6 6.2mg/L，氟节胺0.7 0.9mg/L，蔗糖27 32g/L，山梨~ ~ ~ ~
醇29 33g/L， 海藻酸钠2.5 3.0mg/L，葡萄籽粉2.3 2.9g/L，代森铵14 18 mg/L，卡拉胶6~ ~ ~ ~ ~
7g/L，pH为5.6 6.0。
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MnSO4·4H2O 20~23mg/L，ZnSO4·7H2O 7~9mg/L，H3BO3 11~14mg/L，KI 0.6~0.7mg/L，CuSO4·5H2O 0.022~0.026mg/L，CoCl2·6H2O 0.022~0.026mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.20~
0.30mg/L，FeSO4·7H2O 53 58mg/L，Na2-EDTA 60 64mg/L，肌醇50 60mg/L，谷胱甘肽21~ ~ ~ ~
25mg/L，赖氨酸4 7mg/L，色氨酸3 5mg/L，维生素B1 0.3 0.6mg/L，维生素B6 0.4 0.7mg/L，~ ~ ~ ~
柠檬酸1.2 1.4 mg/L，泛酸0.45 0.55mg/L，大豆卵磷脂17 23 mg/L，乳酸链球菌素8.8~ ~ ~ ~
9.4mg/L，蔗糖27 32g/L，山梨醇29 33g/L，洋葱浸提液40 46mL/L，活性炭0.4 0.6 g/L，卡~ ~ ~ ~
拉胶6 7g/L，pH为5.6 6.0。
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具体实施方式
1）酥梨外植体的取材与消毒
在春季酥梨的盛花期，采集酥梨树当年生带芽且生长健壮无病虫的幼嫩枝条，小心摘除叶片，然后将枝条用洗衣粉水刷洗干净，切成 1-2 cm的茎段，每段含有 1个顶芽或腋芽，再将茎段用流水冲洗 20-30 min，之后在超净工作台上用70%酒精消毒1min，无菌蒸馏水冲洗 2-3次，再用0.6%的邻苯二甲醛8-10min，期间需要不断地摇动使茎段充分接触溶液，无菌蒸馏水冲洗3次；用滤纸吸干表面水分后备用。
5.8），置于温度25℃、光照强度2000lx、每天光照12h的条件下，培养27-35d诱导出不定芽。
800Lx、每天光照11h的培养条件下缓慢生长，每12个月继代一次，种质保存培养基①和种质保存培养基②继代时交替使用，然后继续进行慢生长保存；继代4次，又培养5个月后统计不定芽存活率和增殖系数；
种质保存培养基①的配方为：KNO3 211mg/L，NH4NO3 825mg/L，KH2PO4 87.5mg/L，MgSO4·7H2O 177mg/L，CaCl2·2H2O 209mg/L，MnSO4·4H2O 21.5mg/L，ZnSO4·7H2O 8mg/L，H3BO3 12.5mg/L，KI 0.65mg/L，CuSO4·5H2O 0.024mg/L，CoCl2·6H2O 0.024mg/L，Na2MoO4·
2H2O 0.25mg/L，FeSO4·7H2O 27.5mg/L，Na2-EDTA 35.5mg/L，肌醇55mg/L，L-天冬酰胺
23mg/L，脯氨酸6mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.6mg/L，烟酸0.5mg/L，核黄素0.5mg/L，二硫基丙醇5.9mg/L，氟节胺0.8mg/L，蔗糖29g/L，山梨醇31g/L， 海藻酸钠2.8mg/L，葡萄籽粉2.6g/L，代森铵16mg/L，卡拉胶6.5g/L，pH为5.7；
种质保存培养基②的配方为：KNO3 923mg/L，NH4NO3 825mg/L，KH2PO4 21mg/L，MgSO4·
7H2O 177mg/L，CaCl2·2H2O 209mg/L，MnSO4·4H2O 21.5mg/L，ZnSO4·7H2O 8mg/L，H3BO3
12.5mg/L，KI 0.65mg/L，CuSO4·5H2O 0.024mg/L，CoCl2·6H2O 0.024mg/L，Na2MoO4·2H2O
0.25mg/L，FeSO4·7H2O 27.5mg/L，Na2-EDTA 35.5mg/L，肌醇55mg/L，L-天冬酰胺23mg/L，赖氨酸5.5mg/L，色氨酸4mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.6mg/L，柠檬酸1.3mg/L，泛酸
0.5mg/L，大豆卵磷脂20mg/L，乳酸链球菌素9.1mg/L，蔗糖29g/L，山梨醇31g/L，洋葱浸提液
43mL/L，活性炭0.5g/L，卡拉胶6.5g/L，pH为5.8。
2000lx。
3）中单独使用种质保存培养基①。
3）中单独使用种质保存培养基②。
3）中单独使用MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+ PP3335.0mg/L+甘露醇30g/L+活性炭3.0g/L作为种质保存培养基，该配方来源于赵胜利《桃梨离体再生体系建立及试管苗种质保存研究》。
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