一种丛枝菌根真菌的保存方法
阅读：658发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种丛枝菌根真菌的保存方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种丛枝菌根 真菌 的保存方法，在低温保存菌种前，充分降低丛枝菌根真菌繁殖体内的 水 分。先通过常温通 风 干燥，降低基质材料中的大部分水分，使 含水量 降至8%以下；再在玻璃干燥器内，利用 硅 胶干燥进一步降低繁殖体含水量，使基质含水量降至5%以下。通过两个步骤降低繁殖体材料含水量使丛枝菌根真菌孢子和菌丝细胞内的水分缓慢降低，有利于保持菌种活 力 ，同时避免在急速冷冻时 冰 晶对细胞造成伤害。通过实验对比，采用本发明方法，能够有效保存丛枝菌根真菌菌种活性。本发明方法与盆栽接种方法和超低温保存方法相比，不占用培养 温室 、不需要定期的人工分离接种，不需要菌种保护剂和液氮保存材料等，操作简单，节省物力和人力。，下面是一种丛枝菌根真菌的保存方法专利的具体信息内容。
一种丛枝菌根真菌的保存方法
技术领域
[0002] 丛枝菌根真菌是一种能与植物根系形成共生体的菌根真菌，对植物生长发育具有重要作用。目前已有许多菌根菌剂产品应用于促进植物生长、养分吸收、防治病虫害等领域。具有优良性状的丛枝菌根真菌通常需要保存以备后期的研究和使用。由于丛枝菌根真菌与其他微生物生理特性不同，在保存方法上与其他微生物存在差别。目前丛枝菌根真菌的保存方法主要有盆栽传代保存法、常温保存法和超低温保存法。
[0003] 盆栽传代培养保存，是利用盆栽的方法，在温室大棚内，每隔一段时期对菌种材料进行分离－接种－培养的传代培养方法，这种方法适用于大部分丛枝菌根真菌种类，能够较好保存菌种侵染活力，但在保存过程中需要投入较多的培养空间和人力，并存在菌种污染和菌种分离损失的风险。常温保存是将分离出的菌根菌剂放置在4℃冰箱内保存，这种方法通常可使保存期限达到1-2年，但菌种活力和侵染能力会大幅降低。超低温保存是将菌种繁殖体与保护剂结合，放置在-80℃冰箱或液氮中进行保存的方法，这种方法可以使菌剂保存较长时期，但这种方法步骤繁琐，维护成本较高，对于一般的机构不太适用。
发明内容
[0004] 本发明提供一种丛枝菌根真菌的保存方法，是在现有超低温保存方法的基础上，先对菌种材料进行干燥脱水，然后再进行低温保存，避免低温对菌种细胞造成伤害。该方法可以长期保存菌种，并有效保存菌种活性。
[0005] 本发明的技术方案是：
[0006] 一种丛枝菌根真菌的保存方法，包括如下步骤：
[0008] （2）用湿筛法筛选风干基质中的丛枝菌根真菌孢子，并转移至2ml塑料离心管内，每管放入150-200个孢子，同时放入风干的基质材料和剪碎的培养植物细根；
[0010] （4）将离心管密封后，转移至-80℃冰箱进行长期保存；
[0011] （5）使用时，从-80℃冰箱中取出离心管，直接放入35℃水浴锅中进行解冻30分钟，解冻后的丛枝菌根真菌繁殖体可以直接接种植物。
[0012] 本发明方法通过逐步干燥使丛枝菌根真菌繁殖体的含水量降至5%以下，再进行冷冻保存，减少冷冻对丛枝菌根真菌细胞的伤害；其次通过水浴快速解冻，减少解冻过程对细胞伤害。
[0014] 图1 为实施例中不同丛枝菌根真菌保存方法，保存12个月、24个月和36个月后丛枝菌根真菌菌种对白三叶根系侵染率变化柱状图。柱状图上不同字母代表差异显著（P<0.05)。
具体实施方式
[0015] 下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
[0016] 实施例：
[0017] 采用本发明方法、盆栽传代培养方法、常温保存、超低温保存方法分别保存丛枝菌根真菌菌种，检验不同保存方法对丛枝菌根真菌繁殖材料的保存效果。
[0018] 试验材料：试验菌种为丛枝菌根真菌Glomus mosseae，此菌种是从广西喀斯特石漠化地区分离；接种植物材料为白三叶；基质材料为在121℃，灭菌30分钟的河沙和泥炭，河沙∶泥炭＝4∶1；试验前，利用丛枝菌根真菌在基质材料上接种白三叶，在温室大棚内进行5个月的扩繁培养。
[0019] 1、试验方法与步骤
[0020] 1.1本发明方法
[0021] （1）将培养5个月的丛枝菌根真菌繁殖体基质，包括培养基质、植物根系，从花盆内取出，放置在实验室通风干燥处，常温下风干1周，利用称重法测定含水量，使基质含水量降至8%以下；
[0022] （2）用湿筛法筛选风干基质中的菌根真菌孢子，并转移至2ml塑料离心管内，每管放入150-200个孢子，同时放入风干的基质材料和剪碎的培养植物细根；
[0023] （3）将离心管放置在玻璃干燥器内，利用蓝色硅胶干燥剂，在常温下干燥2周，使基质含水量降至5%以下，利用称重法测定含水量，如干燥2周后未达到5%含水量，继续干燥；
[0024] （4）将干燥后的离心管密封，并转移至-80℃冰箱进行长期保存；
[0025] （5）在保存12个月、24个月和36个月后，分别取出3个离心管进行测试；
[0026] （6）将取出的离心管直接放入35℃水浴锅中解冻30分钟；
[0027] （7）利用灭菌的河沙∶泥炭＝4∶1作为基质，白三叶作为接种植物，在温室大棚内进行接种试验。每盆基质1kg，将离心管中的接种菌种倒入盆中，放入消毒后的白三叶种子，然后覆盖2cm厚基质；每3-4天淋一次无菌水，每2周施一次霍格兰营养液（稀释10倍浓度）；
[0028] （8）在大棚内培养6个月后，采集植物根系，用墨水醋染色法检测根系菌根侵染率。
[0029] 1.2 盆栽传代培养方法
[0030] （1）用湿筛法从培养5个月的丛枝菌根真菌基质中筛选菌根真菌孢子，同时将植物根系剪碎，并转移至2ml塑料离心管内，每管放入150-200个孢子，同时放入基质材料；
[0031] （2）利用高温灭菌的河沙∶泥炭＝4∶1作为基质，白三叶作为接种植物，在温室大棚内进行接种试验；每盆基质1kg，将离心管中的菌种倒入盆中，放入消毒后的白三叶种子，然后覆盖2cm厚基质；每3-4天淋一次无菌水，每2周施一次霍格兰营养液（稀释10倍浓度）；
[0032] （3）在温室大棚内培养6个月后，再次按照步骤（1）-（3）再次进行分离培养，至试验结束共进行36个月的培养；
[0033] （4）分别在培养试验进行至12个月、24个月和36个月后，随机取3个花盆，采集植物根系，用墨水醋染色法检测根系菌根侵染率。
[0034] 1.3 4℃冰箱保存
[0035] （1）将培养5个月的丛枝菌根真菌繁殖体，包括培养基质、植物根系，摊开放置在实验室通风干燥处，常温下风干1周左右；
[0036] （2）将菌根繁殖体用封口袋包装后直接放入4℃冰箱内，长期保存；
[0037] （3）在保存12个月、24个月和36个月后，取出菌剂进行测试；
[0038] （4）利用高温灭菌的河沙∶泥炭＝4∶1作为基质，白三叶作为接种植物，在温室大棚内进行接种试验；每盆基质1kg，将2g菌剂（孢子含量100-150个/g土）倒入盆中，放入消毒后的白三叶种子，然后覆盖2cm厚基质；每3-4天淋一次无菌水，每2周施一次霍格兰营养液（稀释10倍浓度）；
[0039] （5）在大棚内培养6个月后，采集植物根系，用墨水醋染色法检测根系菌根侵染率。
[0040] 1.4 超低温保存法
[0041] （1）将培养5个月的丛枝菌根真菌基质和植物根系转移到灭菌的搅拌器内，加入灭菌的去离子水100ml，搅拌2次，每次30s；
[0042] （2）利用灭菌的尼龙网（40 um网孔）将搅拌器内混合物进行过滤；
[0043] （3）将过滤物（孢子和菌根根段）加入到浓度0.5M的海藻糖中，制成海藻糖微球，每个微球约含有菌根繁殖体50±5个（孢子和菌根根段）；
[0044] （4）将海藻糖微球放置在27℃下，干燥两天，放入-130℃冰箱中冷冻，然后转移到-196℃液氮中长期保存；
[0045] （5）在保存12个月、24个月和36个月后，取出海藻糖微球，用30℃水浴进行快速解冻；
[0046] （6）利用高温灭菌的河沙∶泥炭＝4∶1作为基质，白三叶作为接种植物，在温室大棚内进行接种试验；每盆基质1kg，将4个海藻糖微球菌种倒入盆中，放入消毒后的白三叶种子，然后覆盖2cm厚基质；每3-4天淋一次无菌水，每2周施一次霍格兰营养液（稀释10倍浓度）；
[0047] （7）在大棚内培养6个月后，采集植物根系，用墨水醋染色法检测根系菌根侵染率。
[0048] 2. 试验结果
[0049] 参照图1，为实施例中不同丛枝菌根真菌保存方法，保存12个月、24个月和36个月后丛枝菌根真菌菌种对白三叶根系侵染率变化柱状图，柱状图上不同字母代表差异显著（P<0.05)。
[0050] 采用本发明方法和其它方法分别保存丛枝菌根真菌Gloums mosseae繁殖体，并在保存的不同阶段进行接种白三叶根系侵染试验，结果表明：在保存一年后，本发明方法与盆栽方法保存的菌种侵染率都在55%以上，显著高于超低温保存，4℃冰箱保存法在一年后菌种侵染率已下降至25.3%，显著低于前面三种方法。
[0051] 在保存两年后，本发明方法、盆栽方法和超低温保存方法菌种侵染率略有下降，但均保持在47%以上，仍显著高于4℃冰箱保存法。
[0052] 保存三年后，本发明方法比盆栽方法和超低温保存方法的菌种侵染率略有下降，但未表现出显著差异，侵染率保持在43%以上，4℃冰箱保存法的菌种侵染率已下降至16%。
[0053] 根据国际丛枝菌根真菌保藏中心（INVAM）认为菌种侵染率>20%即可认为是高活性接种剂，因此，可以看出，采用本发明方法，能够有效保存丛枝菌根真菌菌种活性。
[0054] 同时本发明方法与盆栽接种方法和超低温保存方法相比，本发明方法不占用培养温室、不需要定期的人工分离接种，不需要菌种保护剂和液氮保存材料等，在操作上比这两种方法简单，节省物力和人力。
[0055] 本发明丛枝菌根真菌的保存方法，在低温保存菌种前，充分降低繁殖体材料内的水分。第一步，通过常温通风干燥，降低基质材料中的大部分水分，使含水量降至8%以下。第二步，在玻璃干燥器内，利用硅胶干燥2周左右，进一步降低繁殖体含水量，使孢子和菌丝细胞内的水分缓慢降低，有利于保持菌种活力，同时避免在急速冷冻时冰晶对细胞造成伤害。
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