在胚乳的胚乳基部传递层中有效的植物启动子及其应用
阅读：1165发布：2021-01-12
专利汇可以提供在胚乳的胚乳基部传递层中有效的植物启动子及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了分离的启动子或其活性 片段 或衍 生物 ，所述启动子或其活性片段或衍生物能够赋予与其有效连接的基因在发育中的 植物 种子 的胚乳中和优选地在胚乳的胚乳基部传递层(BETL)中进行选择性表达。本发明也提供包含该启动子、活性片段和衍生物的表达载体和构建体和转基因植物细胞、植物部分和整个植物，以及利用该启动子、活性片段和衍生物调节一个或多个植物表型的方法。，下面是在胚乳的胚乳基部传递层中有效的植物启动子及其应用专利的具体信息内容。
1.分离的启动子或其活性片段或衍生物，所述启动子或其活性片段或衍生物能够赋予与其有效连接的基因在发育中的植物种子的胚乳中选择性表达，其中所述启动子在其天然环境中赋予基因组基因胚乳选择性表达或胚乳优先表达，所述基因组基因包括选自以下的序列：
(i)SEQ ID NO：1中所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：1所编码的多肽至少约50％相同的多肽的编码序列，其中所述多肽在发育中的种子的胚乳中选择性表达；
(iii)与(i)或(ii)中的序列或其互补序列在至少中等严紧条件下杂交的序列，其中所述杂交序列在发育中的种子的胚乳中选择性表达；以及
(iv)通过使用BLASTN算法进行同源搜索、例如采用核苷酸错配罚分(-q)至少为-1所确定的，与(i)或(ii)中的序列具有同源性的序列，其中所述同源序列在发育中的种子的胚乳中选择性表达。
2.根据权利要求1的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中启动子、活性片段或衍生物能够赋予与其有效连接的基因在植物种子的胚乳基部传递层(BETL)中选择性表达或优先表达。
3.根据权利要求1或2的分离的启动子、活性片段或衍生物，其来自单子叶植物。
4.根据权利要求3的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中单子叶植物选自小麦、玉米、稻、大麦、高粱、甘蔗、薏苡、芒草、柳枝稷和短柄草以及它们的组合。
5.根据权利要求1或2的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中启动子、活性片段或衍生物能够在授粉后约5天至至少授粉后约25天的期间，赋予与其有效连接的基因胚乳选择性表达或胚乳优先表达。
6.根据权利要求1或2的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、活性片段或衍生物不赋予在营养组织或器官中可检测的表达。
7.根据权利要求1或2的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、活性片段或衍生物不赋予在生殖组织或器官中可检测的表达。
8.根据权利要求1或2的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、活性片段或衍生物不赋予在花组织或器官中可检测的表达。
9.权利要求1或2的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、活性片段或衍生物不赋予在胚中可检测的表达。
10.权利要求1或2的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、活性片段或衍生物不赋予在成熟种子的胚乳中可检测的表达。
11.根据权利要求1或2的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、活性片段或衍生物赋予、诱导或激活与其有效连接的基因胚乳特异性表达。
12.根据权利要求1或2的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子包含表
1和/或表3和/或表4中所示的一个或多个核苷酸序列。
13.根据权利要求12的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子包含下组中每一个元件的多数个：ARR1AT元件、BIHD1OS元件、BOXIINTPATPB元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件、DPBFCOREDCDC3元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件、GT1GMSCAM4元件、IBOXCORE元件、INRNTPSADB元 件、MYBCORE元 件、MYBPLANT元 件、MYBPZM 元 件、MYBST1 元 件、MYCATERD1元 件、MYCCONSENSUSAT元件、NODCON1GM元件、OSE1ROOTNODULE元件、POLASIG1元件、POLASIG3元件、POLLEN1LELAT52元件、RAV1AAT元件、ROOTMOTIFTAPOX1元件、SEBFCONSSTPR10A元件、SEF4MOTIFGM7S元件、SORLIP1AT元件、TAAAGSTKST1元件、TATABOX4元件、WBOXATNPR1元件、WBOXNTERF3元件和WRKY71OS元件。
14.根据权利要求13的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中每一个元件在其来源的对应基因组基因中出现至少2或3或4或5次。
15.根据权利要求13的分离的启动子、活性片段或衍生物，所述启动子、活性片段或衍生物包含4次以上的每一个以下元件：ARR1AT元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件、MYCCONSENSUSAT元件、POLLEN1LELAT52元件、RAV1AAT元件、ROOTMOTIFTAPOX1元件和WRKY71OS元件。
16.根据权利要求13的分离的启动子、活性片段或衍生物，所述启动子、活性片段或衍生物包含5次以上的每一个以下元件：ARR1AT元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件、MYCCONSENSUSAT元件、ROOTMOTIFTAPOX1元件和WRKY71OS元件。
17.根据权利要求1或2的分离的启动子、活性片段或衍生物，所述启动子、活性片段或衍生物包含选自以下的核苷酸序列：
(i)选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NOs：8-10的序列；
(ii)与(i)中序列互补的序列；
(iii)与(i)或(ii)的序列具有至少70％的序列相同性的序列；以及
(iv)使用一个或多个扩增引物从基因组DNA中可扩增出的序列，其中每个所述引物包含长约至少12个连续核苷酸、来源于SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：8和/或SEQ ID NO：
9和/或SEQ ID NO：10，或SEQID NOs：2或8-10之任一的互补序列的序列。
18.根据权利要求1或2的分离的启动子、活性片段或衍生物，其包含选自以下的核苷酸序列：
(i)选自SEQ ID NO：s 2或8-10的序列；以及
(ii)与(i)中序列互补的序列；
19.包含有效连接到转基因的根据权利要求1或2的分离的启动子或其活性片段或衍生物的表达构建体。
20.包含根据权利要求1或2的分离的启动子或其活性片段或衍生物的表达载体。
21.权利要求20的表达载体，进一步包含转基因，其中启动子有效连接到所述转基因。
22.权利要求19的表达构建体或权利要求20的表达载体，其中转基因包括编码多肽、siRNA、RNAi、反义RNA或micro RNA的序列。
23.权利要求19的表达构建体或权利要求20的表达载体用于植物的生物射弹转化。
24.权利要求19的表达构建体或权利要求20的表达载体用于植物的农杆菌介导的转化。
25.用于产生表达构建体的方法，所述方法包括将根据权利要求1或2的分离的启动子或其活性片段或衍生物连接到转基因，以使启动子能够赋予所述转基因在细胞中表达。
26.用于产生表达载体的方法，所述方法包括将根据权利要求1或2的分离的启动子或其活性片段或衍生物连接到空载体，从而产生表达载体。
27.用于产生表达载体的方法，所述方法包括将根据权利要求19的表达构建体连接到空载体，从而产生表达载体。
28.权利要求1或2的分离的启动子或其活性片段或衍生物在产生表达构建体或表达载体中的应用。
29.包含根据权利要求1或2的分离的启动子或其活性片段或衍生物的转基因植物部分或植物。
30.根据权利要求29的转基因植物部分或植物，其中启动子、活性片段或衍生物有效连接到所述植物细胞或植物部分或植物的内源核酸。
31.根据权利要求29的转基因植物部分或植物，其中启动子、活性片段或衍生物有效连接到转基因。
32.包含根据权利要求19的表达构建体或权利要求20的表达载体的转基因植物部分或植物。
33.根据权利要求32的转基因植物部分或植物，其中表达构建体整合进植物细胞、植物部分或植物的核酸中。
34.根据权利要求32的转基因植物部分或植物，其中表达构建体或表达载体以附加体形式存在或存在于染色体外。
35.用于产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求1或2的分离的启动子或其活性片段或衍生物、或权利要求19的表达构建体或权利要求20的表达载体导入到植物细胞中。
36.权利要求35的方法，还包括提供或获得根据权利要求1或2的分离的启动子或其活性片段或衍生物、或权利要求19的表达构建体或权利要求20的表达载体。
37.用于产生转基因植物或小植物的方法，所述方法包括：
(i)执行权利要求35的方法，从而产生转基因植物细胞；以及
(ii)从(i)产生的转基因植物细胞再生转基因植物或小植物，从而产生转基因植物或小植物或植物部分。
38.权利要求37的方法，还包括使转基因植物在足以产生种子的条件和一段时间中生长。
39.权利要求38的方法，还包括获得包含导入的启动子、活性片段或衍生物的种子。
40.权利要求39的方法，还包括自转基因植物或小植物获得包含导入的启动子、活性片段或衍生物的植物部分。
41.权利要求37的方法，还包括提供所述植物和/或其后代植物、和/或其种子、和/或其繁殖材料、和/或其生殖材料、和/或其种质，其中所述植物、后代植物、种子、繁殖材料、生殖材料或种质包含导入到转基因植物细胞中的启动子、或其活性片段或衍生物。
42.根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物在产生转基因植物部分和/或转基因植物中的应用。
43.用于从植物产生转基因种子的方法，所述方法包括提供、产生或获得根据权利要求
29的转基因植物，并在足以产生种子的条件和一段时间中生长或维持该转基因植物。
44.根据权利要求43的方法，还包括获得种子，所述种子包含根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物、或根据权利要求19的表达构建体或根据权利要求20的表达载体。
45.用于培育转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)通过执行根据权利要求37的方法产生转基因植物，或获得根据权利要求29的转基因植物；以及
(ii)培育在(i)中产生的转基因植物，从而产生合子，所述合子包含根据权利要求1或
2的启动子或其活性片段或衍生物、或权利要求19的表达构建体或权利要求20的表达载体。
46.根据权利要求45的方法，还包括使合子生长形成转基因胚和/或转基因小植物和/或转基因植物。
47.根据权利要求45的方法，其中获得转基因植物包括获得种子，所述种子包含根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物、或权利要求19的表达构建体或权利要求
20的表达载体，并种植所述种子从而获得转基因植物。
48.用于培育转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)通过执行根据权利要求37的方法产生转基因植物或小植物或植物部分，或获得根据权利要求29的转基因植物；以及
(ii)在足以使植物进行无性繁殖的条件和一段时间中维持转基因植物。
49.用于在发育中的胚乳或其细胞或组织(例如，胚乳基部或BETL细胞)中表达核酸的方法，所述方法包括：
(i)提供、获得或产生包含有效连接到核酸的根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物的转基因植物、转基因植物细胞或转基因的植物部分；以及
(ii)在足以使所述核酸表达的条件和一段时间中维持所述转基因植物或后代。
50.根据权利要求49的方法，其中核酸在发育中的胚乳的胚乳基部传递层(BETL)中表达。
51.根据权利要求49或50的方法，其中核酸是植物、植物细胞或植物组织的内源核酸。
52.根据权利要求49或50的方法，其中核酸是转基因。
53.根据权利要求49或50的方法，所述方法包括提供、获得或产生包含根据权利要求
19的表达构建体或根据权利要求20的表达载体的转基因植物、转基因植物细胞或转基因植物部分。
54.权利要求52的方法，还包括确定转基因在发育中的胚乳或其细胞或组织(例如，胚乳基部或BETL细胞)中的表达。
55.根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物、或权利要求19的表达构建体或权利要求20的表达载体用于在植物细胞、或植物部分或植物中表达核酸的用途。
56.根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物、或权利要求19的表达构建体或权利要求20的表达载体用于在调节与其有效连接的转基因在发育中的胚乳中的表达的用途。
57.根据权利要求56的用途，其中调节转基因在发育中的胚乳的胚乳基部传递层(BETL)中的表达。
58.用于在植物部分或植物中调节或赋予表型或性状的方法，所述方法包括：
(i)提供、获得或产生包含有效连接到核酸的根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物的转基因植物、植物细胞或植物部分，其中核酸的表达在植物细胞和/或植物部分和/或植物中调节或赋予表型；以及
(ii)在足以表达所述核酸的条件和一段时间下维持(i)中的转基因植物、植物细胞或植物部分。
59.根据权利要求58的方法，其中启动子、活性片段或衍生物有效连接到转基因。
60.根据权利要求59的方法，所述方法包括提供、获得或产生包含权利要求19的表达构建体或权利要求20的表达载体的转基因植物或植物部分。
61.根据权利要求58的方法，所述方法用于改进植物的生产力。
62.根据权利要求58的方法，所述方法用于赋予植物抗病性。
63.根据权利要求58的方法，所述方法用于赋予植物或植物部分以营养品质。
64.根据权利要求58的方法，其中表型或性状产生工业、制药、兽医或农业产品或增强所述产品的产出。
65.根据权利要求64的方法，所述方法用于生产淀粉、酿造或发酵的饮料或食品、面粉、含面粉的产品、淀粉、脂肪酸、食用油、纸、纺织品、乙醇、或工业聚合物，或增强其产出。
66.根据权利要求58的方法，所述方法用于调节植物的形态。
67.根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物用于在植物、植物细胞或植物部分中调节或赋予表型或性状的用途。
68.根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物用于赋予植物抗病性的用途。
69.根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物用于赋予植物或植物部分营养品质的用途。
70.根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物在赋予植物或植物部分以制药特性中的应用。
71.根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物用于生产工业、制药、兽医或农业产品的用途。
72.根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物在生产淀粉、酿造或发酵的饮料或食品、面粉、含面粉的产品、淀粉、脂肪酸、食用油、纸、纺织品、乙醇、或工业聚合物中的用途。
73.根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物在调节植物形态中的用途。
74.根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物在调节溶质从植物的质外体向胚乳的运输中的用途。
75.根据权利要求74的用途，其中调节的溶质运输增强按胚乳和/或胚的大小和干重测定的种子产量。
76.根据权利要求74的用途，其中调节的溶质运输增强籽粒灌浆率和/或胚乳中贮藏蛋白的积累。
77.根据权利要求1或2的启动子或其活性片段或衍生物在改变种子中胚乳与胚间干重的比率中的用途。
78.根据权利要求77的用途，其中种子中胚乳干重与胚干重间的比率被增加。
79.根据权利要求77的用途，其中种子中胚乳干重与胚干重间的比率被降低。
80.根据权利要求1至79之任一的产品、方法或用途，其中任何一个或多个所述权利要求中所述产品、方法或用途的所要求保护的特征在原则上适用于任何其它权利要求中任何产品、方法或用途的一个或多个所要求保护的特征。
在胚乳的胚乳基部传递层中有效的植物启动子及其应用
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求美国专利申请号61/177,898(2009年5月13日递交)和美国专利申请号61/251,635(2009年10月14日递交)的优先权，这两个专利申请的内容均全文并入本文作为参考。发明领域
[0003] 本发明涉及组合物，该组合物包含植物有效的启动子序列及其衍生的调控序列，并涉及使用该组合物赋予基因表达，特别是在发育中的胚乳细胞，例如在胚乳的胚乳基部传递层(basal endosperm transfer layer)细胞中的表达。
背景技术
[0004] 相关技术领域的描述
[0005] 迄今，因各种原因对植物进行了遗传修饰，包括例如通过表达抗真菌或抗细菌蛋白质来赋予抗害性，或例如通过调节果实成熟来改善农艺性状，或在杂种植物中诱导不育，或用于大规模生产工业、制药业、兽医和农业用途的蛋白质。在这方面，生物技术研究的发展已经产生了与大量核酸相关的信息爆炸，这些核酸经鉴定，在合适地表达时，可以用于产生改良的植物，例如抗收获前萌芽的植物、具有改善的营养质量的植物、具有药学特性的植物、生殖发育受到控制的植物、具有改变的形状或大小特征的植物、收获后能够快速再生的植物、或具有对病原体改良的抗性的植物，等等。
[0006] 然而，与农业上重要的植物(例如作物)的遗传改良相关的一个问题是操纵基因的表达以产生表现新特性的植物。在这方面，通常所希望的是，待在植物中表达的核酸优先地，选择性地，或特异地，在植物的一个或多个特定细胞类型、组织或器官中、或在特定的环境或发育条件下表达，而不是组成型表达。
[0007] 此外，由于可获得更多具有所需农艺或药学价值的基因，对于向植物转化多个基因的需求将会呈指数增加。这多个外源基因典型地必须受各自的调控序列控制，以提供合适的表达水平和模式，对于每个结构基因或其它待表达的转基因，这些表达水平和模式可能不一样。例如，某些基因可能需要被组成型表达，而其它基因则需要在转基因生物体的某些发育阶段或位置表达。因此，需要具有不同效应的多种调控序列。
[0008] 整个说明书和权利要求书中所使用的“优先地”(preferentially)是指，启动子赋予与其有效连接的核酸在植物的一个或多个特定细胞类型、组织或器官中或在特定的环境或发育条件下比在一个或多个其它细胞、组织或器官中或在其它条件下以更大的程度或更高的水平表达。然而，术语“优先地”并不将核酸的表达局限于植物的该一个或多个特定细胞类型、组织或器官中或在该特定环境或发育条件下。而是，仅需要表达水平增加到较高水平，优选显著增加。例如，优先表达可以包括基因在BETL中的表达是在非BETL层的胚乳细胞中或在穗丝组织、叶或根中检测到的表达的至少约1.5倍。在另一个例子中，优先表达可以包括基因在BETL中的表达是在非BETL层的胚乳细胞中或在穗丝组织、叶或根中检测到的表达的至少约2倍。在另一个例子中，优先表达可以包括基因在BETL中的表达是在非BETL层的胚乳细胞中或在穗丝组织、叶或根中检测到的表达的至少约3倍。在另一个例子中，优先表达可以包括基因在BETL中的表达是在非BETL层的胚乳细胞中或在穗丝组织、叶或根中检测到的表达的至少约4倍。在另一个例子中，优先表达可以包括基因在BETL中的表达是在非BETL层的胚乳细胞中或在穗丝组织、叶或根中检测到的表达的至少约5倍。在另一个例子中，优先表达可以包括基因在BETL中的表达是在非BETL层的胚乳细胞中或在穗丝组织、叶或根中检测到的表达的至少约10倍。
[0009] “选择性地”是指，启动子赋予与其有效连接的核酸在植物的一个或多个特定细胞类型、组织或器官中或在特定的环境或发育条件下表达。
[0010] “特异地”是指专一地。
[0011] 如在整个说明书和其后的权利要求书中所使用，除非在上下文中另有要求，词“赋予”(“confer”)及其变体(例如“conferring”)应理解为是指，启动子或其活性片段或衍生物能够，例如在其它因子(例如DNA构象、和/或顺式作用DNA序列、和/或反式作用因子、和/或信号途径、和/或转录本的结构、和/或转录本的加工)的背景中，造成与启动子或活性片段或衍生物有效连接的核酸对一个或多个发育的和/或环境的和/或激素的和/或其它的刺激作出响应的表达或表达模式(对于在启动子的天然情况下与启动子有效连接的核酸，所述刺激正常地引发该表达或表达模式)。
[0012] 如在整个说明书和其后的权利要求书中所使用，术语“启动子”应从最广泛的含义上来理解，它包括经典的基因组基因的转录调控序列，包括基础启动子调控区(包含转录起始所需的TATA盒以及带有或不带有CCAAT盒序列)、以及可选的额外调控元件(例如，上游激活序列、增强子和沉默子)，这些额外调控元件响应于发育的和/或激素的和/或环境的刺激、或以组织特异性或细胞类型特异性方式改变基因表达。启动子通常但不一定，位于被其赋予表达的结构基因的上游或5’。此外，包含启动子的调控元件通常位于植物基因转录起始位点的2kb以内。
[0013] 如在整个说明书和其后的权利要求书中所使用，除非在上下文中另有要求，词“包括”(comprise)，或变体，例如“comprises”或“comprising”应理解为意指涵盖了所述及的步骤或元素或整体、或步骤或元素或整体的组，而不排除任何其它步骤或元素或整体、或元素或整体的组。
[0014] 如在整个说明书和其后的权利要求书中所使用，与启动子一起使用的术语“活性片段”应理解为是指启动子的片段或区域或部分，该片段或区域或部分保留了其所来源的启动子起始转录的能力。这样的活性片段不一定以和其所来源的启动子相同的方式赋予与其有效连接的核酸表达或表达模式。例如，启动子的活性片段，与其所来源的启动子相比，可以诱导核酸表达水平至更高或更低的程度。备选地或此外，相对于其所来源的启动子赋予表达发生的细胞、组织或器官，启动子的活性片段可以赋予在不同的细胞、组织或器官中、或在更少的组织中、或在额外的细胞、组织或器官中的表达。用于鉴定这样的活性片段的方法对技术人员而言将是显而易见的，并/或描述于本文中。
[0015] 如在整个说明书和其后的权利要求书中所使用，与启动子一起使用的术语“衍生物”应理解为是指由本文中任何示例性描述的启动子衍生的启动子，例如，包含一个或多个额外调控元件的启动子，以例如增加或降低或以其它方式控制与其有效连接的核酸的表达。本发明也涵盖包含连接到其它启动子的根据本文中任何实施方案所描述的启动子的衍生物，例如双向启动子。在这方面，其它启动子也可以是根据本文中任何实施方案所描述的启动子。术语“衍生物”也涵盖相对于根据本文中任何实施方案所描述的启动子，在其序列上包含变异的启动子。例如，这样的衍生物的序列可包括一个或多个以下变异：缺失、插入、单点或多点突变或在特定的限制性酶切位点上的改变，条件是衍生启动子保留了其起始和/或抑制与其相连接的核酸的转录的能力。
[0016] 如在整个说明书和其后的权利要求书中所使用，术语“表达”(“expression”)或类似的术语(例如“express”)应理解为至少是指核酸转录产生RNA，和备选地包括该转录以及其后转录的RNA翻译产生肽、多肽或蛋白质。该定义不应被限定于任何特定的细胞环境，并包括例如使用体外表达系统获得的或在分离的细胞、组织或器官中的表达。
[0017] 类似地，“表达的模式”是指，如上文所定义的表达的时间选择(timing)、水平、细胞位置、亚细胞位置、组织选择性或器官选择性中的一个或多个，包括在一种细胞、组织或器官中与其它细胞、组织或器官相比较的相对表达，以及包括表达的相对水平或相对时间选择，例如在不同的发育阶段或响应于不同的环境或激素刺激。
[0018] 如在整个说明书和其后的权利要求书中所使用，术语“有效”应被理解为指，所述及的整体在特定的环境中(但不必只在该述及的环境中)起作用的能力。
[0019] 如在整个说明书和其后的权利要求书中所使用，术语“有效连接”和“有效连接于”是指，将本发明的启动子或其活性片段或衍生物置于在空间上和其它核酸(例如，转基因包括结构基因、开发阅读框和报告基因，或编码核酶、小核酶、RNAi分子或其它RNA的核酸)相关的位置上，从而通过启动子、活性片段或衍生物赋予所述其它核酸表达。由此，启动子、活性片段或衍生物与其它核酸的相对放置位置产生了可以赋予该其它核酸功能性表达模式的结构。启动子通常位于其控制表达的核酸的5’(上游)。为了构建异源的启动子/核酸组合(例如，启动子/转基因、和/或启动子/选择标记基因组合)，通常优选将启动子置于距离基因转录起始位点一定距离的位置，该距离大约和启动子与其天然控制的核酸(即启动子所源自的基因)间的距离相同。如本领域公知，可以容许在该距离上的一些变动而不失去启动子的功能。
[0020] 如在整个说明书和其后的权利要求书中所使用，本文中的术语“天然环境”应理解为是指在植物的基因组中启动子天然存在于的基因组基因，即，启动子所分离自的基因组基因。可以鉴定启动子天然所位于的基因组基因和/或使用序列分析软件对其进行序列比较，所述软件可以从例如美国政府国家卫生研究院的国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(NCBI)(贝塞斯达，MD，20894，美国)获取。
[0021] 在被子植物中，种子胚乳构成胚的营养组织。例如，谷物的胚乳起源于一系列游离核分裂，接着进行细胞化以及随后形成一系列的功能性细胞域。该组织(特别是在谷物中)在其结构和发育上复杂。通过生长的胚乳吸取同化物是种子发育中的关键过程。胚乳的中心区由大的液泡细胞组成，该液泡细胞储存淀粉和非常丰富的贮藏蛋白。
[0022] 胚乳的胚乳基部传递层(BETL)包含高度特化的传递细胞，该传递细胞促进从母体花梗组织吸收溶质，并将溶质运输到发育中的胚乳和胚中。在母体和胚性组织之间没有共质体连接，韧皮部卸载将营养物质释放到质外体空间。基部传递细胞促进胚乳从质外体吸收营养，所述基部传递细胞拥有大量的细胞壁内突从而增加膜的表面积和运输能力(Pate等，Ann.Rev.Plant Physiol.23(1972)，173-196)。在玉米中，胚乳基部传递细胞层的缺乏与降低的谷粒灌浆率以及最终的种子败育相关(Brink和Cooper，Genetics 32，(1947)，350-368；Charlton等，Development 121(1995)，3089-3097)。
[0023] BETL基因可以在胚乳中，于最大籽粒灌浆和贮藏蛋白积累期(例如在小麦中于授粉后约8至20天(DAP)之间)表达。迄今，只有有限数量的BETL表达基因被鉴定出来，它们包括富半胱氨酸蛋白质(包含伸展蛋白样基序，例如SPPPP)、在氨基酸序列水平上与植物防卫素相关的蛋白质、和在氨基酸序列水平上与Bowman-Birk蛋白酶/α-淀粉酶抑制剂相关的蛋白质的编码基因。
[0024] 在胚乳中表达重组核酸的能力，对于生产异源蛋白质，例如用于制药或工业目的，是期望的。例如，胚乳已进化为允许在小的体积和稳定的环境中积累大量的贮藏蛋白。此外，胚乳的小体积允许重组蛋白质在小的生物量中达到相对高的浓度，这有利于提取和下游加工。而且，由于已知干扰下游加工步骤的化合物(例如，存在于烟叶中的酚类物质和生物碱类物质，以及存在于苜蓿中的草酸)的低水平，也可以简化该下游加工。此外，因为种子通常适于人和动物食用，在发育中的种子中积累蛋白质，是用于生产人或动物口服重组蛋白(例如用于生产具有药学性质的食品，例如口服疫苗，或用于生产具有改善的营养质量的食品)的有吸引力的方法。
[0025] 蛋白质在植物种子中的积累也特别有用，这是因为种子的收获已经是以作物为基础的农业的主要特征，可以利用现有技术相对容易地实施。相对于在整个植物中的组成型表达，蛋白质在胚乳中的选择性表达降低了干扰植物营养生长的风险。此外，这种有限的表达限制了与非靶生物体(例如生物圈中的微生物以及食叶的食植动物)的接触(Stoger等，Current Opinion in Biotechnology，16：167-173，2005)。当前正需要能够赋予在胚乳中选择性或特异性地表达的调控序列，这是因为例如，大多数迄今为止分离的序列，就它们更广泛地赋予在营养组织或花组织或生殖器官、成熟种子或胚性组织中的表达而言，是渗漏的或非选择性的，和/或因为它们不可用于不同的物种中，或在不同物种间赋予不同的表达模式。
[0026] 在本领域中仅已知少数胚乳启动子，这些启动子主要来源于几个丰富表达的贮藏蛋白基因。此外，本领域已知的分离的启动子中大多数赋予冠细胞(crown cell)的表达而不是基部胚乳传递细胞的表达，几乎没有可以赋予胚乳基部传递细胞特异性表达模式的启动子的例子。因为在植物中难以自相同的启动子表达多个基因，可利用的启动子的数量少使得难以通过基因堆积(即，表达多个转基因)改变或改善植物种子产量或其它种子品质。例如，在顺式作用元件之间对调控性DNA结合蛋白的竞争会降低启动子的效率，从而使得，与在使用不同的启动子时相比，在相同细胞中于相同启动子的控制下的多个基因的表达可能降低。
[0027] 从前述内容中，对本领域技术人员而言将显而易见的是，种子产量和/或种子质量的遗产操作对农业是有益的并且是可实现的，例如通过在包括冠细胞和/或BETL细胞的胚乳中表达基因而实现。改良的植物种子可以带来很多顺带的益处，使得可以生产人或兽用的药物，和/或改善或改变从植物生产的食物的营养质量。据此，对于提供这些益处，赋予在发育中的胚乳(包括冠细胞和/或BETL细胞)中表达的启动子是明显期望的。
[0028] 常规的分子生物学技术、重组DNA技术描述于，例如以下教科书中：
[0029] 1.Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第二版(1989)，整个卷I，II和III；
[0030] 2.DNA Cloning：A Practical Approach， 卷 I 和 II(D.N.Glover，1985)，IRL Press，Oxford，全文；
[0031] 3.Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(M.J.Gait，ed.，1984)IRL Press，Oxford，全文，尤其涉及其中的部分文章：Gait，第1-22页；Atkinson等，第35-81页；Sproat等，第83-115页；和Wu等，第135-151页；
[0032] 4.Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach(B.D.Hames 和S.J.Higgins，eds.，1985)IRL Press，Oxford，全文；
[0033] 5.Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；发明概要
[0034] 在本发明的前期工作中，本发明人致力于通过利用微阵列技术并随后分离赋予在发育中的胚乳细胞中表达的启动子序列，提供在种子胚乳的一个或多个组织中有效的分离的启动子。如本文举例说明，本发明人鉴定出了在发育中的胚乳(包括基部胚乳传递层BETL)中以发育选择性方式表达的小麦转录本，并分离出了在种子发育过程中在其天然环境中调控该转录本表达的小麦启动子。
[0035] 本发明人也证实了，本发明的示例性小麦启动子赋予与其有效连接的报告基因在转基因小麦和玉米的发育中的胚乳中(例如，授粉后5-10天(DAP)到至少约25DAP的期间)选择性表达。在小麦和玉米中，本发明的启动子都赋予在转基因植物的BETL细胞中的表达。在玉米植物中，启动子赋予在BETL细胞中高水平表达，说明例如与本发明的启动子有效连接的报告基因的表达对胚乳基部(basal endosperm)是选择性的，例如，对BETL细胞是选择性的。
[0036] 如本文所举例说明，在玉米的基因组中鉴定出了小麦启动子的变体。为了鉴定该玉米启动子，本发明人在水稻、大麦和玉米中鉴定出了与通过微阵列技术鉴定出的小麦转录本具有超过85％序列同一性的基因，然后进行染色体步行查明相关的玉米启动子序列。通过使用基于所鉴定的启动子序列的PCR引物，对玉米基因组DNA中编码区域上游的核酸进行扩增，分离玉米启动子。
[0037] 该示例性玉米和小麦启动子及本文中描述的其分离方法从而代表了一类启动子，这类启动子在其天然环境中赋予与其有效连接的基因选择性地/特异地在胚乳中表达，例如，在小麦、玉米、稻、大麦和高粱等谷物的发育中的胚乳(包括BETL细胞)中表达。
[0038] 据此，本发明的一个实施方案提供了分离的启动子或其活性片段或衍生物，所述启动子或其活性片段或衍生物能够赋予与其有效连接的基因在发育中的植物种子的胚乳中选择性表达，其中所述启动子在其天然环境中赋予基因组基因发生胚乳选择性表达或胚乳优先表达，所述基因组基因包括选自以下的序列：
[0039] (i)SEQ ID NO：1中所示的序列；
[0040] (ii)编码与SEQ ID NO：1所编码的多肽至少约50％相同的多肽的序列，其中所述多肽在发育中的种子的胚乳中选择性表达；
[0041] (iii)与(i)或(ii)中的序列或其互补序列在至少中等严紧条件下杂交的序列，其中所述杂交序列在发育中的种子的胚乳中选择性表达；以及
[0042] (iv)通过使用BLASTN算法，例如采用至少-1的核苷酸错配罚分(-q)，进行同源搜索所确定的，与(i)或(ii)中的序列具有同源性的序列，其中所述同源序列在发育中的种子的胚乳中选择性表达。
[0043] 在另一个实施方案中，分离的启动子、活性片段或衍生物至少能够赋予与其有效连接的基因在发育中的种子中以胚乳选择性的方式表达或以胚乳优先的方式表达。在另一个实施方案中，分离的启动子、活性片段或衍生物赋予在胚乳基部中(例如，在胚乳基部传递层(BETL)细胞中)的表达。在另一个实施方案中，分离的启动子、活性片段或衍生物，例如在玉米和/或小麦中，赋予在胚乳基部中(例如在BETL细胞中)以及在其它胚乳细胞(例如冠细胞)中表达。在另一个实施方案中，分离的启动子、活性片段或衍生物，例如在玉米和/或小麦中，赋予在胚乳基部中(例如在BETL细胞中)比在其它胚乳细胞中显著更高水平的表达。在另一个实施方案中，分离的启动子、活性片段或衍生物，例如在玉米和/或小麦中，赋予在胚乳基部中(例如在BETL细胞中)优先表达。在另一个实施方案中，分离的启动子、活性片段或衍生物，例如在玉米中，赋予在胚乳基部中(例如在BETL细胞中)选择性表达。
[0044] 在另一个实施方案中，分离的启动子、活性片段或衍生物至少能够赋予与其有效连接的基因在单子叶植物(例如，小麦、玉米、稻、大麦、高粱、甘蔗、薏苡(coix)、芒草(miscanthus)、柳枝稷或短柄草(Brachypodium)的胚乳中以胚乳选择性方式表达或以胚乳优先方式表达。也不排除本发明的启动子、活性片段或衍生物用于非此处具体提及的其它物种范围。
[0045] 在另一个实施方案中，从单子叶植物(例如，小麦、玉米、稻、大麦、高粱、甘蔗、薏苡、芒草、柳枝稷或短柄草)中分离启动子、活性片段或衍生物。也不排除本发明启动子的非此处具体提及的其它来源。
[0046] 在另一个实施方案中，分离的启动子、活性片段或衍生物能够赋予与其有效连接的基因在授粉后约5天到至少约25天(DAP)的期间进行胚乳选择性表达或胚乳优先表达。
[0047] 应理解的是，由本发明启动子所赋予的优先表达是指，与在其它植物部分、器官、组织或细胞中相比，与启动子、片段或衍生物有效连接的基因在胚乳(例如，包括胚乳基部)中显著更高水平地表达，和/或在胚乳基部(例如，包括BETL细胞)中显著更高水平地表达，和/或在BETL细胞中显著更高水平地表达，这可以通过以常规的转录谱分析或Northern杂交或RT-PCR方法、或以免疫学方法(例如ELISA)、或通过测定酶活性所测量到的转录本和/或蛋白质的可检测水平来确定。例如，在胚乳和/或胚乳基部和/或BETL细胞中的优先表达包括在该器官和/或组织和/或细胞中，比在一个或多个营养组织或器官、和/或一个或多个生殖组织或器官、和/或一个或多个花组织或器官(例如，叶和/或根和/或节和/或茎节间和/或颖和/或花药和/或子房和/或花粉和/或外壳和/或穗丝和/或胚和/或成熟种子胚乳)中，显著更高水平地表达。
[0048] 也应理解的是，由本发明启动子所赋予的选择性表达是指，与启动子、片段或衍生物相连接的基因，例如在以常规的转录谱分析或Northern杂交或RT-PCR方法、或以免疫学方法(例如ELISA)、或通过测定酶活性进行测定时，在一个或多个营养组织或器官和/或一个或多个生殖组织或器官和/或一个或多个花组织或器官中，不表达可检测水平的转录本和/或蛋白质。例如，以这些方法进行测定时，本发明的启动子不赋予在叶和/或根和/或节和/或茎节间和/或颖和/或花药和/或子房和/或花粉和/或外壳和/或胚和/或成熟种子胚乳中可检测的表达。
[0049] 在另一个实施方案中，本发明的分离的启动子、活性片段或衍生物赋予、诱导或激活与其有效连接的基因进行胚乳特异性或胚乳基部特异性或BETL特异性表达，即表达严格地局限于发育中的种子的胚乳或胚乳基部或BETL细胞。
[0050] 序列分析显示，尽管在不同启动子之间通常低的序列相同性，但根据本发明提供的分离的启动子及其活性片段和衍生物拥有结构上保守的特征，所述特征允许将它们表征和鉴定为一类或一个亚类的胚乳选择性或胚乳特异性调控序列。在一个实施方案中，当例如通过PLACE分析调控序列以鉴定其中的顺式作用元件时，本发明的启动子或其活性片段和衍生物包含表3和/或表4中所示的一个或多个核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明的分离的启动子包含表1中所示的，即对应于在所示例的小麦和玉米胚乳调控序列之间保守的顺式作用元件的，一个或多个核苷酸序列。在再一个实施方案中，本发明的分离的启动子或其活性片段或衍生物包含下组中任何元件的复数个：ARR1AT元件、BIHD1OS元件、BOXIINTPATPB元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件、DPBFCOREDCDC3元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件、GT1GMSCAM4元件、IBOXCORE元件、INRNTPSADB元件、MYBCORE元件、MYBPLANT元件、MYBPZM元件、MYBST1元件、MYCATERD1元件、MYCCONSENSUSAT元件、NODCON1GM元件、OSE1ROOTNODULE元件、POLASIG1元件、POLASIG3元件、POLLEN1LELAT52元件、RAV1AAT元件、ROOTMOTIFTAPOX1元件、SEBFCONSSTPR10A元件、SEF4MOTIFGM7S元件、SORLIP1AT元件、TAAAGSTKST1元件、TATABOX4元件、WBOXATNPR1元件、WBOXNTERF3元件和WRKY71OS元件。备选地或此外，本发明的分离的启动子或活性片段或衍生物包含选自下组的元件的2个以上的拷贝：ARR1AT元件、BIHD1OS元件、BOXIINTPATPB元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件、DPBFCOREDCDC3元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件、GT1GMSCAM4元件、IBOXCORE元件、MYBCORE元件、MYBPZM元件、MYBST1元件、MYCCONSENSUSAT元件、POLASIG1元 件、POLLEN1LELAT52元件、RAV1AAT元 件、ROOTMOTIFTAPOX1元 件、TATABOX4元件和WRKY71OS元件。备选地或此外，本发明的分离的启动子或活性片段或衍生物包含选自下组的元件的3个以上的拷贝：ARR1AT元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件、GT1GMSCAM4元件、IBOXCORE元件、MYBCORE元件、MYCCONSENSUSAT元件、POLLEN1LELAT52元件、RAV1AAT元件、ROOTMOTIFTAPOX1元件和WRKY71OS元件。备选地或此外，本发明的分离的启动子或活性片段或衍生物包含选自下组的元件的4个以上的拷贝：ARR1AT元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件、MYCCONSENSUSAT元件、POLLEN1LELAT52元件、RAV1AAT元件、ROOTMOTIFTAPOX1元件和WRKY71OS元件。备选地或此外，本发明的分离的启动子或活性片段或衍生物包含选自下组的元件的5个以上的拷贝：ARR1AT元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件、MYCCONSENSUSAT元件、ROOTMOTIFTAPOX1元件和WRKY71OS元件。根据每一个上述实施方案，保守结构基序优选位于，相对于相应转录本的翻译起始位点(即，在启动子的天然环境中与启动子有效连接的相应转录本的推定的或预测的或真实的翻译起始位点)而言，启动子的近侧的2.5kb内。这包括如下启动子、活性片段和衍生物，其中保守的结构基序包含在相对于相应转录本的翻译起始位点的启动子近侧约2.0kb内、或相对于相应转录本的翻译起始位点的启动子近侧约1.5kb内、或相对于相应转录本的翻译起始位点的启动子近侧约1.2kb内、或相对于相应转录本的翻译起始位点的启动子近侧约1.0kb内。
[0051] 本发明的启动子因此可以，例如在不同的物种或等位基因中，包括表1或表3或表4中所示序列的一个或多个拷贝，例如在启动子序列中带有或不带有间插序列地重复，例如串联重复序列，和/或以相反的取向来重复。本发明的启动子也可以，例如在不同物种或等位基因中，包括下文表1或表3或表4中所示任何序列的反向互补序列。
[0052] 表1中所示的序列在物种间，或在物种内不同的同源物或等位基因之间是保守的，能够单独地或一起地对本发明启动子所赋予的表达或表达模式作出贡献，从而解释了在不同或相同物种中针对有效连接到启动子上的转录本所观察到的一种或多种保守的表达模式。因此，本发明启动子的代表性例子，除了那些由于基因复制而产生的启动子例子以外，具有低的总体序列相同性，但是它们都具有以特定的空间或时间模式和/或以响应一个或多个信号(例如环境、激素等)的方式赋予表达的保守能力。
[0053] 本领域技术人员也知道，这种短序列可以用于向与其有效连接的异源核酸赋予表达或表达模式，例如激活、沉默、增强、阻遏或以其它方式调节与其有效连接的核酸的表达和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。
[0054] 在再一个实施方案中，分离的启动子、活性片段或衍生物包含选自以下的核苷酸序列：
[0055] (i)选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NOs：8-10的序列；
[0056] (ii)与(i)中序列互补的序列；
[0057] (iii)与(i)或(ii)的序列至少70％序列相同的序列；以及
[0058] (iv)使用一个或多个扩增引物从基因组DNA中可扩增出的序列，其中每个所述引物包含长约至少12个连续核苷酸的、来源于SEQ ID NO：2或8或其互补序列的序列。
[0059] 本文中示例的启动子的优选变体缺乏翻译起始密码子和/或包括多个翻译终止密码子，以阻止从启动子(例如SEQ ID NO：9或10)内部的假翻译起始。
[0060] 为了命名目的，SEQ ID NO：2中所示的序列包含来自小麦的被称为“WP04”的启动子，所述启动子赋予(例如在其天然环境中或在原位)与其有效连接的基因在胚乳细胞中表达，包括胚乳基部表达，例如在BETL细胞中表达；和/或赋予(例如在其天然环境中或在原位)与其有效连接的基因在胚乳基部细胞(包括BETL细胞)中表达；和/或赋予(例如在其天然环境中或在原位)与其有效连接的基因在BETL细胞中表达。SEQ ID NO：8中所示的序列包含来自小麦的被称为“WP04”的启动子的玉米变体，其中该玉米变体赋予(例如在其天然环境中或在原位)与其有效连接的基因在胚乳(包括胚乳基部)细胞中(例如在BETL细胞中)表达；和/或赋予(例如在其天然环境中或在原位)与其有效连接的基因在胚乳基部细胞(包括BETL细胞)中表达；和/或赋予(例如在其天然环境中或在原位)与其有效连接的基因在BETL细胞中表达。SEQ ID NO：8中所示的序列包含被称为“ZmGSStuc11-12-04.13411.1”的玉米基因座在其天然环境中的5’上游调控序列，其中所述玉米基因在发育中的种子中表达，并通过如本文实施例中所描述的同源搜索而鉴定出来。SEQ ID NO：9中所示的序列涉及SEQ ID NO：8的玉米5’上游调控序列的变体，其中多数个ATG序列已经被突变为非ATG的序列(例如，序列BVH)。SEQ ID NO：10中所示的序列涉及SEQ ID NO：8的玉米5’上游调控序列的变体，其中多数个ATG序列已经被突变为非ATG的序列(例如，序列BVH)，并且其中已经引入了多数个翻译终止密码子(例如TRR)。
[0061] 应理解的是，本发明显然包括包含如下核苷酸序列的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述核苷酸序列单个地或一起地选自：
[0062] (i)选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NOs：8-10的序列；以及
[0063] (ii)与(i)中的任何一个或多个序列互补的序列。
[0064] 也应理解的是，本发明原则上延及包含如下核苷酸序列的分离的启动子或其活性片段或衍生物，所述核苷酸序列在其天然环境中赋予本文实施例中所提及的SEQ ID NO：1或LOC_Os03g025350或ZmGSStuc11-12-04.13411.1所定义的核酸、以及所述任何一个或多个核酸的任何同源物进行胚乳表达。
[0065] 备选地或此外，本发明的启动子包含在其天然环境中赋予核酸胚乳选择性或胚乳特异性表达的序列，其中所述核酸在至少中等严紧条件下，优选高严紧条件下，与本文实施例中所提及的SEQ ID NO：1或LOC_Os03g025350或ZmGSStuc11-12-04.13411.1所编码的多肽的编码核酸杂交。
[0066] 备选地或此外，本发明的启动子包含在其天然环境中赋予核酸胚乳选择性或胚乳特异性表达的序列，所述核酸在至少中等严紧条件下，优选高严紧条件下，与本文实施例中所提及的SEQ ID NO：1或ZmGSStuc11-12-04.13411.1所编码的多肽的编码核酸的互补序列杂交。
[0067] 杂交条件为技术人员所知或描述于本文中。由于公认的在功能相关的启动子之间的低总体序列相同性，优选采用低严紧性杂交条件，然而，也可以采用中等或高严紧性。
[0068] 更优选地，本发明的启动子或其活性片段或衍生物包含使用一个或多个扩增引物可以从基因组DNA扩增出的核苷酸序列，其中每个所述引物包含长约至少12个连续核苷酸的序列，且所述序列来源于本文实施例中所提及的SEQ ID NO：1或LOC_Os03g025350或ZmGSStuc11-12-04.13411.1中所示的序列或其互补序列。
[0069] 在一个特别优选实施方案中，本发明的启动子包含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NOS：8-10的序列或其互补序列，或所述序列或互补序列的活性片段或衍生物。
[0070] 在一个更特别优选实施方案中，本发明的启动子包含SEQ ID NO：2所示的序列或其互补序列，或所述序列或互补序列的活性片段或衍生物。或者，本发明的启动子包含SEQ ID NO：8所示的序列或其互补序列，或所述序列或互补序列的活性片段或衍生物。或者，本发明的启动子包含SEQ ID NO：9所示的序列或其互补序列，或所述序列或互补序列的活性片段或衍生物。或者，本发明的启动子包含SEQ ID NO：10所示的序列或其互补序列，或所述序列或互补序列的活性片段或衍生物。
[0071] 本发明也提供根据本文任何实施方案的启动子或其活性片段或衍生物在产生表达构建体中的用途。
[0072] 例如，本发明的启动子特别可以用于产生表达构建体，以在发育中的胚乳的细胞中(例如在胚乳基部细胞中，例如在BETL细胞中)表达与启动子有效连接的核酸，优选在这样的胚乳细胞中优先地或选择性地表达。
[0073] 术语“表达构建体”应从其最广泛含义上理解，它包括被放置在与转基因有效连接的位置上的分离的启动子或活性片段或衍生物。
[0074] 如本文中所使用，术语“转基因”应理解为是指这样的核酸，该核酸不是由本发明的启动子在其天然环境中赋予表达或表达模式的核酸，即“异源核酸”。本发明的一般适用性不为转基因的特性所限制。基于本文的描述，合适的转基因对技术人员而言将是显而易见的，包括待在发育中的胚乳或其细胞或组织(例如胚乳基部或BETL细胞)中表达的多肽的编码核酸，或能够降低核酸在发育中的胚乳或其细胞或组织(例如胚乳基部或BETL细胞)中的表达的核酸，例如短干扰RNA(siRNA)或RNAi或反义RNA或微小RNA(miRNA)。优选，核酸能够调节涉及胚乳发育、淀粉或贮藏蛋白的积累或生物合成、或赋予种子抗病性或营养价值的多肽的表达。从前述内容中可以理解，优选借助于启动子调节该表达，所述启动子在发生表达、阻遏、抑制或降低所需的一个或多个因子的存在下赋予表达。优选，表达优先地或选择性地在这些条件下被调节。基于本文描述，其它合适的转基因对技术人员而言将是显而易见的，并显然包括编码如下多肽的转基因，所述多肽向发育中的胚乳赋予营养或药学特性，或所述多肽用于生产有用的下游产物或副产物(例如淀粉、酿造或发酵的饮料或食物、面粉、含面粉的产品(例如面包、饼干、意大利面(pasta)或面条)、淀粉、脂肪酸、食用油、纸、纺织品、乙醇、聚合物)或用于其它工业用途。也优选编码一种或多种糖、氨基酸或其它溶质(例如叶酸、磷酸盐、铁等)的转运蛋白的转基因。
[0075] 本发明也提供用于产生表达构建体的方法，所述方法包括将根据本文任何实施方案的本发明启动子或活性片段或衍生物与转基因相连接，以使启动子能够赋予所述核酸在发育中的胚乳或其细胞或组织(例如胚乳基部，例如BETL细胞)中的表达或表达模式。
[0076] 执行该实施方案的优选细胞、组织或器官为植物细胞、组织或器官，例如单子叶植物细胞、组织或器官，例如来自小麦、大麦、玉米、稻、高粱、黑麦、粟(例如珍珠粟或黍稷(proso millet))、荞麦(例如蓼科(Polygonaceae)荞麦属)、燕麦(例如，Avena sativa)，或来自禾本科(Graminaceae，Gramineae或Poaceae)的任何其它植物的细胞、组织或器官。这包括任何能够赋予启动子在其天然环境中(如前所定义)所有效连接的核酸表达的植物细胞、组织或器官。
[0077] 在启动子、活性片段或衍生物与转基因之间的连接优选为共价连接。应理解的是，因为启动子、活性片段或衍生物可以在距其有效连接的转基因一定的距离处赋予表达，所以转基因不需要和启动子、活性片段或衍生物并置在一起，即可以存在长达约2kb的间插序列，优选长达约1kb，更普遍地是长约200-500bp。也可以利用较短的间插序列，例如长达约100或200bp的内含子序列。
[0078] 用于连接核酸的合适的方法对技术人员而言将是显而易见的，并/或描述于本文中，包括酶促连接(例如T4DNA连接酶)、拓扑异构酶介导的连接(例如使用痘苗病毒拓扑异构酶I)、顺式或反式重组(例如使用重组酶或通过随机整合)、从一个或多个引物序列扩增(包括引物延伸手段)、从载体扩增、或化学连接(例如溴化氰介导的核酸缩合)。
[0079] 在另一个实施方案中，本发明也提供了包含有效地连接到转基因上的、根据本文任何实施方案的本发明启动子的表达构建体。
[0080] 本发明也提供了根据本文任何实施方案的启动子或其活性片段或衍生物在产生表达载体中的用途。优选地，使用有效地连接到转基因的启动子。技术人员知道，表达载体包含足够的遗传信息以允许从启动子、活性片段或衍生物起始表达，例如，存在该启动子或活性片段或衍生物、以及与之有效连接的一个或多个转录终止序列和/或增强子元件序列和/或内含子序列和/或内含子剪接接头序列。表达载体通常也包含一个或多个使其在细胞中得以维持的序列，例如一个或多个选择标记基因(所述选择标记基因可以例如赋予包含表达构建体的细胞对抗生素或除草剂的抗性)，和一个或多个复制起点(例如用于在细菌细胞或酵母中复制)。表达载体可以还包含一个或多个重组酶位点序列，以允许自细胞中切除该载体DNA的一部分和/或促进整合进入宿主细胞DNA中。
[0081] 本发明也提供了用于产生表达载体的方法，所述方法包括将根据本文任何实施方案的本发明启动子或活性片段或衍生物连接到空载体中，从而产生表达载体。如本文中所使用，术语“空载体”应理解为是指不包含本发明的启动子或其活性片段或衍生物的载体。技术人员知道，示例性载体包括质粒、噬菌粒、黏粒、病毒基因组或亚基因组片段、噬菌体人工染色体(例如，P1人工染色体)、细菌人工染色体、酵母人工染色体、或能够在细胞中通过染色体或染色体外方式维持和/或复制的其它核酸。
[0082] 在一个实施方案中，方法还包括将转基因连接到表达载体上，以使启动子、活性片段或衍生物与转基因处于有效连接状态。
[0083] 作为另外的选择，本发明提供了用于产生表达载体的方法，所述方法包括将根据本文任何实施方案的表达构建体连接到空载体，从而产生表达载体。
[0084] 在本文中，可以理解，在表达载体的各个组分之间的连接或用于实现该连接的手段可以与用于产生本发明表达构建体时的一样。
[0085] 在一个实施方案中，方法还包括产生或获得本发明表达构建体。
[0086] 在另一个实施方案中，方法包括获得用于产生本发明表达载体的本发明的启动子、活性片段或衍生物、和/或转基因、和/或空载体。
[0087] 在另一个实施方案中，本发明还提供了包含本发明的启动子或其活性片段或衍生物的表达载体。
[0088] 优选的表达载体包括本发明的表达构建体，即包括有效连接到转基因的本发明启动子。例如，本发明人已经产生了用于小麦的生物射弹或农杆菌介导的转化的载体、例如包含SEQ ID NO：3或4或5或6中所示的序列，或用于玉米农杆菌介导的转化的载体，例如包含SEQ ID NO：7中所示的序列。
[0089] 根据本文任何实施方案的启动子或其活性片段或衍生物也可以用于产生转基因植物或植物部分，所述转基因植物或植物部分例如包含与转基因有效连接或与内源核酸有效连接的本发明启动子、活性片段或衍生物。“内源核酸”是指植物、植物细胞或植物部分中的细胞核或细胞器来源的核酸，所述核酸由于启动子、活性片段或衍生物的导入而成为转基因。例如，这种“内源核酸”在通过本发明的启动子、活性片段或衍生物的导入而成为转基因的植物或植物部分中是天然存在的。
[0090] 因此，本发明提供本发明的启动子、活性片段或衍生物在产生植物细胞、植物组织、植物器官或整个植物中的应用，例如用于调节转基因在胚乳中(例如，包括在胚乳基部，例如在BETL细胞中)的表达。例如，启动子、活性片段或衍生物赋予内源或异源转基因优先地或选择性地在发育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部中，例如在BETL细胞中)表达，和/或用于抑制或降低内源转基因在发育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部中，例如在BETL细胞中)的表达。
[0091] 术语“植物部分”应理解为是指植物的细胞、组织或器官，或复数的植物细胞、组织或器官，包括任何繁殖材料，例如种子、发育中的胚乳(例如，包括胚乳基部，例如BETL细胞)。本发明优选植物部分包含本发明的启动子或其活性片段或衍生物。
[0092] 备选地，本发明提供本发明的启动子、活性片段或衍生物在制备表达载体或表达构建体中的应用，所述表达载体或表达构建体用于产生植物细胞、组织或器官或整株植物，例如以赋予优先地或选择性地在发育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部中，例如在BETL细胞中)的表达，和/或以抑制或降低在发育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部中，例如在BETL细胞中)的表达。
[0093] 在一个实施方案中，使用本发明的启动子、活性片段或衍生物产生其中内源核酸的表达被改变了的植物或植物部分，即启动子、活性片段或衍生物被有效连接到内源核酸上。例如，这种植物或植物部分的产生可以使内源核酸的表达得到增强或减弱。这种调节了的表达可以用于，例如，目的表达产物(例如目的蛋白质)的诱导型生产，或用于控制目的表达产物表达的时间和/或位置，或用于降低不想要的表达产物的水平或延迟其表达。
[0094] 备选地，使用启动子、活性片段或衍生物来鉴定和/或分离可以诱导目的表型的核酸。例如，将启动子、活性片段或衍生物导入到植物或植物部分的基因组中，以使其有效连接到基因组核酸上，从而相对于除了在对应基因组位置上缺乏所述启动子、活性片段或衍生物之外等基因或近等基因的材料的表型，在所述植物或植物部分中产生不同的表型。任选地，使用标准技术(例如，cDNA末端的5′快速扩增(RACE)或3′RACE)，对该植物的基因组中有效连接到启动子、活性片段或衍生物上的核酸进行鉴定和/或分离。
[0095] 在另一个实施方案中，使用本发明的启动子、活性片段、衍生物赋予转基因在植物部分中如上文所定义的表达。应理解的是，为了在植物部分中赋予如上文所定义的表达，也可以使用本发明的表达构建体或表达载体产生植物细胞、植物部分或整个植物。就包含表达构建体的转基因植物、或转基因植物细胞、或转基因植物部分而言，表达构建体可以被整合到植物、植物细胞或植物部分的基因组中，或能够以附加体形式存在或存在于染色体外。
[0096] 优选地，使用本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体生产植物或植物部分，所述植物或植物部分，相对于除了不含该启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体之外等基因的植物或植物部分，具有改变的表型。例如，转基因植物或植物部分包含本发明的表达构建体或表达载体，所述表达构建体或表达载体包含被有效地置于本发明的启动子控制下的转基因或结构基因。
[0097] 在一个实施方案中，在本发明的启动子控制下表达的结构基因的开发阅读框赋予或增强植物对病害或农害的耐受性(例如，来自昆虫抗性基因、细菌病害抗性基因、真菌病害抗性基因、病毒病害抗性基因、线虫病害抗性基因的开发阅读框)。在另一个实施方案中，在本发明的启动子控制下表达的结构基因的开发阅读框赋予或增强植物对除草剂的耐受性(例如，草甘膦抗性基因或膦丝菌素抗性基因)。在另一个实施方案中，在本发明的启动子控制下表达的结构基因的开发阅读框改变籽粒的组成或质量，例如胚乳的大小、胚乳细胞数量、种子大小、或其它产量特性。在另一个实施方案中，在本发明的启动子控制下表达的结构基因的开发阅读框改变营养利用，提高对真菌毒素的耐受性，提高或增强对环境或其它胁迫的耐受性(例如，干旱耐受基因、耐热基因、耐冷基因、耐冻基因、耐淹基因、耐盐基因、或氧化胁迫耐受基因)、油的数量和/或质量、氨基酸或蛋白质组成，以及来自植物、其它真核生物或原核生物的用于表达外源产物(例如酶、辅因子、和激素)的基因。也可以通过修饰如下基因的表达，在植物中产生商业性状，所述基因能够改变淀粉或蛋白质用于生产纸、纺织品、乙醇、聚合物或具有工业用途的其它材料。
[0098] 在另一个实施方案中，本发明的启动子或其活性片段或衍生物赋予编码植物激素转运蛋白的转基因(例如，编码生长素转运蛋白的Pin基因)表达。备选地或此外，可以使用编码赤霉酸(gibberilinic acid)转运蛋白的转基因。
[0099] 在另一个实施方案中，本发明的启动子或其活性片段或衍生物赋予编码细胞周期蛋白的转基因表达，从而例如增加细胞数量。
[0100] 在另一个实施方案中，本发明的启动子或其活性片段或衍生物赋予用于延迟细胞死亡的转基因表达，从而延长通过BETL细胞的转运。
[0101] 在另一个实施方案中，本发明的启动子或其活性片段或衍生物赋予包括溶质转运蛋白的转基因表达，以例如，增强氨基酸、糖(糖类物质或二糖)、磷酸盐、糖磷酸(sugar phosphate)、核苷酸、核苷酸-糖磷酸(nucleotidyl-sugar phosphate)、铁、叶酸等的转运，和任选地增强或赋予对病害的抗性(例如对真菌病原体的抗性)。不受限于任何理论或作用模式，胚乳基部中转运蛋白表达的增强，导致一种或多种原本在种子发育期中(例如，在籽粒灌浆期)限制胚乳和/或胚生长的代谢物的转运增强，从而增加胚乳和/或胚的大小，或增加胚乳干重与胚干重间的比率，或以其它方式增加种子的产量(如通过种子干重确定的)。适于该应用的转基因包括一个或多个以下示例性转基因：氨基酸选择性通道蛋白(例如Pohlmeyer等，Proc Natl Acad Sci U S A.94(1997)，9504-9509)、ABC型转运蛋白(ATP酶组分，EC 3.6.3；Krattinger等，Science 323(2009)，1360-1363)、磷酸盐易位蛋白(例如Knappe等，Plant Physiol.131(2003)，1178-1190)、葡萄糖-6-磷酸/磷酸易位蛋白(例如Kammerer等，The Plant Cell 10(1998)，105-117)、质体核苷酸转运蛋白(例如Neuhaus等，The Plant Journal 11(1997)，73-82)、ADP-葡萄糖转运蛋白(例如BT1蛋白(例如ZmBT1)(例如Cao等，Physiologia Plantarum 95(1995)，176-186；Sullivan等，Planta 196(1995)，477-484；Cao等，Physiologia Plantarum 100(1997)，400-406)、或转运蛋白的线粒体载体家族(MCF)的其它转运蛋白(例如Sullivan等，The Plant Cell3(1991)，1337-1348；Picault等，Trends in Plant Sci.9(2004)，138-146)。
[0102] 在另一个实施方案中，使用本发明的启动子降低内源胚乳基因的表达，例如通过在本发明的启动子的有效控制下，在胚乳中表达一个或多个转基因，所述转基因包含一个或多个反义分子、核酶(Haseloff等，Nature 334，585-591，1988；Steinecke等，EMBO J.11，1525(1992)；Perriman等，Antisense Res.Dev.3，253(1993))、共抑制分子、RNAi分子(Napoli等，Plant Cell 2，279-289，1990；美国专利号5,034,323；Sharp等，Genes Dev.13，139-141，1999；Zamore等，Cell 101，25-33，2000；和Montgomery等，PNAS USA 95，15502-15507，1998)、发夹结构(Smith等，Nature 407，319-320，2000；WO 99/53050；和WO98/53083)、microRNAs(Aukerman等，Plant Cell 15，2730-2741，2003)、转录因子打靶基因(transcription factor-targeted gene)(例如，WO 01/52620、WO 03/048345和WO
00/42219)、阻遏物编码基因、转座子、或显性失活突变体。本发明显然包括使用其它方法或任何两个或多个本领域技术人员所知的以上程序的组合。
00/42219)、阻遏物编码基因、转座子、或显性失活突变体。本发明显然包括使用其它方法或任何两个或多个本领域技术人员所知的以上程序的组合。
[0103] 通过表达与其有效连接的结构基因(例如开发阅读框)或起到减少内源胚乳基因转录作用的分子，本发明的启动子或其活性片段或衍生物对于改变一个或多个籽粒性状具有特别的用途。优选的籽粒性状包括：例如溶质的转运、和/或脂肪酸的含量和/或组成、氨基酸的含量和/或组成(包括含赖氨酸或含硫的蛋白质的含量以及种子贮藏蛋白的含量和/或组成)、淀粉的含量和/或组成、生长调节蛋白质(包括细胞周期调节蛋白)、凋亡或籽粒败育、胚乳和胚的比率、以及环境胁迫。在另一个实施方案中，转基因编码抑制多肽在发育中的胚乳中表达的siRNA或反义RNA或RNAi或miRNA。或者，核酸编码抗体片段，所述抗体片段能够结合并抑制多肽在发育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部中，例如在BETL细胞中)的活性。
[0104] 在另一个实施方案中，使用本发明的启动子、活性片段、或衍生物、或表达构建体或表达载体，赋予植物部分或整个植物对病害或农害的抗性。例如，表达构建体或表达载体包含转基因，所述转基因在表达时赋予对植物病害或植物农害的抗性，例如的几丁质酶或奇甜蛋白样蛋白质(例如来自小麦)，或来自农害的外壳蛋白(例如，大麦黄花叶病毒外壳蛋白)。
[0106] 本发明也包括使用本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体在植物或植物部分上赋予营养品质。例如，表达构建体或表达载体包含编码种子贮藏蛋白、脂肪酸途径酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶或淀粉分支酶的转基因。在一个实施方案中，转基因编码巴西坚果蛋白、钙结合蛋白或铁结合蛋白。
[0107] 本发明也包括使用本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体来改变植物或植物部分的形态。例如，表达构建体或表达载体包含编码多肽的转基因，所述多肽涉及生长素的合成或代谢、或细胞分裂素的合成或代谢(例如，细胞分裂素氧化酶)。通过改变植物或植物部分中生长素和/或细胞分裂素的水平，改变植物或植物部分的形态。
[0108] 应理解的是，本发明的启动子对于基因堆积目的具有特别的用途，例如与不同的启动子一起使用，以在植物的胚乳中表达多数个结构基因或转基因。在另一个实施方案中，与一个或多个其它启动子联合使用本发明的启动子，以在相同或不同的植物细胞中表达多个结构基因或转基因，例如，其中该表达是同时发生的、同时期发生的或同步发生的。例如，利用本发明的启动子或其活性片段或衍生物表达不同的结构基因或转基因，这些结构基因或转基因当表达时在植物种子中改变相同的生化途径。或者，利用本发明的启动子或其活性片段或衍生物，在植物种子中表达与在其它启动子控制下表达的结构基因或转基因在功能上不同或不相关的结构基因或转基因。如技术人员所知，可以通过同时或顺序转化程序(涉及导入待表达的基因构建体)来进行基因堆积。
[0109] 在另一个基因堆积的实施方案中，将包含有效地连接转基因或结构基因的本发明启动子或其活性片段或衍生物的构建体导入到植物胚乳中，其中所述植物胚乳已经在另一启动子的控制下表达转基因或结构基因，所述另一启动子在多个不同的植物器官、组织或细胞(例如，包括胚乳)中赋予或调节表达。另一个实施方案中，采用了双组分系统，其中产生两个亲本株系，每个亲本株系在启动子的控制下表达所需的转基因，从而使得一个植物株系包含根据本发明的启动子或其活性片段或衍生物，另一个植物株系包含其它启动子，其中将这两个转基因植物株系进行杂交以产生表达两个转基因的后代植物。在另一个实施方案中，将包含有效地连接转基因或结构基因的本发明启动子或其活性片段或衍生物的第一构建体，与包含有效地连接到不同启动子的转基因或结构基因的第二构建体，一起导入到植物胚乳中，所述不同的启动子在多个不同的植物器官、组织或细胞(例如，包括胚乳)中赋予或调节表达。在多个不同的植物器官、组织或细胞(例如，包括胚乳)中赋予或调节表达的示例性启动子在本领域公知，例如p326启动子、YP0144启动子、YP0190启动子、p13879启动子、YP0050启动子、p32449启动子、21876启动子、YP0158启动子、YP0214启动子、YP0380启动子、PT0848启动子、PT0633启动子、CaMV 35S启动子、甘露碱合酶(MAS)启动子、源自根癌农杆菌的T-DNA的1′或2′启动子、玄参花叶病毒34S启动子、例如来自稻的肌动蛋白启动子、和例如来自玉米的泛素启动子(Ubi-1)。
[0110] 在另一个基因堆积的实施方案中，将包含有效地连接转基因或结构基因的本发明启动子或其活性片段或衍生物的构建体导入到植物胚乳中，所述植物胚乳已经在成熟胚乳启动子的控制下表达转基因或结构基因，所述成熟胚乳启动子在成熟中的胚乳中，尽管不一定专一地或主要地在成熟中的胚乳中，赋予或调节表达。在另一个实施方案中，采用双组分系统，其中产生两个亲本株系，每个亲本株系在启动子的控制下表达所需的转基因，从而使得一个植物株系包含根据本发明的启动子或其活性片段或衍生物，另一个植物株系包含在成熟中的胚乳中起作用的其它启动子，其中将这两个转基因植物株系进行杂交以产生在胚乳中表达两个转基因的后代植物。在另一个实施方案中，将包含有效地连接转基因或结构基因的本发明启动子或其活性片段或衍生物的第一构建体，与包含有效地连接到不同启动子的转基因或结构基因的第二构建体，一起导入到植物胚乳中，其中所述不同的启动子在成熟中的胚乳中，尽管不一定是专一地或显著地在成熟中的胚乳中，赋予或调节表达。
[0111] 在另一个基因堆积的实施方案中，将包含有效地连接转基因或结构基因的本发明启动子或其活性片段或衍生物的构建体导入到植物胚乳中，其中所述植物胚乳已经在成熟胚乳启动子的控制下表达转基因或结构基因，所述成熟胚乳启动子在胚囊或早期胚乳中赋予或调节表达，尽管不一定是专一地或主要地在胚囊/早期胚乳中。在另一个实施方案中，将包含有效地连接到转基因或结构基因的本发明启动子或其活性片段或衍生物的第一构建体，与包含有效地连接到不同启动子的转基因或结构基因的第二构建体，一起导入到植物胚乳中，所述不同的启动子在胚囊或早期胚乳中赋予或调节表达，尽管不一定是专一地或主要地在胚囊/早期胚乳中。“胚囊”或“早期胚乳”是指极核和/或中央细胞，或极核的前体和在细胞化之前。在胚囊或早期胚乳中起作用的示例性启动子包括例如拟南芥viviparous-1基因启动子(见，GenBank号U93215)；拟南芥Atmyc1基因启动子(Urao等，Plant Mol.Biol.，32：571-57，1996；Conceicao Plant，5，493-505，1994)；拟南芥FIE基因启动子(见GenBank号AF129516)；拟南芥MEA基因启动子；拟南芥FIS2基因启动子(见GenBank号AF096096)；拟南芥FIE 1.1基因启动子(美国专利号6,906,244)，玉米MAC1基因启动子(Sheridan等，Genetics，142，1009-1020，1996)；和玉米Cat3基因启动子(见GenBank号L05934；Abler等，Plant Mol.Biol.，22，10131-1038)，1993。
[0112] 本发明也提供用于产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括将本发明的启动子、活性片段或衍生物，或本发明的表达构建体或表达载体导入到植物细胞中。用于将核酸导入到植物细胞中的合适的方法对技术人员而言将是显而易见的，例如使用CaCl2进行的转化及其变型形式、PEG介导的原生质体摄取、微粒轰击、电穿孔、显微注射、组织的真空浸润或农杆菌介导的转化。例如，通过执行在国际专利申请号PCT/AU2007/000021中所描述的农杆菌介导的转化方法来产生转基因植物细胞。
[0113] 优选地，方法还包括产生、提供或获得启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体。
[0114] 在一个实施方案中，用于产生本发明的转基因植物细胞的方法还包括：将产生的转基因植物细胞，与可以诱导愈伤组织形成、和/或诱导转基因细胞(或源自其的细胞)脱分化、和/或诱导从所述转基因细胞产生未分化细胞的化合物，在足以产生愈伤组织和/或脱分化的细胞和/或未分化的细胞的条件和一段时间中进行接触。合适的化合物对技术人员而言将是显而易见的，例如合成的或天然的植物生长激素，例如，化合物选自：2，4-二氯苯氧基乙酸、3，6-二氯-邻-茴香酸、4-氨基-3，5，6-三氯甲基吡啶酸以及它们的混合物。“愈伤组织”是指在无再生的情况下由细胞分裂产生的一簇或一群未分化细胞。
[0115] 本领域技术人员知道，无需进行过度实验，转基因植物细胞可用于，例如通过再生，产生转基因植物。“再生”是指，例如通过器官发生或胚发生过程，从转基因植物细胞产生植物或植物部分，特别是小植物的过程。
[0116] 如本文中所使用，术语“器官发生”应理解为是指芽和根相继地从分生组织中心发育的过程。
[0117] 如本文中所使用，术语“胚发生”应理解为是指，芽和根以协同的方式一起地(而非相继地)从体细胞或配子发育的过程。
[0118] 如本文中所使用，术语“小植物”应理解为是指，例如使用体外技术，从植物细胞发育成的芽或根。例如小植物为使用化合物从愈伤组织诱导生长出的芽或根，所述化合物例如吲哚-3-乙酸、苄基腺嘌呤、吲哚丁酸、玉米素、α-萘乙酸、6-苄基氨基嘌呤、噻苯隆(thidiazuron)或激动素、2iP。
[0119] 基于以上描述，对技术人员而言将显而易见的是，本发明提供了包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的转基因植物细胞在生产转基因植物或小植物中的应用。
[0120] 本发明也提供用于生产转基因植物或小植物的方法，所述方法包括：
[0121] (i)提供、产生或获得包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的转基因植物细胞或愈伤组织；以及
[0122] (ii)从(i)中转基因植物细胞或愈伤组织再生转基因植物或小植物，从而生产转基因植物或小植物。
[0123] 在一个实施方案中，方法用于生产转基因植物或小植物，其中本发明的启动子、活性片段或衍生物赋予核酸(例如，转基因)优先地或选择性地在发育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部中，例如在BETL细胞中)进行如上文中定义的表达，和/或用于优先地或选择性地在发育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部和/或BETL细胞中)抑制或降低核酸的表达。
[0124] 用于从植物细胞或愈伤组织再生植物或小植物的方法对技术人员而言将是显而易见的，并/或描述于本文中。例如，将可以诱导愈伤组织形成和/或诱导转基因细胞(或源自其的细胞)脱分化和/或诱导从所述转基因细胞产生未分化细胞的化合物(例如上文中所描述的化合物)，与转基因植物细胞，在足以产生愈伤组织和/或脱分化的细胞和/或未分化的细胞的条件和一段时间中进行接触。通常在利于形成小植物的条件和一段时间中，使愈伤组织与诱导芽和/或根形成的化合物(例如上文中所描述的用于产生小植物的化合物)接触。可以使小植物在利于其发育成整株植物(例如，生长至成熟)的条件下生长一段时间，以产生整株植物。
[0125] 在一个实施方案中，用于产生根据本文任何实施方案的转基因植物或小植物的方法，还包括从该转基因植物或小植物提供或获得后代植物和/或种子和/或繁殖材料和/或生殖材料和/或种质，其中所述后代植物、种子、繁殖材料或生殖材料包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体。
[0126] 本发明还提供用于从植物生产转基因种子的方法，所述方法包括提供、产生或获得根据本文任何实施方案的转基因植物或小植物，以及在足以产生种子的条件和一段时间中生长或维持转基因植物或小植物。任选地，方法还包括获得包含了导入的本发明启动子、活性片段或衍生物、或本发明的表达构建体或表达载体的种子。
[0127] 本发明也提供包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的转基因植物或小植物或植物部分或后代植物或种子或繁殖材料或生殖材料或种质。在一个实施方案中，植物或小植物或植物部分或后代植物或种子或繁殖材料或生殖材料或种质，包含有效连接到所述植物或小植物或植物部分或后代植物或种子或繁殖材料或生殖材料或种质的内源核酸的启动子、活性片段或衍生物。
[0128] 在一个优选实施方案中，本发明提供包含有效连接到本发明启动子、活性片段或衍生物的核酸(例如包含本发明的表达构建体或表达载体)的转基因植物或小植物或植物部分或后代植物或种子或繁殖材料或生殖材料或种质。优选地，启动子、活性片段或衍生物赋予该核酸优先地或选择性地在发育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL细胞)中表达，和/或优先地或选择性地在发育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL细胞)中抑制或降低该核酸的表达。
[0129] 本发明还提供转基因植物、小植物或植物部分在产生合子和/或后代小植物和/或后代植物中的应用。
[0130] 此外，本发明提供用于培育(breeding)转基因植物的方法。术语“培育”应从其最广泛含义上理解为是指从或使用亲本植物或其部分或其细胞产生合子和/或后代小植物或植物的任何过程。例如，术语“培育”包括例如杂交育种或异花授粉等有性繁殖，其中使用来自一个植物的生殖材料(例如花粉)给来自另一个植物的生殖材料(例如胚珠中的卵细胞)受精。术语“培育”也包括例如自交或自花授粉等有性繁殖，其中使用来自一个植物的生殖材料(例如花粉)给来自相同植物的生殖材料(例如胚珠中的卵细胞)受精。术语“培育”也包括无性形式的繁殖，例如从匍匐枝、或根茎、或球茎、或块茎、或球根、或插条、或嫁接物、或芽产生植物。术语“培育”也包括体外方法，例如体外受精和合子培养。
[0131] 就有性繁殖而言，本发明提供用于培育转基因植物的方法，所述方法包括：
[0132] (i)提供、产生或获得包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的转基因植物；以及
[0133] (ii)培育在(i)中产生的转基因植物，从而产生包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的合子。
[0134] 或者，方法包括：
[0135] (i)提供、产生或获得包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的植物生殖材料；以及
[0136] (ii)使(i)中的生殖材料与一个植物的生殖材料结合，从而产生包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的合子。
[0137] 优选地，方法还包括使合子生长以形成发育中的转基因胚乳(例如包括胚乳基部和/或BETL细胞)、和/或转基因小植物、和/或转基因植物、和/或转基因植物部分(例如发育中的胚乳，例如包括胚乳基部和/或BETL细胞)。
[0138] 在一个实施方案中，获得以上转基因植物的步骤包括获得包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的种子或小植物或植物部分，和种植所述种子或小植物或植物或植物部分，从而获得转基因植物。
[0139] 就杂交育种而言，使转基因植物与转基因植物交配，或使转基因生殖材料或转基因生殖材料结合，以产生对于本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体而言纯合或杂合的合子、植物、小植物或植物部分。备选地，使转基因植物与野生型植物交配，或使转基因生殖材料与野生型生殖材料结合，以产生对于本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体而言杂合的合子、植物、小植物或植物部分。
[0140] 优选地，本发明的培育方法还包括选择或鉴定包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的合子、小植物、植物部分或整个植物。
[0141] 在一个实施方案中，本发明的培育方法还包括在小植物、植物部分或整个植物中，检测有效连接到本发明的启动子、活性片段或衍生物上的核酸的表达或表达模式。
[0142] 就无性繁殖而言，本发明提供以下方法，其包括：
[0143] (i)提供、产生或获得包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的转基因植物、小植物或植物部分；以及
[0144] (ii)在足以使植物无性繁殖的条件和一段时间中维持转基因植物。
[0145] 合适的条件取决于无性繁殖的形式，并对技术人员而言将是显而易见的。例如，通过掩埋枝条，诱导植物的侧枝形成不定根，在不定根形成后，枝条从母体植物分离并长成新植株。备选地或此外，例如，通过切割一部分植物、植物部分或小植物或使用以上所描述的方法，诱导植物或小植物或植物部分形成愈伤组织，并使愈伤组织在足以生长出小植物或植物的条件下维持。
[0146] 如本文中举例说明，根据本文中任何实施方案的启动子可以用于在植物或植物细胞或植物部分中(例如，在发育中的胚乳或其细胞或组织(例如胚乳基部和/或BETL细胞)中)表达核酸。据此，本发明提供本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体在赋予核酸(例如，转基因)在植物细胞或植物部分中表达的用途，例如用于赋予核酸优先地或选择性地在发育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL细胞)中表达，和/或用于优先地或选择性地在发育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL细胞)中抑制或降低核酸的表达。
[0147] 本发明也提供用于在植物或植物细胞或植物部分中表达核酸的方法，所述方法包括：
[0148] (i)提供、获得或产生包含有效连接到核酸的根据本文中任何实施方案的启动子、活性片段或衍生物的转基因植物、转基因植物细胞或转基因植物部分；以及
[0149] (ii)在足以使所述核酸表达的条件和一段时间中维持所述转基因植物或后代。
[0150] 在一个实施方案中，启动子、活性片段或衍生物有效连接到植物细胞、植物部分或植物的内源核酸。或者，启动子、活性片段或衍生物有效连接到转基因，例如转基因植物、转基因植物细胞或转基因植物部分包含本发明的表达载体或表达构建体。合适的转基因描述于本文中，并且原则上适用于本发明的该实施方案。
[0151] 在一个实施方案中，用于表达本发明的核酸的方法是优先地或选择性地在发育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL细胞)中赋予该核酸表达，和/或优先地或选择性地在发育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL细胞)中抑制或降低该核酸的表达。
[0152] 优选地，方法还包括测定植物、植物细胞或植物部分中核酸的表达或表达模式。
[0153] 基于以上的描述，对技术人员而言将显而易见的是，通过调节植物细胞或植物部分中核酸的表达，可以改变植物细胞、植物部分、小植物或整个植物的表型或性状，或向植物细胞、植物部分、小植物或整个植物赋予表型或性状。因此，本发明提供启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体在改变植物细胞、植物部分、小植物或整个植物的表型或性状，或在向植物细胞、植物部分、小植物或整个植物赋予表型或性状中的应用。例如，植物细胞、植物部分、小植物或整个植物具有改善的营养品质或具有药学性质。备选地或此外，植物部分、小植物或整个植物具有改变的形态。用于调节或赋予一个或多个性状的合适的核酸(例如，转基因)描述于本文中，并且原则上适用于本发明的该实施方案。
[0154] 本发明也提供用于调节植物细胞、植物部分、小植物或植物中表型或性状，或用于向植物细胞、植物部分、小植物或植物赋予表型或性状的方法，所述方法包括：
[0155] (i)提供、产生或获得包含有效连接到核酸的本发明启动子、活性片段或衍生物的植物细胞、植物部分、小植物或植物，所述核酸在表达时调节植物细胞、植物部分、小植物或植物的表型或性状，或在表达时向植物细胞、植物部分、小植物或整个植物赋予表型或性状；以及
[0156] (ii)在足以表达核酸和改变或赋予表型或性状的条件和一段时间中，维持(i)中的植物细胞、植物部分、小植物或植物。
[0157] 示例的性状、表型和核酸描述于本文中，并原则上适用于本发明的该实施方案。
[0158] 本发明也提供具有改变的表型或性状或新的表型或性状的植物细胞、植物部分、小植物或植物，所述植物细胞、植物部分、小植物或植物包含有效连接到核酸的本发明启动子、活性片段或衍生物，所述核酸在表达时调节植物细胞、植物部分、小植物或植物的表型或性状，或在表达时赋予植物细胞、植物部分、小植物或整个植物表型或性状。
[0159] 示例的性状、表型和核酸描述于上文中，并且原则上适用于本发明的该实施方案。
[0160] 本发明也提供了用于分离新启动子的方法，例如能够赋予核酸在发育中的胚乳或其细胞或组织(例如，胚乳基部和/或BETL细胞)中表达的启动子。例如，本发明提供了用于分离胚乳选择性启动子的方法，所述方法包括：
[0161] (i)鉴定基因的表达产物，与所述表达产物在吸涨的种子或吸涨的胚中的表达水平相比，所述表达产物在未成熟胚乳中以增加的水平表达；和
[0162] (ii)分离有效连接所述基因的启动子，其中所述启动子赋予在发育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL细胞)中的选择性表达。
[0163] 优选地，用于分离根据本文中任何实施方案的启动子的方法包括：
[0164] (i)测定多个表达产物在发育中的胚乳中的表达水平，例如在籽粒灌浆或贮藏蛋白积累期(例如在约10-14DAP)；
[0165] (ii)测定多个表达产物在未成熟胚中的表达水平，例如在籽粒灌浆或贮藏蛋白积累期(例如在约10-14DAP)自种子测量；
[0166] (iii)鉴定一个或多个在(i)中比在(ii)中以增加的水平表达的表达产物；以及[0167] (iv)分离赋予(iii)中的一个或多个表达产物表达的启动子。
[0168] 优选地，所检测的表达产物为基因编码的转录本或mRNA。例如，使用微阵列检测转录本或mRNA。
[0169] 本说明书包含核苷酸和氨基酸序列信息，所述核苷酸和氨基酸序列信息使用PatentIn第3.5版编制并呈现于权利要求之后。序列表中通过数字指示符<210>和其后的序列标识(例如<210>1，<210>2，<210>3等)来标识每一个核苷酸序列。通过分别在数字指示符区域<211>，<212>和<213>中提供的信息，指示每一个核苷酸序列的序列长度和类型(DNA、蛋白质(PRT)等)及来源生物。使用术语“SEQ ID NO：”及其后的序列标识来定义本说明书中提及的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1是指在序列表中标注为<400>1的序列)。
[0170] 本文所提及的核苷酸残基的命名为IUPAC-IUB生物化学命名委员会所推荐的命名，其中A代表腺嘌呤、C代表胞嘧啶、G代表鸟嘌呤、T代表胸腺嘧啶、Y代表嘧啶残基、R代表嘌呤残基、M代表腺嘌呤或胞嘧啶、K代表鸟嘌呤或胸腺嘧啶、S代表鸟嘌呤或胞嘧啶、W代表腺嘌呤或胸腺嘧啶、H代表除鸟嘌呤以外的其它核苷酸、B代表除腺嘌呤以外的其它核苷酸、V代表除胸腺嘧啶以外的其它核苷酸、D代表除胞嘧啶以外的其它核苷酸、N代表任何核苷酸残基。
[0171] 在整个说明书中，除非另有特别说明或在上下文中另有要求，提到单个的步骤、单个的组合物、单个的步骤组或单个的组合物组时，应理解为涵盖一个和复数个(即一个或多个)该步骤、该组合物、该组步骤或该组组合物。
[0172] 本文中所描述的每一个实施方案，除非另有特别说明，原则上适用于每个和任何其它实施方案。
[0173] 本领域技术人员知道，对本文所描述的发明，除那些特别描述的地方以外，可以容易地进行改变和修改。应理解的是，本发明包括所有这些改变和修改。本发明也包括单个地或集合地在本说明书中提及或指明的所有步骤、特征、组合物和化合物，和任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和/或所有的组合。
[0174] 本发明在范围上不局限于本文中所描述的具体实施方案，这些实施方案仅旨在用于举例说明。如本文所描述的，功能上等同的产品、组合物和方法显然包括在本发明的范围中。
[0175] 如本文中所使用，术语“来源于”应理解为是指，所述及的整体可以从一个特定的来源，但不一定直接从该来源，获得。
[0177] 图1a提供图示，以显示用于Affymetrix 小麦基因组阵列的未成熟胚的总RNA、标记的cRNA和片段化的cRNA样品的质量。
[0178] 图1b提供图示，以显示用于Affymetrix 小麦基因组阵列的发育中的胚乳的总RNA、标记的cRNA和片段化的cRNA样品的质量。
TM
TM
[0179] 图2是照片拷贝，显示琼脂糖凝胶，其中解析了在GenomeWalker 分析中自小麦扩增的核酸片段，以用于WP04启动子序列的分离。在第6泳道解析了分子量标准。
[0180] 图3是名为pBSubi::bar-nos_R4R3(SEQ ID NO：3)的载体的示意图，该载体是用于克隆启动子和/或报告基因的基础载体。该载体包含Ubi::bar-nos选择盒和用于启动TM子、报告基因和终止序列进入克隆的R4R3多位点Gateway 进入点。该基础载体用于构建每一个启动子的生物射弹转化载体。
[0181] 图4示 意 载 体pPZP20035S hph 35S R4R3(SEQ ID NO：4)，该 载 体 包 含35S::hph-35St选择盒和用于启动子、报告基因和终止序列进入克隆的R4R3多位点TM
Gateway 进入点。该基础载体用于构建每一个启动子的双元转化载体。
Gateway 进入点。该基础载体用于构建每一个启动子的双元转化载体。
[0182] 图5示意载体pMPB0096(SEQ ID NO：5)，该载体是双元载体，用于使用农杆菌将2126bp的WP04小麦启动子(SEQ ID NO：2)导入到细胞中。该载体来源于pPZP20035S hph
35S R4R3，其中该小麦启动子、合成的绿色荧光蛋白(sGFP)和NOS终止子已插入到R4R3多TM
位点Gateway 进入点中。
35S R4R3，其中该小麦启动子、合成的绿色荧光蛋白(sGFP)和NOS终止子已插入到R4R3多TM
位点Gateway 进入点中。
[0183] 图6示意显示载体pMPB0097(SEQ ID NO：6)，该载体用于使用粒子轰击将2126bp的WP04小麦启动子(SEQ ID NO：2)导入到细胞中。该载体来源于pBSubi::bar-nos_R4R3，其中该小麦启动子、合成的绿色荧光蛋白(sGFP)和NOS终止子已插入到R4R3多位点TMGateway 进入点中。
[0184] 图7示意显示载体RHF113qc(SEQ ID NO：7)，该载体用于WP04::GUS-nos表达盒在转基因玉米中的表达。
[0185] 图8示意性显示使用生物射弹转化法转化小麦的程序。
[0186] 图9提供照片，显示小麦(MPB Bobwhite 26)的生物射弹转化的各个阶段。幅A显示供体植物的产生；幅B-D显示合子胚的分离和轰击；幅E-H显示愈伤组织诱导和在草胺磷选择下的再生；幅I显示在选择下的根的形成；幅J显示用于获取转基因后代而在受控制的温室条件下生长的T0植物。
[0187] 图10提供照片，显示使用真空浸润法进行拟南芥的农杆菌介导的转化的各个阶段。幅A显示小麦(MPB Bobwhite 26)。幅A显示在小扁篮中发芽的拟南芥Columbia种子；幅B和C显示约4周大小的幼苗，该苗用于在真空条件下在农杆菌悬浮液中浸花；幅D显示分离并生长至成熟的拟南芥植物；幅E和F显示：经表面消毒后铺种于选择培养基上TM的种子，以及转移到含ARACON 碱的土壤中的推定转基因植物，以及用于T2种子收集的管。
[0188] 图11提供照片，显示由小麦WP04启动子驱动的GFP在10-14DAP时的表达，所述表达局限于转基因种子的胚乳(包括胚乳基部传递层(BETL)细胞)，而在胚或非转基因种子中不存在。
[0189] 图12提供照片，显示由小麦WP04启动子驱动的GFP在25-30DAP时的表达，所述表达局限于转基因种子的胚乳(包括胚乳基部传递层(BETL)细胞)，而在胚或非转基因种子中不存在。
[0190] 图13提供照片，显示由小麦WP04启动子驱动的GUS报告基因在转基因玉米种子的胚乳中，主要地在胚乳基部传递层(BETL)细胞中，的强空间性表达。表达于5DAP在转基因种子的胚乳基部中可见，并持续到至少授粉后25天(DAP)。
[0191] 图14提供照片，显示授粉后15天的发育中的种子(左幅)的纵切片(中间和右幅)，其显示出由小麦WP04启动子驱动的GUS报告基因的表达局限于转基因玉米种子的胚乳基部(特别是BETL细胞)。中幅中的加框的区域与右幅对应，比右幅的放大率低。右幅的标尺显示在其下右角。
[0192] 图15提供照片，显示由小麦WP04启动子驱动的GUS报告基因在48小时吸涨(左列)、72小时吸涨(第二列)后的萌发中的玉米种子的胚乳基部中，和在发芽后的幼苗中(最后3列)的低表达。
[0193] 图16提供示意图，显示如在TIGR基因组浏览器中所示的，名为LOC_Os03g25350的稻基因座及20kb的侧翼序列。
[0194] 图17显示LOC_Os03g25350.1和ZmGSStuc11-12-04.13411.1之间的序列比对，所述比对通过使用LOC_Os03g25350.1作为查询序列，采用核苷酸错配罚分-1，对玉米基因组组装序列进行BLASTN搜索获得。
[0195] 图18提供示意图，显示以下序列之间的多序列比对：
[0196] (i)用于鉴定WP04启动子的基因组步行引物序列；
[0197] (ii)WP04(SEQ ID NO：2)的末端76个核苷酸；
[0198] (iii)PUT-153a-Triticum_aestivum-74777序列；
[0199] (iv)小麦Affymetrix共有序列Ta.10064.1.S1_at；
[0200] (v)分配检索号为AJ890018.1的小麦序列；
[0201] (vi)检索号ZmGSStuc11-12-04.13411.1的玉米基因组序列；
[0202] (vii)使用ZmGSStuc11-12-04.13411.1鉴定出的组装的玉米转录本；
[0203] (viii)对应于LOC_Os03g25350的稻cDNA；
[0204] (ix)对应于LOC_Os03g25350的稻基因组序列(籼型栽培种)，以及
[0205] (x)对应于LOC_Os03g25350的稻基因组序列(粳型栽培种)。
[0206] 优选实施方案的详细描述
[0207] 用于确定本发明的启动子的序列分析参数
[0208] a)序列相同性定义
[0209] 关于确定两个氨基酸序列是否在本文中所定义的百分比同一性范围内，本领域技术人员知道，可以对氨基酸序列进行肩并肩地比较。在这样的比较或比对中，取决于用来进行比对的算法，差异残基的位置可能不同。在本文中，关于两个或多个氨基酸序列之间的百分比同一性和相似性，应理解为分别指，使用本领域技术人员已知的任何标准算法所确定的，所述序列之间一致的和相似的残基的数量。特别地，使用Computer Genetics Group公司(University Research Park，Maddison，Wisconsin，美国)的软件计算氨基酸的同一性和相似性，例如使用GAP程序(Devereaux等，Nucl.Acids Res.12，387-395，1984)，该程序采用Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48，443-453，1970)。备选地，使用CLUSTAL W算法(Thompson等，Nucl.Acids Res.22，4673-4680，1994)获得多个序列的比对，其中必需或期望在比对中使一致的/相似的残基的数量最大和使序列空位的数量和/或长度最小。
[0210] 备选地，美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)提供一套常用和免费获取的序列比较算法，该算法可通过几个来源获得，包括NCBI，Bethesda，Md。BLAST软件套件包括各种序列分析程序，包括“blastn”——其用于将已知的核苷酸序列与来自多种数据库的其它多核苷酸序列进行比对，和“blastp”——其用于将已知的氨基酸序列与来自一个或多个数据库的一个或多个序列进行比对。也可以获得的是称为“BLAST
2Sequences”的工具，其用于两个核苷酸序列的直接成对比较。
2Sequences”的工具，其用于两个核苷酸序列的直接成对比较。
[0211] 关于确定两个核苷酸序列是否在本文中所定义的特定百分比同一性范围内，本领域技术人员知道，必须对序列进行肩并肩地比较或多重比对。在这样的比较或比对中，取决于用来进行比对的算法，差异残基的位置可能不同。在本文中，关于两个或多个核苷酸序列之间的百分比同一性应理解为是指，使用本领域技术人员已知的任何标准算法所确定的，所述序列之间一致的残基的数量。例如，可以使用BESTFIT程序或Computer Genetics Group公司(University Research Park，Maddison，Wisconsin，美国)的其它适当的程序(Devereaux等，Nucl.Acids Res.12，387-395，1984)，比对核苷酸序列和计算它们的同一性。如以上所讨论，BLAST也可以用于比对核苷酸序列和确定百分比同一性。
[0212] 使用术语“至少”或“至少约”述及本文中特定序列同一性水平时，应理解为涵盖了所述水平以上的任何序列同一性水平。据此，本发明包括与所述及的序列至少约80％相同、或与所述及的序列至少约85％相同、或与所述及的序列至少约90％相同、或与所述及的序列至少约95％相同、或与所述及的序列至少约98％或99％相同的核苷酸序列或氨基酸序列。
[0213] b)顺式作用元件分析
[0214] 用于确定启动子是否包含顺式作用元件的方法对技术人员而言将是显而易见的。例如，使用在本领域中公知和/或在本文中所描述的方法分离启动子，并使用在本领域中公知和/或描述于例如Ausubel等(于：Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience，ISBN 047150338，1987)和Sambrook等(于：Molecular Cloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，2001年第
3版)中的方法，确定启动子的序列。例如，使用例如基于PCR的基因组步行，或通过筛选核酸文库(例如，如本文中所描述的)，分离核酸的启动子或其片段，其中所述核酸包含多肽的编码序列，所述多肽包含至少一个最小GILT结构域；使用例如基于双脱氧核苷酸的测序来确定启动子的序列。然后对序列进行分析，以确定其是否包含一个或多个如本文中以上所描述的顺式作用元件。
3版)中的方法，确定启动子的序列。例如，使用例如基于PCR的基因组步行，或通过筛选核酸文库(例如，如本文中所描述的)，分离核酸的启动子或其片段，其中所述核酸包含多肽的编码序列，所述多肽包含至少一个最小GILT结构域；使用例如基于双脱氧核苷酸的测序来确定启动子的序列。然后对序列进行分析，以确定其是否包含一个或多个如本文中以上所描述的顺式作用元件。
[0216] (i)PLACE(植物顺式作用DNA元件)，描述于Higo等，Nucl.Acids Res.27：297-300，1999中，可以从日本的国家农业生物科学研究所(National Institute of Agrobiological Sciences，Ibaraki，Japan)获取；
[0217] (ii)Plant CARE(顺式作用调控元件)Motif Sampler，描述于Thijs等，J Comput Biol.9：447-464，2002中，可以从比利时的佛兰德斯大学校际生物技术研究所(Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology(VIB)，Zwijnaarde，Belgium)获取；以及[0218] (iii)PlantProm数据库，描述于Shahmuradov等，Nucleic Acids Res.31：114-7，2003中。
[0219] 如本文中以上所讨论的，本发明人鉴定出了多个启动子，并且通过分析这些启动子的序列，鉴定出了保守的顺式作用元件，例如来自如下启动子的保守的顺式作用元件，所述启动子能够赋予核酸在发育中的胚乳或其细胞或组织(例如，包括胚乳基部和/或BETL细胞)中的表达或表达模式。例示的启动子序列中所包含的示例性顺式作用元件示于本文表3和表4。在5个例子之间保守的示例性顺式作用元件示于表1。因此，优选的是，根据本文任何实施方案的启动子包含一个或多个表1中所示的顺式作用元件。
[0220] 应理解的是，本发明的启动子中任何特定的顺式作用元件的精确数量可根据长度而变，并且除表1中明确指出的那些顺式作用元件以外，也允许其它元件。技术人员可以容易根据本文中(例如表3和4中)提供的数据，确定表1中所示元件的任何数量的变异。
[0221] 表1、在小麦和玉米启动子中保守的结构序列元件
[0222]
[0223]
[0224] 本发明启动子的植物来源
[0225] 在一个实施方案中，根据本文中任何实施方案的启动子来源于小麦，例如本文中的SEQ ID No：2，或包含表3中所示的全部顺式作用元件或在表1和表5中所示的保守的全部顺式作用元件，不考虑每一个序列中元件的准确取向和/或位置。
[0226] 术语“小麦”应从最广泛的含义上理解为指，能够产生直立的穗状花序和浅棕色谷粒的一年生或二年生草本植物，其属于山羊草属-小麦属种群，包括小麦属(Triticum)和山羊草属(Aegilops)中的种。术语“小麦”因此延及小麦属的任何各种一年生谷类草本植物，例如通常在温带栽培以获取其可食用的谷粒用于生产面粉，例如用于面包和/或饼干和/或面条和/或意大利面中的那些植物。基于本文中的描述，合适的物种和/或栽培种对技术人员而言将是显而易见的。
[0227] 术语“小麦”也包括任何四倍体、六倍体和异源多倍体(例如，异源四倍体和异源六倍体)山羊草属(Aegilops)或小麦属(Triticum)物种，其可以携带异源六倍体小麦(Triticum aestivum)或其变种的A基因组和/或B基因组和/或D基因组。这包括：A基因组二倍体，例如一粒小麦(T.monococcum)和乌拉尔图小麦(T.urartu)；B基因组二倍体，例如拟斯卑尔托山羊草(Aegilops speltoides)和西尔斯山羊草(T.searsii)，和密切相关的S基因组二倍体，例如沙仑山羊草(Aegilops sharonensis)；D基因组二倍体，例如节节麦(T.tauschii)和方穗山羊草(Aegilops squarrosa)；四倍体，例如圆锥小麦(T.turgidum)和二粒小麦(T.dicoccum)(AABB)，粗山羊草(Aegilops tauschii)(AADD)；
以及六倍体，例如普通小麦(T.aestivum)和密穗小麦(T.compactum)。术语“小麦”可以包括山羊草属(Aegilops)或小麦属(Triticum)物种的品种、栽培种和株系，但是除非另有具体说明，不限于其任何特定的品种、栽培种或株系。
以及六倍体，例如普通小麦(T.aestivum)和密穗小麦(T.compactum)。术语“小麦”可以包括山羊草属(Aegilops)或小麦属(Triticum)物种的品种、栽培种和株系，但是除非另有具体说明，不限于其任何特定的品种、栽培种或株系。
[0228] 优选地，小麦为普通小麦(T.aestivum)或圆锥小麦(T.turgidum)(以前被称为硬粒小麦(T.durum))或其品种、栽培种或株系，任选地基于种子质量性状(例如产量、面包制作质量、饼干制作质量或面条/意大利面制作质量)进行选择。
[0229] 从上文中，对技术人员而言将显而易见的是，许多小麦品种为多倍体。据此，任何单个小麦基因组都可能包含多个作为本发明部分的本文中所定义的启动子。本发明显然涉及任何和/或所有的这些启动子。
[0230] 在本发明另一个实施方案中，根据本文中任何实施方案的启动子来自玉米，例如本文中的SEQ ID NOs：8-10，或包含表4中所示的全部顺式作用元件或在表1和表5中所示的保守的全部顺式作用元件，不考虑每一个序列中元件的准确取向和/或位置。
[0231] 术语“玉米”应从最广泛的含义上理解为指，玉蜀黍属(Zea)的草本植物。优选地，术语玉米包括玉蜀黍(Zea mays)种的任何植物。术语玉米包括物种例如，硬粒型玉米(Z.mays indurata)、马齿型玉米(Z.mays indenta)、爆裂型玉米(Z.mays everta)、甜质型玉米(Z.mays saccharata)、粉质型玉米(Z.mays amylacea)、有稃型玉米(Z.mays tunicata)和/或糯质型玉米(Z.mays Ceratina Kulesh)。
[0232] 在本发明另一个实施方案中，根据本文中任何实施方案的启动子来自稻，例如包含表1中所示的全部顺式作用元件而不考虑每一个序列中元件的准确取向和/或位置。
[0233] 术语“稻”应从最广泛的含义上理解为稻属(Oryza)的草本植物，包括籼型和粳型稻物种和品种。优选地，术语稻包括稻(Oryza sativa)种的任何植物。
[0234] 在另一个实施方案中，根据本文中任何实施方案的启动子来自大麦、或高粱、或黑麦、或粟(例如珍珠粟或黍稷)、或荞麦(例如蓼科植物)或燕麦(Avena sativa)，或来源于禾本科(Graminaceae，Gramineae或Poaceae)任何其它植物的细胞、组织或器官。
[0235] 启动子的分离
[0236] 使用多种分子生物学技术中的任何技术，分离根据本文任何实施方案所描述的启动子。例如，使用基于本文中所描述的启动子的序列(例如，在SEQ ID NO：2和/或8中序列)的引物，通过聚合酶链式反应来分离启动子。例如，制备一对引物，其包含至少约20至约30个核苷酸，所述核苷酸能够与如下核酸杂交，所述核酸包含SEQ ID NO：2和/或8之任一或多个中所示的序列。优选地，引物的一个或两个都能够与SEQ ID NO：2和/或8中所示的多个序列杂交，即，引物与保守区域杂交，和/或是简并的。用于设计和制备用于PCR的引物的合适方法在本领域公知，和/或描述于Dieffenbach(编辑)和Dveksler(编辑)(于：PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratories，NY，1995)中。然后将这些引物与核酸模板(例如，来自植物的基因组DNA)的不同链杂交，酶促扩增模板的特定核酸拷贝。在扩增之后，使用本领域公知的方法分离扩增后的核酸，并优选地，将其克隆到合适的载体中。这样的方法可以用于从任何植物的核酸(优选地，基因组DNA)分离启动子。
[0237] 用于分离根据本发明的启动子的示例性杂交条件包括例如如下条件，其等价于在7％的十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，其后在例如2x SSC、
0.1％SDS中于50℃的条件下洗涤以除去非特异性杂交的探针。在另一个实施方案中，杂交条件等价于在7％的十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，其后在例如1x SSC、0.1％SDS中于50℃的条件下洗涤以除去非特异性杂交的探针。在另一个实施方案中，杂交条件等价于在7％的十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，其后在例如0.5x SSC、0.1％SDS中于50℃的条件下洗涤以除去非特异性杂交的探针。在另一个实施方案中，杂交条件等价于在7％的十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，其后在例如0.1xSSC、0.1％SDS中于50℃的条件下洗涤以除去非特异性杂交的探针。在另一个实施方案中，杂交条件等价于在7％的十二烷基硫酸钠(SDS)、
0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，其后在例如1x SSC、0.1％SDS中于65℃的条件下洗涤以除去非特异性杂交的探针。
0.1％SDS中于50℃的条件下洗涤以除去非特异性杂交的探针。在另一个实施方案中，杂交条件等价于在7％的十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，其后在例如1x SSC、0.1％SDS中于50℃的条件下洗涤以除去非特异性杂交的探针。在另一个实施方案中，杂交条件等价于在7％的十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，其后在例如0.5x SSC、0.1％SDS中于50℃的条件下洗涤以除去非特异性杂交的探针。在另一个实施方案中，杂交条件等价于在7％的十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，其后在例如0.1xSSC、0.1％SDS中于50℃的条件下洗涤以除去非特异性杂交的探针。在另一个实施方案中，杂交条件等价于在7％的十二烷基硫酸钠(SDS)、
0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，其后在例如1x SSC、0.1％SDS中于65℃的条件下洗涤以除去非特异性杂交的探针。
[0238] 上述杂交条件也用来鉴定或分离核酸，所述核酸包含连接到根据本文中任何实施方案所描述的本发明启动子或其它转录调控核苷酸序列的变体上的编码序列、或其互补序列，其中所述编码序列或其互补序列与连接到根据本文中任何实施方案所描述的本发明启动子或其它转录调控核苷酸序列上的编码序列或其互补序列杂交。因此，可以通过在所连接的编码区(于核苷酸序列水平上至少约50％或60％或70％或80％或90％或95％或更多相同)之间杂交，然后分离所连接的变体启动子或其它转录调控核苷酸序列，来分离变体启动子或其它转录调控核苷酸序列。
[0239] 备选地或此外，制备能够与根据本文中任何实施方案所描述的启动子杂交的寡核苷酸。优选地，寡核苷酸能够与根据本文中任何实施方案所描述的启动子中的如下区域杂交，所述区域在多个启动子中保守。备选地或此外，寡核苷酸能够在低或中等严紧条件下，与根据本文中任何实施方案所描述的多个启动子杂交。这样的寡核苷酸随后可以用于筛选核酸文库(例如，包含来自植物的基因组DNA片段的文库)，筛选方法是本领域公知的和描述于例如Ausubel等(于：Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience，ISBN 047150338，1987)，Sambrook等(于：Molecular Cloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，2001年第3版)中。然后分离合适的片段，如果需要，从片段中分离启动子。
[0240] 也可以基于其赋予在发育中的胚乳中(例如，在胚乳基部中，例如在BETL细胞中)表达的能力来分离合适的启动子。例如，使用一个或多个与本发明的启动子杂交的寡核苷酸引物，利用来自发育中的胚乳或胚乳基部或BETL细胞的mRNA进行RT-PCR，扩增包含这样的核酸的cDNA片段。然后使用该片段分离赋予所述mRNA表达或表达模式的启动子。例如，如本文中所描述，使用基因组步行来分离启动子。在该方法中，对来自植物的基因组DNA进行切割(例如，使用限制性内切酶)，随后连接到具有已知序列的接头。然后使用能够与接头退火的引物和能够与cDNA片段退火的引物进行PCR。以这种方式，分离与启动子在其天然环境中连接的序列的上游或5’序列，包括启动子序列。
[0241] 备选地，使用寡核苷酸筛选来自植物的基因组DNA文库来分离包含基因或其片段的基因组DNA片段，所述基因或其片段包含启动子。然后，可以使用来自分离的基因组DNA片段的序列来分离另外的基因组DNA片段。例如使用本文中所描述的方法，通过分析基因组DNA的核苷酸序列，来确定启动子的序列。
[0242] in-silico筛选也可以用于鉴定合适的启动子。例如，本发明人鉴定了与根据本文中任何实施方案所描述的启动子天然有效连接的基因的多个保守区域。基于这些序列中的一个或多个，对来自植物的序列数据库(例如，包含基因组DNA序列的数据库)进行搜索，鉴定与保守区域同源的序列。然后对所鉴定区域的上游序列进行分析以鉴定与其有效连接的启动子的序列。启动子预测的in-silico方法在本领域公知，描述于例如Shahmuradov等，Nucleic Acids Research 33：1069-1076，2005中，或使用从伦敦Royal Holloway大学的生物科学学院(School of Biological Sciences，Royal Holloway University of London)获取的植物启动子预测软件。
[0243] 应对使用任何以上所描述的方法鉴定出的启动子进行经验测试，以确定其赋予核酸例如在发育中的胚乳或其细胞或组织中(例如，在胚乳基部中，例如在BETL细胞中)表达的能力。基于本文中描述，用于测试启动子的合适的方法对技术人员而言将是显而易见的。
[0244] 启动子、活性片段或衍生物赋予胚乳表达的能力
[0245] 用于确定启动子或其片段或其衍生物赋予核酸表达的能力的方法包括，例如，测定启动子、片段、衍生物在植物的细胞、组织或器官中诱导报告基因表达的能力。
[0246] 例如，使根据本文中任何实施方案所描述的启动子或片段或衍生物与报告基因有效连接，所述报告基因例如为产生可检测信号的报告基因，或允许对表达该基因的细胞进行选择的报告基因。
[0247] 报告基因对技术人员而言将是显而易见的，其包括例如，bar基因(双丙氨膦抗性基因)、细菌新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因、潮霉素磷酸转移酶基因、aacC3基因、aacC4基因、氯霉素乙酰转移酶基因、5-烯醇式丙酮酸-莽草酸-3-磷酸合酶编码基因或膦丝菌素合酶编码基因。这些基因每一个都赋予对除草剂或抗生素的抗性。备选地，报告基因可以在使未转化的植物细胞不能生长和/或存活的化合物存在时，赋予存活和/或生长的能力，例如mana基因(Hansen和Wright，Trends in Plant Sciences，4：226-231，1999)、氰胺水合酶(Cah)基因(如USSN09/518,988中所描述)、或D-氨基氧化酶(DAAO)基因(Erikson等，Nature Biotechn ology，22：455-458，2004)。
[0248] 在表达时产生可检测表达产物的报告基因包括，例如β-葡糖醛酸糖苷酶基因(GUS；通过5-溴-4-氯-3-吲哚-1-葡糖苷酸的代谢产生蓝色沉淀来检测其表达)、细菌萤光素酶基因、萤火虫萤光素酶基因(可通过以萤光素接触植物细胞进行检测)、或荧光报告基因，例如单体香菇珊瑚红色荧光蛋白(Campbell等，Proc Natl Acad Sci U S A.99：7877-7882，1992)或来自水母(Aequorea coerulescens)的单体GFP(Gurskaya等，Biochem J.373：403-408，2003)。
[0249] 在将根据本文中任何实施方案所描述的启动子或片段或衍生物与合适的报告基因连接后，例如使用本文中所描述的方法，将所产生的表达构建体转化到植物细胞或植物部分或植物中。然后检测报告基因的表达。例如，就可进行选择的报告基因来说，使转化的植物细胞、部分或植物在合适的除草剂或抗生素存在下生长，只有那些表达报告基因的胚或细胞能够生长。就可进行检测的报告基因来说，对植物细胞、植物部分或整个植物进行分析，以检测可检测的报告基因表达产物(例如荧光或底物代谢产生的可检测的代谢物)的表达。
[0250] 备选地，使用本领域公知和/或本文中所描述的方法转化植物细胞或组织。然后使用转化了的细胞或组织再生植物。可选地，培育该植物并种植植物的后代。此方法提供了另外的好处，即，其允许在各种组织中并在各个发育阶段检测报告基因的表达水平。就鉴定赋予核酸在发育中的胚乳中(例如，在胚乳基部中，例如在BETL细胞中)表达的启动子来说，使植物生长至其产生种子。然后，对来自发育中的种子的胚乳进行分析，以检测报告基因在例如胚乳基部中(例如BETL细胞中)的表达。这样的方法允许鉴定优先地或选择性地在发育中的胚乳或其细胞或组织中(例如，在胚乳基部中，例如在BETL细胞中)表达报告基因的启动子。
[0251] 也可以通过使用例如Northern印迹、定量PCR、微阵列分析或免疫分析法，测定天然连接启动子的核酸的表达产物的表达模式，以确定启动子赋予核酸例如在发育中的胚乳或其细胞或组织中(例如，在胚乳基部中，例如在BETL细胞中)表达或表达模式的能力。合适的方法对技术人员而言将是显而易见的，并/或描述于Ausubel等(于：Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience，ISBN 047150338，1987)，Sambrook等(于：Molecular Cloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，2001年第3版)中。
[0252] 例如，如本文中所例示，本发明人已经进行了微阵列分析，以检测与根据本文中任何实施方案所描述的启动子连接的核酸在各种组织中的表达水平。此方法包括从来自植物的各种组织分离mRNA，制备拷贝RNA(cRNA)并例如使用荧光标记(例如Cy5)标记cRNA。也以和用于标记测试cRNA的标记(例如Cy5)不同的标记，对来自对照组织的拷贝RNA进行标记，并混合两样品。然后将标记的cRNA与固相基质接触，所述固相基质在其上固定有寡核苷酸，所述寡核苷酸能够特异地和连接到目的启动子的核酸杂交。在标记的mRNA与寡核苷酸杂交足够时间之后，洗涤固相基质并检测每个标记的荧光水平。用这种方式，测定和对照样品中的水平相比较，测试样品中目的核酸的表达水平。使用该方法，本发明人证实，与在成熟种子、营养组织或生殖组织(对照样品)(其中本发明例示的启动子不赋予显著表达)中相比较，与根据本文中任何实施方案所描述的启动子有效连接的基因所编码的转录本，在发育中的胚乳(测试样品)中以更高的水平表达。
[0253] 本发明也使用定量RT-PCR测定连接到根据本文中任何实施方案所描述的启动子的核酸的表达水平。用于进行这样的定量RT-PCR的合适方法对技术人员而言将是显而易见的，并/或描述于例如US 6,174,670中。
[0254] 活性启动子片段
[0255] 本发明也包括根据本文中任何实施方案所描述的启动子的片段。在一个实施方案中，这样的活性片段保留了启动子赋予核酸在发育中的胚乳或其细胞或组织中(例如，在胚乳基部中，例如在BETL细胞中)表达或表达的模式的能力。在此方面，片段不必和其来源的启动子赋予同样水平的表达或表达模式。例如，比其来源的启动子，片段诱导与其有效连接的核酸更低程度地表达，例如因为片段缺乏转录因子的结合位点。备选地，比其来源的启动子，片段可以诱导与其有效连接的核酸更高程度地表达，因为例如片段缺乏转录抑制蛋白的结合位点。
[0256] 在一个实施方案中，本发明提供了根据本文中任何实施方案所描述的启动子的活性片段，所述活性片段包含，例如来源于序列表中所示的例示启动子的，至少约200个碱基对(bp)或至少约500bp或至少约700bp或至少约900bp或至少约1000bp。
[0257] 在另一个实施方案中，本发明的活性启动子片段至少包含来自全长启动子的基本启动子调控区域，例如为在种子胚乳中转录起始所必需和/或足以在种子胚乳中引起转录起始的最少序列。基本启动子调控区域包含功能TATA盒元件，所述TATA盒元件例如位于转录起始位点上游约15至约50个核苷酸之间，优选转录起始位点上游约15至约40个核苷酸之间，更优选转录起始位点上游约15至约30或35个核苷酸之间。为了命名目的，在此上下文中的基本启动子调控区域包含SEQ ID No：2或8或其互补序列的末端100或90或80或70或60或50或40个核苷酸。
[0258] 优选的基本启动子调控区域也包含CCAAT盒元件(例如，序列CCAAT或GGGCG)，其位于转录起始位点上游约40至约200个核苷酸之间、或约50至约150个核苷酸之间、或约60至约120个核苷酸之间。为了命名目的，在此上下文中的基本启动子调控区域包含SEQ ID No：2或8或其互补序列的末端200或190或180或170或160或150或140或130或
120或110或100或90或80或70或60或50个核苷酸。
120或110或100或90或80或70或60或50个核苷酸。
[0259] 本发明也提供了包含天然启动子的基本启动子调控区域和一个或多个上游元件的活性片段。例如，活性片段可以包含SEQ ID No：2或8或其互补序列的末端500个核苷酸、或末端400个核苷酸、或末端300个核苷酸或末端200个核苷酸。或者，与SEQ ID No：2或8中所示的启动子序列相比，这样的活性片段可以是在3’末端被截短了的，例如通过缺失转录起始位点下游的序列。例如，活性片段可以包含SEQ ID No：2或8或其互补序列的3’末端上游从约500个核苷酸到约40个核苷酸间、或SEQID No：2或8或其互补序列的3’末端上游从约400个核苷酸到约40个核苷酸间、或SEQ ID No：2或8或其互补序列的3’末端上游从约300个核苷酸到约40个核苷酸间、或SEQ ID No：2或8或其互补序列的3’末端上游从约200个核苷酸到约40个核苷酸间、或SEQ ID No：2或8或其互补序列的3’末端上游从约400个核苷酸到约50个核苷酸间、或SEQ ID No：2或8或其互补序列的3’末端上游从约500个核苷酸到约60个核苷酸间、或SEQ ID No：2或8或其互补序列的3’末端上游从约300个核苷酸到约70个核苷酸间、或SEQ ID No：2或8或其互补序列的3’末端上游从约200个核苷酸到约80个核苷酸间的序列。不排除其它片段。这样的活性片段优选包含于本文中公开的一个或多个保守的序列基序。
[0260] 用于产生根据本文中任何实施方案所描述的启动子的片段的合适方法，对技术人员而言将是显而易见的，和/或描述于例如Ausubel等(于：Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience，ISBN047150338，1987) 和 Sambrook 等 ( 于：Molecular Cloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Third Edition 2001)中。例如，使用任何已知的方法(例如，使用一种或多种限制性内切核酸酶)对以前分离的启动子进行切割，然后对所得到的片段进行分析，以确定其赋予核酸在发育中的胚乳或其细胞或组织(例如，胚乳基部或BETL细胞)中表达或表达的模式的能力。备选地，使用核酸扩增反应(例如，PCR)对根据本文中任何实施方案所描述的启动子的片段进行扩增。然后对所得到的片段进行分析，以确定其是否能够向核酸赋予例如在发育中的胚乳(例如，包括胚乳基部或BETL细胞)中的表达或表达模式。
[0261] 用于确定片段赋予核酸表达或表达模式的能力的合适方法描述于本文中。
[0262] 启动子衍生物
[0263] 本发明所涵盖的启动子衍生物包括来源于根据本文中任何实施方案所描述的启动子的启动子，然而其包含一个或多个来源于例示的启动子或异源启动子的额外的调控元件。例如，该额外的调控元件进一步增强与其有效连接的核酸的表达，和/或改变与其有效连接的序列的表达时间选择。例如，包含SEQ ID NO：2或8中所示的核苷酸序列的该嵌合启动子可以通过包括来自不同的胚乳有效启动子的核酸而改变，以进一步增强与启动子有效连接的核酸在发育中的胚乳或其细胞或组织中的表达。本领域技术人员很容易执行这样的实施方案。
[0264] 本领域技术人员知道，通过对与核酸有效连接的启动子序列中的调控遗传序列(例如，顺式作用元件或5’非编码区等)进行突变，也可以改变植物或植物部分中结构基因表达的水平、和/或结构基因表达的时间、和/或结构基因表达的位置。例如，为了达到该目的，对本发明的启动子序列进行诱变，以产生单个或多个核苷酸的替换、缺失和/或添加。
[0265] 备选地或此外，可以改变启动子中特定调控序列的排列，包括从启动子中删除某些调控序列和/或在其中添加来源于相同或不同启动子序列的调控序列。
[0266] 根据本文中任何实施方案所描述的启动子的优选衍生物包含一个或多个存在于根据本文中任何实施方案所描述的启动子中的功能性顺式作用元件，例如，为赋予表达或表达模式所需的或与之相关的顺式作用元件。
[0267] 启动子的衍生物可以利用合成手段制备，或备选地，从天然来源衍生。
[0268] 例如，可以对启动子序列进行衍生而不完全丧失其功能，这样其至少包含一个或多个以下序列：
[0269] (i)5’非编码区；和/或
[0270] (ii)一个或多个顺式调控区域，例如一个或多个转录调控蛋白或翻译调控蛋白的功能性结合位点、一个或多个上游激活序列、增强子元件或沉默子元件；和/或
[0271] (iii)TATA盒基序；和/或
[0272] (iv)CCAAT盒基序；和/或
[0273] (v)上游开放阅读框(uORF)；和/或
[0274] (vi)转录起始位点；和/或
[0275] (vii)翻译起始位点；和/或
[0276] (viii)编码前导序列的核苷酸序列。
[0277] 如本文中所使用，术语“5’非编码区”应从最广泛的含义上理解为包括来源于基因(例如在发育中的胚乳中表达的基因)的上游区域的所有核苷酸序列，但不是编码包含所述基因的多肽产物的氨基酸残基的那些序列。这样的区域包括内含子，例如来源于泛素基因的内含子。
[0278] 如本文中所使用，术语“uORF”指位于基因中功能性翻译起始位点上游并通常位于5’转录区内、编码氨基酸序列的核苷酸序列(即，前导序列)。然而，不受限于任何理论或作用方式，uORF所起的作用可以是防止与其有效连接的结构基因序列的过量表达或备选地，降低或阻止该表达。
[0279] 本发明所涉及的其它衍生启动子包括，例如，包含根据本文中任何实施方案所描述的启动子的双向启动子。这样的双向启动子包括，例如，(i)根据本文中任何实施方案所描述的启动子，所述启动子位于可以赋予连接到例如其3’末端的核酸表达或表达模式的位置；(ii)连接到(i)中的启动子的5’末端的第二启动子，第二启动子位于可以赋予连接到第二启动子的5’末端的核酸表达或表达模式的位置。显然，第二启动子也可以是根据本文中任何实施方案所描述的启动子。
[0280] 表达构建体和表达载体
[0281] 在分离根据本文中任何实施方案所描述的启动子后，可以制备表达构建体。这样的表达构建体包含有效连接到待表达的核酸(即，转基因)的根据本文中任何实施方案所描述的启动子、活性片段或衍生物，所述待表达的核酸例如为编码目的多肽的核酸，或转录后编码例如siRNA、核酶、microRNA或RNAi的核酸。
[0282] 本发明涉及将根据本文中任何实施方案所描述的启动子、活性片段或衍生物连接到任何转基因。合适的转基因的例子对技术人员而言将是显而易见的，和/或描述于本文中。
[0283] 用于将根据本文中任何实施方案所描述的启动子、活性片段或衍生物与转基因连接的方法，对技术人员而言将是显而易见的，包括，例如使用T4DNA连接酶将启动子、活性片段或衍生物连接到转基因。备选地或此外，使用重组手段(例如，剪接-重叠延伸)使启动子、活性片段或衍生物与转基因融合。用于连接两个或多个核酸的合适方法也描述于例如Ausubel等(于：Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience，ISBN 047150338，1987)和Sambrook等(于：Molecular Cloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，2001年第3版)中。
[0284] 这样的表达构建体可以包含额外的组件，所述组件例如编码靶向序列或可检测标记的序列。这样的额外的组件可以位于启动子和转基因之间，例如，使其以和转基因所编码的多肽5’融合的形式表达。备选地，额外的组件可以位于转基因的3’。
[0285] 靶向序列是多肽中引导多肽到特定的亚细胞位置的氨基酸序列。可以用于本发明的靶向序列在本领域公知并描述于，例如Johnson等，The Plant Cell 2：525-532，1990；Mueckler等，Science 229：941-945，1985；Iturriaga等，The Plant Cell 1：381-390，
1989；McKnight等，Nucl.Acid Res.18：4939-4943，1990；Matsuoka和akamura，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：834-838，1991中。此外，书名为《来自植物的重组蛋白》的书籍(编辑：
C.Cunningham和A.J.R.Porter，1998Humana Press Totowa，N.J)中描述了用于在植物中生产重组蛋白的各种合适方法和用于使蛋白质靶向植物细胞中不同区室的方法。
1989；McKnight等，Nucl.Acid Res.18：4939-4943，1990；Matsuoka和akamura，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：834-838，1991中。此外，书名为《来自植物的重组蛋白》的书籍(编辑：
C.Cunningham和A.J.R.Porter，1998Humana Press Totowa，N.J)中描述了用于在植物中生产重组蛋白的各种合适方法和用于使蛋白质靶向植物细胞中不同区室的方法。
[0286] 合适的可检测标记包括，例如表位，例如，流感病毒血凝素(HA)、猿猴病毒5(V5)、多组氨酸、c-myc、FLAG。
[0287] 备选地或此外，根据本文中任何实施方案所描述的启动子、活性片段或衍生物包含在表达载体中。在此方面，这样的表达载体可以包含有效连接到根据本文中任何实施方案所描述的启动子、活性片段或衍生物的转基因。备选地或此外，表达载体可以包含用于插入基因的手段，以使基因有效连接到启动子、片段或衍生物。这样的手段包括，例如包含一个或多个限制性内切核酸酶切割位点的多克隆位点。另外的手段包括一个或多个重组位点。
[0288] 表达载体的另外组件对技术人员而言将是显而易见的，包括，例如允许载体在细菌细胞中复制的复制起点，例如ColE1复制起点。
[0289] 表达载体也可以包含有效连接到启动子的选择标记基因。示例性选择标记基因包括以下之一或多个：编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的序列；编码经修饰的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的序列，任选地连接编码叶绿体转运肽的序列；编码降解草甘膦的酶(例如草甘膦氧化还原酶(gox))的序列；编码失活茅草枯的脱卤素酶(deh)的序列；编码失活磺酰脲的乙酰乳酸合酶或失活咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶(例如，ahas，ALS，具有例如EP154204中所描述的S4、XI12、XA17和/或Hra突变的突变ahas变体或突变ALS变体)的序列；编码降解溴苯腈的腈水解酶(bxn)的序列；编码卡那霉素抗性基因(例如，NPTII；NPT或neo)的序列；编码遗传霉素抗性基因(例如，G418抗性基因)的序列；编码2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶(例如，DOGR1基因产物；WO 98/45456；EP 0807836)的序列；编码潮霉素磷酸转移酶(例如，HPT)的序列；编码赋予对氨甲蝶呤抗性的经修饰的二氢叶酸还原酶的序列；编码赋予对5-甲基色氨酸抗性的经修饰的或突变的邻氨基苯甲酸合酶的序列。也可以使用另外的细菌来源的赋予对抗生素抗性的负选择标记基因，例如，赋予对抗生素壮观霉素抗性的aadA基因，编码庆大霉素乙酰转移酶或链霉素磷酸转移酶(SPT)或氨基糖苷-3-腺嘌呤转移酶的序列、或能够赋予对博来霉素抗性的序列。特别优选的负选择标记基因赋予对D-氨基酸(例如，描述于WO 03/060133中的，D-丙氨酸和/或D-丝氨酸)所施与的毒性效应的抗性。例如，可以使用Rhodotorula gracilis或圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)的daol基因(E.C.1.4.3.3；GenBank登录号U60066)和/或编码D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶)(E.C.4.3.1.18；GenBank登录号J01603)的大肠杆菌(E.coli)dsdA基因，以赋予对D-氨基酸所施与的毒性效应的抗性。如本领域公知，可以在遗传构建体中使用上述选择标记基因的组合。
[0290] 可以将一个或多个选择标记有效连接到泛在启动子(ubiquitous promoter)上，例如来自泛素(ubi)的启动子或来自花椰菜花叶病毒的启动子(例如，CaMV 35S)。合适的启动子和选择标记对技术人员而言将是显而易见的。
[0291] 就使用基于农杆菌的转化来递送表达载体到植物中而言，载体优选包含位于待转移到植物细胞中的转基因侧翼的左边界(LB)序列和右边界(RB)序列，即，转移DNA。这样的载体也可以包含合适的选择标记，用于对包含载体的细菌进行选择，例如通过赋予对氨苄青霉素的抗性。
[0292] 优选地，载体为双元Ti质粒或Ri质粒。双元Ti质粒或Ri质粒的产生是基于：观察到T-DNA(转移到植物细胞的核酸)和转移T-DNA所需的vir基因可以分别位于不同的质粒上(Hoekema等，Nature，303：179-180，1983)。在此方面，vir功能通常由在用于转化植物细胞的农杆菌菌株中寄居或内源的卸甲Ti质粒提供。
[0293] 据此，双元Ti质粒或Ri质粒包含位于转移核酸(例如，T-DNA)内的转基因。这样的包含转基因的转移核酸通常由LB和RB位于其侧翼或界定其边界。
[0294] 合适的双元质粒在本领域公知和/或可商业获取。例如，对双元Ti载体的选择包 括 pBIN19(Bevan 等，Nucleic Acids Res.，12：8711-8721，1984)；pC22(Simoens 等，Nucleic Acids Res.14：8073-8090，1986)；pGA482(An 等，EMBO J.4：277-284，1985)；pPCV001(Koncz 和 Schell Mol.Gen.Genet.204：383-396，1986)；pCGN1547(McBride 和Summerfelt 14：269-276，1990)；pJJ1881(Jones等，Transgenic Res.1：285-297，1992)；
pPZP111(Hajukiewicz等，Plant Mol.Biol.，25：989-994，1994)；和pGreen0029(Hellens等，Plant Mol.Biol.，42：819-832，2000)。
pPZP111(Hajukiewicz等，Plant Mol.Biol.，25：989-994，1994)；和pGreen0029(Hellens等，Plant Mol.Biol.，42：819-832，2000)。
[0295] 另外的双元载体描述于，例如Hellens和Mullineaux Trends in Plant Science5：446-451，2000。也可以使用例如描述于本文中或在本领域公知的这些质粒的变体。
[0296] 合适的Ri质粒也在本领域公知，其包括，例如pRiA4b(Juouanin Plasmid，12：91-102，1984)、pRi1724(Moriguchi等，J.Mol. Biol.307：771-784，2001)、pRi2659(Weller等，Plant Pathol. 49：43-50，2000)或pRi1855(O′Connell等，Plasmid 18：156-163，
1987)。
1987)。
[0297] 转基因
[0298] 如上文所讨论的，本发明包括表达构建体或表达载体，所述表达构建体或表达载体包含连接到任何转基因的根据本文中任何实施方案所描述的启动子、活性片段或衍生物。
[0299] 在一个实施方案中，转基因编码待在发育中的胚乳或其细胞或组织(例如，植物的胚乳基部或BETL细胞)中表达的多肽。例如，转基因编码多肽，所述多肽参与淀粉或贮藏蛋白的生物合成或一种或多种溶质的运输，所述溶质(例如，糖、糖磷酸、核苷酸糖磷酸、氨基酸、叶酸、磷酸盐、铁等)为胚乳发育和/或籽粒灌浆和/或贮藏蛋白的积累所需。这样的转基因的表达可以用于延长籽粒灌浆或增强产量特征，或增强种子的营养品质。这样的表达构建体也可以用于例如改善终产物的性状，包括而不限于编码转运蛋白、种子贮藏蛋白、脂肪酸途径酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶和淀粉分支酶。
[0300] 示例性的转运蛋白包括，例如氨基酸选择性通道蛋白(例如，Pohlmeyer等，Proc Natl Acad Sci U S A.94(1997)，9504-9509)、ABC型转运蛋白(ATP酶组分，EC 3.6.3；Krattinger等，Science 323(2009)，1360-1363)、磷酸盐易位蛋白(例如Knappe等，Plant Physiol.131(2003)，1178-1190)、葡萄糖-6-磷酸/磷酸易位蛋白(例如Kammerer等，The Plant Cell 10(1998)，105-117)、质体核苷酸转运蛋白(例如Neuhaus等，The Plant Journal 11(1997)，73-82)、ADP-葡萄糖转运蛋白(例如BT1蛋白(例如ZmBT1)(例如Cao 等，Physiologia Plantarum 95(1995)，176-186；Sullivan 等，Planta 196(1995)，
477-484；Cao等，Physiologia Plantarum 100(1997)，400-406)、或转运蛋白的线粒体载体家族(MCF)的其它转运蛋白(例如Sullivan等，The Plant Cell 3(1991)，1337-1348；
Picault等，Trends in Plant Sci. 9(2004)，138-146)。
477-484；Cao等，Physiologia Plantarum 100(1997)，400-406)、或转运蛋白的线粒体载体家族(MCF)的其它转运蛋白(例如Sullivan等，The Plant Cell 3(1991)，1337-1348；
Picault等，Trends in Plant Sci. 9(2004)，138-146)。
[0301] 示例的种子贮藏蛋白包括玉米醇溶蛋白(例如，如美国专利号4,886,878，4,885,357和5,215,912中所描述)、7S蛋白(例如，如美国专利号5,003,045和5,576,203中所描述)、巴西坚果蛋白(例如，如美国专利号5,850,024中所描述)、无苯丙氨酸蛋白(例如，如PCT公布WO96/17064中所描述)、白蛋白(例如，如PCT公布WO 97/35023中所描述)。
[0302] 脂肪酸途径酶的例子包括，例如硫酯酶(例如，如美国专利号5,512,482，5,530,186和5,945,585中所描述)和脱饱和酶(例如，如美国专利号5,689,050，
5,663,068和5,614,393中所描述)。在一个实施方案中，硬脂酰-ACP脱饱和酶编码基因的表达被下调，由此增加种子的硬脂酸含量，例如，Knultzon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
89,2624(1992)和WO99/64579。在另一个实施方案中，通过修饰FAD-2基因、和/或通过修饰FAD-3基因以降低亚麻酸含量，来提高或增强油酸含量，例如，如美国专利号6,063,947、
6,323,392和6,372,965；以及WO 93/11245。在另一个实施方案中，改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，例如，WO01/12800。在另一个实施方案中，改变一个或多个基因的表达，所述基因选自LEC1、AGP、Dek1、Superal1、mi1ps和lpa基因(例如，lpa1、lpa3、hpt或hggt)，例如，WO 02/42424、WO 98/22604、WO03/011015，美国专利号6,423,886、美国专利号6,197,561、美国专利号6,825,397、美国专利公布号20030079247、20030204870，和WO02/057439和WO
03/011015，以及Rivera-Madrid等，Proc.Natl.Acad.Sci.92，5620-5624，1995。
5,663,068和5,614,393中所描述)。在一个实施方案中，硬脂酰-ACP脱饱和酶编码基因的表达被下调，由此增加种子的硬脂酸含量，例如，Knultzon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
89,2624(1992)和WO99/64579。在另一个实施方案中，通过修饰FAD-2基因、和/或通过修饰FAD-3基因以降低亚麻酸含量，来提高或增强油酸含量，例如，如美国专利号6,063,947、
6,323,392和6,372,965；以及WO 93/11245。在另一个实施方案中，改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，例如，WO01/12800。在另一个实施方案中，改变一个或多个基因的表达，所述基因选自LEC1、AGP、Dek1、Superal1、mi1ps和lpa基因(例如，lpa1、lpa3、hpt或hggt)，例如，WO 02/42424、WO 98/22604、WO03/011015，美国专利号6,423,886、美国专利号6,197,561、美国专利号6,825,397、美国专利公布号20030079247、20030204870，和WO02/057439和WO
03/011015，以及Rivera-Madrid等，Proc.Natl.Acad.Sci.92，5620-5624，1995。
[0303] 在另一个实施方案中，为了在转基因植物中获得特别高含量的多不饱和脂肪酸(PUFA；例如，具有至少2个或3个或4个或5个或6个双键的C18-，C20-或C22-脂肪酸)，对一个或多个PUFA生物合成基因在本发明的启动子、活性片段或衍生物的控制下进行表达。任选地，多个这样的基因在多个启动子、其活性片段或衍生物的控制下分开地表达，其中至少一个启动子、活性片段或衍生物为本发明的启动子、活性片段或衍生物，且一个或多个其它在胚和/或胚乳(例如，胚乳基部和/或BETL细胞)中具有活性的启动子被用于基因堆积方法中。例如，通过改变具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的表达，增强PUFA的含量，例如，其中酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶由特异转化C16-，C18-，C20-或C22-脂肪酸的核酸序列编码，并任选地改变一个或多个酰基辅酶A脱氢酶、和/或一个或多个酰基ACP [＝酰基载体蛋白]脱饱和酶、和/或一个或多个酰基ACP硫酯酶、和/或一个或多个脂肪酸酰基转移酶、和/或一个或多个脂肪酸合成酶、和/或一个或多个脂肪酸羟化酶、和/或一个或多个乙酰辅酶A羧化酶、和/或一个或多个酰基辅酶A氧化酶、和/或一个或多个脂肪酸脱饱和酶、和/或一个或多个脂肪酸乙炔酶、和/或一个或多个脂氧化酶、和/或一个或多个三酰甘油脂肪酶、和/或一个或多个allenoxide合酶、和/或一个或多个氢过氧化物裂合酶、和/或一个或多个脂肪酸延长酶的表达。特别优选的在本发明的启动子或其活性片段或衍生物的控制下表达的转基因包括，例如一个或多个Δ4-脱饱和酶、和/或一个或多个Δ5-脱饱和酶、和/或一个或多个Δ6-脱饱和酶、和/或一个或多个Δ8-脱饱和酶、和/或一个或多个Δ9-脱饱和酶、和/或一个或多个Δ12-脱饱和酶、和/或一个或多个Δ5-延长酶、和/或一个或多个Δ6-延长酶、和/或一个或多个Δ9-延长酶(美国专利公布号20090094707)。在这样的涉及基因堆积的实施方案中，只需要其中一个导入的转基因(例如，Δ4-脱饱和酶、或Δ5-脱饱和酶、或Δ6-脱饱和酶、或Δ8-脱饱和酶、或Δ9-脱饱和酶、或Δ12-脱饱和酶、或Δ5-延长酶、或Δ6-延长酶、或Δ9-延长酶)以正义或反义方向被置于在本发明的启动子的有效控制下。包含根据本发明的方法合成的多不饱和脂肪酸的转基因植物可直接销售，而无需分离合成的油、脂质或脂肪酸。也可以使用来源于转基因植物的收获材料、植物组织、生殖组织和细胞培养物。也可以以油、脂肪、脂质和/或游离脂肪酸的形式分离根据本发明的转基因植物的产物。以本方法生产的多不饱和脂肪酸可以通过如下方式获得：从生长其的作物或从田间收获生物体，采用例如压榨或其它提取方法，例如冷抽打或冷压榨，或通过粉碎、蒸煮或烘烤和基于溶剂的提取(例如，使用温热的己烷)对种子进行预加工。此后，对所得到的产物进行进一步加工，即，精炼以除去植物黏液和悬浮物质、脱矿泥、和脂肪酸的碱提取(例如，使用氢氧化钠)、干燥、漂白和脱臭。
[0304] 在另一个实施方案中，通过在启动子、其活性片段或衍生物的控制下，在胚乳(例如，胚乳基部和/或BETL细胞)中表达肌醇六磷酸酶编码基因，由此增强肌醇六磷酸的分解，增加游离磷酸对转化的植物的可得性，从而改变胚乳的磷含量。黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因由例如Van Hartingsveldt等，Gene 127：87(1993)公开。
[0305] 在另一个实施方案中，在根据本发明的启动子或其活性片段或衍生物的有效控制下，表达降低肌醇六磷酸含量的基因。在玉米中，这可以通过表达LPA等位基因(例如，Raboy等，(1990)Maydica 35：383)和/或通过改变肌醇激酶的活性(例如，WO 02/059324，美国专利公布号20030009011，WO 03/027243，美国专利公布号20030079247，WO99/05298，美国专利号6,197,561，美国专利号6,291,224，美国专利号6,391,348，WO 2002/059324，美国专利公布号2003/0079247，WO98/45448，WO 99/55882，WO 01/04147)来完成。
[0306] 在另外一个实施方案中，使用本发明的启动子或其活性片段或衍生物表达营养性蛋白(例如肌醇六磷酸酶)。来自禾本科植物的谷粒也广泛用作非反刍动物的动物饲料，黑曲霉(Aspergillus niger)的肌醇六磷酸酶被用作动物饲料中的添加剂以提高磷酸盐和矿物质的可消化性以及也提高其生物利用率。在一个实施方案中，使用根据本文中任何实施方案所描述的启动子、活性片段或衍生物，在发育中的胚乳(例如，胚乳基部和/或BETL细胞)中表达来自黑曲霉的phyA基因。
[0307] 在另一个实施方案中，利用本发明的启动子、活性片段或衍生物改变生育三烯酚和/或生育酚的含量。生育三烯酚是维生素E相关化合物，其在植物中的存在主要局限于单子叶植物(例如，棕榈、小麦、稻和大麦)的种子中。生育三烯酚在结构上与生育酚(包括α-生育酚，其是维生素E的一种形式)类似。生育酚和生育三烯酚是强效的脂溶性抗氧化剂，在人类和动物饮食中具有相当高的营养价值(例如，Packer等J.Nutr.131：369S-373S(2001))，并是降胆固醇化合物(Theriault等，Clin.Biochem.32，309-319，
1999；Qureshii等，J.Biol.Chem.261，10544-10550，1986)。通过在本发明的启动子的有效控制下表达2-甲基-6-植基苯醌甲基转移酶(VTE3)和/或生育酚环化酶(VTE1)和/或γ-生育酚甲基转移酶(VTE4)，改变种子胚乳中一种或多种生育酚的水平。优选地，在本发明的启动子、活性片段或衍生物的有效控制下表达选自VTE1、VTE3和VTE4的酶的编码基因，并例如通过基因堆积，于另一个启动子的有效控制下在胚乳中表达生育酚生物合成途径中的不同基因。在另一个实施方案中，在本发明的启动子、活性片段或衍生物的有效控制下，表达尿黑酸香叶基香叶基转移酶(HGGT)的编码基因，以调节胚乳中生育三烯酚的水平。在另一个实施方案中，调节胚乳(例如，胚乳基部和/或BETL细胞)中编码HGGT和VTE3和VTE4多肽的转基因的表达，其中至少一个所述转基因处于本发明的启动子、活性片段或衍生物的有效控制下。可以使用本发明的启动子调节其表达的生育酚生物合成酶的更多例子包括，例如tyrA，slr1736，ATPT2，dxs，dxr，GGPPS，HPPD，GMT，MT1，tMT2，AANT1，slr 1737(Kridl 等，Seed Sci.Res.1：209：219(1991)；Keegstra，Cell 56(2)：
247-53(1989)；Nawrath等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：12760-12764(1994)；Xia等，J.Gen.Microbiol. 138：1309-1316(1992)；Lois 等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)：
2105-2110(1998)；Takahashi 等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(17)，9879-9884(1998)；
Norris 等，Plant Physiol.117：1317-1323(1998)；Bartley 和 Scolnik，Plant Physiol.104：1469-1470(1994)；Smith 等，Plant J.11：83-92(1997)；WO 00/32757；WO
00/10380；Saint Guily 等，Plant Physiol.，100(2)：1069-1071(1992)；Sato 等，J.DNA Res.7(1)：31-63(2000))。
1999；Qureshii等，J.Biol.Chem.261，10544-10550，1986)。通过在本发明的启动子的有效控制下表达2-甲基-6-植基苯醌甲基转移酶(VTE3)和/或生育酚环化酶(VTE1)和/或γ-生育酚甲基转移酶(VTE4)，改变种子胚乳中一种或多种生育酚的水平。优选地，在本发明的启动子、活性片段或衍生物的有效控制下表达选自VTE1、VTE3和VTE4的酶的编码基因，并例如通过基因堆积，于另一个启动子的有效控制下在胚乳中表达生育酚生物合成途径中的不同基因。在另一个实施方案中，在本发明的启动子、活性片段或衍生物的有效控制下，表达尿黑酸香叶基香叶基转移酶(HGGT)的编码基因，以调节胚乳中生育三烯酚的水平。在另一个实施方案中，调节胚乳(例如，胚乳基部和/或BETL细胞)中编码HGGT和VTE3和VTE4多肽的转基因的表达，其中至少一个所述转基因处于本发明的启动子、活性片段或衍生物的有效控制下。可以使用本发明的启动子调节其表达的生育酚生物合成酶的更多例子包括，例如tyrA，slr1736，ATPT2，dxs，dxr，GGPPS，HPPD，GMT，MT1，tMT2，AANT1，slr 1737(Kridl 等，Seed Sci.Res.1：209：219(1991)；Keegstra，Cell 56(2)：
247-53(1989)；Nawrath等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：12760-12764(1994)；Xia等，J.Gen.Microbiol. 138：1309-1316(1992)；Lois 等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)：
2105-2110(1998)；Takahashi 等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(17)，9879-9884(1998)；
Norris 等，Plant Physiol.117：1317-1323(1998)；Bartley 和 Scolnik，Plant Physiol.104：1469-1470(1994)；Smith 等，Plant J.11：83-92(1997)；WO 00/32757；WO
00/10380；Saint Guily 等，Plant Physiol.，100(2)：1069-1071(1992)；Sato 等，J.DNA Res.7(1)：31-63(2000))。
[0308] 在另一个实施方案中，通过在本发明的启动子或其活性片段或衍生物的有效控制下，在胚乳(例如，胚乳基部和/或BETL细胞)中表达一种或多种具有增强的营养价值或特定氨基酸的含量的蛋白质，增加植物蛋白质(特别是可以改善植物的营养价值的改变的蛋白质)的水平。例如，hordothionin蛋白的改变描述于WO 94/16078、WO 96/38562、WO96/38563和美国专利号5,703,409中。美国专利号6,127,600和美国专利号6,080,913也描述了用于增加种子中必需氨基酸的积累的转基因。富含赖氨酸和/或富含硫的白蛋白也描述于WO 97/35023和美国专利号5,990,389和美国专利号5,885,802(高甲硫氨酸)和美国专利号5,939,599(高硫)和美国专利号5,912,414(增加的甲硫氨酸)中。美国专利号6,459,019描述了用于增加赖氨酸和苏氨酸含量的转基因，WO 96/01905描述了用于增加苏氨酸含量的转基因。氨基酸生物合成酶的例子包括邻氨基苯甲酸合酶(例如，描述于美国专利号5,965,727、PCT公布WO 97/26366、WO99/11800和WO 99/49058中)、色氨酸脱羧酶(例如，描述于PCT公布WO 99/06581中)、苏氨酸脱羧酶(例如，描述于美国专利号5,534,421和5,942,660；PCT公布WO 95/19442中)、苏氨酸脱氨酶(PCT公布WO 99/02656和WO 98/55601)、二氢吡啶二羧酸合成酶(例如，描述于美国专利号5,258,300中)、甘油二酯酰基转移酶(例如，描述于美国专利公布20030115632A1和20030028923A1中)和天冬氨酸激酶(例如，描述于美国专利号5,367,110、5,858,749和6,040,160中)。
[0309] 在另一个实施方案中，通过例如改变如下基因的表达，引起碳水化合物代谢发生改变，所述基因为：影响淀粉分支模式的酶的编码基因、或改变硫氧还蛋白的基因，如NTR和/或TRX(例如，美国专利号6,531,648)、和/或枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(例如，Steinmetz等，(1985)Mol.Gen.Genet.200：220)、和/或α-淀粉酶基因(例如，Pen等，(1992)Bio/Technology 10：292；Sogaard等，(1993)J.Biol.Chem.268：22480)、和/或番茄转化酶基因(Elliot等，(1993)Plant Mol.Biol.21：515)、和/或淀粉分支酶(例如，美国专利号6,232,122和6,147,279和PCT公布WO 97/22703)，包括玉米胚乳淀粉分支酶II(Fisher等，(1993)Plant Physiol.102：1045)、和/或UDP-D-木糖4-差向异构酶或Fragile-1或Fragile-2或Refl或HCHL或C4H基因(例如，WO 99/10498)、和/或ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGP；例如美国专利号6,232,529)。此外，鉴于淀粉和油途径的相互关系，本发明范围也包括通过直接改变淀粉或其它碳水化合物的含量以间接地改变脂肪酸水平或组成，以及反之亦然。
[0310] 在另一个实施方案中，使用本发明的启动子或其活性片段或衍生物调节乙烯的产生和/或感知、和/或与乙烯的产生和/或感知相关的胚乳凋亡。例如，通过下调乙烯的产生和/或感知，可以延缓或阻抑谷物胚乳的凋亡，例如Campbell和Drew，Planta 157：350-357(1983)；Drew 等，Planta 147：83-88(1979)；He 等，Plant Physiol.112：1679-1685(1996)；Young 等，Plant Physiol.119：737-751(1997)；Young和 Gallie，PlantMol.Biol.39：915-926(1999)；Young 和 Gallie，Plant Mol.Biol.42：
397-414(2000)。谷物中乙烯的感知极有可能涉及拟南芥膜定位受体ETR1、ERS1、ETR2、ERS2和EIN4的同源物(Chang等，Science 262：539-544(1993)；Hua等，Science 269：
1712-1714(1995)；Hua等，Plant Cell10：1321-1332(1998)；Sakai 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：5812-5817(1998))、或玉米乙烯受体基因ZmETR2和ZmERS1、ZmETR9和ZmETR40的产物。谷物的胚乳充当谷粒的主要贮藏器官，但在种子发育的中到晚期中经历由乙烯调节的细胞死亡。通过下调胚乳(例如，胚乳基部和/或BETL细胞)中乙烯受体基因的表达，可以延缓或减少或抑制该器官的凋亡，从而延长籽粒灌浆和贮藏蛋白积累的时期。
397-414(2000)。谷物中乙烯的感知极有可能涉及拟南芥膜定位受体ETR1、ERS1、ETR2、ERS2和EIN4的同源物(Chang等，Science 262：539-544(1993)；Hua等，Science 269：
1712-1714(1995)；Hua等，Plant Cell10：1321-1332(1998)；Sakai 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：5812-5817(1998))、或玉米乙烯受体基因ZmETR2和ZmERS1、ZmETR9和ZmETR40的产物。谷物的胚乳充当谷粒的主要贮藏器官，但在种子发育的中到晚期中经历由乙烯调节的细胞死亡。通过下调胚乳(例如，胚乳基部和/或BETL细胞)中乙烯受体基因的表达，可以延缓或减少或抑制该器官的凋亡，从而延长籽粒灌浆和贮藏蛋白积累的时期。
[0311] 在另一个实施方案中，使用根据本文中任何实施方案所描述的启动子、活性片段或衍生物表达有治疗作用的蛋白质，例如疫苗或抗体片段。改进的“plantibody”载体(例如，描述于Hendy等，J.Immunol.Methods231：137-146，1999中)和纯化策略使这样的方法成为生产重组免疫球蛋白的实际而高效手段，所述重组免疫球蛋白不仅可以用于人类和动物治疗，也可以用于工业应用(例如，催化性抗体)。此外，已显示，植物生产的抗体是安全和有效的，并避免了动物来源材料的使用和由此带来的污染传染性海绵状脑病(TSE)物质的风险。而且，植物和哺乳动物细胞产生的抗体在糖基化模式上的差异对抗原结合或特异性具有很小的影响或没有影响。此外，在接受局部口服应用植物来源的分泌性二聚IgA抗体的病人中，没有观察到毒性或人抗鼠抗体(HAMA)的迹象(见Larrick等，Res.Immunol.149：603-608，1998)。
[0312] 例如，可以使用本发明的启动子或其活性片段或衍生物，在胚乳(例如，胚乳基部和/或BETL细胞)中表达重组抗体，例如抗-CD4抗体，以能够抑制HIV-1病毒至细胞、或感染的细胞至未感染的细胞的传播，或用于抑制或减轻炎症反应，或用于CD-4自身免疫病(例如类风湿性关节炎或牛皮癣)的治疗。
[0313] 可以使用各种方法在转基因植物中表达重组抗体。例如，将抗体的重链和轻链独立克隆进核酸构建体，接着使用本发明的方法体外转化植物细胞。随后，再生表达各单链的整个植物，接着对它们进行有性杂交，最后导致产生完全组装的功能性抗体(见，例如，Hiatt等，Nature 342：76-87，1989)。在各个实施方案中，可以利用信号序列，通过引导抗体链到合适的植物环境，来促进未组装的抗体链的表达、结合和折叠。
[0314] 在另一个实施方案中，将编码能够在宿主中诱发免疫反应的肽或多肽的转基因连接到根据本文中任何实施方案所描述的启动子、活性片段或衍生物上。例如，将编码乙型肝炎表面抗原的转基因插入到本文中所描述的核酸构建体中，并使用根据本文中任何实施方案所描述的方法来生产转基因植物。依照此实施方案，使用该植物或其部分生产的食物产品然后可以作为药物性食品或口服疫苗，施用于人类(例如，为人类食用)。
[0315] 不偏离本发明的启动子、活性片段或衍生物的一般适用性，本发明也包括将所述启动子、活性片段或衍生物连接到编码蛋白质的核酸，所述蛋白质赋予或增强抗植物病原体的保护作用，所述病原体例如种传真菌、种传病毒、种传细菌，或采食种子的昆虫。这样的蛋白质为本领域技术人员所知，其包括，例如一系列在结构上和功能上多样的植物防御蛋白或病理相关蛋白(例如，几丁质酶，特别是酸性几丁质酶或内切几丁质酶；β-葡聚糖酶，特别是β-1，3-葡聚糖酶；核糖体失活蛋白(RIP)；高梁醇溶蛋白，例如α-高梁醇溶蛋白、β-高梁醇溶蛋白、γ-高梁醇溶蛋白；三叶橡胶(Hevea brasiliensis)橡胶蛋白(hevein)；马铃薯win1或win2蛋白，或来自小麦的相关蛋白，例如wheatwin或WPR4，或来自大麦的相关蛋白，例如barwin；硫堇，特别是K-硫堇；奇甜蛋白或奇甜蛋白样蛋白质，例如zeamatin；蛋白酶抑制剂，例如，胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶；或sormatin)、病毒外壳蛋白、和将一种或多种病原体毒素转化为非毒性产物的蛋白质。编码这样的蛋白质的核酸是公众可得的和/或描述于科学文献中。这样的基因的结构和它们编码的蛋白质详尽地描述于美国国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(8600Rockville Pike，Bethesda，MD20894，USA)的数据库中。
[0316] 也可以将根据本文中任何实施方案所描述的启动子、活性片段或衍生物与编码多肽的核酸有效连接，用于重组生产该多肽。如上文所讨论，植物种子的组织(例如，发育中的胚乳)对于生产重组多肽是有用的。据此，本发明提供了用于生产重组多肽的方法，例如以用于商业目的。
[0317] 应理解的是，本发明也延及生产表达转基因的转基因植物，所述转基因不编码蛋白质。例如，转基因编码干扰RNA、反义RNA、核酶、抗体酶(abzyme)、共抑制分子、基因沉默分子或基因打靶分子，它们阻止或降低目的核酸的表达。
[0318] 用于产生干扰RNA、或核酶、或抗体酶的合适的方法在本领域公知。
[0319] 例如，已经鉴定出了多类核酶。一类核酶来源于多种小的环形RNA，所述环形RNA能够在植物中自我切割和复制。其例子包括来自鳄梨日斑类病毒的RNA和来自烟草环斑病毒、紫花苜蓿短暂条纹病毒(lucerne transient streak virus)、绒毛烟斑驳病毒、莨菪斑驳病毒和地三叶斑驳病毒的卫星RNA。编码能够选择性切割靶标RNA的核酶的转基因的设计和使用描述于，例如，Haseloff等，Nature，334：585-591(1988)。
[0320] 备选地，转基因表达核酸，所述核酸能够诱导对目标核酸的有义抑制。例如，产生转基因，该转基因包含以有义方向配置为目标核酸的启动子的核酸。这样的方法描述于，例如Napoli等，The Plant Cell 2：279-2891990；或美国专利号5,034,323。
[0321] 为了通过有义抑制来降低或阻止核酸的表达，转基因不必和该核酸完全相同。此外，为了通过有义抑制来降低或阻止所述核酸的表达，转基因不必包含该核酸的全部序列。
[0322] RNA干涉也可以用于降低或阻止核酸的表达。RNAi的合适的方法描述于Marx，Science，288：1370-1372，2000。用于降低或阻止核酸表达的示例性方法描述于WO99/49029、WO 99/53050和WO 0/75164。简单地说，产生表达核酸的转基因，所述核酸与目标核酸中的核苷酸序列互补。转基因另外还表达与目标核酸中所述核苷酸序列基本相同的核酸。由转基因表达的这两个核酸能够杂交，并降低或阻止目标核酸的表达(可能在转录后水平上)。
[0323] MicroRNA或miRNA是小的双链RNA，它通过mRNA切割、翻译阻遏/抑制、或异染色质沉默来调控或调节靶标信使RNA的表达(见例如Ambros，2004，Nature，431，350-355；Bartel，2004，Cell，116，281-297；Cullen，，2004，Virus Research.，102，3-9；He等，2004，Nat.Rev.Genet.，5，522-531；和Ying等，2004，Gene，342，25-28)。可以使用根据本文中任何实施方案所描述的启动子、活性片段或衍生物表达这样的microRNA。备选地，使用根据本文中任何实施方案所描述的启动子、活性片段或衍生物，核酸能够赋予miRNA表达或表达模式。
[0324] 植物转化或转染
[0325] 在产生合适的表达构建体或表达载体之后，将构建体或载体导入到植物细胞或组织中。用于将重组DNA导入到植物组织或细胞中的手段包括但不限于，使用CaCl2进行的转化及其变化形式(例如，如Hanahan(1983)所描述)，DNA直接吸收到原生质体中(Krens等，Nature 296，72-74，1982；Paszkowski等，EMBO J.3，2717-2722，1984)，PEG介导的原生质体摄取(Armstrong等，Plant Cell Rep.9，335-339，1990)，微粒轰击，电穿孔(Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，82，5824-5828，1985)，DNA的显微注射(Crossway等，Mol. Gen.Genet.202，179-185，1986)，组织外植体或细胞的微粒轰击(Christou等，Plant Physiol.87，671-674，1988；Sanford，Part.Sci.Technol.5，27-37，1988)，用核酸进行组织的真空浸润，或就植物来说，T-DNA介导从农杆菌转移到植物组织(基本上描述于An等，EMBO J.4，277-284，1985；Herrera-Estella等，Nature 303，209-213，1983；Herrera-Estella等，EMBO J.2，987-995，1983；或Herrera-Estella等，于：《植物遗传工程》，剑桥大学出版社，N.Y.，第63-93页，1985)。
[0326] 粒子轰击介导的转化也可以将裸核酸递送到植物细胞中(Sanford等，J.Part.Sci.Technol.5：27，37，1987)。该技术涉及将浓缩核酸包裹的微粒(例如，金或钨粒)加速到足够的速度以穿透植物细胞壁和核。所导入的核酸随后整合进植物基因组，由此产生转基因植物细胞。该细胞然后被用来再生转基因植物。示例性装置和程序由Stomp等(美国专利号5,122,466)和Sanford和Wolf(美国专利号4,945,050)公开。合适的方法也例示于本文中。适合于在这样的系统中使用的微粒的例子包括1至5微米的金球。可以通过任何适合的技术(例如沉降)将DNA构建体沉积到微粒上。
[0327] 备选地，可以将表达构建体或表达载体导入到植物原生质体中。为了制备原生质体，需要从植物细胞除去细胞壁。用于制备原生质体的方法在本领域公知并由例如Potrykus和Shillito(Methods in Enzymology 118，449-578，1986)描述。裸核酸(即，不包含在运载体、载体、细胞、噬菌体或病毒中的核酸)可以通过对原生质体质膜的物理或化学透化处理而被导入到植物原生质体中( 等，Mol.Gen.Genet.199：178-182，1985和Fromm等，Nature，319：791-793，1986)。
[0328] 用于将核酸导入到原生质体中的优选的物理手段是电穿孔，其包括对原生质体施加短暂的高压电脉冲，由此在质膜上形成纳米大小的微孔。核酸通过这些微孔被吸收到细胞质中。备选地，核酸可以因为伴随孔关闭的膜组分的重新分配而被摄取通过质膜。核酸被从细胞质运送到核，并在核中整合到基因组中。
[0329] 用于将核酸导入到原生质体中的优选的化学手段是利用聚乙二醇(PEG)。PEG介导的转化通常包括在存在PEG溶液时在足以透化原生质体的质膜的条件和一段时间中以目的核酸处理原生质体。核酸随后通过在质膜中形成的微孔而被吸收，并作为附加型质粒保持或整合到原生质体的基因组中。
[0330] 在本发明另一个实施方案中，通过电穿孔将表达载体或构建体导入到植物细胞中(Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824，1985)。在该技术中，在存在质粒或包含相关遗传构建体的核酸时对植物原生质体进行电穿孔。高场强的电脉冲使生物膜可逆地透化，从而允许质粒导入。经电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁、分裂并形成植物愈伤组织。可以使用表型标记对携带转化了的基因的转化了的植物细胞进行选择。
[0331] 花椰菜花叶病毒(CaMV)也可以用作将表达载体或构建体导入到植物细胞中的载体(Hohn等，(1982)《植物肿瘤的分子生物学》，学术出版社，纽约，第549-560页；Howell，美国专利号4,407,956)。CaMV病毒DNA基因组被插入到亲本细菌质粒中，由此产生能在细菌中增殖的重组DNA分子。在克隆后，通过导入目的核酸，对重组质粒进行再次克隆和进一步的修饰。然后将重组质粒的经修饰的病毒部分从亲本细菌质粒中切出，并用来接种植物细胞或植物。
[0332] 用于将表达构建体导入到植物细胞中的一个另外的方法是以转化了表达构建体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染植物细胞、外植体、分生组织或种子。在本领域公知的合适的条件下，使转化了的植物细胞生长形成芽、根，并进一步发育成为植株。例如，可以依靠根癌农杆菌的Ti质粒，将表达构建体导入到合适的植物细胞中。通过农杆菌的感染，Ti质粒被递送到植物细胞，并稳定整合到植物基因组中(Horsch等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803，1984)。
[0333] 目前至少有三种不同的以农杆菌转化植物细胞的方法：(1)将农杆菌与培养的分离原生质体进行共培养；(2)以农杆菌转化细胞或组织，或(3)以农杆菌转化种子、茎尖或分生组织。
[0334] 方法(1)使用已确立的培养系统，该系统允许培养原生质体和从培养的原生质体再生植株。
[0335] 方法(2)意味着(a)植物细胞或组织能够被农杆菌转化，和(b)转化的细胞或组织能够被诱导再生成整个植物。
[0336] 方法(3)使用微繁殖。在双元系统中，需要两种质粒进行感染：包含T-DNA的质粒和vir质粒。可以使用多种包含T-DNA的质粒中的任何一种，主要的是能够对这两种质粒的每一种独立地进行选择。
[0337] 在转化植物细胞或植物后，可以通过转化载体表达的适当的表型标记，选择那些因转化了Ti质粒而整合了目的DNA片段的植物细胞或植物。这些表型标记包括但不限于，抗生素抗性、除草剂抗性或可通过目视观测检测的性状。其它表型标记在本领域公知并可以用于本发明。
[0338] 备选地，通过使用根癌农杆菌进行in planta转化方法，产生转化的植物，例如，由 Bechtold 等，CR Acad.Sci.(Paris，Sciences de la vie/Life Sciences)316，1194-1199，1993或Clough等，Plant J 16：735-74，1998所描述的方法，其中将根癌农杆菌(A.tumefaciens)施加在发育中的花芽的外部，然后将双元载体DNA导入到发育中的小孢子和/或大孢子和/或发育中的种子，以产生转化的种子。本领域技术人员将知道，对用于此程序中的组织的选择可以不同，然而，通常优选的是，在in planta转化程序中，使用处于合子形成阶段的植物材料。
[0339] 在另一个实施方案中，使用如下方法转化禾本科植物，所述方法包括：在足以使表达载体被递送到成熟胚的一个或多个细胞的条件和一段时间中，使包含表达载体的农杆菌接触成熟的胚(例如，来自已完成了籽粒灌浆的种子的小麦胚)。这样的转化还可以包括去TM除种皮和/或在存在Soytone 时进行转化，两者都提高转化效率。转化的细胞可以被用来再生植物或植物的部分。
[0340] 本发明也包括使用转化了的植物细胞或植物部分进行重复周期的转化，所述转化了的植物细胞或植物部分包含本发明的启动子、活性片段或衍生物、或处于所述启动子、活性片段或衍生物有效控制下的转基因、或包含处于所述启动子、活性片段或衍生物有效控制下的所述转基因的基因构建体。
[0341] 在一个实施方案中，进行了基因堆积。基因堆积可以顺序地或同时地进行。在一个同时地进行的基因堆积的实施方案中，以两个基因构建体转化植物细胞、植物组织、植物器官或整个植物，其中至少一个所述基因构建体包含本发明的启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体。在顺序地进行的基因堆积的一个实施方案中，包含第一启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体的第一转化了的植物细胞，以不同于用来产生该第一植物细胞、组织、器官或整个植物的构建体的第二基因构建体转化，例如，其中第二基因构建体包含在第二启动子有效控制下的第二转基因，所述第二启动不同于第一植物细胞、组织、器官或整个植物的第一启动子。例如，第二基因构建体或第二转基因可以包含第二本发明的启动子、活性片段或衍生物，其不同于第一植物细胞、组织、器官或植物中的第一本发明的启动子、活性片段或衍生物。在另一个实施方案中，第二启动子在种子中，优选在植物的胚乳中有效，例如，启动子赋予或调节在多种不同的植物器官、组织或细胞(例如，包括胚乳)中的表达，或主要地或专一地在胚乳(包括早期胚乳和/或成熟中的胚乳和/或胚乳基部和/或BETL细胞)中调节表达。在另一个实施方案中，第二启动子在植物种子的胚中有效。在另一个实施方案中，第二基因构建体还可以包含不同于第一转基因的第二转基因，即，其中调节每个转基因的启动子是不同的。例如，利用第一和第二转基因表达在功能上不同或在结构上不同或不相关的第一和第二结构基因或转基因。这样的不同的转基因可以催化或调节同一生化途径中的不同步骤或完全不同的生化途径，和/或它们可以协同，即协作，起作用，产生一个或多个目的性状。优选地，使用不同的选择标记来监测第一和第二和随后的转化。
[0342] 通过本文中公开的可以与本发明的启动子、活性片段或衍生物组合使用的示例性启动子、和本文中公开的可以在植物中表达(例如在本发明的启动子、活性片段或衍生物的有效控制下)的示例性转基因，用于这样的基因堆积方法的第一和第二转基因的具体例子将显而易见。应理解的是，在基因堆积方法中，对例如在本发明的启动子、活性片段或衍生物的有效控制下可以在植物中表达的转基因的描述，原则上适用于本实施方案的第二基因构建体和第二转基因。
[0343] 自转化的细胞/原生质体再生和繁殖植物
[0344] 依照本领域公知的程序，可以从转化的或转染的细胞再生整个植物。可以用根据本文中任何实施方案所描述的载体或构建体转化能够随后通过器官发生或胚胎发生进行克隆繁殖的植物组织。
[0345] 如本文中所使用的术语“器官发生”，意指从分生组织的中心相继发育芽和根的过程。
[0346] 如本文中所使用的术语“胚胎发生”，意指芽和根从体细胞或配子以协同的方式一同(而非相继地)发育的过程。
[0347] 从培养的原生质体再生植物描述于，例如Evans等，《原生质体分离和培养-植物细胞培养手册1》(MacMillan出版公司，1983)和Binding《植物的再生-植物原生质体》，第21-73页(CRC出版社，Boca Raton，1985)。再生随物种的不同而不同。通常，制备转化了的原生质体的悬浮物(例如，使用本文中描述的方法)。在一些物种中，然后诱导转化的原生质体形成胚，然后至成熟和萌发阶段。这样的诱导包括，例如，向原生质体的培养基中添加化合物，例如，就玉米或苜蓿来说，谷氨酸和/或脯氨酸。
[0348] 在一个实施方案中，使用通过本文中描述的方法产生的转化了的禾本科植物细胞，再生植物或植物部分或小植物。优选地，使转化了的细胞与诱导愈伤组织形成的化合物，在足以使愈伤组织形成的条件下接触一段时间。备选地或此外，使转基因植物细胞与诱导细胞脱分化的化合物，在足以使细胞脱分化的条件下接触一段时间。备选地或此外，使转基因植物细胞与诱导未分化细胞生长的化合物，在足以使未分化细胞生长的条件下接触一段时间。诱导愈伤组织形成和/或诱导产生未分化和/或脱分化细胞的化合物对技术人员而言将是显而易见的，其包括，例如植物生长素(例如，2，4-D)、3，6-二氯-邻-茴香酸(麦草畏)、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸(毒莠定)或噻苯隆(TDZ)。
[0349] 这样的培养基可以另外包含一种或多种促进愈伤组织形成/脱分化或未分化细胞生长的化合物。例如，Mendoza和Kaeppler(In vitro Cell Dev.Biol.，38：39-45，2002)发现，在2，4-D存在的条件下，包含麦芽糖而不是蔗糖的培养基增强愈伤组织的形成。
[0350] 备选地或此外，还可以使胚细胞与肌醇接触。研究显示，肌醇有用于维持愈伤组织中的细胞分裂(Biffen和Hanke，Biochem.J.265：809-814，1990)。
[0351] 类似地，酪蛋白水解物显示出诱导愈伤组织中细胞分裂和维持愈伤组织形态发生反应。因此，在另一个实施方案中，还使禾本科植物胚胎细胞与酪蛋白水解物接触。
[0352] 用于从禾本科植物成熟胚胎细胞诱导愈伤组织形成和/或细胞脱分化和/或未分化细胞生长的合适的培养基和方法在本领域公知，和/或描述于Mendoza和Kaeppler，In vitro Cell Dev.Biol.，38：39-45，2002； zgen等，Plant Cell Reports，18：331-335，1998；Patnaik和Khurana，BMCPlant Biology，3：1-11；Zale等，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，76：277-281，2004，以及 Delporte等，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，80：139-149，2005中。
[0353] 在愈伤组织诱导、细胞脱分化和/或未分化细胞生长之后，使植物细胞和/或来源于其的细胞(例如，来源于其的愈伤组织或其脱分化或未分化的细胞)与诱导芽形成的化合物，在足以使芽发育的条件下接触一段时间。用于诱导芽形成的合适的化合物和方法在本领域公知和/或描述于，例如Mendoza和Kaeppler，In vitro Cell Dev.Biol.，38：39-45，2002； 等，Plant Cell Reports，18：331-335，1998；Patnaik和Khurana，BMC Plant Biology，3：1-11；Zale等，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，76：277-281，
2004；Murashige和Skoog，Plant Physiol.，15：473-479，1962；或Kasha等，(于：《植物发育中的基因操作II》，Gustafson编辑，Plenum出版社，1990)中。例如，可以使愈伤组织或未分化的或脱分化的细胞接触诱导芽形成的一种或多种植物生长调节剂。合适的化合物(即，植物生长调节剂)的例子包括吲哚-3-乙酸(IAA)、苄基腺嘌呤(BA)、吲哚丁酸(IBA)、玉米素、a-萘乙酸(NAA)、6-苄基氨基嘌呤(BAP)、噻苯隆(thidiazuron)、激动素、2iP、或其组合。
2004；Murashige和Skoog，Plant Physiol.，15：473-479，1962；或Kasha等，(于：《植物发育中的基因操作II》，Gustafson编辑，Plenum出版社，1990)中。例如，可以使愈伤组织或未分化的或脱分化的细胞接触诱导芽形成的一种或多种植物生长调节剂。合适的化合物(即，植物生长调节剂)的例子包括吲哚-3-乙酸(IAA)、苄基腺嘌呤(BA)、吲哚丁酸(IBA)、玉米素、a-萘乙酸(NAA)、6-苄基氨基嘌呤(BAP)、噻苯隆(thidiazuron)、激动素、2iP、或其组合。
[0354] 包含用于诱导芽形成的化合物的培养基的合适来源在本领域公知，其包括，例如Sigma-Aldrich Pty Ltd(Sydney，澳大利亚)。
[0355] 备选地或此外，使愈伤组织或未分化的或脱分化的细胞，于不包含植物生长调节剂的培养基中或上，在足以诱导芽形成和产生小植物的条件下维持一段时间。
[0356] 在芽形成时或芽形成后，优选将愈伤组织或未分化的或脱分化的细胞与诱导根形成的化合物，在足以引发根生长和产生小植物的条件下接触一段时间。
[0357] 诱导根形成的合适的化合物为技术人员所知，其包括植物生长调节剂，例如，如上文所描述的。
[0358] 用于诱导生根的合适的方法在本领域公知和/或描述于Mendoza和Kaeppler，In vitro Cell Dev.Biol.，38：39-45，2002； zgen等，Plant Cell Reports，18：331-335，1998；Patnaik和Khurana，BMC Plant Biology，3：1-11；Zale等，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，76：277-281，2004；Murashige 和 Skoog，Plant Physiol.，15：473-479，
1962；或Kasha等，(于：《植物发育中的基因操作II》，Gustafson编辑，Plenum出版社，
1990)中。
1962；或Kasha等，(于：《植物发育中的基因操作II》，Gustafson编辑，Plenum出版社，
1990)中。
[0359] 在本发明的一个实施方案中，将愈伤组织和/或脱分化的细胞和/或未分化的细胞，与包含玉米素的培养基在足以诱导芽形成的条件下接触一段时间，并与包含NAA的培养基在足以诱导根形成的条件下接触一段时间。
[0360] 在进行盆栽(例如，在potting mix和/或沙子中)和生长之前，使小植物生长一段足以使根生长的时间。
[0361] 可以利用各种手段繁殖所产生的转化了的植物，例如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，可以使第一代(或T1)转化的植物自交以产生纯合的第二代(或T2)转化体，再通过经典的育种技术繁殖T2植物。在此方面，技术人员将知道，术语“自交”是指如上文所讨论的自交的过程。
[0362] 本发明也包括使用转化了的植物材料进行重复周期的转化的产物，所述植物材料转化了本发明的启动子、活性片段或衍生物、或处于所述启动子、活性片段或衍生物有效控制下的转基因、或包含处于所述启动子、活性片段或衍生物有效控制下的所述转基因的基因构建体。
[0363] 在一个实施方案中，进行基因堆积。在一个基因堆积的实施方案中，包含第一启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体的第一植物细胞、第一植物组织或第一植物器官或第一整个植物，以不同于用来产生第一植物细胞、组织、器官或整个植物的构建体的第二基因构建体转化，例如，其中第二基因构建体包含在第二启动子有效控制下的第二转基因，所述第二启动不同于第一植物细胞、组织、器官或整个植物的第一启动子。例如，第二基因构建体或第二转基因可以包含第二本发明的启动子、活性片段或衍生物，其不同于第一植物细胞、组织、器官或植物中的第一本发明的启动子、活性片段或衍生物。在另一个实施方案中，第二启动子在种子中，优选在植物的胚乳中有效，例如，启动子赋予或调节在多个不同的植物器官、组织或细胞(例如，包括胚乳)中的表达，或主要地或专一地在胚乳(包括早期胚乳和/或成熟中的胚乳和/或胚乳基部和/或BETL细胞)中调节表达。在另一个实施方案中，第二启动子在植物种子的胚中有效。在另一个实施方案中，第二基因构建体还可以包含不同于第一转基因的第二转基因，即，其中调节每个转基因的启动子是不同的。例如，可以利用第一和第二转基因表达在功能上不同或在结构上不同或不相关的第一和第二结构基因或转基因。这样的不同的转基因可催化或调节同样生化途径中的不同的步骤或完全不同的生化途径，和/或它们可协同起作用，即，协作地，产生一个或多个目的性状。
[0364] 通过本文中公开的可以与本发明的启动子、活性片段或衍生物组合使用的示例性启动子、和本文中公开的可以在植物中表达(例如在本发明的启动子、活性片段或衍生物的有效控制下)的示例性转基因，用于这样的基因堆积方法的第一和第二转基因的具体例子将显而易见。应理解的是，在基因堆积方法中，对例如在本发明的启动子、活性片段或衍生物的有效控制下可以在植物中表达的转基因的描述，原则上适用于本实施方案的第二基因构建体和第二转基因。
[0365] 本发明也包括使用转化了的植物材料进行传统育种或无性或克隆繁殖的产物，其中所述植物材料转化了本发明的启动子、活性片段或衍生物、或在所述启动子、活性片段或衍生物有效控制下的转基因、或包含在所述启动子、活性片段或衍生物有效控制下的转基因的基因构建体。
[0366] 在一个实施方案中，进行基因堆积。在一个基因堆积的实施方案中，将包含第一启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体的第一植物，与表达一个或多个期望性状或具有期望遗传背景的第二植物进行有性杂交，鉴定和任选地分离携带第一启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体并表现期望性状的后代。如本领域技术人员所知，当杂交的亲本每一个对他们的后代贡献不相同的遗传材料时，这样的后代植物对于该亲本来源的第一启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体和期望性状，是杂合的。在另一个实施方案中，将杂合的后代自交，鉴定和任选地分离纯合的后代。当杂交旨在将本发明的启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体近渗入到期望的遗传背景中时，在每一杂交的后代和包含期望遗传背景的植物之间进行反复的回交。通常，进行足够的回交，以确保原代转化体中所导入的启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体存在于实质上或显著地与期望遗传背景相同的遗传背景中。
[0367] 在另一个实施方案中，存在于这样的育种或杂交程序的一个亲本中的一个或多个期望性状由不同于另一亲本中的第一基因构建体的第二基因构建体赋予；或由在不同于另一亲本的第一启动子的第二启动子有效控制下的第二转基因赋予。例如，第二基因构建体或第二转基因可以包含不同于第一启动子、活性片段或衍生物的本发明的第二启动子、活性片段或衍生物。在另一个实施方案中，第二启动子在种子中，优选在植物的胚乳中有效，例如，启动子赋予或调节在多个不同的植物器官、组织或细胞(例如，包括胚乳)中的表达，或主要地或专一地在胚乳(包括早期胚乳和/或成熟中的胚乳和/或胚乳基部和/或BETL细胞)中调节表达。在另一个实施方案中，第二启动子在植物种子的胚中起作用。在另一个实施方案中，第二基因构建体还可以包含不同于第一转基因的第二转基因，即，其中调节每个转基因的启动子是不同的。例如，可以利用第一和第二转基因表达在功能上不同或在结构上不同或不相关的第一和第二结构基因或转基因。这样的不同的转基因可催化或调节同样生化途径中的不同步骤或完全不同的生化途径，和/或它们可能协同起作用，即，协作地，产生一个或多个期望性状。
[0368] 通过本文中公开的可以与本发明的启动子、活性片段或衍生物组合使用的示例性启动子、和本文中公开的可以在植物中表达(例如在本发明的启动子、活性片段或衍生物的有效控制下)的示例性转基因，用于这样的基因堆积方法的第一和第二转基因的具体例子将显而易见。应理解的是，在基因堆积方法中，对例如在本发明的启动子、活性片段或衍生物的有效控制下可以在植物中表达的转基因的描述，原则上适用于本实施方案的第二转基因。
[0369] 从前述内容中将显而易见的是，本发明还提供本发明的遗传修饰细胞或生物体的后代或生殖组织，条件是该后代或生殖组织包含编码本发明的融合蛋白的核酸。
[0370] 本文涉及的所产生的转化的生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化了的细胞和未转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有细胞经转化包含表达构建体或载体)；转化了的和未转化的组织的嫁接体(例如，在植物中，嫁接到未转化的接穗上的转化了的砧木)。
[0371] 其它启动子的鉴定
[0372] 如本文中以上所讨论的，本发明人也已经提供了用于鉴定或分离启动子的方法，所述启动子能够赋予核酸例如在植物发育中的胚乳或其细胞或组织(例如，胚乳基部，或更特别地，BETL细胞)中的表达或表达模式。在优选实施方案中，该方法包括：
[0373] (i)测定发育中的胚乳中多个表达产物的表达水平；
[0374] (ii)测定对照组织或细胞或植物部分中多个表达产物的表达水平；
[0375] (iii)鉴定与(ii)相比较，在(i)中表达水平增强的一个或多个表达产物；和[0376] (iv)分离赋予(iii)中该一个或多个表达产物在发育中的胚乳中表达的启动子。
[0377] 合适的对照植物部分、组织或细胞对技术人员而言将是显而易见的，包括非来源于胚乳的任何植物部分、组织或细胞。优选地，对照植物部分、组织或细胞来自非休眠的种子或胚，例如，来自吸涨的胚或种子，或来自萌发中的胚或种子。
[0378] 优选地，所检测的表达产物为基因编码的转录本或mRNA。例如，使用微阵列检测转录本或mRNA
[0379] 在一个实施方案中，将在发育中的胚乳中的表达水平与多个对照组织、细胞或植物部分中的表达水平进行比较。例如，多个对照组织、细胞或植物部分包括来自非休眠种子或胚的植物部分、组织或细胞和非胚性植物部分、非胚性组织或非胚性细胞。通过这种方式，鉴定出了赋予核酸优先地或选择性地在发育中的胚乳或其细胞或组织中表达的启动子。
[0380] 在一个实施方案中，根据本文中任何实施方案所描述的方法另外还包括：
[0381] (v)任选地，测定启动子的结构，例如，启动子的序列；
[0382] (vi)任选地，提供启动子的结构；以及
[0383] (vii)提供启动子。
[0384] 在一个实施方案中，在表达载体中提供启动子。本发明显然延及此处所述的任何鉴定或分离启动子的方法的直接产物。
[0385] 现参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。
[0386] 实施例1
[0387] 鉴定在发育中的小麦种子中选择性表达的小麦基因
[0388] 本实施例支持为如下小麦基因的种子选择性表达提供了，所述小麦基因在其天然环境中由被称为WP04的本发明小麦启动子调控。
[0389] 以来源于不同的RNA样品(未成熟胚和发育中的胚乳)的探针，查寻Affymetrix 小麦基因组阵列，鉴定具有胚乳优先表达谱的候选基因。
[0390] 收获未成熟小麦胚(来自开花后10至14天的种子)和胚乳(来自开花后10至14天的种子)材料，提取RNA并进行进一步纯化，确认RNA的质量和产量(图1a和1b)。标记RNA并与 小麦基因组阵列杂交，分析数据以得到按级别排列的基因列表。
[0391] 使用AVADISTM软件(Strand Genomics Pvt.Ltd.Bangalore)分析微阵列表达。将所有芯片的.CEL文件输入到AVADIS，应用RMA算法(Irazarry等，Biostatistics4(2003)，249-264)进行背景校正、归一化和探针聚集(probe aggregation)。生成每个基因的绝对CALL值(absolute calls)和p值，将在所有阵列中都缺乏(绝对CALL)的探针集从分析中排除。
[0392] 为了确定优先地或选择性地在种子中表达的转录本，使用胚乳或未成熟胚(作为用于比较的参考组织)进行了两个差异表达分析。关于胚乳的分析，对于每一个比较对，仅保留在所有胚乳阵列中都存在(绝对CALL)且在比较的组织中缺乏(绝对CALL)的基因，对列表过滤以保留仅在所有比较对中都出现的基因。关于未成熟胚的分析，对于每一个比较对，仅保留在所有未成熟胚阵列中都存在(绝对CALL)且在比较的组织中缺乏(绝对CALL)的基因，列表过滤以保留仅在所有比较对中都出现的基因。将胚乳和未成熟胚的列表合并成在胚乳或未成熟胚中但不在任何其它组织中表达的基因的列表。
[0393] 计算倍数变化值的平均值、标准差和％CV。按差异表达水平的p值对基因列表进行排序，过滤以仅保留那些差异表达大于10倍且在参考组织中表达的平均信号值在6000以上的基因。
[0394] 基于这些标准，制作出了一列候选基因，其功能是未知的，并且对于其，在公众数据库中没有对应的上游基因组序列可得。
[0395] 存在于Affymetrix 小麦基因组阵列上的候选基因的序列通过NetAffx网络入口
[0396] (http://www.affymetrix.com/analysis/netaffx/index.affx)获取。TM
[0397] 下载Affymetrix序列和对应的来自GenBank的公开序列，使用Sequencher 软件进行比对。在明显情况下，例如在序列开始处长段的多聚T时，对序列进行反向互补转换以TM得到“正义”方向，从Sequencher 输出并随后用于引物设计。在所有其它不明显的情况下，假定序列是处于“正义”方向。使用GenBank序列作为输入文件用于引物设计。
TM
TM
[0398] 使用PrimerExpress 1.5版的“TaqMan MGB探针和引物设计”模块，采用默认设置，设计了用于RT-QPCR验证的引物。对于每个目标候选基因和内标准，鉴定了两对引物。
[0399] 使用 绿色荧光，进行RT-QPCR，以检测从用于微阵列实验的cDNA样品中候选基因序列的扩增。用于每一个候选基因的标准实时PCR混合物包含1x Green
master mix、200-300nM的每个引物、2μl的cDNA(约20ng)和水至终体积为25μl。PCR的热循环条件为：进行一个95℃、10分钟的循环，随后进行95℃、30秒和60℃、1分钟的40个循环。在Stratagene MX3000p实时PCR仪上进行实时PCR和数据分析。使用解离程序以证实具有正确Tm的单扩增子。
master mix、200-300nM的每个引物、2μl的cDNA(约20ng)和水至终体积为25μl。PCR的热循环条件为：进行一个95℃、10分钟的循环，随后进行95℃、30秒和60℃、1分钟的40个循环。在Stratagene MX3000p实时PCR仪上进行实时PCR和数据分析。使用解离程序以证实具有正确Tm的单扩增子。
[0400] 通过RT-QPCR验证为种子特异性的一个种子特异性候选基因的序列显示于SEQ ID NO：1。SEQ ID NO：1的序列对应于来自小麦(Triticum aestivum)的mRNA序列 (gb:BQ805508/DB_XREF ＝ gi:22029717/DB_XREF ＝ WHE3567_G07_M13ZS/CLONE ＝WHE3567_G07_M13/TID＝Ta10064.1/CNT＝22/FEA＝EST/TIER-ConsEnd/STK＝0/UG＝Ta.10064)。
[0401] 实施例2
[0402] 来自在发育中的小麦种子中选择性表达的小麦基因的胚乳选择性启动子的分离[0403] 本实施例对名为WP04的本发明小麦来源启动子的分离提供了支持。
[0404] 为了命名目的，在本文中称为“WP04”的启动子在其天然环境中有效连接于Affymetrix克隆Ta.10064.1.S1。
[0405] 为了克隆Affymetrix克隆Ta.10064.1.S1的启动子区域，使用从Clontech TMLaboratories公司(Mountain View，CA，USA)获取的Genome Walker 试剂盒进行基因组步行。简单地说，从小麦栽培种Bobwhite 26中提取基因组DNA，以平端限制性内切酶SspI、ScaI、EcoRV、StuI、DraI进行消化。然后使用所得到的片段构建几个包含小麦基因组DNATM
的Genome Walker 文库。经消化的DNA以酚氯仿纯化，重新溶解于TE缓冲液(10mM Tris TM
HCl，0.1mM EDTA，pH 7.5)中，并连接到来自Genome Walker 试剂盒的接头上。所得到的文库命名为：
的Genome Walker 文库。经消化的DNA以酚氯仿纯化，重新溶解于TE缓冲液(10mM Tris TM
HCl，0.1mM EDTA，pH 7.5)中，并连接到来自Genome Walker 试剂盒的接头上。所得到的文库命名为：
[0406] 1.DL 1-SspI
[0407] 2.DL 2-DraI
[0408] 3.DL 3-ScaI
[0409] 4.DL 4-EcoRV
[0410] 5.DL 5-StuI
[0411] 以接头和序列特异性引物对小麦DNA文库模板进行巢式PCR。使用0.7％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳分辨PCR产物(图2a、2b)。从凝胶上切下大小在1.0kb左右或更大的片段，对切下的片段进行纯化，并基本按照厂家的说明书(Promega公司，Madison，WI，美国)将纯化的片段连接到载体pGEM-T Easy中。对片段进行测序，并与每一个目标候选基因的来自Affymetrix和GenBank的序列数据进行比对。从比对为预测的开发阅读框上游的那些区域中，鉴定出被称为WP04的启动子序列。
[0412] 对于Affymetrix克隆Ta.10064.1.S1_at，分离了总计13个独立的PCR扩增产物，确定了WP04启动子片段位于2.5kb的片段(片段WPR04.3.1)中。
[0413] 包含功能性WP04启动子的2126bp片段的序列如SEQ ID NO：2所示。
[0414] 表2
[0415]
[0416] 实施例3
[0417] 胚乳选择性启动子WP04的功能性的验证
[0418] 本实施例通过启动子调节报告基因选择性地或特异地在小麦的发育中的胚乳(包括BETL细胞)中和主要地在转化的玉米种子的BETL细胞中的表达，为称为WP04的分离的本发明小麦来源启动子的功能性提供了支持，即，本发明小麦来源启动子选择性地或特异地在发育中的种子的胚乳(包括胚乳基部传递层(BETL)细胞)中赋予表达。
[0419] 1.植物转化方法
[0420] a)小麦转化载体
[0421] 使用基础载体pBSubn R4R3(图3；SEQ ID NO：3)作为选择标记盒的来源，其中泛素启动子调节bar选择标记基因的表达，所述bar选择标记基因有效连接到胭脂碱合酶(NOS)基因的终止子上，即Ubi::bar-nos。使用基础载体pPZP20035D hph 35S R4R3(图4；SEQ ID NO：4)作为选择标记盒的来源，其中CaMV 35S启动子调节潮霉素磷酸转移酶(hph)选择标记基因的表达，所述hph选择标记基因有效连接到CaMV35S基因的终止子上，即35S::hph-35S。从基础载体产生双元载体，用于植物的转化。简单地说，产生包含有效连接绿色荧光蛋白基因(gfp)和CaMV 35S或NOS终止子的2126bp WP04小麦启动子(SEQ ID TM
NO：2)的报告基因盒，使用Gateway (Invitrogen)适应引物(adapted primers)进行PCR扩增，并克隆到进入载体中。随后使用重组将它们克隆进目的载体(destination vector)，所述目的载体包含经常规方法克隆的选择标记盒。对所有的载体依照严格的质量保证操作程序进行完全测序。
NO：2)的报告基因盒，使用Gateway (Invitrogen)适应引物(adapted primers)进行PCR扩增，并克隆到进入载体中。随后使用重组将它们克隆进目的载体(destination vector)，所述目的载体包含经常规方法克隆的选择标记盒。对所有的载体依照严格的质量保证操作程序进行完全测序。
[0422] 所产生的每一个双元载体具有pPZP200载体骨架(Hajdukiewicz等，Plant Mol Biol.25：989-94，1994)并包含如以下所示的嵌合的报告基因盒和选择标记盒：
[0423] (i)WP04::sgfp-nos报告基因盒和35S::hph-35S选择标记盒(pMPB0096；图5；SEQ ID NO：5)；以及
[0424] (ii)WP04::sgfp-nos报告基因盒和Ubi::bar-nos选择标记盒(pMPB0097；图6；SEQ ID NO：6)。
[0425] b)玉米转化载体
[0426] 为了构建用来在玉米中验证WP04启动子的功能性的表达载体，扩增启动子(SEQ ID No：2)并克隆到pENTRTM 5’-TOPO TA克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)中。所得到的载体用作Gateway进入载体以构建包含WP04启动子的双元载体RHF113qcz(图7；
SEQ IDNO：7)，其中所述WP04启动子调节有效连接到NOS基因终止子上的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因的表达。c )小麦(Triticum aestivum L.)的生物射弹转化
SEQ IDNO：7)，其中所述WP04启动子调节有效连接到NOS基因终止子上的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因的表达。c )小麦(Triticum aestivum L.)的生物射弹转化
[0427] 使用本文中以上所描述的小麦转化载体进行小麦(Triticum aestivum L.MPB Bobwhite 26)的生物射弹转化。转化程序的示意图描述于图8中。转化程序包括以下步骤：
[0428] 步骤1(供体植物的产生)：
[0429] 使用小麦(Triticum aestivum L.MPB Bobwhite 26)种子产生供体植物材料。小麦植物种植于由堆制成肥料的松树皮、珍珠岩和蛭石组成的苗圃用混合物中，每盆中种植5株，最大盆尺寸为20厘米。植物在约22-24C的温室条件下生长12-16周(图9a)。一旦第一个穗从旗叶中露出，以标签标记植物，并从开花后12-15天的最高穗头上收集胚。
[0430] 步骤2(第1天)
[0431] 收获在期望发育阶段的穗。从穗上去下颖果后在0.8％(v/v)的NaOCl溶液中表面消毒20分钟，以无菌双蒸水冲洗至少4次。使用解剖显微镜，在无菌条件下从每个颖果中切下长度达10mm的胚(除下胚轴)，胚轴面向下放置在渗透压培养基(E3maltose)上进行培养，所述渗透压培养基包含2x Murashige和Skoog(1962)大量营养素、1x微量营养素和有机维生素、40mg/L的硫胺素、150mg/L的L-天门冬酰胺、补充15％(w/v)的麦芽糖、0.8％(w/v)的Sigma-琼脂和2.5mg/L的2，4-D。在60mm x 15mm的透明聚丙烯皮氏培养皿中的15毫升培养基上对胚进行培养。在轰击前，将培养皿在黑暗中于24℃培养4小时。
使用BioRad PDS1000基因枪，以900psi和以6cm，以沉降在0.6μm金微粒上的1μg载体质粒DNA对胚进行轰击。轰击后，在渗透压培养基上于黑暗中对胚进行培养过夜。该步骤显示于图9b、9c和9d中。
使用BioRad PDS1000基因枪，以900psi和以6cm，以沉降在0.6μm金微粒上的1μg载体质粒DNA对胚进行轰击。轰击后，在渗透压培养基上于黑暗中对胚进行培养过夜。该步骤显示于图9b、9c和9d中。
[0432] 步骤3(第2天)：
[0433] 将胚转移到愈伤组织诱导培养基(E3calli)上，所述培养基包含2xMurashige和Skoog(1962)大量营养素和1x微量营养素和有机维生素、40mg/L的硫胺素、150mg/L的L-天门冬酰胺、补充6％(w/v)的蔗糖、0.8％(w/v)的Sigma-琼脂和2.5mg/L的2，4-D。在黑暗中于24℃培养胚2周。
[0434] 步骤4(第16天)：
[0435] 在E3calli上培养2周后，将产生胚胎发生愈伤组织的胚于选择培养基(E3Select)上进行继代培养，所述选择培养基包含2x Murashige和Skoog(1962)大量营养素和1x微量营养素和有机维生素、40mg/L的硫胺素、150mg/L的L-天门冬酰胺、补充2％(w/v)的蔗糖、0.8％(w/v)的Sigma-琼脂和5mg/L的D，L膦丝菌素(PPT)并且不含植物生长调节剂。培养物于E3Select上，在光照和12小时光周期于24℃再培养14天。该步骤显示于图9e、9f中。
[0436] 步骤5(第30天)：
[0437] 在E3Select上培养14天后，将胚胎发生愈伤组织在新鲜的E3Select上再继代培养14天。
[0438] 步骤6(第44天)：
[0439] 在E3Select上培养约4周后，从胚性愈伤组织团块上切下发育中的小植物(图9g、9h)，并使其在68mm x 80mm或65mm x 150mm的聚碳酸酯组织培养瓶中的生根培养基(RM)上再生长3周，如图9i所示。生根培养基包含1x Murashige和Skoog(1962)大量营养素、微量营养素和有机维生素、40mg/L的硫胺素、150mg/L的L-天门冬酰胺、补充有2％(w/v)的蔗糖、0.8％(w/v)的Sigma-琼脂和5mg/L的PPT。将剩下的胚胎发生愈伤组织在E3Select上进行另外14天的继代培养。
[0440] 步骤7(第65天及以后)：
[0441] 将在生根培养基上存活超过3周并具有良好根系形成的再生小植物移栽到由泥炭和沙子(1∶1)组成的苗圃混合物中，在苗圃潮湿室系统下在升高的湿度条件下于22-24℃保持(图9h)。两周后，将植物从潮湿室中移出，每周进行人工浇水和施加液体肥料TM
Aquasol 直到成熟。对T0植物进行取样，用于基因组DNA和分子分析。收集T1种子并进行种植，用于高通量的Q-PCR分析。
Aquasol 直到成熟。对T0植物进行取样，用于基因组DNA和分子分析。收集T1种子并进行种植，用于高通量的Q-PCR分析。
[0442] c)农杆菌介导的拟南芥转化
[0443] 将本文中以上所描述的双元载体转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株AGL1中，并通过花组织的真空浸润进行拟南芥的inplanta转化。简单地说，将容器(500或1,000mL容量)置于真空干燥器中，并将容器中盛满细菌悬浮液。将装有约4周大小的拟南芥植物的扁篮倒置并浸入到细菌悬浮液中，包括莲座叶。盖上干燥器的盖子并抽真空直到仪表显示约250mm(10英寸)Hg。使植物在真空中保持2分钟。然后移出植物并使多余的细菌悬浮液从植物上流掉。将植物放回生长室，盖上圆顶盖或塑料覆盖物，并使其远离直接光照而过夜。第二天，将植物放回到直接光照下，并移去圆顶盖或塑料覆盖物。使植物生长直到荚果完全发育，收获干种子。对拟南芥种子进行表面消毒后铺种到选择培养基上，将推定的转基因拟南芥植物移栽到土壤中以获取T2转基因种子。这些步骤显示于图10中。
[0444] d)农杆菌介导的玉米转化
[0445] 使用例如国际专利公布号WO 2006/136596A2和/或WO 2007/014744A2中描述的技术，进行玉米转化。
[0446] 步骤1：农杆菌的制备
[0447] 简单地说，自甘油保存物将农杆菌接种物划线培养在含有适合抗生素(例如，50mg/L的壮观霉素和/或10mg/L的四环素)的YP琼脂培养基上。将细菌培养物在黑暗中于28℃培养1至3天，或直到可见单菌落。将所得到的平板于4℃存放一个月并用作母板以划线产生新鲜细胞。在转化前至少2天，自母板上的单菌落，在含有适合抗生素的YP琼脂培养基上划线长出新鲜细胞。将这些细菌培养物在黑暗中于28℃培养1至3天。
[0448] 备选地，通过从冷冻保存种在平板B-YP-002(YP+50mg/L壮观霉素+10mg/L四环素)上划农杆菌细胞线，预备冷冻的农杆菌保存种，并于28℃生长2至3天。产生母板并于4℃存放多达一个月。从母板上挑取细胞，加入到装有补充50mg/L的壮观霉素和10mg/L的四环素的25ml液体B-YP-000培养基的瓶子中。将瓶子在设置为300rpm的摇床上于28℃培养2至3天。为制备冷冻的农杆菌保存种，将一份所获得的培养物与一份无菌的30％甘油混和。然后将混和物进行涡旋以充分混和，分装10μl的农杆菌/甘油混和物到Eppendorf管中，保存种于-80℃储存。
[0449] 为了制备用于感染的细胞，将来自前段中所描述的来自细菌培养物的细胞悬浮于1.0至1.8mL补充有100μM乙酰丁香酮的LS-inf培养基中。这样得到光密度(OD600)在约0.5至2.0之间的细菌悬浮液。将混和物涡旋0.5至3小时。在比色杯中将约100μL农杆菌细胞悬浮液与900μL的LS-inf溶液混和，测定光密度(OD600)值。以LS-Inf(含
100μM乙酰丁香酮)溶液将农杆菌溶液的光密度(OD600)值调整到约0.6至约2.0之间。
在感染前，将该农杆菌悬浮液在含乙酰丁香酮的LS-inf培养基中涡旋至少0.5至3小时。
100μM乙酰丁香酮)溶液将农杆菌溶液的光密度(OD600)值调整到约0.6至约2.0之间。
在感染前，将该农杆菌悬浮液在含乙酰丁香酮的LS-inf培养基中涡旋至少0.5至3小时。
[0450] 备选地，按以下程序制备用于玉米转化的农杆菌悬浮液：在转化前2天，将取自冷冻保存种的农杆菌溶液划线接种到含有B-YP-002(固化的YP+50mg/L壮观霉素+10mg/L四环素)的平板上，在黑暗中于28℃生长2天。在转化前1至4小时，将细菌细胞样品加到2ml Eppendorf管中的1.5ml M-LS-002培养基(LSinf+200μM乙酰丁香酮)中，在约1000rpm下涡旋样品1至4小时。所得到的溶液的OD600值应在约0.6至约1.0的范围内
8
或约10cfu/mL。
8
或约10cfu/mL。
[0451] 为了进行以下实施例，以转化有双元载体的根癌农杆菌菌株LBA4404或卸甲农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)转化玉米，所述双元载体包含乙酰羟酸合酶(ahas基因)(作为选择标记)和GUS报告基因。
[0452] 步骤2：玉米穗的表面消毒和未成熟胚的分离
[0453] 从温室中授粉后8至12天的一株或多株植物上收获玉米穗。去掉所有的外皮和穗丝，将穗运送到组织培养实验室。将一对大的手术钳插入到穗的基部中，此手术钳用作操控玉米穗轴的手柄。
[0454] 任选地，当穗上存在昆虫/真菌时，以20％的商业漂白剂对穗消毒10分钟(备选地，以30％的Clorox溶液消毒15分钟)，然后以无菌水冲洗3次。通过手术钳握住玉米穗轴，以70％的乙醇对穗进行全面喷洒，然后以无菌双蒸水冲洗穗。
[0455] 步骤3：接种
[0456] 方法1：改进的“管”法
[0457] 将带手术钳把手的玉米穗轴放置在大的皮氏培养皿中。例如以解剖刀，去掉每颗籽粒的顶部(大约三分之二)。然后，例如以解剖刀，从玉米穗轴上的籽粒中切下未成熟胚。在此方面，将解剖刀片以一定的角度插入到籽粒的一端，将胚乳向上抬起远离位于胚乳下面的胚。将切下的胚收集到微型离心管(或小的皮氏培养皿)中约1.5至1.8mL农杆菌悬浮液中，其中农杆菌悬浮于含乙酰丁香酮的LS-inf液体培养基中。将装有胚的管手动混和几次，在室温(20至25℃)下孵育30分钟。以移液管从管/培养皿中移去多余的细菌悬浮液。将剩余的LS-inf培养基中的未成熟胚和细菌转移到皮氏培养皿中的共培养琼脂培养基上。将未成熟胚以平面朝下(盾片朝上)的方式放置于共培养培养基上。以移液管移去大部分的多余细菌悬浮液。使少量的液体遗留在培养皿中以防止在铺种时胚的干燥。
[0458] 在无菌通风橱中敞开平板的盖子约15分钟以蒸发覆盖在未成熟胚上的多余水分。密封皮氏培养皿，在黑暗中于22℃培养2至3天。如果使用了GUS构建体来评估GUS的瞬时表达，则选取未成熟胚(例如，3至5个胚)进行GUS染色。
[0459] 方法2：“滴”法
[0460] 将切下的未成熟胚以平面朝下(盾片朝上)的方式直接放置于共培养培养基上。在每个未成熟胚上滴加5微升稀释的农杆菌细胞悬浮液。通过在通风橱中敞开平板的盖子约15分钟来蒸发覆盖在未成熟胚上的多余水分。然后密封培养皿并在黑暗中于22℃培养
2至3天。如果使用了GUS构建体来评估GUS的瞬时表达，则选取未成熟胚(例如，3至5个胚)进行GUS染色。
2至3天。如果使用了GUS构建体来评估GUS的瞬时表达，则选取未成熟胚(例如，3至5个胚)进行GUS染色。
[0461] 步骤4：恢复
[0462] 在共培养后，将胚转移到恢复培养基，以盾片朝上的方式放置，在黑暗中于27℃培养约5至10天。
[0463] 步骤5：选择
[0464] 将未成熟胚转移到第一选择培养基上。密封皮氏培养皿，在黑暗中于27℃培养10至14天(第一次选择)。将所有产生可变愈伤组织的未成熟胚传代到第二选择培养基上。在此阶段，去掉已经形成的任何芽。然后密封培养皿，在与用于第一次选择相同的条件下，在黑暗中于27℃培养约2周。然后在立体显微镜下，从盾片上切下可再生的愈伤组织。将愈伤组织转移到新鲜的第二选择培养基上，密封后在黑暗中于27℃培养2周。
[0465] 步骤6：转化植物的再生和移植
[0466] 以和用于第二次选择相同的方式切下正在增殖的愈伤组织，将其转移到25x100mm培养皿中的再生培养基上。密封培养皿，在光下(约2,000勒克斯；14/10小时光照/黑暗)于25℃或27℃放置2至3周，或直到可见类似芽的结构。
[0467] 将带有再生芽或芽样结构的愈伤组织部分转移到装有生根培养基的Phytatray或Magenta盒中，在与前段中所讨论的相同的条件下培养2周，或直到发育形成带根的小植物。在生根培养基上2至4周后，将仍然具有绿色区域的愈伤组织转移到新鲜生根Phytatray中。取幼苗样品用于TaqMan分析以确定转移DNA(T-DNA)插入的数量。
[0468] 然后将生根的幼苗转移到温室中的Metromix土壤中，盖上塑料圆顶盖直到幼苗建成(通常约1周)。以每天浇一次水和每周施用两次液体肥料对植物进行维护。当植物达TM TM到3至4叶期时，使用Osmocote 对它们进行施肥。如果需要，用70至100g/ha的Pursuit对推定的转基因植物进行喷雾，在温室中再生长2周。在同一时间内，非转基因植物通常会TM
产生除草剂症状或死亡。将存活的植物移植到装有Metromix和一茶匙Osmocote 的10英寸花盆中。
产生除草剂症状或死亡。将存活的植物移植到装有Metromix和一茶匙Osmocote 的10英寸花盆中。
[0469] 在开花期后，以牛皮纸袋对转基因植物的雄穗进行套袋以防止花粉选出。对转基因植物进行授粉。如果抽丝和开花期不同步，则使用和转基因T0植物具有相同遗传背景的野生型的花粉供体或受体植物进行异花授粉。收获T1种子，干燥并在种子袋上作充分标记后储存起来。收获转基因T1种子后，可以通过在高压蒸气灭菌器中的热处理对T0植物连同土壤和花盆进行灭菌。
[0470] 采用这样的程序，使用双元载体pRHF112和pRHF121产生了转化的玉米。
[0471] 2.植物转化结果
[0472] a)报告基因在WP04启动子的控制下在小麦中的表达
[0473] 使用WP04::sgfp-nos转化载体进行小麦(Triticum aestivum L.MPB Bobwhite26)的生物射弹转化，将所得到的转基因材料切片，分析GFP的存在以显示该小麦启动子的空间表达(图11和12)。主要在授粉后约10天的发育中种子的胚乳(包括胚乳基部)中检测到在WP04启动子控制下的GFP表达，该表达在整个谷粒发育期持续，例如至授粉后约
30天。这对应于籽粒灌浆期。在营养器官(例如，叶、根、茎节、茎节间或颖片)中、或在生殖组织(例如，花药、子房或花粉)中或在成熟的种子中没有明显的表达(数据未显示)。
这些数据表明，WP04启动子赋予与启动子有效连接的基因在小麦发育中的种子中进行胚乳选择性表达(包括胚乳基部表达)，甚至更可能是严格地胚乳特异性表达。
30天。这对应于籽粒灌浆期。在营养器官(例如，叶、根、茎节、茎节间或颖片)中、或在生殖组织(例如，花药、子房或花粉)中或在成熟的种子中没有明显的表达(数据未显示)。
这些数据表明，WP04启动子赋予与启动子有效连接的基因在小麦发育中的种子中进行胚乳选择性表达(包括胚乳基部表达)，甚至更可能是严格地胚乳特异性表达。
[0474] b)报告基因在WP04启动子的控制下在玉米中的表达
[0475] 使用双元载体RHF11qcz(图7；SEQ ID NO：7)转化玉米植物，所述双元载体包含由小麦WP04启动子驱动的GUS表达盒。将所得到的转基因材料切片和进行GUS表达分析。以蜡包埋授粉15天后的籽粒、切片并染色检测GUS表达，以光学显微镜观察来鉴定细胞类型特异性表达。
[0476] 图13至15中呈现的数据显示，在授粉后5天和整个谷粒发育期(例如，至少直到授粉后25天)，在WP04启动子控制下的GUS报告基因的表达主要局限于胚乳基部，特别是胚乳基部传递层细胞(图14)。
[0477] 如同在小麦中的表达，在营养器官(例如，叶、根或茎)或外皮中没有明显的报告基因的表达。然而，在玉米的穗丝中也有明显的表达(数据没显示)。
[0478] 这些数据表明，在玉米发育中的种子中，WP04启动子赋予与该启动子有效连接的基因胚乳选择性(特别是在BETL细胞中)表达。
[0479] 实施例4
[0480] 来自单子叶植物的WP04等同物的表征
[0481] 该实施例提供了对单子叶植物中胚乳选择性启动子亚类的支持，所述启动子例如由于调节与WP04启动子天然控制的基因在结构上相关的基因，而等同于分离的小麦来源启动子WP04。
[0482] 1.玉米、大麦和稻中WP04的等同物
[0483] 为了鉴定与WP04等同的启动子，使用小麦Affymetrix共有Ta.10064.1.S1_at序列，对NCBI非冗余核苷酸数据库和下载自植物基因组数据库(Plant Genome Database)(http://www.plantgdb.org/)的小麦组装EST数据库，进行BLASTN查询。该方法在GenBank非冗余数据库中鉴定出了两个小麦来源的序列，最靠近的匹配被赋给了登录号AJ890018.1，其与WP04具有93％的最大同一性。也鉴定出了登录号为No.Z69631.1的大麦克隆，其具有85％的最大同一性。
[0484] 对小麦组装EST的搜索也鉴定出了具有98％的最大同一性的序列，其登录号为PUT-153a-Triticum_aestivum-74777。在SEQ ID NO：2的末端76个核苷酸和用来鉴定WP04启动子的Genome Walker引物序列之间进行登录号AJ890018.1和PUT-153a-Triticum_aestivum-74777 的 比 对，证 实 了 登 录 号 AJ890018.1 和 PUT-153a-Triticum_aestivum-74777与WP04启动子天然调节的结构基因之间的相关性(未显示)。用来鉴定WP04启动子的Genome Walker引物序列为：
[0485] (i)CCATAGTCATGGCAAAACTCATGTGCA；和
[0486] (ii)CTCACTATTGGGGTAGCCATGTCGGCT。
[0487] 通过该方法，也鉴定出了所分配的登录号为PUT-153a-Triticum_aestivum-25138的第二克隆，其具有94％的最大同一性。
[0488] 使用BLASTN算法，采用核苷酸错配罚分(-q)为-1，以PUT-153a-Triticum_aestivum-74777序列搜索cDNA序列，所述cDNA序列从TIGR稻基因组注释项目(Rice Genome Annotation Project)(http://blast.jcvi.org/euk-blast/index.cgi)所产生的稻假分子(pseudomolecules)数据库中提取。鉴定出了相关序列，所分配的登录号为LOC_Os03g25350，该序列编码被称为5a2的推定的过氧化物酶蛋白(图16)。MPSS表达谱分析显示，LOC_Os03g25350在6天龄的发育中的稻种子中表达，例如与天然受WP04启动子调节的SEQ ID NO：1的表达模式一致。使用TIGR基因组浏览器所确定的LOC_Os03g25350的位置显示，下一个上游结构基因位于与LOC_Os03g25350相距大约10kb的位置。
[0489] 下载植物基因组数据库(Plant Genome Database)(http://www.plantgdb.org/)组装的玉米基因组的叠连群装配物，使用LOC_Os03g25350的完整基因组序列，采用核苷酸错配罚分(-q)为-1，对叠连群装配物进行了搜索。鉴定出了一个所分配登录号为ZmGSStuc11-12-04.13411.1的玉米基因组DNA装配物，其与LOC_Os03g25350的第232至311残基具有高的序列同一性(图17)。对以下序列进行了如图18所示的多重比对：
[0490] (i)用来鉴定WP04启动子的Genome Walker引物序列；
[0491] (ii)WP04(SEQ ID NO：2)的末端76个核苷酸；
[0492] (iii)PUT-153a-Triticum_aestivum-74777的序列；
[0493] (iv)Affymetrix共有小麦序列Ta.10064.1.S1_at；
[0494] (v)所分配的登录号为AJ890018.1的小麦序列；
[0495] (vi)登录号为ZmGSStuc11-12-04.13411.1的玉米基因组序列；
[0496] (vii)使用ZmGSStuc11-12-04.13411.1鉴定出的玉米转录本装配物；
[0497] (viii)LOC_Os03g25350的稻cDNA；
[0498] (ix)LOC_Os03g25350的稻基因组序列(籼型栽培稻)；和
[0499] (x)LOC_Os03g25350的稻基因组序列(粳型栽培稻)。
[0500] 该比对允许鉴定推定的翻译起始密码子(未显示)。在该推定的翻译起始密码子的上游，WP04启动子序列(SEQ ID NO：2)的3’末端与这些序列对齐。
[0501] 这些数据提示，登录号LOC_Os03g25350、登录号ZmGSStuc11-12-04.13411.1和登录号PUT-153a-Triticum_aestivum-74777包含在本文中所举例说明的WP04启动子的等同物，例如功能和/或结构等同物。
[0502] ZmGSStuc11-12-04.13411.1的5’上游区域的序列呈现于SEQ ID NO：8中。通过与玉米共有转录本PUT-157a-Zea_mays-015099进行比对，界定全长启动子序列(SEQ ID NO：8)的3’末端。在启动子该末端的ATG是预测的ATG，它是将玉米序列与稻和小麦的序列进行比对时(数据未显示)，自TIGR玉米基因索引序列PUT-157a-Zea_mays-015099预测的。通过ZmGSStuc11-12-04.13411.1共有序列的末端来定义启动子的5’末端，因为没有EST匹配到该序列的这个末端。
[0503] 实施例5
[0504] 启动子的结构分析
[0505] 该实施例提供了对功能性胚乳启动子WP04(SEQ ID NO：2)和登录号ZmGSStuc11-12-04.3411.1(SEQ ID NO：8)的5’上游序列之间结构保守性的支持。该分析很容易应用到所例示的启动子的任何变体，包括SEQ ID NO：9和/或10。
[0506] 简单地说，使用PLACE(植物顺式作用DNA元件)(Plant cis-acting DNAelements)对SEQ ID NOs：2和8中所示的小麦和玉米启动子的核苷酸序列进行分析，以确定启动子中的顺式作用元件，所述PLACE描述于Higo等，Nucl.Acids Res.27：297-300，
1999中，其可从日本国家农业生物科学研究所(National Institute of Agrobiological Sciences，Ibaraki，日本)获取。该分析的结果显示于表3和4中。
1999中，其可从日本国家农业生物科学研究所(National Institute of Agrobiological Sciences，Ibaraki，日本)获取。该分析的结果显示于表3和4中。
[0507] 表3、WP04(2126bp)启动子的PLACE分析结果
[0508]
[0509] 表3续、WP04(2126bp)启动子的PLACE分析结果
[0510]
[0511] 表3续、WP04(2126bp)启动子的PLACE分析结果
[0512]
[0513] 表3续、WP04(2126bp)启动子的PLACE分析结果
[0514]
[0515] 表3续、WP04(2126bp)启动子的PLACE分析结果
[0516]
[0517] 表3续、WP04(2126bp)启动子的PLACE分析结果
[0518]
[0519] 表3续、WP04(2126bp)启动子的PLACE分析结果
[0520]
[0521] 表3续、WP04(2126bp)启动子的PLACE分析结果
[0522]
[0523] 表3续、WP04(2126bp)启动子的PLACE分析结果
[0524]
[0525] 表3续、WP04(2126bp)启动子的PLACE分析结果
[0526]
[0527] 表3续、WP04(2126bp)启动子的PLACE分析结果
[0528]
[0529] 表3续、WP04(2126bp)启动子的PLACE分析结果
[0530]
[0531] 表4、小麦WP04启动子的玉米等同物(1164bp)的PLACE分析结果
[0532]
[0533] 表4续：小麦WP04启动子的玉米等同物(1164bp)的PLACE分析结果
[0534]
[0535] 表4续：小麦WP04启动子的玉米等同物(1164bp)的PLACE分析结果
[0536]
[0537] 表4续：小麦WP04启动子的玉米等同物(1164bp)的PLACE分析结果
[0538]
[0539] 表4续：小麦WP04启动子的玉米等同物(1164bp)的PLACE分析结果
[0540]
[0541] 表4续：小麦WP04启动子的玉米等同物(1164bp)的PLACE分析结果
[0542]
[0543] 表4续：小麦WP04启动子的玉米等同物(1164bp)的PLACE分析结果
[0544]
[0545] 尽管在所分析的启动子和5’上游调控序列的长度上有所变化，表3和表4中所呈现的数据显示，在所分离的小麦和玉米启动子中存在几个保守的结构特征，包括例如，至少一个选自表5中所示的元件。
[0546] 表5、小麦和玉米启动子中保守的结构序列元件
[0547]
[0548] 表5、小麦和玉米启动子中保守的结构序列元件
[0549]
[0550] 小麦和玉米启动子序列的特征也在于下组中的任何元件的复数个：ARR1AT元件、BIHD1OS元件、BOXIINTPATPB元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件、DPBFCOREDCDC3元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件、GT1GMSCAM4元件、IBOXCORE元件、INRNTPSADB元件、MYBCORE元件、MYBPLANT元件、MYBPZM元件、MYBST1元件、MYCATERD1元件、MYCCONSENSUSAT元件、NODCON1GM元件、OSE1ROOTNODULE元件、POLASIG1元件、POLASIG3元件、POLLEN1LELAT52元件、RAV1AAT元件、ROOTMOTIFTAPOX1元件、SEBFCONSSTPR10A元件、SEF4MOTIFGM7S元件、SORLIP1AT元件、TAAAGSTKST1元件、TATABOX4元件、WBOXATNPR1元件、WBOXNTERF3元件和WRKY71OS元件。
[0551] 两个启动子都包含2次以上的以下元件：ARR1AT元件、BIHD1OS元件、BOXIINTPATPB元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件、DPBFCOREDCDC3元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件、GT1GMSCAM4元件、IBOXCORE元件、MYBCORE元件、MYBPZM元件、MYBST1元件、MYCCONSENSUSAT元件、POLASIG1元件、POLLEN1LELAT52元件、RAV1AAT元件、ROOTMOTIFTAPOX1元件、TATABOX4元件和WRKY71OS元件。
[0552] 两个启动子都包含3次以上的以下元件：ARR1AT元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件、GT1GMSCAM4元件、IBOXCORE元件、MYBCORE元件、MYCCONSENSUSAT元件、POLLEN1LELAT52元件、RAV1AAT元件、ROOTMOTIFTAPOX1元件和WRKY71OS元件。
[0553] 两个启动子都包含4次以上的以下元件：ARR1AT元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件、MYCCONSENSUSAT元件、POLLEN1LELAT52元件、RAV1AAT元件、ROOTMOTIFTAPOX1元件和WRKY71OS元件。
[0554] 两个启动子都包含5次以上的以下元件：ARR1AT元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件、MYCCONSENSUSAT元件、ROOTMOTIFTAPOX1元件和WRKY71OS元件。
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