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一种提高忍冬遗传转换效率的方法

阅读：1030发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种提高忍冬遗传转换效率的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高忍冬遗传转换效率的方法，包括如下步骤，S1、获得用于侵染的外植体；S2、获得含有目标基因的重组农杆菌菌液，使用该菌液侵染外植体；S3、培养侵染后的外植体，得到目标基因稳定表达的转基因植株。本发明的有益效果是：本发明的重组农杆菌介导的丁香叶忍冬遗传转化方法，该方法重复性强，不受基因型限制，侵染效率能够得到很大提高，转化效率至少为40％，可以提高丁香叶忍冬的转化率。，下面是一种提高忍冬遗传转换效率的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种提高忍冬遗传转换效率的方法，其特征在于，包括如下步骤，
S1、获得用于侵染的外植体；
S2、获得含有目标基因的重组农杆菌菌液，使用该菌液侵染外植体；
S3、培养侵染后的外植体，得到目标基因稳定表达的转基因植株。
2.根据权利要求1所述的一种提高忍冬遗传转换效率的方法，其特征在于，S1中，所述外植体获得方法如下，选择丁香叶忍冬的茎段的腋芽，洗洁精清洗后用清水冲洗至无泡沫，在超净台中先用60-70％的酒精浸1-2分钟，无菌水冲洗2-3次，用质量浓度为5-10％的次氯酸钠溶液消毒3-5分钟，用无菌水洗2-3次，放入初代启动培养基中诱导腋芽萌发，待腋芽长至3-4cm时，移植到继代培养基中增值，取继代培养3-4w的无菌苗叶片作为外植体。
3.根据权利要求1所述的一种提高忍冬遗传转换效率的方法，其特征在于，S2中，所述重组农杆菌为带有gus基因的EHA105农杆菌，转化所用载体为pCAMBIA2301。
4.根据权利要求1所述的一种提高忍冬遗传转换效率的方法，其特征在于，S2中，侵染的具体方法为，将外植体置于分化培养基中预培养2-3天，用浓度为OD600＝0.3-0.5的重组农杆菌菌液侵染外植体，侵染时间为4-20分钟。
5.根据权利要求1所述的一种提高忍冬遗传转换效率的方法，其特征在于，所述步骤S3的具体方法为将侵染后的外植体叶正面朝下转接到分化培养基上，黑暗条件下培养1-2天，叶正面朝上转接到含有15-30mg/L的卡那霉素和400-800mg/L的头袍霉素的筛选培养基中培养，培养条件为温度25±1℃、光照时间10-15h、光照强度1000-2000Lx。
6.根据权利要求2所述的一种提高忍冬遗传转换效率的方法，其特征在于，所述初代启动培养基的配方为：以MB为基本培养基，并添加6-BA 1mg/L、IAA 0.8mg/L，调节pH至5.6；
所述继代培养基的配方为：以MB为基本培养基，并添加6-BA 0.5mg/L、IAA 0.8mg/L，调节pH至5.6。
7.根据权利要求4或5中所述的一种提高忍冬遗传转换效率的方法，其特征在于，所述分化培养基的配方为：以MB为基本培养基，并添加6-BA 1mg/L、KT 2mg/L、NAA 0.1mg/L、调节pH至5.8。
8.根据权利要求5所述的一种提高忍冬遗传转换效率的方法，其特征在于，所述筛选培养基的配方为：以MB为基本培养基，并添加DCR 2.0mg/L、TDZ 0.05mg/L、NAA 20g/L，pH6.0。

说明书全文

一种提高忍冬遗传转换效率的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高忍冬遗传转换效率的方法。

背景技术

[0002] 丁香叶忍冬(学名：Lonicera oblata)是忍冬科忍冬属的植物，是中国的特有植物。分布在中国大陆的河北等地，生长于海拔1200米的地区，一般生于多石山坡上。

[0003] 忍冬主要依靠人工栽培来满足市场需求，但产量相对较少，远不能满足市场以及出口的需求，同时在人工栽培中，产量与品质参次不齐，制约了产业的高效发展，因此对如何提高忍冬遗传转换效率就显得尤为重要。

发明内容

[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种提高忍冬遗传转换效率的方法，可以显著提高丁香叶忍冬的遗传转换效率。

[0005] 本发明提供了如下的技术方案：

[0006] 一种提高忍冬遗传转换效率的方法，包括如下步骤，

[0007] S1、获得用于侵染的外植体；

[0008] S2、获得含有目标基因的重组农杆菌菌液，使用该菌液侵染外植体；

[0009] S3、培养侵染后的外植体，得到目标基因稳定表达的转基因植株。

[0010] 优选的，S1中，所述外植体获得方法如下，选择丁香叶忍冬的茎段的腋芽，洗洁精清洗后用清水冲洗至无泡沫，在超净台中先用60-70％的酒精浸1-2分钟，无菌水冲洗2-3次，用质量浓度为5-10％的次氯酸钠溶液消毒3-5分钟，用无菌水洗2-3次，放入初代启动培养基中诱导腋芽萌发，待腋芽长至3-4cm时，移植到继代培养基中增值，取继代培养3-4w的无菌苗叶片作为外植体。

[0011] 优选的，S2中，所述重组农杆菌为带有gus基因的EHA105农杆菌，转化所用载体为pCAMBIA2301。

[0012] 优选的，S2中，侵染的具体方法为，将外植体置于分化培养基中预培养2-3天，用浓度为OD600＝0.3-0.5的重组农杆菌菌液侵染外植体，侵染时间为4-20分钟。

[0013] 优选的，所述步骤S3的具体方法为将侵染后的外植体叶正面朝下转接到分化培养基上，黑暗条件下培养1-2天，叶正面朝上转接到含有15-30mg/L的卡那霉素和400-800mg/L的头袍霉素的筛选培养基中培养，培养条件为温度25±1℃、光照时间10-15h、光照强度1000-2000Lx。

[0014] 优选的，所述初代启动培养基的配方为：以MB为基本培养基，并添加6-BA 1mg/L、IAA 0.8mg/L，调节pH至5.6；

[0015] 所述继代培养基的配方为：以MB为基本培养基，并添加6-BA 0.5mg/L、IAA 0.8mg/L，调节pH至5.6。

[0016] 优选的，所述分化培养基的配方为：以MB为基本培养基，并添加6-BA 1mg/L、KT 2mg/L、NAA 0.1mg/L、调节pH至5.8。

[0017] 优选的，所述筛选培养基的配方为：以MB为基本培养基，并添加DCR 2.0mg/L、TDZ 0.05mg/L、NAA 20g/L，pH6.0

[0018] 本发明的有益效果是：本发明的重组农杆菌介导的丁香叶忍冬遗传转化方法，该方法重复性强，不受基因型限制，侵染效率能够得到很大提高，转化效率至少为40％，可以提高丁香叶忍冬的转化率。

具体实施方式

[0019] 下面结合具体实施例对本发明做具体说明。

[0020] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0021] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0022] 本发明中MB培养基的组成如下：

[0023]名称浓度(mg/L)
KNO3 1500
NH4NO3 300
CaCl·2H2O 400
(MH4)2SO4 100
KI 0.5
H3BO3 3.15
MnSO4·4H2O 10
ZnSO4·7H2O 4.25
FeSO4·7H2O 25
肌醇 100
甘氨酸 2
盐酸硫胺素 0.1
烟酸 0.5

[0024] 实施例1

[0025] 一种提高忍冬遗传转换效率的方法，包括如下步骤，

[0026] S1、选择丁香叶忍冬的茎段的腋芽，洗洁精清洗后用清水冲洗至无泡沫，在超净台中先用60％的酒精浸1分钟，无菌水冲洗2次，用质量浓度为5％的次氯酸钠溶液消毒3分钟，用无菌水洗2次，放入初代启动培养基中诱导腋芽萌发，待腋芽长至3cm时，移植到继代培养基中增值，取继代培养3w的无菌苗叶片作为外植体；

[0027] S2、侵染的具体方法为，将外植体置于分化培养基中预培养2天，用浓度为OD600＝0.3的重组农杆菌菌液侵染外植体，侵染时间为4分钟，所述重组农杆菌为带有gus基因的EHA105农杆菌，转化所用载体为pCAMBIA2301；

[0028] S3、将侵染后的外植体叶正面朝下转接到分化培养基上，黑暗条件下培养1天，叶正面朝上转接到含有15mg/L的卡那霉素和400mg/L的头袍霉素的筛选培养基中培养，培养条件为温度25℃、光照时间10h、光照强度1000Lx。

[0029] 实施例2

[0030] 一种提高忍冬遗传转换效率的方法，包括如下步骤，

[0031] S1、选择丁香叶忍冬的茎段的腋芽，洗洁精清洗后用清水冲洗至无泡沫，在超净台中先用70％的酒精浸1分钟，无菌水冲洗3次，用质量浓度为5-10％的次氯酸钠溶液消毒3分钟，用无菌水洗3次，放入初代启动培养基中诱导腋芽萌发，待腋芽长至4cm时，移植到继代培养基中增值，取继代培养3-4w的无菌苗叶片作为外植体；

[0032] S2、侵染的具体方法为，将外植体置于分化培养基中预培养3天，用浓度为OD600＝0.5的重组农杆菌菌液侵染外植体，侵染时间为10分钟，所述重组农杆菌为带有gus基因的EHA105农杆菌，转化所用载体为pCAMBIA2301；

[0033] S3、将侵染后的外植体叶正面朝下转接到分化培养基上，黑暗条件下培养2天，叶正面朝上转接到含有30mg/L的卡那霉素和600mg/L的头袍霉素的筛选培养基中培养，培养条件为温度25℃、光照时间12h、光照强度1000Lx。

[0034] 实施例3

[0035] 一种提高忍冬遗传转换效率的方法，包括如下步骤，

[0036] S1、选择丁香叶忍冬的茎段的腋芽，洗洁精清洗后用清水冲洗至无泡沫，在超净台中先用65％的酒精浸1分钟，无菌水冲洗3次，用质量浓度为10％的次氯酸钠溶液消毒5分钟，用无菌水洗3次，放入初代启动培养基中诱导腋芽萌发，待腋芽长至4cm时，移植到继代培养基中增值，取继代培养3-4w的无菌苗叶片作为外植体；

[0037] S2、侵染的具体方法为，将外植体置于分化培养基中预培养3天，用浓度为OD600＝0.5的重组农杆菌菌液侵染外植体，侵染时间为15分钟，所述重组农杆菌为带有gus基因的EHA105农杆菌，转化所用载体为pCAMBIA2301；

[0038] S3、将侵染后的外植体叶正面朝下转接到分化培养基上，黑暗条件下培养2天，叶正面朝上转接到含有20mg/L的卡那霉素和800mg/L的头袍霉素的筛选培养基中培养，培养条件为温度25℃、光照时间10h、光照强度1500Lx。

[0039] 实施例4

[0040] 一种提高忍冬遗传转换效率的方法，包括如下步骤，

[0041] S1、选择丁香叶忍冬的茎段的腋芽，洗洁精清洗后用清水冲洗至无泡沫，在超净台中先用60-70％的酒精浸1-2分钟，无菌水冲洗2-3次，用质量浓度为5-10％的次氯酸钠溶液消毒3-5分钟，用无菌水洗2-3次，放入初代启动培养基中诱导腋芽萌发，待腋芽长至3-4cm时，移植到继代培养基中增值，取继代培养3-4w的无菌苗叶片作为外植体；

[0042] S2、侵染的具体方法为，将外植体置于分化培养基中预培养2-3天，用浓度为OD600＝0.3-0.5的重组农杆菌菌液侵染外植体，侵染时间为4-20分钟，所述重组农杆菌为带有gus基因的EHA105农杆菌，转化所用载体为pCAMBIA2301；

[0043] S3、将侵染后的外植体叶正面朝下转接到分化培养基上，黑暗条件下培养1-2天，叶正面朝上转接到含有15-30mg/L的卡那霉素和400-800mg/L的头袍霉素的筛选培养基中培养，培养条件为温度25±1℃、光照时间10-15h、光照强度1000-2000Lx。

[0044] 转基因植株的检测

[0045] 分别采用引物对GUS-F：CATGGAGTCAAAGATTCAAAT和GUS-R：CCCGATCTAGTAACATAGATG对实施例1-4中经过筛选培养基筛选配合后的植株(实施例1-4中各选10株)中的目的DNA进行PCR鉴定。结果如表1所示，

[0046] 表1

[0047] 检测出目的基因的植株实施例1 4
实施例2 4
实施例3 5
实施例4 6

[0048] 从表1中可知，实施例1-4中均检测出含有目的基因的植株，平均可达40％以上，效果最好的是实施例4，转基因植株的成功率高达60％。

[0049] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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