人抗IL-32抗体
阅读：378发布：2020-05-14
专利汇可以提供人抗IL-32抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种人源的新型IL‑32结合分子，特别是人抗IL‑32 抗体 以及其IL‑32结合 片段 、衍 生物 和变体。此外，描述了用于诊断和 治疗 的药物组合物、 试剂 盒 和方法。，下面是人抗IL-32抗体专利的具体信息内容。
1.一种人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段，其中所述人单克隆抗IL32抗体或其IL-32结合片段相对于IL-32α，优先结合IL-32γ和/或不与IL-32α结合，并且在其可变区中，所述人单克隆抗IL32抗体或其IL-32结合片段包括以下氨基酸序列的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的六个互补决定区(CDRs)：
VH-CDR1:SEQ ID NO:2的31-37位，
VH-CDR2:SEQ ID NO:2的52-67位，
VH-CDR3:SEQ ID NO:2的100-107位，
VL-CDR1:SEQ ID NO:4的23-35位，
VL-CDR2:SEQ ID NO:4的51-57位，和
VL-CDR3:SEQ ID NO:4的90-101位。
2.根据权利要求1所述的人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段，其
(i)能够与重组人IL-32γ结合；和/或
(ii)能够中和IL-32γ。
3.根据权利要求1或2所述的人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段，在它的可变区中包括：
选自SEQ ID NO:2和4的VH和/或VL区的氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2所述的人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段，包括：CH和/或CL恒定区，所述CH和/或CL恒定区包含选自SEQ ID NO：6、8、14、16、22、24和30的氨基酸序列。
5.根据权利要求1或2所述的人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段，它选自由单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段、F(ab')2片段和单域抗体片段组成的组。
6.根据权利要求1或2所述的人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段，其：
(i)被可检测地标记，其中可检测标记物选自由酶、放射性同位素、荧光团、肽和重金属组成的组；或者
(ii)附着于药物。
7.根据权利要求1或2所述的人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段，其中所述人单克隆抗IL-32抗体是IgG1或IgG3。
8.一种或多种多核苷酸，对根据权利要求1至5和7中任一项所述的人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段编码。
9.一种或多种载体，包括根据权利要求8所述的多核苷酸。
10.一种宿主细胞，包括根据权利要求8所述的多核苷酸或根据权利要求9所述的载体，其中，所述多核苷酸是对所述可变区和恒定结构域的至少部分编码的cDNA。
11.一种用于制备抗IL-32抗体或其一种或多种免疫球蛋白链的方法，所述方法包括：
(a)培养根据权利要求10所述的宿主细胞；以及
(b)从所述宿主细胞的培养物中分离所述抗体或其一种或多种免疫球蛋白链。
12.一种抗IL-32抗体或其一种或多种免疫球蛋白链，由根据权利要求8所述的多核苷酸编码或通过根据权利要求11所述的方法获得。
13.根据权利要求12所述的抗IL-32抗体，其：
(i)被可检测地标记，其中可检测标记物选自由酶、放射性同位素、荧光团、肽和重金属组成的组；或者
(ii)附着于药物。
14.一种组合物，包括根据权利要求1至7中任一项所述的人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段、根据权利要求12所述的抗IL-32抗体或其一种或多种免疫球蛋白链、根据权利要求13所述的抗IL-32抗体、根据权利要求8所述的多核苷酸、根据权利要求9所述的载体、或根据权利要求10所述的细胞。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物是：
(i)药物组合物，并且还包括药学上可接受的载体；或
(ii)诊断组合物或试剂盒，并且还包括在基于免疫的或基于核酸的诊断方法中常规使用的试剂。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述药物组合物还包括用于治疗炎症性疾病的其他药剂。
17.根据权利要求1至7中任一项所述的人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段、根据权利要求12所述的抗IL-32抗体或其一种或多种免疫球蛋白链、根据权利要求13所述的抗IL-32抗体或者根据权利要求14-16中任一项所述的组合物在制备用于如下的药物中的应用：
(a)治疗或预防免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的进展；
(b)改善与免疫介导的或自身免疫性疾病或病症相关联的症状；和/或
(c)诊断或筛选受试者中免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的存在或者确定受试者发展免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的风险；
其中，疾病与患者中IL-32的表达相关联，其中，所述疾病选自由炎症性肠病、牛皮癣、类风湿关节炎、强直性脊柱炎和其他形式的脊柱关节炎、牛皮癣性关节炎、重症肌无力、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺结核、包括白血病的癌症、血管炎症和动脉粥样硬化组成的组，其中炎症性肠病包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和乳糜泻。
18.根据权利要求1至7中任一项所述的人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段、根据权利要求12所述的抗IL-32抗体或其一种或多种免疫球蛋白链、根据权利要求13所述的抗IL-32抗体在制备诊断受试者中与IL-32的表达相关联的免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的药物中的应用。
19.根据权利要求18所述的应用，其中IL-32是IL-32γ。
20.一种用于制造治疗与IL-32的表达和/或活性水平相关联的疾病的药物组合物的方法，所述方法包括：
(a)培养根据权利要求10所述的宿主细胞；从所述宿主细胞的培养物中制备抗IL-32抗体或其IL-32结合片段；
(b)从所述宿主细胞的培养物纯化所述抗体或其IL-32结合片段至制药等级；以及(c)将所述抗体或其IL-32结合片段与药学上可接受的载体混合以获得所述药物组合物。
人抗IL-32抗体
技术领域
[0001] 本发明大体上涉及哺乳动物(优选人)源的结合白细胞介素-32(IL-32)的新型分子，特别是人单克隆抗体以及其片段、衍生物和变体。特别地，本发明涉及重组人患者来源
的抗IL-32抗体和其IL-32结合片段。此外，描述了包括可用于治疗和诊断疾病(失调，紊乱，
disorder)的这些结合分子、抗体以及其模拟物的组合物。此外，本发明涉及抗IL-32抗体和
所提及的其等同物，用于免疫治疗以及用作自身免疫性疾病和自身炎症性疾病以及恶性肿
瘤，如各种形式的关节炎、炎症性肠病(IBD)、重症肌无力(MG)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮
喘、血管炎症与动脉粥样硬化、特应性皮炎和癌症的治疗干预中的靶。
的抗IL-32抗体和其IL-32结合片段。此外，描述了包括可用于治疗和诊断疾病(失调，紊乱，
disorder)的这些结合分子、抗体以及其模拟物的组合物。此外，本发明涉及抗IL-32抗体和
所提及的其等同物，用于免疫治疗以及用作自身免疫性疾病和自身炎症性疾病以及恶性肿
瘤，如各种形式的关节炎、炎症性肠病(IBD)、重症肌无力(MG)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮
喘、血管炎症与动脉粥样硬化、特应性皮炎和癌症的治疗干预中的靶。
背景技术
[0002] 免疫系统的不恰当反应可引起所涉及机体的应激症状(stressful symptom)。对通常对动物或人的健康没有显著影响的外来物质或物理状况的夸张免疫应答可能引起有
下述症状的过敏，所述症状在从轻微反应(诸如皮肤刺激)到致命情形(诸如过敏性休克或
各种血管炎)的范围内变动。对内源性抗原的免疫应答可引起自身免疫性疾病，诸如系统性
红斑狼疮、特发性自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、I型糖尿病、疱性皮肤病(blistering
skin disease)和不同种类的关节炎。
下述症状的过敏，所述症状在从轻微反应(诸如皮肤刺激)到致命情形(诸如过敏性休克或
各种血管炎)的范围内变动。对内源性抗原的免疫应答可引起自身免疫性疾病，诸如系统性
红斑狼疮、特发性自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、I型糖尿病、疱性皮肤病(blistering
skin disease)和不同种类的关节炎。
[0004] 细胞因子是纳摩尔级至皮摩尔级浓度的作为体液调节物的分泌的可溶性蛋白、肽和糖蛋白，由于它们在全身水平上作用，其表现类似于典型激素，并且它们在正常或病理状
况下调节各个细胞和组织的功能活性。细胞因子与激素的不同之处在于：它们并不是由组
织在专门腺体中的专门细胞生成的，即不存在针对这些介质(mediator)的单一器官或细胞
源，因为它们实质上是由先天免疫和适应性免疫所涉及的所有细胞(诸如上皮细胞、巨噬细
胞、树突细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞)，特别是由其中主要是辅助性T(Th)淋巴细胞的T细
胞所表达的。
况下调节各个细胞和组织的功能活性。细胞因子与激素的不同之处在于：它们并不是由组
织在专门腺体中的专门细胞生成的，即不存在针对这些介质(mediator)的单一器官或细胞
源，因为它们实质上是由先天免疫和适应性免疫所涉及的所有细胞(诸如上皮细胞、巨噬细
胞、树突细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞)，特别是由其中主要是辅助性T(Th)淋巴细胞的T细
胞所表达的。
[0005] 根据细胞因子各自的功能，可将其分为三种功能类别：调节先天免疫反应、调节适应性免疫反应以及刺激造血。归因于所述三种类别内细胞因子的例如涉及细胞活化、增殖、
分化、募集(recruitment)或其他生理反应(例如靶细胞分泌炎症特有的蛋白)的多效活性，
已经发现由异常调节的细胞因子产生所介导的细胞信号传导的干扰是与缺陷免疫反应相
关联的许多疾病(例如炎症和癌症)的原因。
分化、募集(recruitment)或其他生理反应(例如靶细胞分泌炎症特有的蛋白)的多效活性，
已经发现由异常调节的细胞因子产生所介导的细胞信号传导的干扰是与缺陷免疫反应相
关联的许多疾病(例如炎症和癌症)的原因。
[0006] 白细胞介素-32(IL-32，也称之为自然杀伤细胞蛋白4)是最近发现的在宿主防御和先天免疫中具有重要功能的细胞因子。人IL-32基因位于染色体16p13.3处。除了人和猿
同源物，到目前为止已发现牛、猪和马同源物，然而迄今为止没有已知的小鼠同源物。已知
由选择性剪接生成的6种IL-32同种型(Chen等人,Vitam Horm 74(2006),207-228)。最长同
种型IL-32gamma(IL-32γ或IL-32g)包括234个aa(氨基酸)(UniProtKB/Swiss-Prot标识
号：P24001-1)。第二种同种型，也称为IL-32beta(IL-32β或IL-32b；UniProtKB/Swiss-Prot
标识号：P24001-2)具有188个aa。具有178个aa的第三种同种型也称为IL-32delta(IL-32δ
或IL-32d；UniProtKB/Swiss-Prot标识号：P24001-3)。具有131个aa的IL-32alpha(IL-32α
或IL-32a)是第四种同种型(UniProtKB/Swiss-Prot标识号：P24001-4)。同种型5
(UniProtKB/Swiss-Prot标识号：P24001-5)和同种型6(UniProtKB/Swiss-Prot标识号:
P24001-6)分别具有168个aa和179个aa。然而，还可存在其他同型，例如，Imaeda等人已经报
导了具有112个aa的潜在新同型(Mol Med Rep.4(2011),483-487)。
同源物，到目前为止已发现牛、猪和马同源物，然而迄今为止没有已知的小鼠同源物。已知
由选择性剪接生成的6种IL-32同种型(Chen等人,Vitam Horm 74(2006),207-228)。最长同
种型IL-32gamma(IL-32γ或IL-32g)包括234个aa(氨基酸)(UniProtKB/Swiss-Prot标识
号：P24001-1)。第二种同种型，也称为IL-32beta(IL-32β或IL-32b；UniProtKB/Swiss-Prot
标识号：P24001-2)具有188个aa。具有178个aa的第三种同种型也称为IL-32delta(IL-32δ
或IL-32d；UniProtKB/Swiss-Prot标识号：P24001-3)。具有131个aa的IL-32alpha(IL-32α
或IL-32a)是第四种同种型(UniProtKB/Swiss-Prot标识号：P24001-4)。同种型5
(UniProtKB/Swiss-Prot标识号：P24001-5)和同种型6(UniProtKB/Swiss-Prot标识号:
P24001-6)分别具有168个aa和179个aa。然而，还可存在其他同型，例如，Imaeda等人已经报
导了具有112个aa的潜在新同型(Mol Med Rep.4(2011),483-487)。
[0007] 迄今为止，IL-32的受体是未知的。然而，存在一些数据，表明了可以通过蛋白酶3在细胞膜结合和分裂IL-32，暗示了此分子作为可能的受体，其中所产生的片段可具有生物
活性并激活巨噬细胞炎性蛋白-2和IL-8(Dinarello和Kim,Ann Rheum Dis.65 Suppl.3
(2006)；iii 61-64)。暗示IL-32为炎症通路的主要控制器，以自保持循环(self-
perpetuating loop)形式与TNFα具有显著协同效应，其中，IL-32促进TNFα表达，反之亦然，
导致了促炎介质的扩增。已报道，诱导各种细胞因子(如TNFA/TNF-alpha、IL-1β、IL-6、IL-8
和巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2))以激活NF-κ-B和p38 MAPK的典型细胞因子信号传导通路，
且这是IL-18可诱导基因(Kim等人,Immunity 22(2005),131-142；Netea等人,Proc Natl
Acad Sci USA.105(2008),3515–3520；Netea等人,Proc Natl Acad Sci U S A.102
(2005),16309–16314；Joosten等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006),3298-3303)。最
近，还展示了通过外周血单核细胞(PBMC)，IL-32增加了IFN-γ生成(Nold等人,J
Immunol.181(2008),557-565；Netea等人,PLoS Med.3(2006),e277)。
活性并激活巨噬细胞炎性蛋白-2和IL-8(Dinarello和Kim,Ann Rheum Dis.65 Suppl.3
(2006)；iii 61-64)。暗示IL-32为炎症通路的主要控制器，以自保持循环(self-
perpetuating loop)形式与TNFα具有显著协同效应，其中，IL-32促进TNFα表达，反之亦然，
导致了促炎介质的扩增。已报道，诱导各种细胞因子(如TNFA/TNF-alpha、IL-1β、IL-6、IL-8
和巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2))以激活NF-κ-B和p38 MAPK的典型细胞因子信号传导通路，
且这是IL-18可诱导基因(Kim等人,Immunity 22(2005),131-142；Netea等人,Proc Natl
Acad Sci USA.105(2008),3515–3520；Netea等人,Proc Natl Acad Sci U S A.102
(2005),16309–16314；Joosten等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006),3298-3303)。最
近，还展示了通过外周血单核细胞(PBMC)，IL-32增加了IFN-γ生成(Nold等人,J
Immunol.181(2008),557-565；Netea等人,PLoS Med.3(2006),e277)。
[0008] 据报道，IL-32主要通过由IL-2或IFN-γ刺激的NK细胞、T淋巴细胞、上皮细胞和血单核细胞产生(Dahl等人,J Immunol.148(1992),597-603；Kim等人,(2005))。此外，据观
察，IL-32在类风湿性关节炎(RA)滑膜组织活检中过表达，其中IL-32表达的水平与炎症的
严重程度正相关(Alsaleh等人,Arthritis Res Ther.12(2010),R135；Cagnard等人,Eur
Cytokine Netw.16(2005),289-292)。除了属于脊椎关节病科的各种形式的关节炎，如类风
湿性关节炎(RA)或强直性脊柱炎(Ciccia等人,Rheumatology 51(2012),1966-1972)之外，
发现IL-32还与若干其他炎症性肠病(IBD)、重症肌无力(MG)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮
喘、克罗恩氏病(Crohn's disease)、牛皮癣、特应性皮炎和癌症在功能上相关联(Alsaleh
等人,(2010)；Breenan和Beech,Curr.Opin.Rheumatol.,19(2007),296-301；Asquith和
Mclnnes,Curr.Opin.Rheumatol.,19(2007),246-251；Dinarello和Kim,Ann Rheum
Dis.65Suppl 3(2006)；iii 61-64；Fantini等人,Inflamm Bowel Dis.13(2007),1419–
1423；Lee等人,Oncology Letters 3(2012),490-496)。RA中动脉粥样硬化的高比率也表明
IL-32在血管炎症与动脉粥样硬化的炎症通路中的可能作用，例如通过IL-32表达的检测也
已经证实了该暗示，同时IL-32β和IL-32γmRNA的表达在人动脉粥样硬化的动脉血管壁中
显著提高(Kobayashi等人,PLoS One.5(2010)；e9458；Heinhuis等人,Cytokine.(2013),
S1043-4666)。IL-32可能也在对肺结核的免疫反应中起作用(Kundu和Basu,PLoS Med.,3
(2006),e274；Netea等人,2006)。而且，已观察到在细菌和病毒(如结核分枝杆菌(Netea等
人,2006)或流感A(Li等人,PLoS One.3(2008),e1985))感染后IL-32的转录增加，表明IL-
32在宿主防御中的可能作用。
察，IL-32在类风湿性关节炎(RA)滑膜组织活检中过表达，其中IL-32表达的水平与炎症的
严重程度正相关(Alsaleh等人,Arthritis Res Ther.12(2010),R135；Cagnard等人,Eur
Cytokine Netw.16(2005),289-292)。除了属于脊椎关节病科的各种形式的关节炎，如类风
湿性关节炎(RA)或强直性脊柱炎(Ciccia等人,Rheumatology 51(2012),1966-1972)之外，
发现IL-32还与若干其他炎症性肠病(IBD)、重症肌无力(MG)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮
喘、克罗恩氏病(Crohn's disease)、牛皮癣、特应性皮炎和癌症在功能上相关联(Alsaleh
等人,(2010)；Breenan和Beech,Curr.Opin.Rheumatol.,19(2007),296-301；Asquith和
Mclnnes,Curr.Opin.Rheumatol.,19(2007),246-251；Dinarello和Kim,Ann Rheum
Dis.65Suppl 3(2006)；iii 61-64；Fantini等人,Inflamm Bowel Dis.13(2007),1419–
1423；Lee等人,Oncology Letters 3(2012),490-496)。RA中动脉粥样硬化的高比率也表明
IL-32在血管炎症与动脉粥样硬化的炎症通路中的可能作用，例如通过IL-32表达的检测也
已经证实了该暗示，同时IL-32β和IL-32γmRNA的表达在人动脉粥样硬化的动脉血管壁中
显著提高(Kobayashi等人,PLoS One.5(2010)；e9458；Heinhuis等人,Cytokine.(2013),
S1043-4666)。IL-32可能也在对肺结核的免疫反应中起作用(Kundu和Basu,PLoS Med.,3
(2006),e274；Netea等人,2006)。而且，已观察到在细菌和病毒(如结核分枝杆菌(Netea等
人,2006)或流感A(Li等人,PLoS One.3(2008),e1985))感染后IL-32的转录增加，表明IL-
32在宿主防御中的可能作用。
[0009] 因此，IL-32代表尚未完全理解然而重要的新型治疗靶，且需要对所有IL-32同型、其选定子区域(sub-range)或单种IL-32同型如IL-32γ的功能进行中和的IL-32特异性结
合分子。
合分子。
[0010] 已经进行了提供这种分子的首次尝试。例如，Kim等人的第US7,641,904 B2号美国专利提供了鼠IL-32单克隆抗体，其中抗体之一选择性识别IL-32α，其中另一抗体结合IL-
32α、IL-32β和IL-32γ。国际申请WO 2005/047478描述了生成对IL-32α和IL-32β特异性的
鼠抗体片段。然而，显然还没有提供对IL-32γ特异性的抗体。
32α、IL-32β和IL-32γ。国际申请WO 2005/047478描述了生成对IL-32α和IL-32β特异性的
鼠抗体片段。然而，显然还没有提供对IL-32γ特异性的抗体。
[0011] 此外，由于人体中对外来抗体如小鼠抗体的免疫反应(人抗鼠抗体-应答(HAMA-response)；Schroff等人,Cancer Res.45(1985),879-885；Shawler等人,J.Immunol.135
(1985),1530-1535)，因此在当前的治疗方法中大多使用人源化版本的抗体(Chan和
Carter,Nature Reviews Immunology 10(2010),301-316；Nelson等人,Nature Reviews
Drug Discovery 9(2010),767-774)。一种获取这种抗体的方法是将互补决定区(CDR)移植
到完全人类的框架中，即一种称之为抗体人源化的方法(Jones等人,Nature 321(1986),
522-525)。此方法常常由于下述事实而复杂化：小鼠CDR不易于转移到人可变结构域框架，
从而导致人源化抗体相对其亲代小鼠抗体具有较低的亲和力。因此，通常需要其他周详的
诱变实验，以增加如此工程化的抗体的亲和力。另一种实现人源化抗体的方法是对已用人
抗体基因取代其先天性抗体基因的小鼠进行免疫，并分离这些动物产生的抗体。然而，该方
法依然需要用抗原进行免疫，但却不可能用所有抗原进行免疫，原因在于一些抗原存在毒
性。此外，这种方法局限于具有特异性菌株的转基因小鼠的产生。
(1985),1530-1535)，因此在当前的治疗方法中大多使用人源化版本的抗体(Chan和
Carter,Nature Reviews Immunology 10(2010),301-316；Nelson等人,Nature Reviews
Drug Discovery 9(2010),767-774)。一种获取这种抗体的方法是将互补决定区(CDR)移植
到完全人类的框架中，即一种称之为抗体人源化的方法(Jones等人,Nature 321(1986),
522-525)。此方法常常由于下述事实而复杂化：小鼠CDR不易于转移到人可变结构域框架，
从而导致人源化抗体相对其亲代小鼠抗体具有较低的亲和力。因此，通常需要其他周详的
诱变实验，以增加如此工程化的抗体的亲和力。另一种实现人源化抗体的方法是对已用人
抗体基因取代其先天性抗体基因的小鼠进行免疫，并分离这些动物产生的抗体。然而，该方
法依然需要用抗原进行免疫，但却不可能用所有抗原进行免疫，原因在于一些抗原存在毒
性。此外，这种方法局限于具有特异性菌株的转基因小鼠的产生。
[0012] 另一种生成抗体的方法是使用人抗体库，诸如如国际申请WO 2005/007699中所描述的例如用于生成IL-13特异性抗体的噬菌体展示技术。此处，通过将人抗体基因插入到噬
菌体种群中将细菌噬菌体工程化以在其表面展示人scFv/Fab片段。遗憾的是，这种方法也
存在很多缺点，包括用于多价展示的蛋白序列的大小限制、对来自细菌的蛋白即抗体scFv/
Fab片段的分泌的需求、库的大小限制、所产生和测试的可能抗体的数量有限、具有由自然
免疫产生的体细胞超突变的抗体的比例降低；并且所有噬菌体编码蛋白都是融合蛋白，这
可能限制用于一些蛋白结合的活性或可接近性(accessibility)。这种技术的另一个严重
缺点是，如此产生的抗体具有对自身抗原的不期望的交叉反应性的风险，并缺乏由人免疫
系统产生的进化优化的天然人抗体的特性。此外，由于在正常生理环境和功能的情况下这
样的抗体与其他蛋白质和/或与靶蛋白的交叉反应性，这样的抗体可能不够特异性。相似
地，欧洲专利申请EP0616640A1描述了由噬菌体上展示的抗体片段库生成自身抗体。在这方
面，由未免疫的人来生成噬菌体库(参见，例如第16页的第43-51行的实施例1，第17页第
菌体种群中将细菌噬菌体工程化以在其表面展示人scFv/Fab片段。遗憾的是，这种方法也
存在很多缺点，包括用于多价展示的蛋白序列的大小限制、对来自细菌的蛋白即抗体scFv/
Fab片段的分泌的需求、库的大小限制、所产生和测试的可能抗体的数量有限、具有由自然
免疫产生的体细胞超突变的抗体的比例降低；并且所有噬菌体编码蛋白都是融合蛋白，这
可能限制用于一些蛋白结合的活性或可接近性(accessibility)。这种技术的另一个严重
缺点是，如此产生的抗体具有对自身抗原的不期望的交叉反应性的风险，并缺乏由人免疫
系统产生的进化优化的天然人抗体的特性。此外，由于在正常生理环境和功能的情况下这
样的抗体与其他蛋白质和/或与靶蛋白的交叉反应性，这样的抗体可能不够特异性。相似
地，欧洲专利申请EP0616640A1描述了由噬菌体上展示的抗体片段库生成自身抗体。在这方
面，由未免疫的人来生成噬菌体库(参见，例如第16页的第43-51行的实施例1，第17页第
[0158]段第57-58行的实施例2)。然而，与哺乳动物即人体中生成并成熟的抗体相比，该专利申请中描述的方法也存在从噬菌体库生成的抗体的上述一般缺点。
[0013] 鉴于上述内容，仍需要用于治疗和诊断与不利的IL-32活性相关的疾病或病症的其他新型化合物，如具有对IL-32的高特异性的或对选定范围的或单种IL-32同型特异性的
结合分子，特别是对IL-32γ特异的抗体的结合分子，其无论是用于单一疗法还是组合方法
均是在人中可容许的。
结合分子，特别是对IL-32γ特异的抗体的结合分子，其无论是用于单一疗法还是组合方法
均是在人中可容许的。
发明内容
[0015] 本发明涉及IL-32特异性人单克隆抗体和其IL-32结合片段及衍生物。特别地，如在所附实施例和附图中所示的，提供了人单克隆抗IL-32抗体，其具有针对IL-32同型的选
择性结合属性(profile)，且表现出体外和体内的结合和中和活性。由于它们的中和特性，
本发明的抗体具有治疗、预后和诊断功效，这使它们在与以下疾病相关的应用中特别有价
值：与不期望的免疫反应的起始和/或维持中的IL-32活性相关联/有关的多种多样的自身
免疫性和炎症性疾病以及病症，如各种形式的关节炎(例如，类风湿性关节炎(RA)或脊柱关
节病)、重症肌无力(MG)、炎症性肠病(IBD)、肺部疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘、克
罗恩氏病、牛皮癣，血管炎症和动脉粥样硬化、特应性皮炎和癌症；对于这些和其他可能的
抗IL-32的治疗和诊断的适应症，另请参见上文本发明的背景技术部分。
择性结合属性(profile)，且表现出体外和体内的结合和中和活性。由于它们的中和特性，
本发明的抗体具有治疗、预后和诊断功效，这使它们在与以下疾病相关的应用中特别有价
值：与不期望的免疫反应的起始和/或维持中的IL-32活性相关联/有关的多种多样的自身
免疫性和炎症性疾病以及病症，如各种形式的关节炎(例如，类风湿性关节炎(RA)或脊柱关
节病)、重症肌无力(MG)、炎症性肠病(IBD)、肺部疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘、克
罗恩氏病、牛皮癣，血管炎症和动脉粥样硬化、特应性皮炎和癌症；对于这些和其他可能的
抗IL-32的治疗和诊断的适应症，另请参见上文本发明的背景技术部分。
[0016] 已从哺乳动物特别是人分离本发明的抗体，这些哺乳动物受中枢和/或外周耐受性受损或自身耐受性丧失的影响，该中枢和/或外周耐受性受损或自身耐受性丧失可能是
由破坏的或反常的自身耐受基因引起或与其有关，优选地由单基因自身免疫性疾病引起。
为根据本发明的自身抗体提供特别适合的来源的哺乳动物的实例为下述哺乳动物，例如患
有与AIRE(自身免疫调节因子)基因中的突变相关联的疾病的人，上述疾病为诸如自身免疫
性多内分泌腺病综合征1型(APS1)(Peterson等人,Nat.Rev.Immunol.8(2008),948-957)、
自身免疫性多内分泌腺病综合征Ⅱ型(APS2)(Baker等人,J.Clin.Endocrinol.Metab.95
(2010),E263-E270)和免疫功能失调多发性内分泌腺病肠病及X染色体连锁综合征(IPEX)
(Powell等人,J.Pediatr.100(1982),731-737；Ochs等人,Immunol.Rev.203(2005),156-
164)。优选地，从其分离抗体的患者表现出针对人IL-32同型中的至少一种最优选针对IL-
32γ的血清反应性(seroreactivity)。
由破坏的或反常的自身耐受基因引起或与其有关，优选地由单基因自身免疫性疾病引起。
为根据本发明的自身抗体提供特别适合的来源的哺乳动物的实例为下述哺乳动物，例如患
有与AIRE(自身免疫调节因子)基因中的突变相关联的疾病的人，上述疾病为诸如自身免疫
性多内分泌腺病综合征1型(APS1)(Peterson等人,Nat.Rev.Immunol.8(2008),948-957)、
自身免疫性多内分泌腺病综合征Ⅱ型(APS2)(Baker等人,J.Clin.Endocrinol.Metab.95
(2010),E263-E270)和免疫功能失调多发性内分泌腺病肠病及X染色体连锁综合征(IPEX)
(Powell等人,J.Pediatr.100(1982),731-737；Ochs等人,Immunol.Rev.203(2005),156-
164)。优选地，从其分离抗体的患者表现出针对人IL-32同型中的至少一种最优选针对IL-
32γ的血清反应性(seroreactivity)。
[0017] 特别地，根据本发明进行的实验在对来自APS1患者的IL-32特别是IL-32γ特异性抗体的分离上是成功的。因此，本发明大体上涉及高亲和力IL-32中和单克隆抗体。因此，本
发明提供了将在下文详细描述的针对若干或单种IL-32同型的单克隆人抗体(mAb或MAB)，
认为该单克隆人抗体对于其中涉及那些细胞因子的失调是安全和有效的疗法。
发明提供了将在下文详细描述的针对若干或单种IL-32同型的单克隆人抗体(mAb或MAB)，
认为该单克隆人抗体对于其中涉及那些细胞因子的失调是安全和有效的疗法。
[0018] 自然地，本发明扩展至核酸，特别是对本发明的抗体的至少一种可变、恒定和/或互补决定区编码的cDNA，并且扩展至包含这种核酸的载体、产生抗体的细胞系和重组细胞。
本发明还涉及包含通过根据本发明分离的抗体识别的结合分子或肽的药物组合物、诊断测
定和试剂盒，以及涉及基于其的治疗方法。
本发明还涉及包含通过根据本发明分离的抗体识别的结合分子或肽的药物组合物、诊断测
定和试剂盒，以及涉及基于其的治疗方法。
[0019] 根据随后的说明书和实施例，本发明的其他实施方式将显而易见。当这样做时，如果没有其他指示，术语“单克隆抗体”、“mAb”、“MAB”和“MAb”在本文中可互换使用。
[0020] 此外，虽然通过参照在根据本发明进行的和在实施例中描述的实验中最初获得的人源抗体来说明和描述本发明，但要理解的是，本发明的抗体或抗体片段包括抗体的合成
和生物技术衍生物，它表示通过化学或重组技术合成的任何工程化抗体或类抗体的IL-32
结合分子，其保留受试者抗体的一种或多种功能特性，特别是其针对IL-32的中和活性。因
此，虽然为了简明起见可通过参考抗体来描述本发明，但是除非另有说明，否则抗体的合成
和生物技术衍生物以及等同的IL-32结合分子也意指术语抗体并且包括在术语抗体的含义
中。
和生物技术衍生物，它表示通过化学或重组技术合成的任何工程化抗体或类抗体的IL-32
结合分子，其保留受试者抗体的一种或多种功能特性，特别是其针对IL-32的中和活性。因
此，虽然为了简明起见可通过参考抗体来描述本发明，但是除非另有说明，否则抗体的合成
和生物技术衍生物以及等同的IL-32结合分子也意指术语抗体并且包括在术语抗体的含义
中。
附图说明
[0021] 图1：本发明的IL-32特异性人抗体的可变区(即重链和κ/λ轻链(VH、VL))的氨基酸序列。A：抗体2C2(IgG3，λ)；B：抗体14B3(IgG1，λ)；C：抗体19A1(IgG1，λ)；D：抗体26A6(IgG1，λ)。框架(FR)和互补决定区(CDR)通过加下划线的CDR表示。
[0022] 图2：从APS1患者所分离的血清中的IL-32α(实心棱形)和IL-32γ(实心方块)的ELISA血清反应性的比较。X轴表示个体患者，和Y轴表示MAB结合的OD450测量值。
[0023] 图3：示例性抗IL-32 2C2、14B3、19A1和26A6抗体与A：IL-32γ(R&D公司)或B：IL-32α(ImmunoTools公司)结合的EC50ELISA测定。所有测试的抗体与高亲和力IL-32结合。抗
体2C2还与低亲和力IL-32α结合。余下的抗体14B3、19A1和26A6没有显示出与IL-32α的任何
实质结合。
体2C2还与低亲和力IL-32α结合。余下的抗体14B3、19A1和26A6没有显示出与IL-32α的任何
实质结合。
[0024] 图4：本发明的示例性抗体的结合特性和中和特性。A：示例性抗IL-32 2C2抗体与IL-32γ(R&D公司)和IL-32α(ImmunoTools公司)结合的EC50ELISA测定，BSA用作非特异性
结合的对照。示例性抗体2C2与高亲和力IL-32γ结合，且与非常低亲和力IL-32α结合。B：示
例性抗IL-32抗体2C2和19A1对IL-32γ活性的中和能力。
结合的对照。示例性抗体2C2与高亲和力IL-32γ结合，且与非常低亲和力IL-32α结合。B：示
例性抗IL-32抗体2C2和19A1对IL-32γ活性的中和能力。
[0025] 图5：针对每一群组，CytoEar耳厚度测量值被计算为相对于第0天测量值的倍数变化，然后针对相关PBS对照标准化(相对于相关PBS对照归一化，normalized to relevant
PBS controls)。平均数±标准差(Mean+/-SEM)，在图上用N表示。P值通过双向ΑΝOVΑ测
试获得，ns(不显著)＝P＞0.05；*＝P≤0.05；**＝P≤0.01；***＝P＜0.001，****＝P＜
0.0001。IP＝腹腔内抗体注射，ID＝耳皮内注射。
PBS controls)。平均数±标准差(Mean+/-SEM)，在图上用N表示。P值通过双向ΑΝOVΑ测
试获得，ns(不显著)＝P＞0.05；*＝P≤0.05；**＝P≤0.01；***＝P＜0.001，****＝P＜
0.0001。IP＝腹腔内抗体注射，ID＝耳皮内注射。
[0026] 图6：对于每一群组，CytoEar耳厚度测量值被示为绝对值(mm)。平均数±标准差，在图上用N表示。P值通过ANOVA测试获得。IP＝腹腔内抗体注射，ID＝耳皮内注射。P值指示
与图5中一样。
与图5中一样。
[0027] 图7：CytoEar测定-重量监测。实验中所测试的任一动物未观察到显著重量变化。
[0028] 图8：有关IL-32与本发明的抗IL-322C2抗体的结合的传感图(sensogram)的详细分析。观察到非1:1行为，其允许与异源配体的最佳拟合。(A)针对朗格缪尔拟合(Langmuir
fit)和结合反应的实验数据的叠加图表明与1.1朗格缪尔模型的良好拟合。以A1：100nM、
A2：33.33nM、A3：11.11nM、A4：3.70nM、A5:1.23nM的浓度注射IL-32。残差图(Residuals
plot)(B)示出了具有噪音水平级别的随机散射(random scatter)，表明良好的残差拟合。
(C)图下方的表示出了从用于缔合(association)(ka)、离解(kd)、R最大值和所计算的离解常
数KD的拟合曲线得到的动力参数。本发明的示例性抗IL-322C2抗体的KD似乎是在nM范围
内。
fit)和结合反应的实验数据的叠加图表明与1.1朗格缪尔模型的良好拟合。以A1：100nM、
A2：33.33nM、A3：11.11nM、A4：3.70nM、A5:1.23nM的浓度注射IL-32。残差图(Residuals
plot)(B)示出了具有噪音水平级别的随机散射(random scatter)，表明良好的残差拟合。
(C)图下方的表示出了从用于缔合(association)(ka)、离解(kd)、R最大值和所计算的离解常
数KD的拟合曲线得到的动力参数。本发明的示例性抗IL-322C2抗体的KD似乎是在nM范围
内。
[0029] 图9：在CytoEar试验中hIL-32γ诱发炎症之后19A1封闭抗体相较于2C2的效果。为了诱发炎症，以6.25μg/ml的浓度即125ng/耳注射hIL-32γ。A：示例性10天实验的时间轴。
B：实验动物组A至F的实验处理的概观。C-F：在实验起始日向小鼠群组(C57/BL6，8周)IP注
射规定量的2C2或19A1抗体(或IgG对照)，同时每48-72小时向小鼠耳朵皮内注射含有125ng
hrIL-32γ细胞因子的20μl PBS(或PBS对照)。使用Mitutoyo数字测微计进行耳厚度测量。
对于每一群组，CytoEar耳厚度测量值计算为相对于起始日测量值的倍数变化，然后针对相
关PBS对照标准化。平均数±标准差，在图上用N表示。P值通过ANOVA测试获得。IP＝腹腔内
抗体注射，ID＝耳皮内注射，NT＝未处理的对照。
B：实验动物组A至F的实验处理的概观。C-F：在实验起始日向小鼠群组(C57/BL6，8周)IP注
射规定量的2C2或19A1抗体(或IgG对照)，同时每48-72小时向小鼠耳朵皮内注射含有125ng
hrIL-32γ细胞因子的20μl PBS(或PBS对照)。使用Mitutoyo数字测微计进行耳厚度测量。
对于每一群组，CytoEar耳厚度测量值计算为相对于起始日测量值的倍数变化，然后针对相
关PBS对照标准化。平均数±标准差，在图上用N表示。P值通过ANOVA测试获得。IP＝腹腔内
抗体注射，ID＝耳皮内注射，NT＝未处理的对照。
[0030] 图10：在CytoEar试验中hIL-32γ诱发炎症之后不同剂量的19A1抗体的效果。为了诱发炎症，以6.25μg/ml的浓度即125ng/耳注射hIL-32γ。A：示例性10天实验的时间轴。B：
实验动物组A至K的实验处理的概观。C-F：在实验起始日向小鼠群组(C57/BL6，8周)IP注射
规定量的2C2或19A1抗体(或IgG对照)，同时每48-72小时向小鼠耳朵皮内注射含有125ng
hrIL-32γ细胞因子的20μl PBS(或PBS对照)。使用Mitutoyo数字测微计进行耳厚度测量。
对于每一群组，CytoEar耳厚度测量值计算为相对于起始日的测量值的倍数变化，然后针对
相关PBS对照标准化。平均数±标准差，在图上用N表示。P值通过ANOVA测试获得。IP＝腹腔
内抗体注射，ID＝耳皮内注射，NT＝未处理的对照。
实验动物组A至K的实验处理的概观。C-F：在实验起始日向小鼠群组(C57/BL6，8周)IP注射
规定量的2C2或19A1抗体(或IgG对照)，同时每48-72小时向小鼠耳朵皮内注射含有125ng
hrIL-32γ细胞因子的20μl PBS(或PBS对照)。使用Mitutoyo数字测微计进行耳厚度测量。
对于每一群组，CytoEar耳厚度测量值计算为相对于起始日的测量值的倍数变化，然后针对
相关PBS对照标准化。平均数±标准差，在图上用N表示。P值通过ANOVA测试获得。IP＝腹腔
内抗体注射，ID＝耳皮内注射，NT＝未处理的对照。
[0031] 图11：在CytoAnkle测定中诱发炎症时IL-32的剂量依赖性。为了诱发炎症，小鼠获得向右踝关节中的10μl hIL-32γ的踝关节关节腔内注射，而用PBS注射左踝关节。A：示例
性13天实验的时间轴。B：实验动物笼A1至D2的实验处理的概观。C-D：每48-72小时向小鼠群
组(C57/BL6，8周)的小鼠踝关节IA注射规定量的含hrIL-32γ细胞因子的10μl PBS(或PBS
对照)。使用Mitutoyo数字测微计进行轴向踝关节厚度测量。对于每一群组，CytoAnkle厚度
测量值计算为相对于起始日的测量值的倍数变化，然后针对相关PBS对照标准化。平均数±
标准差，在图上用N表示。P值通过ANOVA测试获得。IA＝踝关节关节腔内注射。
性13天实验的时间轴。B：实验动物笼A1至D2的实验处理的概观。C-D：每48-72小时向小鼠群
组(C57/BL6，8周)的小鼠踝关节IA注射规定量的含hrIL-32γ细胞因子的10μl PBS(或PBS
对照)。使用Mitutoyo数字测微计进行轴向踝关节厚度测量。对于每一群组，CytoAnkle厚度
测量值计算为相对于起始日的测量值的倍数变化，然后针对相关PBS对照标准化。平均数±
标准差，在图上用N表示。P值通过ANOVA测试获得。IA＝踝关节关节腔内注射。
[0032] 图12：在CytoAnkle测定中hIL-32γ诱发炎症之后2C2抗体的效果。CytoAnkle测试：+/-IL-32γ+/-2C2。A：示例性10天实验的时间轴。B：实验动物笼A1至D2的实验处理的概
观。C-D：在实验起始日向小鼠群组(C57/BL6，8周)IP注射200μg 2C2抗体(或IgG对照)，同时
每48-72小时向小鼠踝关节IA注射含500ng hrIL-32γ细胞因子的10μl PBS(或PBS对照)。
使用Mitutoyo数字测微计进行轴向踝关节厚度测量。对于每一群组，CytoAnkle厚度测量值
计算为相对于起始日的测量值的倍数变化，然后针对相关PBS对照标准化。平均数±标准
差，在图上用N表示。P值通过ANOVA测试获得。IP＝腹腔内抗体注射，IA＝踝关节关节内注
射。
观。C-D：在实验起始日向小鼠群组(C57/BL6，8周)IP注射200μg 2C2抗体(或IgG对照)，同时
每48-72小时向小鼠踝关节IA注射含500ng hrIL-32γ细胞因子的10μl PBS(或PBS对照)。
使用Mitutoyo数字测微计进行轴向踝关节厚度测量。对于每一群组，CytoAnkle厚度测量值
计算为相对于起始日的测量值的倍数变化，然后针对相关PBS对照标准化。平均数±标准
差，在图上用N表示。P值通过ANOVA测试获得。IP＝腹腔内抗体注射，IA＝踝关节关节内注
射。
具体实施方式
[0033] 本发明大体上涉及一种哺乳动物(优选为人)源的结合IL-32的新型分子，特别是人单克隆抗体以及其片段、衍生物和变体，其识别IL-32的不同同型。
[0034] 如在背景技术部分所描述的，已作出努力以提供IL-32特异性抗体，然而，如上所指出的，目前提供和使用的抗体不是人源的，由于非人源抗体的免疫原性，这极大地损害它
们在人类的治疗使用。此外，尽管可用针对IL-32α的鼠抗体或针对若干IL-32同型具有更广
泛的特异性的鼠抗体，但由于它们广泛的结合特异性，它们可能具有不期望的副作用属性，
并因此可能导致不良反应和疾病。此外，显然还没有可用的人IL-32γ特异性抗体。
们在人类的治疗使用。此外，尽管可用针对IL-32α的鼠抗体或针对若干IL-32同型具有更广
泛的特异性的鼠抗体，但由于它们广泛的结合特异性，它们可能具有不期望的副作用属性，
并因此可能导致不良反应和疾病。此外，显然还没有可用的人IL-32γ特异性抗体。
[0035] 如在实施例中所描述的，通过申请人的共同在审的国际申请WO2013/098419A1中公开的方法分离出本发明的受试者抗体，上述方法基于在中枢和/或外周耐受性受损的或
自身耐受性丧失的患者的血清，如APECED/APS1患者中筛选针对IL-32蛋白的自身抗体。在
这些筛选中，出人意料地观察到在这些血清中存在识别特定IL-32同型的自身抗体。这种细
胞因子仅在最近才被确定为促炎性细胞因子，且其在疾病中的作用，(至少与许多其他促炎
性细胞因子相比)仍然较鲜为人知。在这一点上，没有发展许多常见的自身免疫的和炎症性
的病症和疾病如RA的APS1患者中IL-32自身抗体的存在进一步支持了该细胞因子在这些疾
病的病理中所起的重要作用并证实了本发明的针对治疗介入的基于靶向抗体的抑制的方
法和其在诊断应用中的用途。
自身耐受性丧失的患者的血清，如APECED/APS1患者中筛选针对IL-32蛋白的自身抗体。在
这些筛选中，出人意料地观察到在这些血清中存在识别特定IL-32同型的自身抗体。这种细
胞因子仅在最近才被确定为促炎性细胞因子，且其在疾病中的作用，(至少与许多其他促炎
性细胞因子相比)仍然较鲜为人知。在这一点上，没有发展许多常见的自身免疫的和炎症性
的病症和疾病如RA的APS1患者中IL-32自身抗体的存在进一步支持了该细胞因子在这些疾
病的病理中所起的重要作用并证实了本发明的针对治疗介入的基于靶向抗体的抑制的方
法和其在诊断应用中的用途。
[0036] 考虑到上述情况，根据本发明进行的实验旨在提供IL-32结合分子，尤其是显示出对所有IL-32同型或仅子范围的IL-32同型或甚至仅针对单种同型的结合特异性的抗体，优
选特异性地结合IL-32γ，在APECED/APS1患者中己表现出该免疫反应性以防止例如RA和/
或IBD发病。优选地，该IL-32结合分子能够中和IL-32的生物活性。如通过在所附实施例和
附图(特别是示出结合亲和力的图3和图4A，示出动物模型中受试者抗体的中和活性和治疗
功效的图4B和图5、6和9至12)中的本发明的示例性抗IL-322C2抗体所表明的，本发明潜在
的问题已经得到解决。
选特异性地结合IL-32γ，在APECED/APS1患者中己表现出该免疫反应性以防止例如RA和/
或IBD发病。优选地，该IL-32结合分子能够中和IL-32的生物活性。如通过在所附实施例和
附图(特别是示出结合亲和力的图3和图4A，示出动物模型中受试者抗体的中和活性和治疗
功效的图4B和图5、6和9至12)中的本发明的示例性抗IL-322C2抗体所表明的，本发明潜在
的问题已经得到解决。
[0037] 因此，在其最广泛的方面，本发明涉及结合IL-32同型中的一种或多种的重组人单克隆抗白细胞介素-32(IL-32)抗体和其IL-32结合片段以及其生物技术衍生物；对于包括
例如IL-32γ、IL-32α、IL-32β和IL-32δ的IL-32同型的说明，另请参见上面的背景部分。在
一个实施方式中，人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段能够中和IL-32γ和/或IL-32α
的生物活性。关于本发明的抗体的结合特性和中和特性，它们在针对不同的IL-32同型上是
基本相等的，或者可以具有针对各IL-32同型的优先结合和/或中和活性。
例如IL-32γ、IL-32α、IL-32β和IL-32δ的IL-32同型的说明，另请参见上面的背景部分。在
一个实施方式中，人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段能够中和IL-32γ和/或IL-32α
的生物活性。关于本发明的抗体的结合特性和中和特性，它们在针对不同的IL-32同型上是
基本相等的，或者可以具有针对各IL-32同型的优先结合和/或中和活性。
[0038] 在本发明的一个优选实施方式中，人单克隆抗IL-32抗体或其IL-32结合片段
[0039] (i)能与重组人IL-32gamma(IL-32γ)结合；
[0040] (ii)相对于IL-32alpha(IL-32α)，优先与人IL-32γ结合和/或基本上不与IL-32α结合；和/或
[0041] (iii)能够中和IL-32γ的生物活性。
[0042] 优选地，本发明的抗体或其IL-32的结合片段或等同的结合分子在其可变区中包含：
[0043] (a)(i)图1(VH)(SEQ ID NO：2、10、18和26)和(ii)图1(VL)(SEQ ID NO：4、12、20和28)中描述的VH和/或VL可变区氨基酸序列的至少一个互补决定区(CDR)；
[0044] (b)图1中描述的VH和/或VL区的氨基酸序列；
[0045] (c)由从(a)的任一种氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸序列组成的至少一个CDR；和/或
[0046] (d)包括由从(b)的氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区。
[0047] 如下文更详细描述的，本发明的抗体或其抗原结合片段可以是或源自于任何类型、种类或子类的免疫球蛋白分子。然而，在优选实施方式中，提供为IgG同型，最优选地为
IgG1或IgG3亚型的本发明的抗体。
IgG1或IgG3亚型的本发明的抗体。
[0048] 为了提供这种人源化、嵌合型以及特别是完全人类的抗体和其天然Fab片段，在一个实施方式中本发明的抗体或IL-32结合片段还包含CH和/或CL恒定区，该恒定区包含选自
表1中描述的CH和CL氨基酸序列(SEQ ID NO：6、8、14、16、22、24和30)的氨基酸序列或与所提
及参考序列具有至少60％的同一性、优选70％的同一性、更优选80％的同一性、更优选90％
的同一性，以及特别优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同
一性的氨基酸序列。
表1中描述的CH和CL氨基酸序列(SEQ ID NO：6、8、14、16、22、24和30)的氨基酸序列或与所提
及参考序列具有至少60％的同一性、优选70％的同一性、更优选80％的同一性、更优选90％
的同一性，以及特别优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同
一性的氨基酸序列。
[0049] 如上所述，已经发现IL-32促炎活性诱导各种细胞因子，如TNFα/TNF-alpha、IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-2(参见上述Kim等人,(2005)；Netea等人,(2005)；Netea等人,(2008)；
Joosten等人,(2006))。在本发明中已使用此激活机制用于设计体外和体内测定以测定IL-
32活性，如实施例3和图4B、5和6中描述的通过IL-32刺激的RAW 264.7巨噬细胞监测IL-6表
达以及耳炎症测定来监测本发明的抗体的中和特性。如其中详细描述的，已发现本发明的
抗体具有针对IL-32γ的强效的中和活性，如下进一步详细说明的，其中一种抗体还表现出
对IL-32α的残余结合活性。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体或其IL-32结合片段能
够降低人IL-32(优选IL-32γ)的生物活性。在一个优选实施方式中，该生物活性是人IL-32
γ诱导炎症。此外，在本发明的一个实施方式中，在IL-6诱导测定和/或耳炎症测定中确定
生物活性。
Joosten等人,(2006))。在本发明中已使用此激活机制用于设计体外和体内测定以测定IL-
32活性，如实施例3和图4B、5和6中描述的通过IL-32刺激的RAW 264.7巨噬细胞监测IL-6表
达以及耳炎症测定来监测本发明的抗体的中和特性。如其中详细描述的，已发现本发明的
抗体具有针对IL-32γ的强效的中和活性，如下进一步详细说明的，其中一种抗体还表现出
对IL-32α的残余结合活性。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体或其IL-32结合片段能
够降低人IL-32(优选IL-32γ)的生物活性。在一个优选实施方式中，该生物活性是人IL-32
γ诱导炎症。此外，在本发明的一个实施方式中，在IL-6诱导测定和/或耳炎症测定中确定
生物活性。
[0050] 此外，如本文中例如实施例2中所描述的和图3和4A中所示的，已经通过ELISA测试了本发明的抗体的结合亲和力。根据这些实验的结果，本发明提供了对不同IL-32同型表现
出不同结合亲和力的若干示例性抗IL-32抗体及其IL-32结合片段，这例证了本文提供的
IL-32结合分子的结合特性和中和特性。
出不同结合亲和力的若干示例性抗IL-32抗体及其IL-32结合片段，这例证了本文提供的
IL-32结合分子的结合特性和中和特性。
[0051] 由于在实施例中描述的示例性抗IL-32抗体源自人类患者，所以本发明有利地提供了在治疗应用中特别有用的全人抗体，该抗体基本上没有外来抗体(如人中鼠源抗体，
HAMA-应答)或人源化和类人抗体中另外通常观察到的免疫应答。
HAMA-应答)或人源化和类人抗体中另外通常观察到的免疫应答。
[0052] 由此而论，另请参见下文讨论，与人源化抗体和其他类人抗体相反，本发明的人源抗体的特征在于包含人体中已经见到并因此基本上没有产生免疫性的风险的CDR。因此，如
果抗体的可变轻链和重链中的一种或两者的至少一种、优选两种和最优选所有三个CDR均
源自本文所说明的人抗体，那么本发明的抗体仍可表示为是人源的。
果抗体的可变轻链和重链中的一种或两者的至少一种、优选两种和最优选所有三个CDR均
源自本文所说明的人抗体，那么本发明的抗体仍可表示为是人源的。
[0053] 也可以将人源抗体称为“人自身抗体”，以强调那些抗体实际上最初由受试者表达，而非例如通过人免疫球蛋白表达噬菌体库生成的体外选择的构建体，或者在人免疫球
蛋白库(human immunoglobulin repertoire)的转基因动物表达部分中生成的异种抗体，
迄今这代表用于试图提供类人抗体的最常用方法。另一方面，本发明的人源抗体可以被表
示为是合成的、重组的和/或生物技术的，以将其与自身可以通过蛋白A或亲和柱纯化的人
血清抗体区分开。
蛋白库(human immunoglobulin repertoire)的转基因动物表达部分中生成的异种抗体，
迄今这代表用于试图提供类人抗体的最常用方法。另一方面，本发明的人源抗体可以被表
示为是合成的、重组的和/或生物技术的，以将其与自身可以通过蛋白A或亲和柱纯化的人
血清抗体区分开。
[0054] 然而，本发明使用并设想了对本发明的抗体在动物模型中(例如在表达人IL-32的转基因小鼠中)的进一步研究。为了避免实验动物中类似于人体中的HAMA-应答的免疫效
果，在一方面，提供了本发明的抗体或结合片段，其为嵌合抗体，优选为嵌合啮齿动物-人或
啮齿动物源化(rodentized)抗体，最优选为嵌合鼠-人或鼠源化(murinized)抗体。
果，在一方面，提供了本发明的抗体或结合片段，其为嵌合抗体，优选为嵌合啮齿动物-人或
啮齿动物源化(rodentized)抗体，最优选为嵌合鼠-人或鼠源化(murinized)抗体。
[0055] 如上所述，已从APECED/APS1患者分离本发明的抗体。在此情形下，申请人的共同在审的国际申请WO2013/098419 A1中公开的实验令人惊喜地表明：APECED/APS1患者展示
出自身免疫体(auto-immunosome)，即还包括广谱的对不同IL-32同型特异的结合分子的自
身抗体谱(autoantibody profile)。APS1是由自身免疫调节因子(AIRE)基因中的突变所引
起的罕见自身免疫性疾病。AIRE蛋白支配通过MHC呈现的许多外周自身抗原(例如胰岛素)
的胸腺髓质上皮细胞中的表达，以容忍发展胸腺细胞。在APS1中，AIRE突变引起异常的阴性
选择，使得自身反应T细胞能逃逸至外周。因此，患者在APS1中表现出变化极大的临床特征
谱，但是通常却具有若干种内分泌组织自身免疫性疾病。典型的APS1三联征(triad)包括慢
性皮肤粘膜念珠菌病(chronic mucocutaneous candidiasis)、甲状旁腺功能减退症和肾
上腺衰竭(Perheentupa,Endocrinol.Metab.Clin.North Am.31(2002),295-320)。APECED
患者中所见的其他临床病症包括甲状腺自身免疫性疾病、糖尿病、性腺衰竭、白癜风、斑秃、
慢性肝炎、慢性胃炎和恶性贫血和不同形式的其他胃肠道症状。关于APECED/APS1患者及其
自身免疫体筛选的进一步细节，请参见国际申请WO2013/098419 A1的说明书和其中描述的
实施例，特别是第112-117页的材料和方法部分；第117-118页的实施例1和第128页的实施
例7以及随后的表1-14；以及第168-171页的实施例17，该申请的公开内容通过引用并入到
本文中。
出自身免疫体(auto-immunosome)，即还包括广谱的对不同IL-32同型特异的结合分子的自
身抗体谱(autoantibody profile)。APS1是由自身免疫调节因子(AIRE)基因中的突变所引
起的罕见自身免疫性疾病。AIRE蛋白支配通过MHC呈现的许多外周自身抗原(例如胰岛素)
的胸腺髓质上皮细胞中的表达，以容忍发展胸腺细胞。在APS1中，AIRE突变引起异常的阴性
选择，使得自身反应T细胞能逃逸至外周。因此，患者在APS1中表现出变化极大的临床特征
谱，但是通常却具有若干种内分泌组织自身免疫性疾病。典型的APS1三联征(triad)包括慢
性皮肤粘膜念珠菌病(chronic mucocutaneous candidiasis)、甲状旁腺功能减退症和肾
上腺衰竭(Perheentupa,Endocrinol.Metab.Clin.North Am.31(2002),295-320)。APECED
患者中所见的其他临床病症包括甲状腺自身免疫性疾病、糖尿病、性腺衰竭、白癜风、斑秃、
慢性肝炎、慢性胃炎和恶性贫血和不同形式的其他胃肠道症状。关于APECED/APS1患者及其
自身免疫体筛选的进一步细节，请参见国际申请WO2013/098419 A1的说明书和其中描述的
实施例，特别是第112-117页的材料和方法部分；第117-118页的实施例1和第128页的实施
例7以及随后的表1-14；以及第168-171页的实施例17，该申请的公开内容通过引用并入到
本文中。
[0056] 如上所述，在一个优选实施方式中，从或可以从患有自身免疫性多内分泌腺病-念珠菌病-外胚层营养不良(APECED/APS1)的人受试者样本或从患有类似自身免疫性疾病患
者获得本发明的抗体，如在国际申请WO2013/098419 A1和其中的实施例中所描述的，特别
是第112-117页的材料和方法部分；第117-118页的实施例1；第156-161页的实施例10(特别
是其中第156页的“患者和对照”部分)；以及第168-171页的实施例17，其公开内容通过引用
并入到本文中。此外，在一个优选实施方式中，APS1受试者的特征在于表现出对人IL-32(优
选地对IL-32γ和/或IL-32α)的血清反应性。
者获得本发明的抗体，如在国际申请WO2013/098419 A1和其中的实施例中所描述的，特别
是第112-117页的材料和方法部分；第117-118页的实施例1；第156-161页的实施例10(特别
是其中第156页的“患者和对照”部分)；以及第168-171页的实施例17，其公开内容通过引用
并入到本文中。此外，在一个优选实施方式中，APS1受试者的特征在于表现出对人IL-32(优
选地对IL-32γ和/或IL-32α)的血清反应性。
[0057] 在此情形下，要注意的是，通过在申请人的共同在审国际申请WO2013/098420 A1中公开的分离人抗体的新型专有方法已克隆出本发明的受试者抗IL-32抗体，其公开内容
通过引用并入到本文中。
通过引用并入到本文中。
[0058] 简言之，用于分离感兴趣抗体的样本包括用于检测可能的抗体反应性的外周血单核细胞(PBMC)和血清，或由其组成。源自受试者的样本可以直接用于例如测试对一种或多
种所期望抗原的血清反应性，或者可以被进一步处理，例如被富集用于B淋巴细胞。特别地，
优选地，样本包含或源自产生感兴趣抗体的B细胞，更优选地为记忆B细胞。在如下条件下培
养记忆B细胞：其仅允许B细胞的确定生命周期通常不超过1至2周，直到从B细胞培养物中挑
出对所期望的抗原有反应的细胞，随后进行单个挑选细胞的RT-PCR以用于获得免疫球蛋白
基因库；详细说明参见WO2013/098419 A1的第118-120页的实施例1和2，以及特别是
WO2013/0984220 A1的第27-31页的实施例1至4，其公开内容均通过引用并入到本文中。自
然地，本发明分别延伸至产生具有上下文所限定的显著唯一特征的抗体的人B记忆淋巴细
胞和B细胞。
种所期望抗原的血清反应性，或者可以被进一步处理，例如被富集用于B淋巴细胞。特别地，
优选地，样本包含或源自产生感兴趣抗体的B细胞，更优选地为记忆B细胞。在如下条件下培
养记忆B细胞：其仅允许B细胞的确定生命周期通常不超过1至2周，直到从B细胞培养物中挑
出对所期望的抗原有反应的细胞，随后进行单个挑选细胞的RT-PCR以用于获得免疫球蛋白
基因库；详细说明参见WO2013/098419 A1的第118-120页的实施例1和2，以及特别是
WO2013/0984220 A1的第27-31页的实施例1至4，其公开内容均通过引用并入到本文中。自
然地，本发明分别延伸至产生具有上下文所限定的显著唯一特征的抗体的人B记忆淋巴细
胞和B细胞。
[0059] 因此，除了使用选择的患者库，优选表现出对由本发明的示例性抗体中和的人IL-32同型中至少一种有血清反应性的APS1受试者之外，还已经通过使用专门研发的适用于从
患有自身免疫性疾病的患者如APECED/APS1患者的B细胞分离人单克隆抗体的特定方法来
提供抗IL-32抗体。
患有自身免疫性疾病的患者如APECED/APS1患者的B细胞分离人单克隆抗体的特定方法来
提供抗IL-32抗体。
[0060] 在一个实施方式中，本发明的抗体或IL-32结合分子包含图1中描绘的或由表1所示出的相应核酸编码的VH和/或VL区的氨基酸序列。另外，在另一个实施方式中，本发明涉及
与如上文所限定的本发明抗体在与人IL-32，优选与IL-32γ特异性结合方面竞争的抗IL-
32抗体或IL-32结合分子。特别地，提供了抗IL-32抗体，证实对于实施例和附图中所示出的
抗体所概述的免疫结合特性和/或生物特性。目前，术语抗体与抗原的“免疫结合特性”或其
他结合特性(在其所有语法形式中)是指抗体的特异性、亲和力、交叉反应性和其他结合特
性。
与如上文所限定的本发明抗体在与人IL-32，优选与IL-32γ特异性结合方面竞争的抗IL-
32抗体或IL-32结合分子。特别地，提供了抗IL-32抗体，证实对于实施例和附图中所示出的
抗体所概述的免疫结合特性和/或生物特性。目前，术语抗体与抗原的“免疫结合特性”或其
他结合特性(在其所有语法形式中)是指抗体的特异性、亲和力、交叉反应性和其他结合特
性。
[0061] 在一个实施方式中，本发明的抗体为抗体片段。例如，本发明的抗体或抗体片段可以选自由单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段、F(ab')2片段和单域抗体片段(sdAB)
组成的组。
组成的组。
[0062] 本发明的抗体的另一优点在于：由于已经在天然抗体的生理和细胞环境中引发对天然抗体的体液免疫应答的事实，通常产生自身抗体并且可以分离自身抗体，该自身抗体
可以识别抗原的构象表位，由于其呈现于例如具有其他细胞组分的环境中、呈现在细胞表
面膜上和/或结合至受体。相反，生成单克隆抗体(诸如小鼠单克隆抗体)、其人源化版本或
由噬菌体展示技术获得的抗体的传统方法通常采用靶蛋白的抗原片段，以用于分别使非人
哺乳动物免疫和进行检测，根据该方法，通常获得识别限于免疫原的二维结构的线性表位
或构象表位而非识别其生理和细胞环境中天然蛋白的存在的抗体。因此，谨慎地预期本发
明的自身抗体在其表位特异性方面是唯一的。因此，本发明还涉及表现出与根据本发明的
方法所分离的自身抗体基本上相同的结合特异性的抗体和类结合分子。这种抗体可以容易
地通过下述方法进行测试：例如，竞争ELISA，或更适合地分别使用本发明的自身抗体及其
单克隆衍生物作为参考抗体的基于细胞的中和测定，以及实施例中描述的或本领域技术人
员已知的免疫测试法。
可以识别抗原的构象表位，由于其呈现于例如具有其他细胞组分的环境中、呈现在细胞表
面膜上和/或结合至受体。相反，生成单克隆抗体(诸如小鼠单克隆抗体)、其人源化版本或
由噬菌体展示技术获得的抗体的传统方法通常采用靶蛋白的抗原片段，以用于分别使非人
哺乳动物免疫和进行检测，根据该方法，通常获得识别限于免疫原的二维结构的线性表位
或构象表位而非识别其生理和细胞环境中天然蛋白的存在的抗体。因此，谨慎地预期本发
明的自身抗体在其表位特异性方面是唯一的。因此，本发明还涉及表现出与根据本发明的
方法所分离的自身抗体基本上相同的结合特异性的抗体和类结合分子。这种抗体可以容易
地通过下述方法进行测试：例如，竞争ELISA，或更适合地分别使用本发明的自身抗体及其
单克隆衍生物作为参考抗体的基于细胞的中和测定，以及实施例中描述的或本领域技术人
员已知的免疫测试法。
[0063] 本发明举例说明了IL-32结合分子即抗体及其结合片段，其特征通常可以在于在它们的可变区(即结合结构域)中包括可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)，该
可变区包括在图1的(VH)(SEQ ID NO：2、10、18和26)和(VL)(SEQ ID NO：4、12、20和28)中所
描绘的氨基酸序列——参见在图1中带有下划线的并在表1中指出的示例性CDR序列。然而，
如下所讨论，本领域技术人员清楚地意识到可以另外或可替换地使用与图1中示出的那些
CDR在其氨基酸序列方面相差一个、两个、三个或甚至更多个的氨基酸的CDR这一事实，特别
是在CDR2和CDR3的情况下。
可变区包括在图1的(VH)(SEQ ID NO：2、10、18和26)和(VL)(SEQ ID NO：4、12、20和28)中所
描绘的氨基酸序列——参见在图1中带有下划线的并在表1中指出的示例性CDR序列。然而，
如下所讨论，本领域技术人员清楚地意识到可以另外或可替换地使用与图1中示出的那些
CDR在其氨基酸序列方面相差一个、两个、三个或甚至更多个的氨基酸的CDR这一事实，特别
是在CDR2和CDR3的情况下。
[0064] 如针对本发明的抗体进一步证实的，该抗体能中和其靶蛋白的生物活性；参见，例如，实施例3、图4B中所描述的IL-6中和测定和实施例4、图5和6以及图9至12中所描述的IL-
32耳炎症测定(CytoEar测定)和踝关节炎症测定(CytoAnkle测定)的结果。在这种情况下，
术语“中和”意指本发明的抗-IL-32抗体或其IL-32结合片段在生化的基于细胞的或体内测
定中能够干预其靶蛋白的生物活性，如通过在本发明的受试者抗体的存在下执行相应的测
定可以评估的，其中，与在本发明的抗体不存在而化合物例如已知在性质上使靶蛋白的生
物活性不受影响的对照抗体存在的情况下的蛋白的生物活性相比，靶蛋白的生物活性随着
经受该测定的本发明的抗体的水平增加而降低。还可以使用已知能够中和靶蛋白的生物活
性(诸如针对本发明的抗IL-32抗体所示出的)的参考抗体和使候选抗体经历测试样本来进
行这种生化的基于体外和体内的测定，其中，或者可以观察到由于参考抗体和候选抗体的
组合活性所引起的附加中和效果，或者可以观察到候选抗体和参考抗体的竞争，这可以通
过对任一种抗体进行标记来确定。因此，在本发明的一个优选实施方式中，通过本发明的方
法获得的抗体能够中和其抗原例如人IL-32同型中至少一种，优选为IL-32γ的生物活性。
可以依据例如，降低IL-32活性的量或就引入本发明的IL-32结合分子之后可观察到这种降
低的时间或当然就该量和时间组合，来判定中和效果。
32耳炎症测定(CytoEar测定)和踝关节炎症测定(CytoAnkle测定)的结果。在这种情况下，
术语“中和”意指本发明的抗-IL-32抗体或其IL-32结合片段在生化的基于细胞的或体内测
定中能够干预其靶蛋白的生物活性，如通过在本发明的受试者抗体的存在下执行相应的测
定可以评估的，其中，与在本发明的抗体不存在而化合物例如已知在性质上使靶蛋白的生
物活性不受影响的对照抗体存在的情况下的蛋白的生物活性相比，靶蛋白的生物活性随着
经受该测定的本发明的抗体的水平增加而降低。还可以使用已知能够中和靶蛋白的生物活
性(诸如针对本发明的抗IL-32抗体所示出的)的参考抗体和使候选抗体经历测试样本来进
行这种生化的基于体外和体内的测定，其中，或者可以观察到由于参考抗体和候选抗体的
组合活性所引起的附加中和效果，或者可以观察到候选抗体和参考抗体的竞争，这可以通
过对任一种抗体进行标记来确定。因此，在本发明的一个优选实施方式中，通过本发明的方
法获得的抗体能够中和其抗原例如人IL-32同型中至少一种，优选为IL-32γ的生物活性。
可以依据例如，降低IL-32活性的量或就引入本发明的IL-32结合分子之后可观察到这种降
低的时间或当然就该量和时间组合，来判定中和效果。
[0065] 如下所详述的，通过例如在宿主细胞中或在体外无细胞翻译系统中的表达，可以提供本发明的抗体或抗原结合片段，例如肽、多肽或融合蛋白。为了在宿主细胞中表达肽、
多肽或融合蛋白，可以将对所述肽、多肽或融合蛋白编码的核酸分子插入到适当的表达载
体即包含用于转录和翻译所插入的编码序列的必需元素(元件，element)的载体中。可使用
本领域技术人员公知的方法来构建包含对感兴趣多肽编码的序列和适当的转录和翻译控
制元素的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内基因重组。这种技
术在Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(1989)，以及Ausubel等人,
Current Protocols in Molecular Biology(1989)中有描述；对于在此方面的更多细节，
还请参见下文中进一步描述的“多核苷酸”和“表达”部分，以及实施例部分中引用的文献。
多肽或融合蛋白，可以将对所述肽、多肽或融合蛋白编码的核酸分子插入到适当的表达载
体即包含用于转录和翻译所插入的编码序列的必需元素(元件，element)的载体中。可使用
本领域技术人员公知的方法来构建包含对感兴趣多肽编码的序列和适当的转录和翻译控
制元素的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内基因重组。这种技
术在Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(1989)，以及Ausubel等人,
Current Protocols in Molecular Biology(1989)中有描述；对于在此方面的更多细节，
还请参见下文中进一步描述的“多核苷酸”和“表达”部分，以及实施例部分中引用的文献。
[0066] 用于表达产物的合适宿主细胞可以是任何原核或真核细胞；例如，细菌细胞(诸如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)、昆虫细胞(杆状病毒)、酵母细胞、植物细胞或动物细胞。然而，
为了高效进行处理，优选哺乳动物细胞。可用于该目的的典型哺乳细胞系包括CHO细胞、HEK
293细胞、COS细胞和NSO细胞。
为了高效进行处理，优选哺乳动物细胞。可用于该目的的典型哺乳细胞系包括CHO细胞、HEK
293细胞、COS细胞和NSO细胞。
[0067] 当然，本发明的所分离抗体不可像这样应用于患者，而通常必须按药学配制以确保例如其在患者中的稳定性、可接受性和生物利用度。因此，在一个实施方式中，提供了本
发明的方法，其进一步包括使所分离的单克隆抗体或其片段与药学上可接受的载体混合的
步骤。下文将进一步详细描述药学上可接受的载体。
发明的方法，其进一步包括使所分离的单克隆抗体或其片段与药学上可接受的载体混合的
步骤。下文将进一步详细描述药学上可接受的载体。
[0068] 作为获得本发明的结合分子的稳定永久来源的措施，可以通过直接克隆、PCR扩增或人工合成分离对这些结合分子编码的异源基因，并将该异源基因引入和表达在合适的宿
主细胞或机体中。因此，本发明的目的还在于提供一种制备可用于生产重组人抗IL-32抗体
或其IL-32结合片段的重组细胞的方法，包括如下步骤：
主细胞或机体中。因此，本发明的目的还在于提供一种制备可用于生产重组人抗IL-32抗体
或其IL-32结合片段的重组细胞的方法，包括如下步骤：
[0069] (a)通过如上所述的方法制备B细胞；
[0070] (b)对核酸排序和/或从B细胞获得核酸，该核酸编码：
[0071] (i)表1中列出的CH和CL氨基酸序列(SEQ ID NO：6、8、14、16、22、24和30)中的至少一种或具有至少60％的同一性的氨基酸序列；
[0072] (ii)在图1(VH)(SEQ ID NO：2、10、18和26)和图1(VL)(SEQ ID NO：4、12、20和28)中所描绘的VH和/或VL可变区氨基酸序列中的至少一个互补决定区(CDR)；
[0073] (iii)如图1中所描绘的VH和/或VL区的氨基酸序列；
[0074] (iv)由从(a)的任一种氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸序列组成的至少一个CDR；
[0075] (v)包含由从(ii)的氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区；和/或
[0076] (c)将核酸插入表达宿主中以允许在该宿主中表达感兴趣抗体。
[0077] 本文中描述的宿主细胞也可以用在先前的方法中，并且可以如说明书的“宿主”部分中所详细描述的那样使用。在这一方面，在一个实施方式中，提供了上述方法，其中表达
宿主为酵母细胞、植物细胞或动物细胞。
宿主为酵母细胞、植物细胞或动物细胞。
[0078] 关于上述的用于生产各感兴趣抗体的方法，在一个实施方式中，本发明提供了一种方法，其中在上述步骤(b)和(c)之间操作核酸，以引入限制位点、改变密码子使用和/或
增加或优化转录和/或翻译调节序列。
增加或优化转录和/或翻译调节序列。
[0079] 如在所附实施例2和3中所证实的和表3中所汇总的，已经鉴定和克隆出结合分子即抗体，其表现出对人IL-32的特别高的明显的结合亲和力(EC50/ED50)。为此，在本发明的
一个实施方式中，提供了如上文限定的抗体或其结合片段，其对其相应的靶分子(例如上面
限定的人IL-32同型，优选地对IL-32γ)具有高亲和力，在低于2000ng/ml或1500ng/ml，优
选地低于1000、900、800、700、600、500、400、300、200或100ng/ml，更优选地低于50、20或
10ng/ml的浓度下表现出EC50。可替换地或另外地，在一个实施方式中，提供了如上文所限
定的抗体或其抗原结合片段，其对人IL-32同型优选地对IL-32γ具有高中和能力，在500或
400ng/ml以下，优选地300、200或100ng/ml以下，更优选地50、20或10ng/ml以下的浓度下表
现出IC50。关于本发明的抗体的结合亲和力的更多细节，请进一步参见例如下文的“结合特
性”部分。在一个实施方式中，本发明的抗体或IL-32结合片段特异性结合多于一种的IL-32
同型，优选地其中IL-32γ是所识别的同型之一。在一个实施方式中，第二种同型是IL-32α。
在优选实施方式中，抗IL-32抗体或其IL-32结合片段，和第二识别的同型相比，优选地结合
IL-32γ。此外，在一个实施方式中，本发明的抗IL-32抗体或其IL-32结合片段结合一种IL-
32同型，并且不结合或基本上不结合任何其他的IL-32同型。
一个实施方式中，提供了如上文限定的抗体或其结合片段，其对其相应的靶分子(例如上面
限定的人IL-32同型，优选地对IL-32γ)具有高亲和力，在低于2000ng/ml或1500ng/ml，优
选地低于1000、900、800、700、600、500、400、300、200或100ng/ml，更优选地低于50、20或
10ng/ml的浓度下表现出EC50。可替换地或另外地，在一个实施方式中，提供了如上文所限
定的抗体或其抗原结合片段，其对人IL-32同型优选地对IL-32γ具有高中和能力，在500或
400ng/ml以下，优选地300、200或100ng/ml以下，更优选地50、20或10ng/ml以下的浓度下表
现出IC50。关于本发明的抗体的结合亲和力的更多细节，请进一步参见例如下文的“结合特
性”部分。在一个实施方式中，本发明的抗体或IL-32结合片段特异性结合多于一种的IL-32
同型，优选地其中IL-32γ是所识别的同型之一。在一个实施方式中，第二种同型是IL-32α。
在优选实施方式中，抗IL-32抗体或其IL-32结合片段，和第二识别的同型相比，优选地结合
IL-32γ。此外，在一个实施方式中，本发明的抗IL-32抗体或其IL-32结合片段结合一种IL-
32同型，并且不结合或基本上不结合任何其他的IL-32同型。
[0080] 本发明还涉及对本发明的抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白链的至少一个可变区编码的多核苷酸。优选地，所述可变区包括图1中列出的可变区的VH和/或VL的至少一个互
补决定区(CDR)。
补决定区(CDR)。
[0081] 在衍生序列的情况下，所述序列示出与由上面提到的和在序列表中所鉴定的那些序列组成的组中的序列有至少60％的同一性、更优选地(按照如下顺序)至少70％、至少
75％、至少80％、至少85％、至少90％，以及最优选地95％、至少96-99％或甚至100％的同一
性。两种序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同位置的数目的函数，其中考虑到需
要引入以用于两种序列的最佳对准的空位的数量和每个空位的长度。可以使用本领域技术
人员熟知的数学算法来完成序列的对比和两种序列之间的百分比同一性的确定。文中所提
到的同一性通过使用下文进一步描述的BLAST程序确定。
75％、至少80％、至少85％、至少90％，以及最优选地95％、至少96-99％或甚至100％的同一
性。两种序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同位置的数目的函数，其中考虑到需
要引入以用于两种序列的最佳对准的空位的数量和每个空位的长度。可以使用本领域技术
人员熟知的数学算法来完成序列的对比和两种序列之间的百分比同一性的确定。文中所提
到的同一性通过使用下文进一步描述的BLAST程序确定。
[0082] 如上面所提及的，在一个优选实施方式中，本发明涉及基本上完全人类的抗体(优选地为IgG)，其包括至少恒定区的恒定重链I(CH1)和对应的轻链，即与lambda(λ)或kappa
(κ)组合的γ-1、γ-2、γ-3或γ-4。在一个特别优选的实施方式中，实施例中举例说明的为
受试者抗体所分离的那些恒定区的核苷酸和氨基酸序列如下表1中所描述的使用，并且关
于核苷酸序列以SEQ ID NO：5、7、13、15、21、23和29中的使用，和/或关于氨基酸序列或与之
前参考的那些有至少60％的同一性的氨基酸序列以SEQ ID NO：6、8、14、16、22、24和30中的
使用。
(κ)组合的γ-1、γ-2、γ-3或γ-4。在一个特别优选的实施方式中，实施例中举例说明的为
受试者抗体所分离的那些恒定区的核苷酸和氨基酸序列如下表1中所描述的使用，并且关
于核苷酸序列以SEQ ID NO：5、7、13、15、21、23和29中的使用，和/或关于氨基酸序列或与之
前参考的那些有至少60％的同一性的氨基酸序列以SEQ ID NO：6、8、14、16、22、24和30中的
使用。
[0083] 根据上述内容，在一个实施方式中，本发明还提供了对本发明的抗体或抗原结合片段的一免疫球蛋白链的至少可变区编码的多核苷酸。通常地，由多核苷酸编码的所述可
变区包括所述抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。下面的“IgG结构”部
分更加详细地描述了抗体的可变和恒定区。在本发明的一个优选实施方式中，多核苷酸包
含具有下述多核苷酸序列的核酸、基本上由或由该核酸组成，所述多核苷酸序列对如下表1
描述的本发明的抗体的VH或VL区进行编码。为此，本领域技术人员将容易理解，对至少轻链
和/或重链的可变结构域编码的多核苷酸可以对多种免疫球蛋白链或仅其中一种的可变结
构域编码。在一个优选实施方式中，多核苷酸对上文所限定的抗IL-32抗体或其IL-32结合
片段编码。
变区包括所述抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。下面的“IgG结构”部
分更加详细地描述了抗体的可变和恒定区。在本发明的一个优选实施方式中，多核苷酸包
含具有下述多核苷酸序列的核酸、基本上由或由该核酸组成，所述多核苷酸序列对如下表1
描述的本发明的抗体的VH或VL区进行编码。为此，本领域技术人员将容易理解，对至少轻链
和/或重链的可变结构域编码的多核苷酸可以对多种免疫球蛋白链或仅其中一种的可变结
构域编码。在一个优选实施方式中，多核苷酸对上文所限定的抗IL-32抗体或其IL-32结合
片段编码。
[0084] 表1：本发明的IgG3、λ、IL-32特异性2C2抗体和IgG1、λ、IL-32特异性14B3、19A1和26A6抗体的可变区和恒定区(VH、VL、CH、CL)的核苷酸序列。加下划线并加粗的核苷酸或氨基
酸表明可变链序列中的CDR编码区。加下划线的斜体核苷酸或氨基酸表明尚未排序但已从
数据库中获得的序列。在恒定链中，这些区与数据库中的相关人种系可变区序列对准或根
据数据库中相关人种系可变区序列进行调谐；参见例如由MRC(医学研究委员会)蛋白质工
程中心(英国，剑桥大学)主办的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)。
酸表明可变链序列中的CDR编码区。加下划线的斜体核苷酸或氨基酸表明尚未排序但已从
数据库中获得的序列。在恒定链中，这些区与数据库中的相关人种系可变区序列对准或根
据数据库中相关人种系可变区序列进行调谐；参见例如由MRC(医学研究委员会)蛋白质工
程中心(英国，剑桥大学)主办的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)。
[0085]
[0086]
[0087]
[0088]
[0089] 本领域技术人员容易理解，具有上述可变结构域的抗体的可变结构域可以用于构建具有期望的特异性和生物功能的其他多肽或抗体。因此，本发明还包含多肽和抗体，该多
肽和抗体包括上述可变结构域中的至少一个CDR并且有利地具有与所附实施例中描述的抗
体基本上相同或相似的结合特性。本领域技术人员将容易理解，根据本领域已知的方法，例
如如欧洲专利申请EP0451216 A1和EP0549581 A1中所描述的，可通过利用本文中描述的可
变结构域或CDR来构建抗体。此外，本领域技术人员知晓，可以通过在CDR内或在与由Kabat
定义的CDR部分重叠的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196(1987),901-917)内进行氨
基酸替换来提高结合亲和力。因此，本发明也涉及这样的抗体，其中所提及的CDR中的一种
或多种包括一个或多个(优选不超过两个)的氨基酸替换。优选地，本发明的抗体在其免疫
球蛋白链的一种或二种中包含针对VH区在SEQ ID NO：2、10、18和26中描述的和针对VL区在
SEQ ID NO：4、12、20和28中描述的或如图1中所示的可变区的两个或所有三个CDR。
肽和抗体包括上述可变结构域中的至少一个CDR并且有利地具有与所附实施例中描述的抗
体基本上相同或相似的结合特性。本领域技术人员将容易理解，根据本领域已知的方法，例
如如欧洲专利申请EP0451216 A1和EP0549581 A1中所描述的，可通过利用本文中描述的可
变结构域或CDR来构建抗体。此外，本领域技术人员知晓，可以通过在CDR内或在与由Kabat
定义的CDR部分重叠的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196(1987),901-917)内进行氨
基酸替换来提高结合亲和力。因此，本发明也涉及这样的抗体，其中所提及的CDR中的一种
或多种包括一个或多个(优选不超过两个)的氨基酸替换。优选地，本发明的抗体在其免疫
球蛋白链的一种或二种中包含针对VH区在SEQ ID NO：2、10、18和26中描述的和针对VL区在
SEQ ID NO：4、12、20和28中描述的或如图1中所示的可变区的两个或所有三个CDR。
[0090] 对上述抗体编码的本发明的多核苷酸可以是例如DNA、cDNA、RNA或者合成生成的DNA或RNA，或以单独或组合的方式包含这些多核苷酸中任一种的重组生成的嵌合型核酸分
子。在一个实施方式中，多核苷酸为对可变区和至少部分恒定结构域编码的cDNA。在一个优
选实施方式中，提供了包含上述多核苷酸的载体，可选地组合有对所述抗体的其他免疫球
蛋白链的可变区编码的所述多核苷酸。这些载体可包含其他基因，诸如允许在合适的宿主
细胞中且在合适的条件下选择所述载体的标记基因。
子。在一个实施方式中，多核苷酸为对可变区和至少部分恒定结构域编码的cDNA。在一个优
选实施方式中，提供了包含上述多核苷酸的载体，可选地组合有对所述抗体的其他免疫球
蛋白链的可变区编码的所述多核苷酸。这些载体可包含其他基因，诸如允许在合适的宿主
细胞中且在合适的条件下选择所述载体的标记基因。
[0091] 优选地，本发明的多核苷酸可操作性地连接到允许在原核或真核细胞中表达的表达控制序列。所述多核苷酸的表达包括将多核苷酸转录为可译的mRNA。确保在真核细胞优
选地为哺乳动物细胞中表达的调控元件对于本领域技术人员而言是公知的。调控元件通常
包括确保转录的起始的调节序列，和可选地，确保转录的终止和转录物稳定的聚A信号。另
外的调控元件可以包括转录和翻译增强子和/或自然关联或异源启动子区。
选地为哺乳动物细胞中表达的调控元件对于本领域技术人员而言是公知的。调控元件通常
包括确保转录的起始的调节序列，和可选地，确保转录的终止和转录物稳定的聚A信号。另
外的调控元件可以包括转录和翻译增强子和/或自然关联或异源启动子区。
[0092] 在这方面，本领域技术人员将容易理解，对轻链和/或重链的至少可变结构域编码的多核苷酸可以对两种免疫球蛋白链或仅一种免疫球蛋白链的可变结构域编码。
[0093] 同样，所述多核苷酸可以处于相同启动子的控制下，或者可以被单独控制以用于表达。允许在原核宿主细胞中表达的可能调控元件包括例如大肠杆菌中的PL、lac、trp或
tac启动子，而允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例为酵母中的AOX1或GAL1启动
子，或者哺乳动物和其他动物细胞中的CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、CMV增强子、
SV40增强子或球蛋白内含子。
tac启动子，而允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例为酵母中的AOX1或GAL1启动
子，或者哺乳动物和其他动物细胞中的CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、CMV增强子、
SV40增强子或球蛋白内含子。
[0094] 除了负责转录的起始的元件之外，这种调控元件还包括多核苷酸下游的转录终止信号，诸如SV40聚A位点或tk聚A位点。此外，根据所使用的表达体系，能够将多肽引导至细
胞区室或能够将多肽分泌到介质中的前导序列可以被添加到本发明的多核苷酸的编码序
列中，并且是本领域中公知的。一种或多种前导序列在适当阶段与翻译、起始和终止序列组
装，以及优选，能将所翻译蛋白或其一部分的分泌引导到周质空间或胞外介质的前导序列。
可选地，异源序列可以对包括C端或N端鉴定肽的融合蛋白编码，该C端或N端鉴定肽赋予所
表达的重组产物的期望特征，例如稳定性或简单纯化。在这种情况下，合适的表达载体在本
领域是已知的，诸如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia公司)、pCDM8、pRc/CMV、
pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen公司)或pSPORT1(GIBCO BRL公司)。
胞区室或能够将多肽分泌到介质中的前导序列可以被添加到本发明的多核苷酸的编码序
列中，并且是本领域中公知的。一种或多种前导序列在适当阶段与翻译、起始和终止序列组
装，以及优选，能将所翻译蛋白或其一部分的分泌引导到周质空间或胞外介质的前导序列。
可选地，异源序列可以对包括C端或N端鉴定肽的融合蛋白编码，该C端或N端鉴定肽赋予所
表达的重组产物的期望特征，例如稳定性或简单纯化。在这种情况下，合适的表达载体在本
领域是已知的，诸如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia公司)、pCDM8、pRc/CMV、
pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen公司)或pSPORT1(GIBCO BRL公司)。
[0095] 优选地，表达控制序列将为载体中能够转化或转染真核宿主细胞的真核启动子系统，但还可以使用用于原核宿主的控制序列。一旦载体结合到适当宿主中，将宿主保持在适
于核苷酸序列高水平表达的条件下，并且按所需要的，后面可以跟随免疫球蛋白轻链、重
链、轻/重链二聚体或完整抗体、结合片段或其他免疫球蛋白形式的收集和纯化；参见，
Beychok,Cells of Immunoglobulin Synthesis,Academic Press,N.Y.,(1979)。
于核苷酸序列高水平表达的条件下，并且按所需要的，后面可以跟随免疫球蛋白轻链、重
链、轻/重链二聚体或完整抗体、结合片段或其他免疫球蛋白形式的收集和纯化；参见，
Beychok,Cells of Immunoglobulin Synthesis,Academic Press,N.Y.,(1979)。
[0096] 此外，本发明涉及载体，特别是在基因工程中常用的质粒、粘粒、病毒和噬菌体，其包括对抗原编码或优选地对本发明的抗体的免疫球蛋白链的可变结构域编码的多核苷酸；
可选地，其组合有对本发明的抗体的其他免疫球蛋白链的可变结构域编码的本发明的多核
苷酸。优选地，所述载体为表达载体和/或基因转移或靶向载体。
可选地，其组合有对本发明的抗体的其他免疫球蛋白链的可变结构域编码的本发明的多核
苷酸。优选地，所述载体为表达载体和/或基因转移或靶向载体。
[0097] 源自病毒(诸如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒)的表达载体可以用于将本发明的多核苷酸或载体递送到靶细胞群体中。本领域技术人员熟知
的方法可以用于构建重组病毒载体；参见，例如，Sambrook,Molecular Cloning A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel,Current
Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley
Interscience,N.Y.(1994))中描述的技术。可替换地，本发明的多核苷酸和载体可以被重
组到脂质体中，以递送至靶细胞。包含本发明的多核苷酸(例如，免疫球蛋白链的重链和/或
轻链可变结构域、编码序列和表达控制序列)的载体可以通过公知方法转移到宿主细胞中，
这些方法根据细胞宿主类型的不同而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙
处理或电穿孔可用于其他细胞宿主的转化；参见上述Sambrook部分。
的方法可以用于构建重组病毒载体；参见，例如，Sambrook,Molecular Cloning A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel,Current
Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley
Interscience,N.Y.(1994))中描述的技术。可替换地，本发明的多核苷酸和载体可以被重
组到脂质体中，以递送至靶细胞。包含本发明的多核苷酸(例如，免疫球蛋白链的重链和/或
轻链可变结构域、编码序列和表达控制序列)的载体可以通过公知方法转移到宿主细胞中，
这些方法根据细胞宿主类型的不同而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙
处理或电穿孔可用于其他细胞宿主的转化；参见上述Sambrook部分。
[0098] 关于上述，本发明还涉及包括所述多核苷酸或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核或真核细胞。存在于宿主细胞中的本发明的多核苷酸或载体可以整合到宿主细胞
的染色体组(genome，基因组)中，或者可以保持在染色体外。宿主细胞可以是任何原核或真
核细胞，诸如细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人细胞；在下面的“宿主细胞”部分更加详细地
描述了用于产生本发明的抗体的合适宿主细胞和方法。
的染色体组(genome，基因组)中，或者可以保持在染色体外。宿主细胞可以是任何原核或真
核细胞，诸如细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人细胞；在下面的“宿主细胞”部分更加详细地
描述了用于产生本发明的抗体的合适宿主细胞和方法。
[0099] 使用上述宿主细胞，可以产生和制备本发明的抗体，例如，用于药用用途或作为治疗干预的靶标。因此，在一个实施方式中，本发明的目的还在于提供一种用于制备抗IL-32
抗体或其IL-32结合片段的方法，所述方法包括：
抗体或其IL-32结合片段的方法，所述方法包括：
[0100] (a)培养如上所限定的细胞；以及
[0101] (b)从培养物分离所述抗体或其IL-32结合片段。
[0102] 因此，本发明涉及由本发明的多核苷酸编码或能够通过用于制备抗IL-32抗体或其一种或多种免疫球蛋白链的上述方法获得的重组的、优选人的抗IL-32抗体和其IL-32结
合片段、其一种或多种免疫球蛋白链。用于抗体及其模拟物的重组生产的方式和方法、以及
筛选竞争结合分子(其可以是抗体或可以不是抗体)的方法在本领域是已知的。然而，如文
中所描述的，特别是关于人体中的治疗应用，本发明的抗体在以下意义上而言是人抗体：施
用所述抗体基本上没有针对这种抗体的免疫反应，而针对嵌合抗体和甚至人源抗体会观察
到这种免疫反应。
合片段、其一种或多种免疫球蛋白链。用于抗体及其模拟物的重组生产的方式和方法、以及
筛选竞争结合分子(其可以是抗体或可以不是抗体)的方法在本领域是已知的。然而，如文
中所描述的，特别是关于人体中的治疗应用，本发明的抗体在以下意义上而言是人抗体：施
用所述抗体基本上没有针对这种抗体的免疫反应，而针对嵌合抗体和甚至人源抗体会观察
到这种免疫反应。
[0103] 结合分子、抗体或其片段可以直接用作治疗药剂。然而，在一个实施方式中，本发明提供的抗体或抗原结合片段被可检测地标记或附着于药物，优选地，其中可检测标记物
选自由酶、放射性同位素、荧光团、肽和重金属组成的组。本发明的经标记的抗体或抗原结
合片段可以用于在体内或体外检测特定靶标，包括体外“免疫化学/免疫标记”类测定。在体
内，它们可以以与核医学成像技术相似的方式用于检测表达感兴趣抗原的组织、细胞或其
他材料。下面在“标记和诊断”部分进一步更加详细地描述了标记物、其在诊断中的用途以
及其与本发明的结合分子的偶联。
选自由酶、放射性同位素、荧光团、肽和重金属组成的组。本发明的经标记的抗体或抗原结
合片段可以用于在体内或体外检测特定靶标，包括体外“免疫化学/免疫标记”类测定。在体
内，它们可以以与核医学成像技术相似的方式用于检测表达感兴趣抗原的组织、细胞或其
他材料。下面在“标记和诊断”部分进一步更加详细地描述了标记物、其在诊断中的用途以
及其与本发明的结合分子的偶联。
[0104] 本发明的抗体从患有自身免疫疾病的动物或人分离。另一方面，本发明中鉴定的IL-32特异性抗体可能涉及到严重损害受侵袭个体的免疫系统，这与例如在APECED患者中
观察到的症状相关联。因此，本发明的另一方面在于通过提供使自身抗体的数量和/或自身
抗体在患病的人患者或动物中的作用最小化的手段和措施来消除或至少减轻患有自身免
疫性疾病的受试者的病理反应。因此，在一个实施方式中，本发明也涉及包括由本发明的自
身抗体特异性识别的表位的肽或基于肽的化合物。如下面进一步详细描述的，可以通过抗
独特型抗体获得与通过应用竞争抗原、隔绝并因而阻止自身抗体与其相应靶标结合的相似
作用。因此，在一个实施方式中，本发明还提供了本发明的自身抗体的抗独特型抗体。
观察到的症状相关联。因此，本发明的另一方面在于通过提供使自身抗体的数量和/或自身
抗体在患病的人患者或动物中的作用最小化的手段和措施来消除或至少减轻患有自身免
疫性疾病的受试者的病理反应。因此，在一个实施方式中，本发明也涉及包括由本发明的自
身抗体特异性识别的表位的肽或基于肽的化合物。如下面进一步详细描述的，可以通过抗
独特型抗体获得与通过应用竞争抗原、隔绝并因而阻止自身抗体与其相应靶标结合的相似
作用。因此，在一个实施方式中，本发明还提供了本发明的自身抗体的抗独特型抗体。
[0105] 如上已示出的，本发明还涉及用于治疗如上所定义的疾病，即与自身耐受的破坏或不受控发生相关联的疾病的本发明的抗独特型抗体或肽或基于肽的化合物。本发明的所
分离抗体或其片段可以用作免疫基因以生成单克隆抗独特型抗体组(panel)。对于生成抗
独特型抗体的适合方法，请参见Raychadhuri等人,J.Immunol.137(1986),1743，而对于T细
胞，请参见Ertl等人,J.Exp.Med.159(1985),1776。将使用本领域中经常进行的标准测定，
根据内影像或非内影像独特型(个体基因型，idiotype)的表达来表征抗独特型抗体，如在
Raychaudhuri等人,J.Immunol.137(1986),1743中所详细描述的。如果抗独特型抗体在结
构上模拟其结合至或与其结合的抗体的抗原，则其被称之为抗原的“内影像”。
分离抗体或其片段可以用作免疫基因以生成单克隆抗独特型抗体组(panel)。对于生成抗
独特型抗体的适合方法，请参见Raychadhuri等人,J.Immunol.137(1986),1743，而对于T细
胞，请参见Ertl等人,J.Exp.Med.159(1985),1776。将使用本领域中经常进行的标准测定，
根据内影像或非内影像独特型(个体基因型，idiotype)的表达来表征抗独特型抗体，如在
Raychaudhuri等人,J.Immunol.137(1986),1743中所详细描述的。如果抗独特型抗体在结
构上模拟其结合至或与其结合的抗体的抗原，则其被称之为抗原的“内影像”。
[0106] 本领域描述了提供模拟自身免疫性疾病相关联的自身抗体(自体抗体)的独特型的分子的方法；参见，例如，国际申请WO03/099868，其公开内容通过引用并入到本文中。例
如，这种方法可以包括如下步骤：(a)根据本发明的方法提供自身抗体；(b)将自身抗体结合
至固相以形成亲和基质；(c)使包含免疫球蛋白的混合血浆或B细胞与亲和基质接触，随后
移除未结合的血浆组分；(d)从基质洗脱作为自身抗体的抗独特型抗体(抗Id)的结合免疫
球蛋白；(e)提供包括多种分子成员的分子库；以及(e)使抗Id与分子库接触，并分离被抗Id
结合的那些结合分子，该结合分子为模仿自身抗体的独特型的分子。国际申请WO2010/
136196中公开了分离独特型自身抗体的方法，该申请的公开内容通过引用并入到本文中，
描述了用于治疗自身免疫性疾病和免疫系统失调的包含从正常人血清(NHS)分离的天然多
克隆IgG反应抗体(Ab)的免疫球蛋白制剂。IgG反应Ab通过与其位于抗原组合位点内或附近
(例如，与抗原组合位点重叠)的抗原决定簇结合，强有力地中和了存在于患有自身免疫性
疾病的患者的血清中的疾病相关或病原自身抗体。
如，这种方法可以包括如下步骤：(a)根据本发明的方法提供自身抗体；(b)将自身抗体结合
至固相以形成亲和基质；(c)使包含免疫球蛋白的混合血浆或B细胞与亲和基质接触，随后
移除未结合的血浆组分；(d)从基质洗脱作为自身抗体的抗独特型抗体(抗Id)的结合免疫
球蛋白；(e)提供包括多种分子成员的分子库；以及(e)使抗Id与分子库接触，并分离被抗Id
结合的那些结合分子，该结合分子为模仿自身抗体的独特型的分子。国际申请WO2010/
136196中公开了分离独特型自身抗体的方法，该申请的公开内容通过引用并入到本文中，
描述了用于治疗自身免疫性疾病和免疫系统失调的包含从正常人血清(NHS)分离的天然多
克隆IgG反应抗体(Ab)的免疫球蛋白制剂。IgG反应Ab通过与其位于抗原组合位点内或附近
(例如，与抗原组合位点重叠)的抗原决定簇结合，强有力地中和了存在于患有自身免疫性
疾病的患者的血清中的疾病相关或病原自身抗体。
[0107] 本发明还涉及包括本发明的上述抗IL-32抗体或其IL-32结合片段、多核苷酸、载体、细胞、肽或基于肽的化合物和/或涉及组合时表现出本发明的抗IL-32抗体或其IL-32结
合片段的特征的抗IL-32抗体或其IL-32结合片段的混合物(cocktail)中的任一种的组合
物。另外地或可替换地，在一个实施方式中，本发明的组合物或试剂盒包括本发明的抗独特
性抗体。在一个实施方式中，组合物为药物组合物并且进一步包括药学上可接受的载体。药
学上可接受的载体、给药途径和给药方案可以从本领域技术人员已知的相应文献中获取，
并且还在下面的“药物载体”和“给药方案”部分进一步更加详细地描述。
合片段的特征的抗IL-32抗体或其IL-32结合片段的混合物(cocktail)中的任一种的组合
物。另外地或可替换地，在一个实施方式中，本发明的组合物或试剂盒包括本发明的抗独特
性抗体。在一个实施方式中，组合物为药物组合物并且进一步包括药学上可接受的载体。药
学上可接受的载体、给药途径和给药方案可以从本领域技术人员已知的相应文献中获取，
并且还在下面的“药物载体”和“给药方案”部分进一步更加详细地描述。
[0108] 另外，本发明涉及一种用于制造包含抗IL-32单克隆抗体或其IL-32结合片段或生物技术衍生物的组合物的方法，该制造包括下述步骤：通过在转化编码抗体、其IL-32结合
片段或生物技术衍生物的DNA的重组宿主机体中的表达来制备抗体、其IL-32结合片段或生
物技术衍生物。在一个实施方式中，该组合物是药物组合物，其中，药物组合物的制造中，在
制备抗体、其IL-32结合片段或生物技术衍生物的步骤之后，将抗体、其IL-32结合片段或生
物技术衍生物与药学上可接受的载体相混合，可选地，在之间的一个或多个步骤之后进行
混合。例如，在药物组合物配制之前，可以从细胞培养物纯化该抗体或其IL-32结合片段到
制药等级和/或衍生化(例如被聚乙二醇化(pegylated)或被偶联至诊断标记物或药物)，从
而获得药物组合物。
片段或生物技术衍生物的DNA的重组宿主机体中的表达来制备抗体、其IL-32结合片段或生
物技术衍生物。在一个实施方式中，该组合物是药物组合物，其中，药物组合物的制造中，在
制备抗体、其IL-32结合片段或生物技术衍生物的步骤之后，将抗体、其IL-32结合片段或生
物技术衍生物与药学上可接受的载体相混合，可选地，在之间的一个或多个步骤之后进行
混合。例如，在药物组合物配制之前，可以从细胞培养物纯化该抗体或其IL-32结合片段到
制药等级和/或衍生化(例如被聚乙二醇化(pegylated)或被偶联至诊断标记物或药物)，从
而获得药物组合物。
[0109] 除了生化和基于细胞的体外测定之外，本发明的抗体的治疗功效可以在下文实施例部分详细描述的适当的动物模型中进行验证。
[0110] 在一个实施方式中，药物组合物进一步包含可用于治疗炎症或自身免疫性疾病的其他药剂，优选地，其中所述药剂选自由非甾体抗炎药(NSAID)、皮质类固醇、抗组胺剂及其
组合组成的组。另外地或可替换地，在另一个实施方式中，药物组合物还包含可用于治疗炎
症相关疾病的药剂，该药剂选自由免疫抑制药和抗炎药或“抗风湿”药组成的组。
组合组成的组。另外地或可替换地，在另一个实施方式中，药物组合物还包含可用于治疗炎
症相关疾病的药剂，该药剂选自由免疫抑制药和抗炎药或“抗风湿”药组成的组。
[0111] 在另一个实施方式中，该组合物为诊断组合物或试剂盒，并且还包含在基于免疫或核酸的诊断方法中常用的试剂。
[0112] 此外，本发明提供了用在方法中的前述抗IL-32抗体及其IL-32结合片段或如上所限定的组合物，该方法包括：
[0113] (a)治疗或预防免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的发展；
[0114] (b)改善与免疫介导的或自身免疫性疾病或病症相关联的症状；和/或
[0115] (c)诊断或筛选存在免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的受试者或者诊断或筛选受试者以确定受试者发展免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的风险；
[0116] 其中疾病与患者中IL-32的表达、上升的和/或不利的IL-32活性相关联。
[0117] 在这方面，可以使用若干种施用途径。在本发明的一个实施方式中，提供了上述抗体或抗原结合片段、抗独特型抗体或者肽或基于肽的化合物和/或组合时表现出本发明的
抗体的特征的抗体混合物，其均被设计成静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、鼻内、胃肠外或作
为气溶胶给药。
抗体的特征的抗体混合物，其均被设计成静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、鼻内、胃肠外或作
为气溶胶给药。
[0118] 如上所述，由于它们的结合特异性，本发明的分子诸如抗体及其片段，可以优选地用于上面限定的治疗、减轻、诊断和/或筛选与IL-32表达、上升的和/或不利的IL-32活性相
关联的和/或由它们引起的免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的方法中。例如，在类风湿
性关节炎(RA)滑膜组织活检中已经观察到表达、上升的和/或不利的IL-32活性，其中IL-32
表达的水平与炎症严重程度正相关(Alsaleh等人,(2010),同上；Cagnard等人,(2005),同
上)。除了类风湿性关节炎(RA)之外，还发现IL-32在功能上与几种其他疾病相关联，例如，
强直性脊柱炎(Ciccia等人,(2012),同上)、炎症性肠病(IBD)、重症肌无力(MG)、慢性阻塞
性肺病(COPD)、哮喘、克罗恩氏病、牛皮癣、血管炎症和动脉粥样硬化(Kobayashi等人,
(2010))、特应性皮炎和癌症(Alsaleh等人,(2010)；Breenan和Beech,(2007)；Asquith和
Mclnnes(2007)；Dinarello和Kim,(2006)；Fantini等人,(2007)；所有同上)。IL-32也可在
对肺结核的免疫应答中起作用(Kundu和Basu,(2006)；Netea等人,(2006)；同上)。而且，在
被细菌和病毒(如结核分枝杆菌(Netea等人,(2006),同上)或流感A(Li等人,(2008),同
上))感染后观察到IL-32的转录增加，表明其在宿主防御中可能起作用。
关联的和/或由它们引起的免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的方法中。例如，在类风湿
性关节炎(RA)滑膜组织活检中已经观察到表达、上升的和/或不利的IL-32活性，其中IL-32
表达的水平与炎症严重程度正相关(Alsaleh等人,(2010),同上；Cagnard等人,(2005),同
上)。除了类风湿性关节炎(RA)之外，还发现IL-32在功能上与几种其他疾病相关联，例如，
强直性脊柱炎(Ciccia等人,(2012),同上)、炎症性肠病(IBD)、重症肌无力(MG)、慢性阻塞
性肺病(COPD)、哮喘、克罗恩氏病、牛皮癣、血管炎症和动脉粥样硬化(Kobayashi等人,
(2010))、特应性皮炎和癌症(Alsaleh等人,(2010)；Breenan和Beech,(2007)；Asquith和
Mclnnes(2007)；Dinarello和Kim,(2006)；Fantini等人,(2007)；所有同上)。IL-32也可在
对肺结核的免疫应答中起作用(Kundu和Basu,(2006)；Netea等人,(2006)；同上)。而且，在
被细菌和病毒(如结核分枝杆菌(Netea等人,(2006),同上)或流感A(Li等人,(2008),同
上))感染后观察到IL-32的转录增加，表明其在宿主防御中可能起作用。
[0119] 因此，在一个实施方式中，提供了如上文限定的用于上述方法的抗IL-32抗体或其IL-32结合片段或组合物，其中所述疾病是自身免疫性疾病，优选地选自由类风湿关节炎
(RA)、强直性脊柱炎和包括但不限于牛皮癣性关节炎(银屑病关节炎，psoriatic
arthritis)的其他形式的脊柱关节炎、炎症性肠病(IBD；包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和
乳糜泻(Celiac's disease))、牛皮癣、重症肌无力(MG)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、肺
结核、血管炎症和动脉粥样硬化、特应性皮炎、肺结核和包括白血病的癌症组成的组。
(RA)、强直性脊柱炎和包括但不限于牛皮癣性关节炎(银屑病关节炎，psoriatic
arthritis)的其他形式的脊柱关节炎、炎症性肠病(IBD；包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和
乳糜泻(Celiac's disease))、牛皮癣、重症肌无力(MG)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、肺
结核、血管炎症和动脉粥样硬化、特应性皮炎、肺结核和包括白血病的癌症组成的组。
[0120] 由于本文中提供的适于治疗例如与炎症相关联的疾病的大量分子，本发明还涉及治疗、诊断和/或预后这样的疾病的可能过程和结果的方法，和本发明的分子的用途，优选
地，其中免疫介导的或自身免疫性疾病或病症与IL-32的表达、上升的和/或不利活性相关
联。在一个实施方式中，提供了用于治疗这样的疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者
施用治疗效用量的上述抗体或抗原结合片段、组合时表现出本发明的抗体的特征的抗体混
合物、抗独特型抗体或者肽或基于肽的化合物。
地，其中免疫介导的或自身免疫性疾病或病症与IL-32的表达、上升的和/或不利活性相关
联。在一个实施方式中，提供了用于治疗这样的疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者
施用治疗效用量的上述抗体或抗原结合片段、组合时表现出本发明的抗体的特征的抗体混
合物、抗独特型抗体或者肽或基于肽的化合物。
[0121] 此外，在一个实施方式中，本发明涉及治疗与IL-32的表达、上升的和/或不利的活性相关联的免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的方法，包括向受试者施用治疗有效剂量
的配体结合分子，该配体结合分子包含：
的配体结合分子，该配体结合分子包含：
[0122] (i)本发明的抗IL-32抗体或其IL-32结合片段的至少一个CDR；或
[0123] (ii)如上所限定的至少一种抗独特型抗体和/或肽或基于肽的化合物。
[0124] 基于使用仅一种特异用于与疾病相关或引起疾病的特定抗原的表位的单克隆抗体的治疗方法可能会存在若干缺点。例如，治疗困难和可能的低效性可能源于导致特定疾
病而需要同时靶向若干种抗原的发病机理的多样性。此外，必须考虑患者群体的内在多样
性，涉及例如不同患者或一个患者中给定抗原的多态性、糖基化异质性或轻微变性，这可能
至少引起所使用的单克隆抗体的结合效率降低。这些缺点中的一些可以通过例如进行预处
理筛选以确定抗原是否与意欲治疗的患者免疫地相关以及确定特定患者中是否存在任何
表位变化来避开。然而，由于治疗紧急性或成本限制，通常省略这样的筛选。因此，本发明还
涉及基于一次向患者应用超过一种类型的结合分子的方法，即涉及结合分子混合物的应
用。这些结合分子可以特异性地结合至不同表位下的一种IL-32同型，所应用的每种结合分
子可以特异性地结合另一种IL-32同型，或者若干种结合分子用于结合至超过一种IL-32同
型的若干种表位。在本发明的结合分子针对(特异性地结合)作为抗原的一种IL-32同型的
情况下，它们的结合特异性针对所述抗原的不同表位。特别地设想使用这样的混合物用于
治疗患有自身免疫性疾病如APS1的患者，该患者由于针对约3000个内源抗原的自身抗体的
存在而常常不能使用一种特定抗体进行单一治疗。在这种情况下，期望利用本发明的具有
相同或不同抗原特异性的两种或更多种单克隆抗体和/或肽和基于肽的化合物的组合疗法
能实现至少症状的一些缓解。
病而需要同时靶向若干种抗原的发病机理的多样性。此外，必须考虑患者群体的内在多样
性，涉及例如不同患者或一个患者中给定抗原的多态性、糖基化异质性或轻微变性，这可能
至少引起所使用的单克隆抗体的结合效率降低。这些缺点中的一些可以通过例如进行预处
理筛选以确定抗原是否与意欲治疗的患者免疫地相关以及确定特定患者中是否存在任何
表位变化来避开。然而，由于治疗紧急性或成本限制，通常省略这样的筛选。因此，本发明还
涉及基于一次向患者应用超过一种类型的结合分子的方法，即涉及结合分子混合物的应
用。这些结合分子可以特异性地结合至不同表位下的一种IL-32同型，所应用的每种结合分
子可以特异性地结合另一种IL-32同型，或者若干种结合分子用于结合至超过一种IL-32同
型的若干种表位。在本发明的结合分子针对(特异性地结合)作为抗原的一种IL-32同型的
情况下，它们的结合特异性针对所述抗原的不同表位。特别地设想使用这样的混合物用于
治疗患有自身免疫性疾病如APS1的患者，该患者由于针对约3000个内源抗原的自身抗体的
存在而常常不能使用一种特定抗体进行单一治疗。在这种情况下，期望利用本发明的具有
相同或不同抗原特异性的两种或更多种单克隆抗体和/或肽和基于肽的化合物的组合疗法
能实现至少症状的一些缓解。
[0125] 因此，在一个实施方式中，提供了治疗疾病的另一种方法，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的混合物，该混合物主要由选自由以下组分组成的组中的至少两种、三种、
四种、五种和更多种组分构成：
四种、五种和更多种组分构成：
[0126] -如上所限定的特异性结合IL-32同型的本发明的抗体或其抗原结合片段；和/或
[0127] -本发明的抗独特型抗体和/或本发明的肽或基于肽的化合物，该肽或基于肽的化合物包含通过本发明的抗体或其抗原结合片段特异性识别的表位。
[0128] 本发明自然地还扩展至下述诊断和预后方法，该诊断和预后方法针对诊断与一种或多种IL-32同型优选地IL-32γ的表达、上升的和/或不利的活性相关联的免疫介导的或
自身免疫性病症和疾病，和/或预后疾病的发展，即其进展、对治疗的反应或恢复。因此，在
一个实施方式中，本发明涉及一种诊断受试者中与IL-32表达、上升的和/或不利的活性相
关联的免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的方法，该方法包括使受试者的生物样本与本
发明的抗IL-32抗体或其IL-32结合片段接触，并检测IL-32的存在。在一个优选实施方式
中，检测的IL-32同型是IL-32γ。此外，在一个实施方式中，本发明涉及检测或确定所分离
的生物样本中IL-32的方法，该方法包括：将样本与本发明的抗IL-32抗体混合，允许抗体与
存在于混合物中的任一种IL-32同型形成复合物，以及检测存在于混合物中的复合物，优选
地，其中，IL-32是IL-32γ。
自身免疫性病症和疾病，和/或预后疾病的发展，即其进展、对治疗的反应或恢复。因此，在
一个实施方式中，本发明涉及一种诊断受试者中与IL-32表达、上升的和/或不利的活性相
关联的免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的方法，该方法包括使受试者的生物样本与本
发明的抗IL-32抗体或其IL-32结合片段接触，并检测IL-32的存在。在一个优选实施方式
中，检测的IL-32同型是IL-32γ。此外，在一个实施方式中，本发明涉及检测或确定所分离
的生物样本中IL-32的方法，该方法包括：将样本与本发明的抗IL-32抗体混合，允许抗体与
存在于混合物中的任一种IL-32同型形成复合物，以及检测存在于混合物中的复合物，优选
地，其中，IL-32是IL-32γ。
[0129] 如上面已提及的，在一个实施方式中，本发明涉及用于诊断与IL-32表达相关联的免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的试剂盒，所述试剂盒包括上述抗体或抗原结合片
段、抗独特型抗体或者肽或基于肽的化合物、多核苷酸、载体或细胞，可选地包括试剂和/或
使用说明书。与本发明的试剂盒相关联地，例如在包括该试剂盒的容器内可以是由调控药
物或生物产品的制造、使用或销售的政府机关规定形式的通知，该通知反映上述机构对制
造、使用或销售用于人类给药的批准。另外地或可替换地，该试剂盒包括试剂和/或使用说
明书用于适当诊断测定中。组合物即本发明的试剂盒当然特别适于诊断、预防和治疗伴有
IL-32表达的疾病或病症，特别是适用于治疗如上所述的疾病。在特别优选的实施方式中，
疾病与一种或多种IL-32同型的表达相关联。
段、抗独特型抗体或者肽或基于肽的化合物、多核苷酸、载体或细胞，可选地包括试剂和/或
使用说明书。与本发明的试剂盒相关联地，例如在包括该试剂盒的容器内可以是由调控药
物或生物产品的制造、使用或销售的政府机关规定形式的通知，该通知反映上述机构对制
造、使用或销售用于人类给药的批准。另外地或可替换地，该试剂盒包括试剂和/或使用说
明书用于适当诊断测定中。组合物即本发明的试剂盒当然特别适于诊断、预防和治疗伴有
IL-32表达的疾病或病症，特别是适用于治疗如上所述的疾病。在特别优选的实施方式中，
疾病与一种或多种IL-32同型的表达相关联。
[0130] 在另一个实施方式中，本发明涉及一种诊断组合物，其包含如上所述的本发明的结合分子、抗体、抗原结合片段、肽或基于肽的化合物、多核苷酸、载体或细胞中的任一种，
以及可选地包含用于检测的适合工具，诸如在基于免疫或核酸的诊断方法中惯用的试剂。
例如，本发明的抗体适合用于免疫测定，其中本发明的抗体可以以液相使用或者可以结合
至固相载体。可以利用本发明的抗体的免疫测定的实例为直接或间接形式的竞争和非竞争
免疫测定。这样的免疫测定的实例为放射免疫测定法(RIA)、夹心法(sandwich)(免疫测
定)、流式细胞术和蛋白印迹测定。本发明的抗原和抗体可以结合至许多不同的载体，并且
用于分离与其特异性结合的细胞。公知载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、
聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然的和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和
磁铁矿。为了本发明的目的，载体的性质是可溶或非可溶的。存在许多本领域技术人员知晓
的许多不同标记物和标记方法。可以在本发明中使用的标记物类型的实例包括酶、放射性
同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；同样参见上文讨论的
实施方式。
以及可选地包含用于检测的适合工具，诸如在基于免疫或核酸的诊断方法中惯用的试剂。
例如，本发明的抗体适合用于免疫测定，其中本发明的抗体可以以液相使用或者可以结合
至固相载体。可以利用本发明的抗体的免疫测定的实例为直接或间接形式的竞争和非竞争
免疫测定。这样的免疫测定的实例为放射免疫测定法(RIA)、夹心法(sandwich)(免疫测
定)、流式细胞术和蛋白印迹测定。本发明的抗原和抗体可以结合至许多不同的载体，并且
用于分离与其特异性结合的细胞。公知载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、
聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然的和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和
磁铁矿。为了本发明的目的，载体的性质是可溶或非可溶的。存在许多本领域技术人员知晓
的许多不同标记物和标记方法。可以在本发明中使用的标记物类型的实例包括酶、放射性
同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；同样参见上文讨论的
实施方式。
[0131] 在这种情况下，本发明还涉及特别设计用于该目的的工具。例如，可使用基于蛋白或抗体的阵列，该阵列例如加载有源自一种或多种IL-32同型的和包含疾病相关抗原的任
一种抗原，以检测可能存在于患有自身免疫性疾病(特别是RA、IBD或APECED/APS1)的患者
中的自身抗体，或者加载有特异性地识别那些炎症相关抗原中的任一种的本发明的抗体或
等同的抗原结合分子。Kusnezow等人,Mol.Cell Proteomics 5(2006),1681-1696中概述了
微阵列免疫测定的设计。因此，本发明还涉及加载有根据本发明识别的结合分子或抗原的
微阵列。
一种抗原，以检测可能存在于患有自身免疫性疾病(特别是RA、IBD或APECED/APS1)的患者
中的自身抗体，或者加载有特异性地识别那些炎症相关抗原中的任一种的本发明的抗体或
等同的抗原结合分子。Kusnezow等人,Mol.Cell Proteomics 5(2006),1681-1696中概述了
微阵列免疫测定的设计。因此，本发明还涉及加载有根据本发明识别的结合分子或抗原的
微阵列。
[0132] 定义和实施方式
[0133] 除非另有说明，本文中使用的术语和实施方式被给予如国际申请WO2013/098419 A1和WO2013/098420 A1中所提供和使用的定义。作为补充，本文中使用的常用术语被给予
如在2000修订和2003年再版的国际标准书号(ISBN)为0198506732的Oxford Dictionary
of Biochemistry and Molecular Biology(生物化学和分子生物的牛津字典),牛津大学
出版社,1997中所提供的定义。
如在2000修订和2003年再版的国际标准书号(ISBN)为0198506732的Oxford Dictionary
of Biochemistry and Molecular Biology(生物化学和分子生物的牛津字典),牛津大学
出版社,1997中所提供的定义。
[0134] 要注意的是，术语“一个”或“一种”实体是指该实体中的一个或多个或者一种或多种；例如，“一种抗体”被理解为代表一种或多种抗体。因此，本文中术语“一个”(或“一种”)、“一种或多种/一个或多个”以及“至少一种/个”可互换使用。
[0135] 术语“中和”和“中和抗体”分别如本领域中常见的一样使用，即这种抗体指降低或消除抗原或活体微生物的至少某种生物活性。例如，本发明的同型-特异性抗IL-32抗体为
中和抗体，例如在如实施例中描述的测定中，如果处于充足的量，那么该抗体消除或降低一
种或多种相应IL-32同型的活性。中和通常用50％抑制浓度(IC50)来定义，并且其可以基于
中和滴定曲线(AUC)下的面积来统计评估。本文中描述和示出了本发明的示例性抗IL-32抗
体的IC50值，例如示例性抗体2C2具有300ng/ml的IL-32γIC50值。
中和抗体，例如在如实施例中描述的测定中，如果处于充足的量，那么该抗体消除或降低一
种或多种相应IL-32同型的活性。中和通常用50％抑制浓度(IC50)来定义，并且其可以基于
中和滴定曲线(AUC)下的面积来统计评估。本文中描述和示出了本发明的示例性抗IL-32抗
体的IC50值，例如示例性抗体2C2具有300ng/ml的IL-32γIC50值。
[0136] 中枢和外周耐受
[0137] 自身耐受是免疫系统不对该机体的成分的抗原应答的过程。自身耐受通过自身反应性T和B细胞的死亡或失活而完成，其可作为在中枢(生殖)免疫器官(胸腺或骨髓)中的中
枢耐受的一部分发生，或者作为被最常视为二级免疫组织(例如脾脏、淋巴结、肠)中的外周
耐受发生。自身耐受是正常免疫系统的重要特征。未能建立和/或维持自身耐受导致了可引
起对宿主机体具有严重健康影响的自身免疫性疾病的自身免疫。
枢耐受的一部分发生，或者作为被最常视为二级免疫组织(例如脾脏、淋巴结、肠)中的外周
耐受发生。自身耐受是正常免疫系统的重要特征。未能建立和/或维持自身耐受导致了可引
起对宿主机体具有严重健康影响的自身免疫性疾病的自身免疫。
[0138] T细胞和B细胞可发展针对存在于生殖免疫器官中的那些抗原的中枢耐受。在骨髓中，B细胞发展了对广泛表达的骨髓特异性抗原和通过血液循环引入的抗原的耐受。在胸腺
中，胸腺髓质上皮细胞可表达呈递至发育时的T细胞的数百种自身抗原。在胸腺髓质上皮细
胞中的负责自身抗原的广泛表达的基因是AIRE(自身免疫调节因子)。AIRE激活了通常只在
特定外周器官中表达(如胰腺胰岛中的胰岛素)的多种组织特异性基因。在不存在功能性
AIRE基因时，没有呈递抗原，T细胞不失活，且对自身抗原的自身免疫发展，导致APECED患者
和AIRE缺陷小鼠中的病理现象。
中，胸腺髓质上皮细胞可表达呈递至发育时的T细胞的数百种自身抗原。在胸腺髓质上皮细
胞中的负责自身抗原的广泛表达的基因是AIRE(自身免疫调节因子)。AIRE激活了通常只在
特定外周器官中表达(如胰腺胰岛中的胰岛素)的多种组织特异性基因。在不存在功能性
AIRE基因时，没有呈递抗原，T细胞不失活，且对自身抗原的自身免疫发展，导致APECED患者
和AIRE缺陷小鼠中的病理现象。
[0139] 在耐受诱导中的另一种重要基因是foxp3。该基因对诱导T淋巴细胞中的免疫抑制调控命运的转录因子编码，该T淋巴细胞在胸腺以及可能也在外周中攻击(接合，engage)自
身抗原。无法对功能FOXP3蛋白编码是IPEX患者的特性，IPEX患者因此也患有普遍的自身免
疫性疾病。
身抗原。无法对功能FOXP3蛋白编码是IPEX患者的特性，IPEX患者因此也患有普遍的自身免
疫性疾病。
[0140] 国际申请WO2013/098419 A1第62-63页的相应章节更详细地描述了中枢和外周耐受，该申请的公开内容通过引用并入本文中。
[0141] 肽和多肽：
[0142] 术语“肽”理解为包括术语“多肽”和“蛋白”(本文中有时可能互换使用)和在本发明含义内的任何氨基酸序列，诸如本发明的重链和轻链可变区及恒定区的那些氨基酸序
列。同样地，也涉及蛋白和多肽的片段，其在本文中可以被称为“肽”。然而，术语“肽”优选地
表示包括至少5个连续氨基酸、优选地至少10个连续氨基酸、更优选地至少15个连续氨基
酸、再优选地至少20个连续氨基酸和特别优选地至少25个连续氨基酸的氨基酸聚合物。另
外，根据本发明的肽通常具有不超过100个连续氨基酸，优选地少于80个连续氨基酸且更优
选地少于50个连续氨基酸。
列。同样地，也涉及蛋白和多肽的片段，其在本文中可以被称为“肽”。然而，术语“肽”优选地
表示包括至少5个连续氨基酸、优选地至少10个连续氨基酸、更优选地至少15个连续氨基
酸、再优选地至少20个连续氨基酸和特别优选地至少25个连续氨基酸的氨基酸聚合物。另
外，根据本发明的肽通常具有不超过100个连续氨基酸，优选地少于80个连续氨基酸且更优
选地少于50个连续氨基酸。
[0143] 如本文中所使用的，术语“多肽”意在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，如本发明的抗体，并且术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称之为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成
的分子。术语“多肽”是指两种或更多种氨基酸的任何一个链或多个链，而并不指特定长度
的产物。因此，“肽”、“二肽”、“三肽”、“寡肽”、“蛋白”、“氨基酸链”或用于指两种或更多种氨基酸的一个或多个链的其他术语包括在“多肽”的定义之内，并且术语“多肽”可用这些术语
中的任一种替换或互换使用。
的分子。术语“多肽”是指两种或更多种氨基酸的任何一个链或多个链，而并不指特定长度
的产物。因此，“肽”、“二肽”、“三肽”、“寡肽”、“蛋白”、“氨基酸链”或用于指两种或更多种氨基酸的一个或多个链的其他术语包括在“多肽”的定义之内，并且术语“多肽”可用这些术语
中的任一种替换或互换使用。
[0144] 术语“多肽”还意指多肽的表达后修饰的产物，该表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行的衍生化、蛋白水解切割(蛋白
水解裂解，proteolytic cleavage)、或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。多肽可以源
自天然生物源或者可以通过重组技术产生，但不一定是由指定的核酸序列翻译。多肽可以
包括通过化学合成在内的任何方式生成。
水解裂解，proteolytic cleavage)、或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。多肽可以源
自天然生物源或者可以通过重组技术产生，但不一定是由指定的核酸序列翻译。多肽可以
包括通过化学合成在内的任何方式生成。
[0145] 本发明的多肽可以具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或
更多个、1000个或更多个、或者2000个或更多个氨基酸的大小。然而，术语“多肽”优选地表
示包括至少100个氨基酸的氨基酸聚合物。多肽可以具有限定的三维结构，虽然它们并非必
须具有这样的结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠式的，而不具有限定的三维结
构的多肽可以采用大量的不同构像，并被称为非折叠式的。如文中所使用的，术语糖蛋白是
指与至少一种碳水化合物部分偶联的蛋白质，该碳水化合物部分通过氨基酸残基(例如丝
氨酸残基或天冬酰胺残基)的含氧的或含氮的侧链附着于蛋白质。
更多个、1000个或更多个、或者2000个或更多个氨基酸的大小。然而，术语“多肽”优选地表
示包括至少100个氨基酸的氨基酸聚合物。多肽可以具有限定的三维结构，虽然它们并非必
须具有这样的结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠式的，而不具有限定的三维结
构的多肽可以采用大量的不同构像，并被称为非折叠式的。如文中所使用的，术语糖蛋白是
指与至少一种碳水化合物部分偶联的蛋白质，该碳水化合物部分通过氨基酸残基(例如丝
氨酸残基或天冬酰胺残基)的含氧的或含氮的侧链附着于蛋白质。
[0146] “分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指并非处于其天然环境中的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，分离的多肽可以从其原生或天然环境中移出。为了本发明的目
的，如已经通过任何合适的技术分离、分馏或者部分或基本纯化的原生或重组多肽一样，宿
主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被视为是分离的。
的，如已经通过任何合适的技术分离、分馏或者部分或基本纯化的原生或重组多肽一样，宿
主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被视为是分离的。
[0147] “重组肽、多肽或蛋白”是指通过重组DNA技术产生(即由通过对包括期望肽的融合蛋白编码的外源性重组DNA表达构建体转化的细胞、微生物或哺乳动物产生)的肽、多肽或
蛋白。在多数细菌培养物中表达的蛋白或肽通常没有多糖。在酵母中表达的蛋白或多肽可
以具有与在哺乳动物细胞中所表达的糖基化模式不同的糖基化模式。
蛋白。在多数细菌培养物中表达的蛋白或肽通常没有多糖。在酵母中表达的蛋白或多肽可
以具有与在哺乳动物细胞中所表达的糖基化模式不同的糖基化模式。
[0148] 作为本发明的多肽，还包括上述多肽的片段、衍生物、类似物和变体及它们的任意组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括具有与天然肽的氨基酸序列基本上相似的氨基酸序列的肽和多肽。术语“足够相似的”指相对于第二氨基酸序列，第一氨基酸序
列包含足够的或最少数量的相同或等同的氨基酸残基，使得第一和第二氨基酸序列具有共
同结构域和/或共同功能活性。例如，在本文中将包含有至少约45％、至少约50％、至少约
55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约
90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约
97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％相同的共同结构域的氨基酸序列限定为基
本上相似。优选地，变体将与本发明的优选肽的氨基酸序列，特别是与抗体或抗体片段，或
者与包含由本发明的抗体或它们中任一种的片段、变体、衍生物或类似物识别的表位的合
成肽或基于肽的化合物基本上相似。这样的变体通常保留本发明的肽的功能活性，即被本
发明的抗体结合。通过一种或多种氨基酸缺失、增加和/或替换，变体包括在氨基酸序列方
面分别与原生和wt肽不同的肽。它们可以是天然存在的变体，也可以是人工设计的变体。
列包含足够的或最少数量的相同或等同的氨基酸残基，使得第一和第二氨基酸序列具有共
同结构域和/或共同功能活性。例如，在本文中将包含有至少约45％、至少约50％、至少约
55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约
90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约
97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％相同的共同结构域的氨基酸序列限定为基
本上相似。优选地，变体将与本发明的优选肽的氨基酸序列，特别是与抗体或抗体片段，或
者与包含由本发明的抗体或它们中任一种的片段、变体、衍生物或类似物识别的表位的合
成肽或基于肽的化合物基本上相似。这样的变体通常保留本发明的肽的功能活性，即被本
发明的抗体结合。通过一种或多种氨基酸缺失、增加和/或替换，变体包括在氨基酸序列方
面分别与原生和wt肽不同的肽。它们可以是天然存在的变体，也可以是人工设计的变体。
[0149] 当提到本发明的抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留相应的原生结合分子、抗体或多肽的至少一些抗原结合特性的任何多肽。除了在本文中其他地方讨论的特异抗体片段之外，本发明的多肽的片段还包括蛋白水解片段以及缺
失片段。本发明的抗体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸替换、缺失
或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或非天然存在的。非天然
存在的变体可以通过使用本领域已知的突变技术产生。变体多肽可包含保守的或非保守的
氨基酸替换、缺失或增加。本发明的结合分子的衍生物，例如本发明的抗体和抗体多肽，是
已经被改变从而展现出原生多肽上未发现的另外特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多
肽在文中还可以被称为“多肽类似物”。如文中所使用的，结合分子或其片段、抗体或抗体多
肽的“衍生物”是指具有通过功能侧基的反应化学衍生出的一种或多种残基的受试者多肽。
作为“衍生物”，还包括含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的肽。
例如，4-羟基脯氨酸可以替换脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以替换赖氨酸；3-甲基组氨酸可以替
换组氨酸；高丝氨酸可以替换丝氨酸；以及鸟氨酸可以替换赖氨酸。
失片段。本发明的抗体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸替换、缺失
或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或非天然存在的。非天然
存在的变体可以通过使用本领域已知的突变技术产生。变体多肽可包含保守的或非保守的
氨基酸替换、缺失或增加。本发明的结合分子的衍生物，例如本发明的抗体和抗体多肽，是
已经被改变从而展现出原生多肽上未发现的另外特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多
肽在文中还可以被称为“多肽类似物”。如文中所使用的，结合分子或其片段、抗体或抗体多
肽的“衍生物”是指具有通过功能侧基的反应化学衍生出的一种或多种残基的受试者多肽。
作为“衍生物”，还包括含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的肽。
例如，4-羟基脯氨酸可以替换脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以替换赖氨酸；3-甲基组氨酸可以替
换组氨酸；高丝氨酸可以替换丝氨酸；以及鸟氨酸可以替换赖氨酸。
[0150] 抗独特型抗体：
[0151] 当提到抗体或其他结合分子时，术语“抗独特型抗体”包括与位于抗原结合位点处或附近的抗体可变区上的独特抗原肽序列结合的分子，由此抑制否则会通过给定的自身抗
体引起的特定免疫反应。以类似的方式，可以使用包括由本发明的抗体特异性识别的表位
的合成肽或基于肽的化合物。
体引起的特定免疫反应。以类似的方式，可以使用包括由本发明的抗体特异性识别的表位
的合成肽或基于肽的化合物。
[0152] 可以以与其他抗体类似的方式获得抗独特型抗体。通过任何类型的交联(通过凝集(浊度法或比浊测定法中)、沉淀(放射免疫扩散)或夹心免疫测定如ELISA中的任一种)来
检测特定的抗独特型抗体。美国专利申请第20020142356号提供了一种用于获得针对高浓
度高分子量的靶抗原特异性的抗体的抗独特型单克隆抗体群的方法，其中，所述抗独特型
单克隆抗体群对于对所述靶抗原特异性的所选抗体具有宽范围的结合亲和力，并且其中，
可以选择针对特定应用具有所需亲和力的所述抗独特型抗体群的子集。
检测特定的抗独特型抗体。美国专利申请第20020142356号提供了一种用于获得针对高浓
度高分子量的靶抗原特异性的抗体的抗独特型单克隆抗体群的方法，其中，所述抗独特型
单克隆抗体群对于对所述靶抗原特异性的所选抗体具有宽范围的结合亲和力，并且其中，
可以选择针对特定应用具有所需亲和力的所述抗独特型抗体群的子集。
[0153] 美国专利申请第20020142356号描述了抗原的竞争免疫测定，其使用抗体作为涂层(coat)而抗独特型抗体作为检测，或反之亦然。公开使用抗独特型抗体作为替代抗原的
其他参考文献包括Losman等人,Cancer Research,55(1995)(23suppl.S):S5978-S5982；
Becker等人,J.of Immunol.Methods 192(1996),73-85；Baral等人,International J.of
Cancer,92(2001),88-95；以及Kohen等人,Food and Agriculture Immunology,12(2000),
193-201。抗独特型抗体在治疗疾病或对抗寄生虫中的用途是本领域中已知的；参见，例如
Sacks等人,J.Exper.Medicine,155(1982),1108-1119中。
其他参考文献包括Losman等人,Cancer Research,55(1995)(23suppl.S):S5978-S5982；
Becker等人,J.of Immunol.Methods 192(1996),73-85；Baral等人,International J.of
Cancer,92(2001),88-95；以及Kohen等人,Food and Agriculture Immunology,12(2000),
193-201。抗独特型抗体在治疗疾病或对抗寄生虫中的用途是本领域中已知的；参见，例如
Sacks等人,J.Exper.Medicine,155(1982),1108-1119中。
[0154] 分子的相似性和/或同一性的确定：
[0155] 两种肽之间的“相似性”通过将一种肽的氨基酸序列与第二种肽的序列相比较来确定。如果相同或存在保守氨基酸替换，那么一种肽的氨基酸与第二种肽的对应氨基酸相
似。保守替换包括在Dayhoff,M.O.编,The Atlas of Protein Sequence and Structure
5,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.(1978)中以及Argos,
EMBO J.8(1989),779-785中描述的那些。例如，属于下述组中之一的氨基酸表示保守变化
或替换：-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；-Cys、Ser、Tyr、Thr；-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；-Lys、Arg、His；-Phe、Tyr、Trp、His；以及-Asp、Glu。
似。保守替换包括在Dayhoff,M.O.编,The Atlas of Protein Sequence and Structure
5,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.(1978)中以及Argos,
EMBO J.8(1989),779-785中描述的那些。例如，属于下述组中之一的氨基酸表示保守变化
或替换：-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；-Cys、Ser、Tyr、Thr；-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；-Lys、Arg、His；-Phe、Tyr、Trp、His；以及-Asp、Glu。
[0156] 优选地，使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:5873-5877的数学算法来完成两个序列之间的百分比同一性或相似性的确定。在NCBI(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)上可获取的Altschul等人(1990)
J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTn和BLASTp程序中结合了这样的算法。
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)上可获取的Altschul等人(1990)
J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTn和BLASTp程序中结合了这样的算法。
[0157] 利用BLASTn和BLASTp程序的标准参数执行百分比同一性或相似性的确定。
[0158] 利用BLASTn程序执行BLAST多核苷酸检索。
[0159] 关于常规参数，可以将“最大靶序列”框设为100，可以勾选“短查询串”框，可以将“期望阈值”框设为10，以及可以将“字体大小”框设为28。关于得分参数，可以将“匹配/错配
分数”设为1、-2，以及可以将“空位罚分(成本)”框设为线性。关于过滤器和掩蔽参数，可以
不勾选“低复杂性区域”框，可以不勾选“物种特异性重复序列”框，可以勾选“仅用于查询表
的掩蔽”框，以及可以不勾选“掩蔽小写字体”框。
分数”设为1、-2，以及可以将“空位罚分(成本)”框设为线性。关于过滤器和掩蔽参数，可以
不勾选“低复杂性区域”框，可以不勾选“物种特异性重复序列”框，可以勾选“仅用于查询表
的掩蔽”框，以及可以不勾选“掩蔽小写字体”框。
[0160] 用BLASTp程序执行BLAST蛋白检索。关于常规参数，可以将“最大靶序列”框设为100，可以勾选“短查询串”框，可以将“期望阈值”框设为10，并且可以将“字体大小”框设为
“3”。关于得分参数，可以将“矩阵”框设为“BLOSUM62”，可以将“空位罚分”框设为“存在：11延伸：1”，可以将“组成调整”框设为“条件性组成得分矩阵调整”。关于过滤器和掩蔽参数，
可以不勾选“低复杂性区域”框，可以不勾选“仅用于查询表的掩蔽”框，以及可以不勾选“掩
蔽小写字体”框。
“3”。关于得分参数，可以将“矩阵”框设为“BLOSUM62”，可以将“空位罚分”框设为“存在：11延伸：1”，可以将“组成调整”框设为“条件性组成得分矩阵调整”。关于过滤器和掩蔽参数，
可以不勾选“低复杂性区域”框，可以不勾选“仅用于查询表的掩蔽”框，以及可以不勾选“掩
蔽小写字体”框。
[0161] 多核苷酸：
[0162] 术语“多核苷酸”意在涵盖单数核酸以及复数核酸，并且指已分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包括常规的磷酸二酯键或非常规
的键(例如，如在肽核酸(PNA)中发现的酰胺键)。术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任一
个或多个核酸段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意指已经从其原生环境中
移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，对包含在载体中的抗体编码的重组
多核苷酸被视为是分离的。分离的多核苷酸的其他实例包括保持在异源宿主细胞中的重组
多核苷酸或溶液中的(部分地或基本上)纯化的多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多
核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的
那些分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件，例如启动子、核糖体结合位
点或转录终止子。
的键(例如，如在肽核酸(PNA)中发现的酰胺键)。术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任一
个或多个核酸段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意指已经从其原生环境中
移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，对包含在载体中的抗体编码的重组
多核苷酸被视为是分离的。分离的多核苷酸的其他实例包括保持在异源宿主细胞中的重组
多核苷酸或溶液中的(部分地或基本上)纯化的多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多
核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的
那些分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件，例如启动子、核糖体结合位
点或转录终止子。
[0163] 如本文所使用的，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不被翻译成氨基酸，但其可以被视为编码区的一部分，但
任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等)都不是编码区的一部
分。本发明的两个或更多个编码区可以存在于单一(单种，单个，single)多核苷酸构建体
中，例如在单一载体上，或者可以存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)
的载体上。此外，任何载体可以含有单一编码区，或可以包括两个或更多个编码区，例如单
一载体可以分别对免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区编码。另外，本发明的
载体、多核苷酸或核酸可以对融合或未融合于编码结合分子、抗体或其片段、变体或衍生物
的核酸的异源编码区编码。异源编码区包括但不限于专门元件(specialized element)或
基序(motif)，如分泌信号肽或异源功能结构域。
任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等)都不是编码区的一部
分。本发明的两个或更多个编码区可以存在于单一(单种，单个，single)多核苷酸构建体
中，例如在单一载体上，或者可以存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)
的载体上。此外，任何载体可以含有单一编码区，或可以包括两个或更多个编码区，例如单
一载体可以分别对免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区编码。另外，本发明的
载体、多核苷酸或核酸可以对融合或未融合于编码结合分子、抗体或其片段、变体或衍生物
的核酸的异源编码区编码。异源编码区包括但不限于专门元件(specialized element)或
基序(motif)，如分泌信号肽或异源功能结构域。
[0164] 在某些实施方式中，多核苷酸或核酸为DNA。在DNA的情况下，包含对多肽编码的核酸的多核苷酸通常可以包括与一个或多个编码区可操作性地缔合的启动子和/或其他转录
或翻译控制元件。可操作缔合(关联，association)是：此时用于基因产物例如多肽的编码
区与一种或多种调节序列缔合，从而在一种或多种调节序列的影响或控制下安排基因产物
的表达。如果诱发启动子功能引起编码期望基因产物的mRNA的转录，以及如果这两个DNA片
段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导该基因产物的表达的能力或不干扰DNA模板
被转录的能力，两个DNA片段(如多肽编码区和与其相关联的启动子)是“可操作性地缔合
的”或“可操作性地连接的”。因此，如果启动子能够影响对多肽编码的核酸的转录，那么启
动子区可以与该核酸可操作性地缔合。启动子可以是仅在预定细胞中指导DNA的大量转录
的细胞特异性启动子。除启动子之外的其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏子和
转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合，以指导细胞特异性转录。本文中公开了合适
的启动子和其他转录控制区。
或翻译控制元件。可操作缔合(关联，association)是：此时用于基因产物例如多肽的编码
区与一种或多种调节序列缔合，从而在一种或多种调节序列的影响或控制下安排基因产物
的表达。如果诱发启动子功能引起编码期望基因产物的mRNA的转录，以及如果这两个DNA片
段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导该基因产物的表达的能力或不干扰DNA模板
被转录的能力，两个DNA片段(如多肽编码区和与其相关联的启动子)是“可操作性地缔合
的”或“可操作性地连接的”。因此，如果启动子能够影响对多肽编码的核酸的转录，那么启
动子区可以与该核酸可操作性地缔合。启动子可以是仅在预定细胞中指导DNA的大量转录
的细胞特异性启动子。除启动子之外的其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏子和
转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合，以指导细胞特异性转录。本文中公开了合适
的启动子和其他转录控制区。
[0165] 各种转录控制区对于本领域技术人员而言是已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子段(立即
早期启动子，连接有内含子-A)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(如劳氏肉瘤病
毒)。其他转录控制区包括源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔
β-球蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中的基因表达的其他序列。其他合适
的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如可由干扰
素或白细胞介素诱导的启动子)。
早期启动子，连接有内含子-A)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(如劳氏肉瘤病
毒)。其他转录控制区包括源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔
β-球蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中的基因表达的其他序列。其他合适
的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如可由干扰
素或白细胞介素诱导的启动子)。
[0166] 类似地，各种翻译控制元件(元素，element)对于本领域普通技术人员而言是已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及源于小核糖核酸病毒
(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也被称为CITE序列)的元件。
(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也被称为CITE序列)的元件。
[0167] 在其他实施方式中，本发明的多核苷酸为例如信使RNA(mRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物形式的RNA。
[0168] 本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的其他编码区相缔和，其指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋
白具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白链已经开始跨越粗面内质网排出，就从成
熟蛋白切割该信号肽或分泌前导序列。本领域普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多
肽通常具有融合至多肽的N端的信号肽，该信号肽是从完整的或“全长”多肽切割出来的以
产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方式中，使用原生信号肽例如免疫球蛋白重链
或轻链信号肽，或使用保留了指导与其可操作性地缔合的多肽的分泌的能力的序列的功能
衍生物。可替换地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列
可以用人组织纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列替换。然而，细胞内
产生本发明的多肽特别是免疫球蛋白及其片段的也是可能的。
白具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白链已经开始跨越粗面内质网排出，就从成
熟蛋白切割该信号肽或分泌前导序列。本领域普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多
肽通常具有融合至多肽的N端的信号肽，该信号肽是从完整的或“全长”多肽切割出来的以
产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方式中，使用原生信号肽例如免疫球蛋白重链
或轻链信号肽，或使用保留了指导与其可操作性地缔合的多肽的分泌的能力的序列的功能
衍生物。可替换地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列
可以用人组织纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列替换。然而，细胞内
产生本发明的多肽特别是免疫球蛋白及其片段的也是可能的。
[0169] 表达：
[0170] 本文中使用的术语“表达”是指一种过程，通过该过程，基因产生生化物，例如RNA或多肽。该过程包括细胞内的基因的功能存在的任何表现，包括但不限于基因敲落以及瞬
时表达和稳定表达。表达包括但不限于：将基因转录成信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小
发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物；以及将这种mRNA翻译成一种或多
种多肽。如果最终期望的产物是生化物，则表达包括生成该生化物和任何前体。基因的表达
产生“基因产物”。如本文中使用的，基因产物可以是核酸(例如通过基因转录所产生的小干
扰RNA(siRNA)、信使RNA)或由转录物翻译得到的多肽。本文中描述的基因产物还包括进行
了转录后修饰(例如聚腺苷酸化)的核酸，或进行了翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、脂质
加成、与其他蛋白亚基缔合、蛋白水解切割等)的多肽。
时表达和稳定表达。表达包括但不限于：将基因转录成信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小
发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物；以及将这种mRNA翻译成一种或多
种多肽。如果最终期望的产物是生化物，则表达包括生成该生化物和任何前体。基因的表达
产生“基因产物”。如本文中使用的，基因产物可以是核酸(例如通过基因转录所产生的小干
扰RNA(siRNA)、信使RNA)或由转录物翻译得到的多肽。本文中描述的基因产物还包括进行
了转录后修饰(例如聚腺苷酸化)的核酸，或进行了翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、脂质
加成、与其他蛋白亚基缔合、蛋白水解切割等)的多肽。
[0171] 可以利用各种表达载体/宿主系统来包含和表达多核苷酸序列。这些表达载体/宿主系统包括但不限于微生物如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母
表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达
载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或细菌表达载体(例如，Ti或pBR322
质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达
载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或细菌表达载体(例如，Ti或pBR322
质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
[0172] 为了在宿主细胞中表达肽、多肽或融合蛋白(以下称为“产物”)，可以使用诸如下述的程序。可以将含有对所述产物编码的DNA序列的限制片段克隆进含有在宿主细胞中作
用的复制起点和合适选择标记物的合适重组质粒中。质粒可以包括用于产物的诱导表达的
启动子(例如,pTrc(Amann等人,Gene 69(1988),301-315)和pETl Id(Studier等人,Gene
Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,
Calif.(1990),60-89))。重组质粒可通过例如电穿孔引入到宿主细胞中，并且含有重组质
粒的细胞可以通过选择质粒上的标记物来鉴定。可以使用对产物特异性的测定来诱导和检
测宿主细胞中该产物的表达。
用的复制起点和合适选择标记物的合适重组质粒中。质粒可以包括用于产物的诱导表达的
启动子(例如,pTrc(Amann等人,Gene 69(1988),301-315)和pETl Id(Studier等人,Gene
Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,
Calif.(1990),60-89))。重组质粒可通过例如电穿孔引入到宿主细胞中，并且含有重组质
粒的细胞可以通过选择质粒上的标记物来鉴定。可以使用对产物特异性的测定来诱导和检
测宿主细胞中该产物的表达。
[0173] 在一些实施方式中，可以优化对产物/肽编码的DNA以便在宿主细胞中表达。例如，DNA可以包括用于一个或多个氨基酸的密码子，该密码子相对于用于相同氨基酸的其他密
码子在宿主细胞中是占主导地位的。
码子在宿主细胞中是占主导地位的。
[0174] 可替换地，可以通过在无细胞提取物中体外合成蛋白来进行产物的表达，该无细胞提取物还特别适于并入修饰的或非天然的氨基酸，以用于功能性研究，也参见下文。当过
表达产物对宿主细胞有毒时，当产物不可溶或形成包涵体时，或者当蛋白通过胞内蛋白酶
经历迅速的蛋白降解时，使用体外翻译系统相较于体内基因表达更具优势。最常使用的无
细胞翻译系统由来自兔网织红细胞、麦胚和大肠杆菌的提取物组成。全部提取物被制备成
包含异源RNA翻译所需要的所有大分子组分(70S或80S核糖体、tRNA、氨酰tRNA合成酶、起始
因子、延伸因子和终止因子等)的粗提取物。为了确保有效翻译，每种提取物必须补充有氨
基酸、能源(ATP、GTP)、能量再生系统(用于真核系统的磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶，以及用于
大肠杆菌裂解物的磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶)以及本领域中已知的其他辅助因子(Mg2
+，K+等)。合适的转录/翻译系统是市售的，例如来自Promega公司、Roche Diagnostics公司、
以及Ambion公司即Applied Biosystems公司(Anderson,C.等人,Meth.Enzymol.101
(1983),635–644；Arduengo,M.等人(2007),The Role of Cell-Free Rabbit
Reticulocyte Expression Systems in Functional Proteomics in,Kudlicki,Katzen和
Bennett eds.,Cell-Free Expression Vol.2007.Austin,Tx:Landes Bioscience,pp.1-
18；Chen和Zubay,Meth.Enzymol.101(1983),674–90；Ezure等人,Biotechnol.Prog.22
(2006),1570–1577)。
表达产物对宿主细胞有毒时，当产物不可溶或形成包涵体时，或者当蛋白通过胞内蛋白酶
经历迅速的蛋白降解时，使用体外翻译系统相较于体内基因表达更具优势。最常使用的无
细胞翻译系统由来自兔网织红细胞、麦胚和大肠杆菌的提取物组成。全部提取物被制备成
包含异源RNA翻译所需要的所有大分子组分(70S或80S核糖体、tRNA、氨酰tRNA合成酶、起始
因子、延伸因子和终止因子等)的粗提取物。为了确保有效翻译，每种提取物必须补充有氨
基酸、能源(ATP、GTP)、能量再生系统(用于真核系统的磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶，以及用于
大肠杆菌裂解物的磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶)以及本领域中已知的其他辅助因子(Mg2
+，K+等)。合适的转录/翻译系统是市售的，例如来自Promega公司、Roche Diagnostics公司、
以及Ambion公司即Applied Biosystems公司(Anderson,C.等人,Meth.Enzymol.101
(1983),635–644；Arduengo,M.等人(2007),The Role of Cell-Free Rabbit
Reticulocyte Expression Systems in Functional Proteomics in,Kudlicki,Katzen和
Bennett eds.,Cell-Free Expression Vol.2007.Austin,Tx:Landes Bioscience,pp.1-
18；Chen和Zubay,Meth.Enzymol.101(1983),674–90；Ezure等人,Biotechnol.Prog.22
(2006),1570–1577)。
[0175] 宿主细胞：
[0176] 关于本发明，宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，诸如细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞或人细胞。优选的真菌细胞为例如酵母属的那些真菌细胞，特
别是物种酿酒酵母(S.cerevisiae)的那些真菌细胞。术语“原核”意在包括可以用用于表达
本发明的抗体或对应的免疫球蛋白链的DNA或RNA分子转化或转染的所有细菌。原核宿主可
以包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌如，例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌
(S.typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草杆菌。术语“真核”意在包
括酵母细胞、高等植物细胞、昆虫细胞和优选地哺乳动物细胞，最优选地为HEK 293细胞、
NSO细胞、CSO细胞和CHO细胞。根据重组生产过程中使用的宿主，由本发明的多核苷酸编码
的抗体或免疫球蛋白链可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的抗体或对应的免
疫球蛋白链还可以包括起始蛋氨酸氨基酸残基。可使用本领域普通技术人员通常已知的任
何技术来用本发明的多核苷酸转化或转染宿主。此外，用于制备融合的可操作性地连接的
基因和在例如哺乳动物细胞和细菌中表达它们的方法是本领域中已知的(Sambrook,
Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold
Spring Harbor,NY,1989)。其中所描述的基因构建体和方法可用于在真核或原核宿主中表
达本发明的抗体或对应的免疫球蛋白链。通常，含有促进所插入多核苷酸的有效转录的启
动子序列的表达载体与宿主结合使用。表达载体通常含有复制起点、启动子和终止子，以及
能提供所转化细胞的表型选择的特定基因。可以从多个来源诸如美国典型培养物保藏中心
(American Type Culture Collection)获得用于DNA序列的合适源细胞和用于免疫球蛋白
表达和分泌的宿主细胞("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas,"Fifth edition
(1985)Rockville,Maryland,U.S.A.,其通过引用并入到本文中)。此外，包含本发明的细胞
的转基因动物(优选地为哺乳动物)可用于大规模生产本发明的抗体。
别是物种酿酒酵母(S.cerevisiae)的那些真菌细胞。术语“原核”意在包括可以用用于表达
本发明的抗体或对应的免疫球蛋白链的DNA或RNA分子转化或转染的所有细菌。原核宿主可
以包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌如，例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌
(S.typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草杆菌。术语“真核”意在包
括酵母细胞、高等植物细胞、昆虫细胞和优选地哺乳动物细胞，最优选地为HEK 293细胞、
NSO细胞、CSO细胞和CHO细胞。根据重组生产过程中使用的宿主，由本发明的多核苷酸编码
的抗体或免疫球蛋白链可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的抗体或对应的免
疫球蛋白链还可以包括起始蛋氨酸氨基酸残基。可使用本领域普通技术人员通常已知的任
何技术来用本发明的多核苷酸转化或转染宿主。此外，用于制备融合的可操作性地连接的
基因和在例如哺乳动物细胞和细菌中表达它们的方法是本领域中已知的(Sambrook,
Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold
Spring Harbor,NY,1989)。其中所描述的基因构建体和方法可用于在真核或原核宿主中表
达本发明的抗体或对应的免疫球蛋白链。通常，含有促进所插入多核苷酸的有效转录的启
动子序列的表达载体与宿主结合使用。表达载体通常含有复制起点、启动子和终止子，以及
能提供所转化细胞的表型选择的特定基因。可以从多个来源诸如美国典型培养物保藏中心
(American Type Culture Collection)获得用于DNA序列的合适源细胞和用于免疫球蛋白
表达和分泌的宿主细胞("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas,"Fifth edition
(1985)Rockville,Maryland,U.S.A.,其通过引用并入到本文中)。此外，包含本发明的细胞
的转基因动物(优选地为哺乳动物)可用于大规模生产本发明的抗体。
[0177] 所转化的宿主可以在发酵器中生长，并根据本领域中已知的技术进行培养，以实现最佳的细胞生长。一旦被表达，本发明的全抗体(the whole antibodies)、其二聚体、各
轻链和重链、或其他免疫球蛋白形式可以根据本领域的标准程序进行纯化，这些标准程序
包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等；参见Scopes,"Protein Purification",
Springer Verlag,N.Y.(1982)。本发明的抗体或其相应的一种或多种免疫球蛋白链然后可
从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜组分(fraction)分离。例如本发明的重组表达抗体或
免疫球蛋白链的分离和纯化可以是任何常规的方法，例如制备性色谱分离和免疫分离，诸
如例如包括使用针对例如本发明的抗体的恒定区的单克隆抗体或多克隆抗体的那些分离。
对本领域技术人员将显而易见的是，本发明抗体可以进一步与其他部分偶联，以用于例如
药物靶向和成像应用。抗体或抗原的表达之后可化学地进行这种偶联至附着位点，或者可
在DNA水平上将偶联产物工程化为本发明的抗体或抗原。然后，在合适的宿主系统中表达
DNA，并且如有必要，收集所表达的蛋白并使其复性。
轻链和重链、或其他免疫球蛋白形式可以根据本领域的标准程序进行纯化，这些标准程序
包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等；参见Scopes,"Protein Purification",
Springer Verlag,N.Y.(1982)。本发明的抗体或其相应的一种或多种免疫球蛋白链然后可
从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜组分(fraction)分离。例如本发明的重组表达抗体或
免疫球蛋白链的分离和纯化可以是任何常规的方法，例如制备性色谱分离和免疫分离，诸
如例如包括使用针对例如本发明的抗体的恒定区的单克隆抗体或多克隆抗体的那些分离。
对本领域技术人员将显而易见的是，本发明抗体可以进一步与其他部分偶联，以用于例如
药物靶向和成像应用。抗体或抗原的表达之后可化学地进行这种偶联至附着位点，或者可
在DNA水平上将偶联产物工程化为本发明的抗体或抗原。然后，在合适的宿主系统中表达
DNA，并且如有必要，收集所表达的蛋白并使其复性。
[0178] 对于药物用途，具有至少约90％至95％的同源性的基本上纯的免疫球蛋白是优选的，且具有98％至99％或更多的同源性的是最优选的。一旦纯化或部分地纯化至所需的同
源性，那么抗体就可以在治疗上(包括在体外)使用或者用于开发和执行测定程序。
源性，那么抗体就可以在治疗上(包括在体外)使用或者用于开发和执行测定程序。
[0179] 本发明还涉及用于生产能够表达本发明的抗体或一种或多种其对应的免疫球蛋白链的细胞的方法，该方法大体上包括用本发明的多核苷酸或载体基因工程化细胞。能够
通过本发明的方法获得的细胞可以用于例如测试本发明的抗体与其抗原的相互作用。
通过本发明的方法获得的细胞可以用于例如测试本发明的抗体与其抗原的相互作用。
[0180] ELISA-测定：
[0181] 用于各种抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)包括基于比色法、化学发光法和荧光测定法的那些测定。ELISA已经成功地应用于测定血浆样本和尿液样本中低量药物和其他
抗原组分，不包括提取步骤并且易于执行。用于检测针对(抗，to)蛋白抗原的抗体的ELISA
经常利用短合成肽与微量滴定板的塑料表面的直接结合。由于肽的合成性质和使用高效液
相色谱法的有效纯化方法，肽通常非常纯。短肽的缺点在于，它们通常表示线性表位，而不
表示构象或非连续表位。为了呈现构象表位，使用长肽或完整的天然蛋白。蛋白抗原与板的
疏水性聚苯乙烯载体(support)直接结合可引起所结合蛋白的部分或完全变性以及构象表
位的丧失。用介导抗原的固定化(捕获ELISA)的抗体涂覆该板，可以避免这种影响。
抗原组分，不包括提取步骤并且易于执行。用于检测针对(抗，to)蛋白抗原的抗体的ELISA
经常利用短合成肽与微量滴定板的塑料表面的直接结合。由于肽的合成性质和使用高效液
相色谱法的有效纯化方法，肽通常非常纯。短肽的缺点在于，它们通常表示线性表位，而不
表示构象或非连续表位。为了呈现构象表位，使用长肽或完整的天然蛋白。蛋白抗原与板的
疏水性聚苯乙烯载体(support)直接结合可引起所结合蛋白的部分或完全变性以及构象表
位的丧失。用介导抗原的固定化(捕获ELISA)的抗体涂覆该板，可以避免这种影响。
[0182] 然而，过表达的重组蛋白经常是不可溶的，并且当要分析构象表位的抗体时需要在变性条件下进行纯化和复性。参见，例如，关于使用重组融合蛋白作为外壳蛋白的通用
ELISA的美国专利申请第20030044870号。
ELISA的美国专利申请第20030044870号。
[0183] 结合分子：
[0184] 本发明的上下文中使用的“结合分子”主要涉及抗体及其片段，但还可以指与本发明的“感兴趣分子”结合的其他非抗体分子，其中，该感兴趣分子是称为细胞因子的糖蛋白
类的蛋白，特别是选自不同IL-32同型的组的白细胞介素。在一个特别优选的实施方式中，
感兴趣分子是IL-32γ。在本发明上文和下文的具体实施方式的描述中进一步详细定义了
本发明的感兴趣分子。本发明的结合分子包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性
复合体(MHC)分子、伴侣分子(诸如热休克蛋白(HSP))以及细胞-细胞粘附分子(诸如钙粘着
蛋白、整合素、C型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族中的成员)。因此，仅出于清楚起见，并且
在不限制本发明的范围的情况下，大多数以下实施方式均关于代表用于开发治疗和诊断试
剂的优选结合分子的抗体和类抗体分子进行了讨论。
类的蛋白，特别是选自不同IL-32同型的组的白细胞介素。在一个特别优选的实施方式中，
感兴趣分子是IL-32γ。在本发明上文和下文的具体实施方式的描述中进一步详细定义了
本发明的感兴趣分子。本发明的结合分子包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性
复合体(MHC)分子、伴侣分子(诸如热休克蛋白(HSP))以及细胞-细胞粘附分子(诸如钙粘着
蛋白、整合素、C型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族中的成员)。因此，仅出于清楚起见，并且
在不限制本发明的范围的情况下，大多数以下实施方式均关于代表用于开发治疗和诊断试
剂的优选结合分子的抗体和类抗体分子进行了讨论。
[0185] 抗体：
[0186] 术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用。抗体或免疫球蛋白为结合至如上下文所定义的本发明的感兴趣分子的分子，该分子包含至少重链的可变结构域，并且
通常包含至少重链和轻链的可变结构域。对脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构了解较
为充分；参见例如，Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring
Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)。术语“结合”和“识别”在关于本发明的结合分子
例如抗体的结合亲和力方面互换使用。
通常包含至少重链和轻链的可变结构域。对脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构了解较
为充分；参见例如，Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring
Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)。术语“结合”和“识别”在关于本发明的结合分子
例如抗体的结合亲和力方面互换使用。
[0187] 如上下文所定义的，含有用以特异性结合至感兴趣分子的充足结构的任何抗体或免疫球蛋白片段在文中可互换地表示为“结合分子”、“结合片段”或“免疫特异性片段”。
[0188] 本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体或衍生物包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、灵长目源化抗体、鼠源化抗
体或嵌合型抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs
(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生
的片段以及抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如针对本文中公开的抗体的抗Id抗体)。scFv分
子是本领域已知的，且例如在美国专利5892019中有描述。在这方面，抗体的抗原结合片段
还可以为结构域抗体(dAB)，结构域抗体也称为单域抗体(sdAB)或纳米抗体TM
(nanobodiesTM)(Ablynx公司，根特，比利时)，参见，例如De Haard等人,J.Bacteriol.187
(2005),4531-4541；Holt等人,Trends Biotechnol.21(2003),484-490。如下面将进一步详
细讨论的，术语“免疫球蛋白”包括可以在生化上区分的各种宽泛种类的多肽。本领域技术
人员将理解，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε)以及其中一些子类(例如，γ1至γ
4)。将抗体的“类”分别确定为IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY的正是该链的性质。免疫球蛋白
亚类(同型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等)被很好地表征，并且已知会赋予功能特
化。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、
IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)或亚类。鉴于本公开内容，本领域技术人员易于辨别这些类和同型中的每一种的修饰版本，因此，这些修饰版本均
落入本发明的范围内。尽管所有的免疫球蛋白类清楚地在本发明的范围内，但以下讨论一
般针对免疫球蛋白分子的IgG类。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包括分子量约为23000道尔
顿的两条相同的轻链多肽和分子量为53000-70000的两条相同的重链多肽。该四条链在“Y”
构型中通常通过二硫键连接，其中，轻链托住(bracket)在“Y”的口处开始并继续通过可变
区的重链。
体或嵌合型抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs
(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生
的片段以及抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如针对本文中公开的抗体的抗Id抗体)。scFv分
子是本领域已知的，且例如在美国专利5892019中有描述。在这方面，抗体的抗原结合片段
还可以为结构域抗体(dAB)，结构域抗体也称为单域抗体(sdAB)或纳米抗体TM
(nanobodiesTM)(Ablynx公司，根特，比利时)，参见，例如De Haard等人,J.Bacteriol.187
(2005),4531-4541；Holt等人,Trends Biotechnol.21(2003),484-490。如下面将进一步详
细讨论的，术语“免疫球蛋白”包括可以在生化上区分的各种宽泛种类的多肽。本领域技术
人员将理解，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε)以及其中一些子类(例如，γ1至γ
4)。将抗体的“类”分别确定为IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY的正是该链的性质。免疫球蛋白
亚类(同型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等)被很好地表征，并且已知会赋予功能特
化。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、
IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)或亚类。鉴于本公开内容，本领域技术人员易于辨别这些类和同型中的每一种的修饰版本，因此，这些修饰版本均
落入本发明的范围内。尽管所有的免疫球蛋白类清楚地在本发明的范围内，但以下讨论一
般针对免疫球蛋白分子的IgG类。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包括分子量约为23000道尔
顿的两条相同的轻链多肽和分子量为53000-70000的两条相同的重链多肽。该四条链在“Y”
构型中通常通过二硫键连接，其中，轻链托住(bracket)在“Y”的口处开始并继续通过可变
区的重链。
[0189] 如根据上表1中列出的本发明的示例性抗IL-32抗体的分类明显看出的，本发明的示例性抗体为IgG3或IgG1类的，可能涉及在这些AIRE缺陷状态下调节性T细胞应答和/或上
皮细胞启动。由 等人,在Clin.Exp.Immunol.(2012)；doi:10.1111/cei.12024(其公
开内容通过引用并入到本文中)中所描述的在AIRE缺陷小鼠中发现的对应自身抗体的分类
证实了这些发现。因此，在本发明的一个优选实施方式中，本发明的抗体为IgG型，甚至更优
选地为IgG3或IgG1。
皮细胞启动。由 等人,在Clin.Exp.Immunol.(2012)；doi:10.1111/cei.12024(其公
开内容通过引用并入到本文中)中所描述的在AIRE缺陷小鼠中发现的对应自身抗体的分类
证实了这些发现。因此，在本发明的一个优选实施方式中，本发明的抗体为IgG型，甚至更优
选地为IgG3或IgG1。
[0190] IgG结构：
[0191] 轻链被分类为κ或λ(κ、λ)。每条重链类可以与κ或λ轻链结合。一般而言，轻链和重链相互共价结合，并且当免疫球蛋白是通过杂交瘤、B细胞或基因工程化宿主细胞生成的
时，两条重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键相互结合。在重链中，氨基酸序列从Y构
型的叉端处的N端持续到每条链的底部的C端。
时，两条重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键相互结合。在重链中，氨基酸序列从Y构
型的叉端处的N端持续到每条链的底部的C端。
[0192] 将轻链和重链二者分为结构和功能同源的区。功能性地使用术语“恒定”和“可变”。就这一点而言，将理解的是，轻链(VL)部分和重链(VH)部分的可变结构域都决定了抗原
的识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物
特性，诸如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随
着它们更加远离抗原结合位点或抗体的氨基端而增加。N端部分为可变区，而在C端部分处
为恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基端。
的识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物
特性，诸如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随
着它们更加远离抗原结合位点或抗体的氨基端而增加。N端部分为可变区，而在C端部分处
为恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基端。
[0193] 如上所述的，可变区允许抗体选择性地识别和特异性地结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域或者互补决定区(CDR)的子集相组合以形成限定三维抗原
结合位点的可变区。四元抗体结构形成存在于Y的每个臂的端部处的抗原结合位点。更具体
地，通过VH和VL链中的每个链上的三个CDR限定抗原结合位点。含有用以特异性地结合至本
发明的感兴趣分子的充足结构的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文中可互换地表示为“结
合片段”或“免疫特异性片段”。
结合位点的可变区。四元抗体结构形成存在于Y的每个臂的端部处的抗原结合位点。更具体
地，通过VH和VL链中的每个链上的三个CDR限定抗原结合位点。含有用以特异性地结合至本
发明的感兴趣分子的充足结构的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文中可互换地表示为“结
合片段”或“免疫特异性片段”。
[0194] 在天然存在的抗体中，抗体包括存在于每个抗原结合结构域中的有时被称为“互补决定区”或“CDR”的六个高变区，当抗体在液态(含水，aqueous)环境中呈现其三维构造
时，该述高变区为被特异性定位以形成抗原结合结构域的氨基酸的短的非连续序列。“CDR”
两侧有显示出较小的分子间可变性的四个相对保守的“框架”区或“FR”。框架区主要采用β
折叠构象，并且CDR形成连接β折叠构象或在一些情况下形成β折叠构象的一部分的环。因
此，框架区用于形成通过链间非共价相互作用在正确方位定位CDR的支架。由定位的CDR形
成的抗原结合结构域限定了与免疫反应抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与
其同源表位(cognate epitope)的非共价结合。针对任何给定的重链或轻链可变区，本领域
普通技术人员可以容易识别分别包括CDR和框架区的氨基酸，因为它们已被精确地定义；参
见“Sequences of Proteins of Immunological Interest,"Kabat,E.等人,
U.S.Department of Health and Human Services,(1983)；以及Chothia和Lesk,
J.Mol.Biol.196(1987),901-917，其全部内容通过引用并入到本文中。
时，该述高变区为被特异性定位以形成抗原结合结构域的氨基酸的短的非连续序列。“CDR”
两侧有显示出较小的分子间可变性的四个相对保守的“框架”区或“FR”。框架区主要采用β
折叠构象，并且CDR形成连接β折叠构象或在一些情况下形成β折叠构象的一部分的环。因
此，框架区用于形成通过链间非共价相互作用在正确方位定位CDR的支架。由定位的CDR形
成的抗原结合结构域限定了与免疫反应抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与
其同源表位(cognate epitope)的非共价结合。针对任何给定的重链或轻链可变区，本领域
普通技术人员可以容易识别分别包括CDR和框架区的氨基酸，因为它们已被精确地定义；参
见“Sequences of Proteins of Immunological Interest,"Kabat,E.等人,
U.S.Department of Health and Human Services,(1983)；以及Chothia和Lesk,
J.Mol.Biol.196(1987),901-917，其全部内容通过引用并入到本文中。
[0195] 在本领域内使用的和/或接受的术语存在两种或多种定义的情况下，除非明确说明与此相反，否则本文中使用的术语的定义意在包括所有这样的含义。一个具体的实例为
使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链和轻链多肽的可变区内都发现的非连续抗原
结合位点。Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of
Proteins of Immunological Interest"(1983)以及Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196
(1987),901-917已经描述了此特定区，上述文献通过引用并入到本文中，其中，当彼此相互
比较时，该定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，任一定义指代抗体或其变体的CDR的
应用意在落入如本文中所定义和使用的术语的范围内。在下表2中列出包含由上述引用的
参考文献中每一个定义的CDR的适当氨基酸残基，作为对比。包含特定CDR的确切残基编号
将根据CDR的序列和大小发生变化。本领域技术人员可以常规地确定在抗体的可变区氨基
酸序列给定的情况下哪些残基包括该抗体的人IgG亚型的特定高变区或CDR。
使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链和轻链多肽的可变区内都发现的非连续抗原
结合位点。Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of
Proteins of Immunological Interest"(1983)以及Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196
(1987),901-917已经描述了此特定区，上述文献通过引用并入到本文中，其中，当彼此相互
比较时，该定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，任一定义指代抗体或其变体的CDR的
应用意在落入如本文中所定义和使用的术语的范围内。在下表2中列出包含由上述引用的
参考文献中每一个定义的CDR的适当氨基酸残基，作为对比。包含特定CDR的确切残基编号
将根据CDR的序列和大小发生变化。本领域技术人员可以常规地确定在抗体的可变区氨基
酸序列给定的情况下哪些残基包括该抗体的人IgG亚型的特定高变区或CDR。
[0196] 表2：CDR定义1
[0197] Kabat Chothia
VHCDR1 31-35 26-32
VHCDR2 50-65 52-58
VHCDR3 95-102 95-102
VLCDR1 24-34 26-32
VLCDR2 50-56 50-52
VLCDR3 89-97 91-96
VHCDR1 31-35 26-32
VHCDR2 50-65 52-58
VHCDR3 95-102 95-102
VLCDR1 24-34 26-32
VLCDR2 50-56 50-52
VLCDR3 89-97 91-96
[0198] 1表2中所有CDR定义的编号依据由Kabat等人阐明的编号惯例(见下文)。
[0199] Kabat等人还定义了可以应用于任何抗体的针对可变结构域序列的编号系统。本领域的普通技术人员可以明确地将此“Kabat编号”系统分配给任何可变结构域序列，而不
依赖于超出序列本身的任何实验数据。如本文中所使用的，“Kabat编号”是指由Kabat等人
在U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence of Proteins of
Immunological Interest"(1983)中提出的编号系统。除非另有说明，否则提及的对本发明
的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中的特定氨基酸残基位置的编号依据Kabat编号
系统，然而Kabat编号系统是理论的并且可能不能同等地应用于本发明的每种抗体。例如，
根据第一CDR的位置，后面的CDR可能沿任一方向移动。
依赖于超出序列本身的任何实验数据。如本文中所使用的，“Kabat编号”是指由Kabat等人
在U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence of Proteins of
Immunological Interest"(1983)中提出的编号系统。除非另有说明，否则提及的对本发明
的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中的特定氨基酸残基位置的编号依据Kabat编号
系统，然而Kabat编号系统是理论的并且可能不能同等地应用于本发明的每种抗体。例如，
根据第一CDR的位置，后面的CDR可能沿任一方向移动。
[0200] 在一个实施方式中，本发明的抗体不是具有五价结构的IgM或其衍生物。特别地，在本发明的具体应用特别是治疗用途中，IgM不如IgG和其他二价抗体或对应结合分子有
用，因为由于IgM的五价结构和亲和力成熟不够，IgM经常表现出非特异性交叉反应性和非
常低的亲和力。
用，因为由于IgM的五价结构和亲和力成熟不够，IgM经常表现出非特异性交叉反应性和非
常低的亲和力。
[0201] 在一个特别优选的实施方式中，本发明的抗体不是多克隆抗体，即其基本上由一个特定抗体种类组成，而非从血浆免疫球蛋白样本获得的混合物。
[0202] 抗体片段，动物化：
[0203] 包括单链抗体的抗体片段可以包括单独的或与下述项中的全部或一部分组合的一个或多个可变区：铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域。本发明还包括与本发明的
感兴趣分子结合的片段，所述片段包括一个或多个可变区与铰链区、CH1结构域、CH2结构域
和CH3结构域的任何组合。与根据本发明的方法分离的单克隆抗体等同，特别是与人单克隆
抗体等同的本发明的抗体或其免疫特异性片段可来自包括鸟类和哺乳动物的任何动物源。
优选地，抗体为人抗体、鼠抗体、驴抗体、兔抗体、山羊抗体、豚鼠抗体、骆驼抗体、美洲驼
(llama)抗体、马抗体或鸡抗体。在另一个实施方式中，可变区可以为源中的软骨鱼类
(condricthoid)(例如来自鲨鱼)的。
感兴趣分子结合的片段，所述片段包括一个或多个可变区与铰链区、CH1结构域、CH2结构域
和CH3结构域的任何组合。与根据本发明的方法分离的单克隆抗体等同，特别是与人单克隆
抗体等同的本发明的抗体或其免疫特异性片段可来自包括鸟类和哺乳动物的任何动物源。
优选地，抗体为人抗体、鼠抗体、驴抗体、兔抗体、山羊抗体、豚鼠抗体、骆驼抗体、美洲驼
(llama)抗体、马抗体或鸡抗体。在另一个实施方式中，可变区可以为源中的软骨鱼类
(condricthoid)(例如来自鲨鱼)的。
[0204] 在本发明的一个特别优选的实施方式中，抗体为由人受试者克隆的天然存在的人单克隆抗体或其结合片段、衍生物和变体，其与本发明的特异IL-32同型，优选地与IL-32γ
特异性结合，如在上文和下文，例如表1、附图(特别是图1至4)中以及实施例(例如实施例2
和6中)中所详细限定的。
特异性结合，如在上文和下文，例如表1、附图(特别是图1至4)中以及实施例(例如实施例2
和6中)中所详细限定的。
[0205] 可选地，根据数据库中的相关人种系可变区序列来对准和采用人抗体的框架区；参见例如由MRC蛋白质工程中心(英国，剑桥大学)主办的Vbase(http://vbase.mrc-
cpe.cam.ac.uk/)。例如，被视为可能源自真正种系序列脱离的氨基酸可能是由于克隆过程
中引入的PCR引物序列。与人工生成的类人抗体(诸如来自噬菌体展示抗体库或异源小鼠的
单链抗体片段(scFv))相比，本发明的人单克隆抗体的特征在于：(i)使用人免疫反应而非
动物替代品的免疫反应获得，即在人体中响应于相关构象的天然IL-32同型而生成抗体；
(ii)保护个体免受或至少显著地最小化疾病例如SLE的症状的存在；以及(iii)因为该抗体
为人源性的，所以最小化了针对自身抗原的交叉反应性风险。因此，根据本发明，术语“人单
克隆抗体”、“人单克隆自身抗体”、“人抗体”等用于表示人源性的具有特定IL-32同型特异
性的IL-32结合分子，即该结合分子已经从人细胞(诸如B细胞)或其杂交瘤细胞分离出，或
者该结合分子的cDNA已经从人细胞(例如人记忆B细胞)的mRNA直接克隆出。人抗体仍然被
认为是“人类的”，即使在抗体中进行氨基酸替换，例如以提高其结合特性。
cpe.cam.ac.uk/)。例如，被视为可能源自真正种系序列脱离的氨基酸可能是由于克隆过程
中引入的PCR引物序列。与人工生成的类人抗体(诸如来自噬菌体展示抗体库或异源小鼠的
单链抗体片段(scFv))相比，本发明的人单克隆抗体的特征在于：(i)使用人免疫反应而非
动物替代品的免疫反应获得，即在人体中响应于相关构象的天然IL-32同型而生成抗体；
(ii)保护个体免受或至少显著地最小化疾病例如SLE的症状的存在；以及(iii)因为该抗体
为人源性的，所以最小化了针对自身抗原的交叉反应性风险。因此，根据本发明，术语“人单
克隆抗体”、“人单克隆自身抗体”、“人抗体”等用于表示人源性的具有特定IL-32同型特异
性的IL-32结合分子，即该结合分子已经从人细胞(诸如B细胞)或其杂交瘤细胞分离出，或
者该结合分子的cDNA已经从人细胞(例如人记忆B细胞)的mRNA直接克隆出。人抗体仍然被
认为是“人类的”，即使在抗体中进行氨基酸替换，例如以提高其结合特性。
[0206] 源自人免疫球蛋白库或来自针对一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物的且不表达内源免疫球蛋白的抗体，如下文以及例如Kucherlapati等人在美国专利第5939598号
中所描述的，表示类人抗体，以将其与本发明的真正人的抗体区分开。
中所描述的，表示类人抗体，以将其与本发明的真正人的抗体区分开。
[0207] 例如，类人抗体(诸如通常从噬菌体展示分离出的合成和半合成抗体)的重链和轻链的配对不一定反映如其出现于原始人B细胞中的原始配对。因此，从现有技术中通常使用
的重组表达文库中获得的Fab和scFv片段可以被视为是人工的，具有对免疫原性和稳定性
的所有可能相关的影响。
的重组表达文库中获得的Fab和scFv片段可以被视为是人工的，具有对免疫原性和稳定性
的所有可能相关的影响。
[0208] 相比之下，本发明提供从所选人受试者分离的亲和力成熟的抗体，其特征在于它们的治疗功效。
[0209] 移植抗体(grafted antibody)(等同物)
[0210] 本发明还涉及含有分别源自本发明的抗体(诸如IL-32抗体)的CDR的移植抗体(可互换地称为等同物)。这样的移植CDR包括动物源化抗体，其中已移植有来自本发明的抗体
的CDR或其中移植有含有一个或多个氨基酸替换的CDR。CDR可以被直接移植到如上所述的
人框架或来自动物源的抗体框架中。若需要，还可以通过生成框架库并入框架变化。如下面
更详细地描述的，CDR和/或框架序列的优化可以单独地执行并按顺序组合，或者可以同时
执行。
的CDR或其中移植有含有一个或多个氨基酸替换的CDR。CDR可以被直接移植到如上所述的
人框架或来自动物源的抗体框架中。若需要，还可以通过生成框架库并入框架变化。如下面
更详细地描述的，CDR和/或框架序列的优化可以单独地执行并按顺序组合，或者可以同时
执行。
[0211] 为了生成移植抗体，本发明的抗体的供体CDR被移植到抗体受体可变区框架上。前面已经描述了用于移植抗体和生成CDR变体以优化活性的方法(参见，例如，国际专利申请
WO 98/33919；WO 00/78815；WO 01/27160)。可以执行该程序以同时地实现供体CDR的移植
和亲和力重新获取。同样地，可以单独或与CDR移植组合地使用该方法，以改进或优化可变
区的结合亲和力。用于将供体CDR结合亲和力赋予到受体可变区上的方法适用于重链以及
轻链可变区两者，并因此可用于同时移植和优化抗体可变区的结合亲和力。
WO 98/33919；WO 00/78815；WO 01/27160)。可以执行该程序以同时地实现供体CDR的移植
和亲和力重新获取。同样地，可以单独或与CDR移植组合地使用该方法，以改进或优化可变
区的结合亲和力。用于将供体CDR结合亲和力赋予到受体可变区上的方法适用于重链以及
轻链可变区两者，并因此可用于同时移植和优化抗体可变区的结合亲和力。
[0212] 可将供体CDR改变为在供体CDR内的所有或所选定位置处包含多个不同氨基酸残基变化。例如，二十种天然存在的氨基酸残基的随机或倾向性(biased)合并或预选子集可
以被引入到供体CDR中，以产生CDR种类的不同群。将CDR变体种类包含到可变区的不同群中
允许生成针对预定抗原展现出优化的结合亲和力的变体种类。可以在供体CDR位置进行一
系列可能改变。可被选择用于改变的上述可能改变中的一些或全部可以被引入到移植供体
CDR群中。可以选择CDR中的单个位置以引入改变，或者可以针对活性组合和筛选具有改变
的氨基酸的各种位置。
以被引入到供体CDR中，以产生CDR种类的不同群。将CDR变体种类包含到可变区的不同群中
允许生成针对预定抗原展现出优化的结合亲和力的变体种类。可以在供体CDR位置进行一
系列可能改变。可被选择用于改变的上述可能改变中的一些或全部可以被引入到移植供体
CDR群中。可以选择CDR中的单个位置以引入改变，或者可以针对活性组合和筛选具有改变
的氨基酸的各种位置。
[0213] 一种方法是通过在每个位置用例如所有二十种天然存在的氨基酸进行替换来沿着CDR改变所有的氨基酸位置。每个位置的替换可以在其他供体CDR氨基酸位置的环境中发
生，使得CDR的重要部分保持真实供体CDR序列并和因此保持供体CDR的结合亲和力。例如，
受体可变区框架——无论是原生的或改变的框架——可以移植有在CDR内的每个位置处包
含单个位置替换的CDR群。同样地，受体可变区框架可以作为目标用于移植有包含一个以上
变化的位置的CDR群，以并入所有20种氨基酸残基或氨基酸子集。待移植的一个CDR或一组
CDR内的一个或多个氨基酸位置可以被改变并移植到受体可变区框架中，以生成移植抗体
群。要理解的是，若需要，具有一个或多个改变位置的CDR可以与具有一个或多个改变位置
的一个或多个其他CDR相组合。
生，使得CDR的重要部分保持真实供体CDR序列并和因此保持供体CDR的结合亲和力。例如，
受体可变区框架——无论是原生的或改变的框架——可以移植有在CDR内的每个位置处包
含单个位置替换的CDR群。同样地，受体可变区框架可以作为目标用于移植有包含一个以上
变化的位置的CDR群，以并入所有20种氨基酸残基或氨基酸子集。待移植的一个CDR或一组
CDR内的一个或多个氨基酸位置可以被改变并移植到受体可变区框架中，以生成移植抗体
群。要理解的是，若需要，具有一个或多个改变位置的CDR可以与具有一个或多个改变位置
的一个或多个其他CDR相组合。
[0214] 具有一个或多个改变位置的CDR变体种类群可以与构成可变区的结合口袋(binding pocket)的任何或所有CDR组合。因此，受体可变区框架可以作为目标用于在重链
或轻链中的一个、两个或所有三个受体CDR位置处同时并入供体CDR变体群。对具有氨基酸
位置改变的作为目标的CDR是哪个CDR或其数量的选择将取决于例如，是否需要将完整CDR
移植到受体中，或者该方法是否是为了优化亲和力而执行的。
或轻链中的一个、两个或所有三个受体CDR位置处同时并入供体CDR变体群。对具有氨基酸
位置改变的作为目标的CDR是哪个CDR或其数量的选择将取决于例如，是否需要将完整CDR
移植到受体中，或者该方法是否是为了优化亲和力而执行的。
[0215] 用于选择要改变的供体CDR氨基酸以用于将供体CDR结合亲和力赋予到抗体受体可变区框架上的另一种方法是选择高度可变的已知的或可容易鉴定的CDR位置。例如，可变
区CDR3通常是高度可变的。因此，该区可以选择性地作为目标用于移植程序中的氨基酸位
置改变，以单独地或连同相关受体可变框架改变一起确保结合亲和力再获取或增大。
区CDR3通常是高度可变的。因此，该区可以选择性地作为目标用于移植程序中的氨基酸位
置改变，以单独地或连同相关受体可变框架改变一起确保结合亲和力再获取或增大。
[0216] 鼠源化抗体：
[0217] 通过如上所述的移植生成的抗体的实例为鼠源化抗体。如本文中所使用的，术语“鼠源化抗体”或“鼠源化免疫球蛋白”是指一种抗体，其包括来自本发明的人抗体的一个或
多个CDR；以及包含基于小鼠抗体序列的氨基酸替换和/或缺失和/或插入的人框架区。提供
CDR的人免疫球蛋白被称为“亲本”或“受体”，而提供框架改变的小鼠抗体被称为“供体”。恒
定区无需存在，但如果恒定区存在，其通常与小鼠抗体恒定区基本相同，即至少约85-90％、
优选地约95％或更多的相同。因此，在一些实施方式中，全长鼠源化人重链或轻链免疫球蛋
白包含小鼠恒定区、人CDR以及具有多个“鼠源化”氨基酸替换的基本上人的框架。通常地，
“鼠源化抗体”为包含鼠源化可变轻链和/或鼠源化可变重链的抗体。例如，鼠源化抗体并不
包含例如典型的嵌合抗体，例如因为嵌合抗体的整个可变区是非小鼠的。已通过“鼠源化”
过程“鼠源化”的已修饰抗体结合至与提供CDR的亲本抗体相同的抗原，并且与亲本抗体相
比，该已修饰抗体在小鼠中的免疫原性通常较低。
多个CDR；以及包含基于小鼠抗体序列的氨基酸替换和/或缺失和/或插入的人框架区。提供
CDR的人免疫球蛋白被称为“亲本”或“受体”，而提供框架改变的小鼠抗体被称为“供体”。恒
定区无需存在，但如果恒定区存在，其通常与小鼠抗体恒定区基本相同，即至少约85-90％、
优选地约95％或更多的相同。因此，在一些实施方式中，全长鼠源化人重链或轻链免疫球蛋
白包含小鼠恒定区、人CDR以及具有多个“鼠源化”氨基酸替换的基本上人的框架。通常地，
“鼠源化抗体”为包含鼠源化可变轻链和/或鼠源化可变重链的抗体。例如，鼠源化抗体并不
包含例如典型的嵌合抗体，例如因为嵌合抗体的整个可变区是非小鼠的。已通过“鼠源化”
过程“鼠源化”的已修饰抗体结合至与提供CDR的亲本抗体相同的抗原，并且与亲本抗体相
比，该已修饰抗体在小鼠中的免疫原性通常较低。
[0218] 抗体片段：
[0219] 如本文中所使用的，术语“重链部分”包括源自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包括以下中的至少一种：CH1结构域、铰链(例如，上部、中部和/或下部铰
链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、或者其变体或片段。例如，本发明中使用的结合多肽
可以包括包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、和CH2结构
域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一
部分、以及CH3结构域的多肽链；或包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域、
以及CH3结构域的多肽链。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括包含CH3结构域的多肽
链。此外，本发明中使用的结合多肽可以缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的
全部或一部分)。如上所述，本领域普通技术人员将理解，可以修饰这些结构域(例如，重链
部分)，使得它们的氨基酸序列不同于天然存在的免疫球蛋白分子。
链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、或者其变体或片段。例如，本发明中使用的结合多肽
可以包括包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、和CH2结构
域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一
部分、以及CH3结构域的多肽链；或包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域、
以及CH3结构域的多肽链。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括包含CH3结构域的多肽
链。此外，本发明中使用的结合多肽可以缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的
全部或一部分)。如上所述，本领域普通技术人员将理解，可以修饰这些结构域(例如，重链
部分)，使得它们的氨基酸序列不同于天然存在的免疫球蛋白分子。
[0220] 在本文中公开的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一个多肽链的重链部分与该多聚体的第二多肽链的重链部分相同。可替换地，本发明的含有重链
部分的单体不相同。例如，每种单体可包含不同的靶结合位点，从而形成例如双特异性抗体
或双抗体。
部分的单体不相同。例如，每种单体可包含不同的靶结合位点，从而形成例如双特异性抗体
或双抗体。
[0221] 在另一个实施方式中，本文中公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物由单一多肽链(诸如scFv)组成，并且在细胞内表达(胞内抗体)用于可能的体内治疗和诊断应
用。
用。
[0222] 本文中公开的用于诊断和治疗方法的结合多肽重链部分可源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链
区。在另一个实例中，重链部分可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。
在另一个实例中，重链部分可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链。
区。在另一个实例中，重链部分可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。
在另一个实例中，重链部分可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链。
[0223] 因此，也如实施例中所例示的，在一个实施方式中，本发明的抗体的恒定区或其一部分——特别是CH2结构域和/或CH3结构域，但可选地也可以是CH1结构域——与根据本发
明的方法所分离的原生人单克隆抗体的可变区异源。在这种情况下，一种或多种该异源恒
定区在本发明的抗体的治疗应用的情况中，优选为人源的，而在动物研究的情况中，也可以
是例如啮齿动物源的；同样参见实施例。
明的方法所分离的原生人单克隆抗体的可变区异源。在这种情况下，一种或多种该异源恒
定区在本发明的抗体的治疗应用的情况中，优选为人源的，而在动物研究的情况中，也可以
是例如啮齿动物源的；同样参见实施例。
[0224] 如本文所使用的，术语“轻链部分”包括源自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，轻链部分包括VL结构域或CL结构域中的至少一种。
[0225] 如先前所指出的，各种免疫球蛋白类的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。如本文所使用的，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基端可变结构域，而术语
“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(主要为氨基端)恒定区结构域。CH1结构域毗邻VH
结构域，并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基端。
“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(主要为氨基端)恒定区结构域。CH1结构域毗邻VH
结构域，并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基端。
[0226] 如本文所使用的，术语“CH2结构域”包括利用传统编号方案(残基244至360，kabat编号系统；以及残基231-340，EU编号系统，参见Kabat EA等人，同前)的例如从抗体的约残
基244延伸至残基360的重链分子的部分。CH2结构域的独特之处在于它不与另一结构域紧
密配对。相反地，在完整的原生IgG分子的两个CH2结构域之间插入两个N-连接分支糖链。有
据可查的是，CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C端，并且包含约108个残基。
基244延伸至残基360的重链分子的部分。CH2结构域的独特之处在于它不与另一结构域紧
密配对。相反地，在完整的原生IgG分子的两个CH2结构域之间插入两个N-连接分支糖链。有
据可查的是，CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C端，并且包含约108个残基。
[0227] 如本文所使用的，术语“铰链区”包括将CH1结构域接合至CH2结构域的重链分子的部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，从而允许两个N端抗原结合区独立地移动。
铰链区可以细分为三个不同的结构域：上部、中部以及下部铰链结构域；参见Roux等人,
J.Immunol.161(1998),4083。
铰链区可以细分为三个不同的结构域：上部、中部以及下部铰链结构域；参见Roux等人,
J.Immunol.161(1998),4083。
[0228] 如本文所使用的，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以与第二硫醇基形成二硫键或桥的硫醇基。在多数天然存在的IgG分子中，CH1
区和CL区通过二硫键连接，并且两条重链通过两个二硫键在与使用Kabat编号系统的239和
242(位置226或229，EU编号系统)相对应的位置处连接。
区和CL区通过二硫键连接，并且两条重链通过两个二硫键在与使用Kabat编号系统的239和
242(位置226或229，EU编号系统)相对应的位置处连接。
[0229] 如本文所使用的，术语“连接的”，“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指两种或更多种元件(要素)或组分通过包括化学偶联或重组方式在内的任何方式连接在一起。
“框内融合”是指两个或多个多核苷酸的开放阅读框(ORF)连接(以保持原始ORF的正确翻译
阅读框的方式)形成连续的较长ORF。因此，重组融合蛋白是含有与由原始ORF编码的多肽相
对应的两个或更多个段(这些段通常实际上并不如此连接)的单种蛋白。虽然由此阅读框在
整个融合段连续形成，这些段可以通过例如框内连接序列在物理上或空间上分开。例如，对
免疫球蛋白可变区的CDR编码的多核苷酸可以在框内被融合，但通过对至少一个免疫球蛋
白框架区或其他CDR区编码的多核苷酸而分开，只要“融合的”CDR被共同翻译作为连续多肽
的一部分即可。因此，在一个实施方式中，多核苷酸是对可变区和至少一部分恒定结构域编
码的cDNA。在一个实施方式中，多核苷酸是对本文中定义的本发明的抗体的可变区和恒定
结构域编码的cDNA。
“框内融合”是指两个或多个多核苷酸的开放阅读框(ORF)连接(以保持原始ORF的正确翻译
阅读框的方式)形成连续的较长ORF。因此，重组融合蛋白是含有与由原始ORF编码的多肽相
对应的两个或更多个段(这些段通常实际上并不如此连接)的单种蛋白。虽然由此阅读框在
整个融合段连续形成，这些段可以通过例如框内连接序列在物理上或空间上分开。例如，对
免疫球蛋白可变区的CDR编码的多核苷酸可以在框内被融合，但通过对至少一个免疫球蛋
白框架区或其他CDR区编码的多核苷酸而分开，只要“融合的”CDR被共同翻译作为连续多肽
的一部分即可。因此，在一个实施方式中，多核苷酸是对可变区和至少一部分恒定结构域编
码的cDNA。在一个实施方式中，多核苷酸是对本文中定义的本发明的抗体的可变区和恒定
结构域编码的cDNA。
[0230] 表位：
[0231] 抗体的肽或多肽表位的最小大小被认为是约四至五个氨基酸。肽或多肽表位优选地包含至少七个、更优选地至少九个以及最优选地在至少约15个至约30个之间的氨基酸。
因为CDR可以识别其三级形式的抗原肽或多肽，所以包含表位的氨基酸不需要是连续的，并
且在一些情况下，甚至可以不处于相同的肽链上。在本发明中，通过本发明的抗体所识别的
肽或多肽表位包含本发明的感兴趣分子的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个，更优选地
至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、在约15个至约30个之间或在
约30个至约50个之间的连续或非连续氨基酸(即至少一种IL-32同型)的序列，或在抗体识
别不止一种同型的情况下的其他IL-32同型的同源序列。
因为CDR可以识别其三级形式的抗原肽或多肽，所以包含表位的氨基酸不需要是连续的，并
且在一些情况下，甚至可以不处于相同的肽链上。在本发明中，通过本发明的抗体所识别的
肽或多肽表位包含本发明的感兴趣分子的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个，更优选地
至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、在约15个至约30个之间或在
约30个至约50个之间的连续或非连续氨基酸(即至少一种IL-32同型)的序列，或在抗体识
别不止一种同型的情况下的其他IL-32同型的同源序列。
[0232] 结合特性：
[0233] 本文中互换使用的“结合”或“识别”通常是指：结合分子(例如抗体)通过其抗原结合结构域结合至预定表位；以及该结合引起抗原结合结构域与表位之间的一些互补性。根
据该定义，认为当抗体结合至表位时，与抗体与随机不相关的表位结合相比，该抗体通过其
抗原结合结构域“特异性结合”至该表位更加容易。术语“特异性”在本文中用于限定由某一
抗体与某一表位结合的相对亲和力。例如，可以认为对给定表位来说抗体“A”比抗体“B”有
更高特异性，或者可以说抗体“A”以比其对相关表位“D”的特异性更高的特异性结合至表位
“C”。无关表位通常是非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白、或任何其他指定多肽)的一部分，其
可以用于评估给定结合分子的结合特异性。在这一方面，术语“特异性结合”是指抗体以比
与非特异性抗原结合的KD低至少两倍的KD与预定抗原结合。如本文中所用的术语“高度特异
性”结合是指抗体对特异性靶抗原的相对KD比该抗体与其他配体结合的KD低至少十倍。
据该定义，认为当抗体结合至表位时，与抗体与随机不相关的表位结合相比，该抗体通过其
抗原结合结构域“特异性结合”至该表位更加容易。术语“特异性”在本文中用于限定由某一
抗体与某一表位结合的相对亲和力。例如，可以认为对给定表位来说抗体“A”比抗体“B”有
更高特异性，或者可以说抗体“A”以比其对相关表位“D”的特异性更高的特异性结合至表位
“C”。无关表位通常是非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白、或任何其他指定多肽)的一部分，其
可以用于评估给定结合分子的结合特异性。在这一方面，术语“特异性结合”是指抗体以比
与非特异性抗原结合的KD低至少两倍的KD与预定抗原结合。如本文中所用的术语“高度特异
性”结合是指抗体对特异性靶抗原的相对KD比该抗体与其他配体结合的KD低至少十倍。
[0234] 若存在，抗体与抗原的所有语法形式的术语“免疫球蛋白结合特性”或其他结合特性是指抗体的特异性、亲和力、交叉反应性和其他结合特性。
[0235] “优先结合”意指结合分子例如抗体特异性结合至表位比该抗体结合至相关、相似、同源或类似表位更加容易。因此，与和相关表位结合相比，“优先结合”至给定表位的抗
体更可能结合至该给定表位，即便这样的抗体可能与所述相关表位交叉反应。关于特定抗
原，诸如特异性IL-32同型，术语“优先结合”意指结合分子例如抗体特异性结合至IL-32同
型比该抗体结合至相关、相似、同源或类似IL-32同型更加容易。
体更可能结合至该给定表位，即便这样的抗体可能与所述相关表位交叉反应。关于特定抗
原，诸如特异性IL-32同型，术语“优先结合”意指结合分子例如抗体特异性结合至IL-32同
型比该抗体结合至相关、相似、同源或类似IL-32同型更加容易。
[0236] 通过非限制性实例，如果结合分子例如抗体以比该抗体对第二表位的离解常数(KD)低的KD结合第一表位，那么可以视为该结合分子优先结合所述第一表位。在另一个非限
制性实例中，如果抗体以比该抗体对第二表位的KD低至少一个数量级的亲和力结合第一表
位，那么可以视为该抗体优先结合所述第一表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体以比
该抗体对第二表位的KD低至少两个数量级的亲和力结合第一表位，那么可以视为该抗体优
先结合所述第一表位。
制性实例中，如果抗体以比该抗体对第二表位的KD低至少一个数量级的亲和力结合第一表
位，那么可以视为该抗体优先结合所述第一表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体以比
该抗体对第二表位的KD低至少两个数量级的亲和力结合第一表位，那么可以视为该抗体优
先结合所述第一表位。
[0237] 在另一个非限制性实例中，如果结合分子例如抗体以比该抗体对第二表位的解离率(k(off))低的k(off)结合第一表位，那么可以视为该结合分子优先结合所述第一表位。
在另一个非限制性实例中，如果抗体以比该抗体对第二表位的k(off)低至少一个数量级的
亲和力结合第一表位，那么可以视为该抗体优先结合所述第一表位。在另一个非限制性实
例中，如果抗体以比该抗体对第二表位的k(off)低至少两个数量级的亲和力结合第一表
位，那么可以视为该抗体优先结合所述第一表位。
在另一个非限制性实例中，如果抗体以比该抗体对第二表位的k(off)低至少一个数量级的
亲和力结合第一表位，那么可以视为该抗体优先结合所述第一表位。在另一个非限制性实
例中，如果抗体以比该抗体对第二表位的k(off)低至少两个数量级的亲和力结合第一表
位，那么可以视为该抗体优先结合所述第一表位。
[0238] 本文中所公开的结合分子，例如抗体或抗原结合片段、变体或衍生物，可被认为以低于或等于5×10-2秒-1、10-2秒-1、5×l0-3秒-1或l0-3秒-1的解离率(k(off))与本发明的感兴
趣分子、其片段或变体结合。更优选地，本发明抗体可被认为以低于或等于5×10-4秒-1、10-4
秒-1、5×10-5秒-1或10-5秒-1、5×10-6秒-1、10-6秒-1、5×10-7秒-1或10-7秒-1的解离率(k(off))
与本发明的感兴趣分子、其片段或变体结合。
趣分子、其片段或变体结合。更优选地，本发明抗体可被认为以低于或等于5×10-4秒-1、10-4
秒-1、5×10-5秒-1或10-5秒-1、5×10-6秒-1、10-6秒-1、5×10-7秒-1或10-7秒-1的解离率(k(off))
与本发明的感兴趣分子、其片段或变体结合。
[0239] 本文中公开的结合分子，例如抗体或抗原结合片段、变体或衍生物，可被认为以大于或等于103M-1秒-1、5×103M-1秒-1、104M-1秒-1或5×104M-1秒-1的结合率(on rate)(k(on))与
本发明的感兴趣分子、其片段或变体结合。更优选地，本发明的抗体可被认为以大于或等于
105M-1秒-1、5×105M-1秒-1、106M-1秒-1或5×106M-1秒-1或107M-1秒-1的结合率(k(on))与本发明
的感兴趣分子、其片段或变体结合。
本发明的感兴趣分子、其片段或变体结合。更优选地，本发明的抗体可被认为以大于或等于
105M-1秒-1、5×105M-1秒-1、106M-1秒-1或5×106M-1秒-1或107M-1秒-1的结合率(k(on))与本发明
的感兴趣分子、其片段或变体结合。
[0240] 如果结合分子例如抗体优先结合给定表位至在一定程度上阻止参考抗体与该表位的结合，那么认为该抗体竞争性抑制该参考抗体与该给定表位的结合。竞争性抑制可以
通过本领域已知的任何方法(例如竞争ELISA测定)确定。抗体可被认为竞争性抑制了参考
抗体与给定表位的结合，至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、或至少50％。
通过本领域已知的任何方法(例如竞争ELISA测定)确定。抗体可被认为竞争性抑制了参考
抗体与给定表位的结合，至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、或至少50％。
[0241] 如本文中所使用的，术语“亲和力”是指单个表位与结合分子(例如免疫球蛋白分子)的CDR的结合强度的度量；参见，例如Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,
冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),2nd ed.(1988)第27-28
页。如本文中所使用的，术语“亲合力(avidity)”是指免疫球蛋白群与抗原之间的复合物的
总体稳定性，也就是说，免疫球蛋白混合物与抗原的功能组合强度；参见例如Harlow第29-
34页。亲合力与群中各免疫球蛋白分子与特异性表位的亲和力以及免疫球蛋白和抗原的化
合价都有关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构的抗原(诸如聚合物)之间的
相互作用可以是高亲合力中的一种。可以使用任何合适的方法经实验确定抗体对抗原的亲
和力或亲合力；参见，例如Berzofsky等人,"Antibody-Antigen Interactions"In
Fundamental Immunology,Paul,W.E.编,Raven Press New York,N Y(1984)和Kuby,Janis
Immunology,W.H.Freeman and Company New York,N Y(1992)，以及其中描述的方法。用于
测量抗体对抗原的亲和力的常规技术包括ELISA、RIA和表面等离子体共振法。如果在不同
的条件(例如盐浓度、pH)下进行测量，那么所测量的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可变
化。因此，优选地利用抗体和抗原的标准溶液以及标准缓冲液来进行对亲和力和其他抗原
结合参数(例如KD、IC50)的测量。
冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),2nd ed.(1988)第27-28
页。如本文中所使用的，术语“亲合力(avidity)”是指免疫球蛋白群与抗原之间的复合物的
总体稳定性，也就是说，免疫球蛋白混合物与抗原的功能组合强度；参见例如Harlow第29-
34页。亲合力与群中各免疫球蛋白分子与特异性表位的亲和力以及免疫球蛋白和抗原的化
合价都有关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构的抗原(诸如聚合物)之间的
相互作用可以是高亲合力中的一种。可以使用任何合适的方法经实验确定抗体对抗原的亲
和力或亲合力；参见，例如Berzofsky等人,"Antibody-Antigen Interactions"In
Fundamental Immunology,Paul,W.E.编,Raven Press New York,N Y(1984)和Kuby,Janis
Immunology,W.H.Freeman and Company New York,N Y(1992)，以及其中描述的方法。用于
测量抗体对抗原的亲和力的常规技术包括ELISA、RIA和表面等离子体共振法。如果在不同
的条件(例如盐浓度、pH)下进行测量，那么所测量的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可变
化。因此，优选地利用抗体和抗原的标准溶液以及标准缓冲液来进行对亲和力和其他抗原
结合参数(例如KD、IC50)的测量。
[0242] 本发明的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，也可以根据其交叉反应性来进行描述或具体化。如本文所使用的，术语“交叉反应性”是指对一种抗原特异
性的抗体与第二抗原反应的能力；即两种不同的抗原物质之间的相关性的度量。因此，如果
抗体与诱导其形成的那个表位不同的表位结合，那么该抗体是交叉反应性的。交叉反应性
表位通常含有许多相同的互补结构特征作为诱导表位，并且在一些情况下，实际上可能比
原来的更加适合。
性的抗体与第二抗原反应的能力；即两种不同的抗原物质之间的相关性的度量。因此，如果
抗体与诱导其形成的那个表位不同的表位结合，那么该抗体是交叉反应性的。交叉反应性
表位通常含有许多相同的互补结构特征作为诱导表位，并且在一些情况下，实际上可能比
原来的更加适合。
[0243] 例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，原因在于它们结合相关但不相同的表位，例如，具有与参考表位至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少
70％、至少65％、至少60％、至少55％、以及至少50％的同一性(如使用本领域已知的和本文
所描述的方法计算的)的表位。如果抗体不与具有与参考表位低于95％、低于90％、低于
85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％以及低于50％的同一
性(如使用本领域中已知和本文中所描述的方法计算出的)的表位结合，那么可认为该抗体
具有较小或没有交叉反应性。如果抗体不与某一表位的任何其他类似物、直系同源物或同
系物结合，那么可以认为该抗体对该表位“高度特异性”。
70％、至少65％、至少60％、至少55％、以及至少50％的同一性(如使用本领域已知的和本文
所描述的方法计算的)的表位。如果抗体不与具有与参考表位低于95％、低于90％、低于
85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％以及低于50％的同一
性(如使用本领域中已知和本文中所描述的方法计算出的)的表位结合，那么可认为该抗体
具有较小或没有交叉反应性。如果抗体不与某一表位的任何其他类似物、直系同源物或同
系物结合，那么可以认为该抗体对该表位“高度特异性”。
[0244] 本发明的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，也可以根据其与本发明的感兴趣分子的结合亲和力来进行描述或具体化。优选的结合亲和力包括解离常数
或KD低于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-
12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的那些结合亲和力。通常，抗体以10-7M或更低的解离常数(KD)与其预定抗原结合。优选地，抗体以10-9M或更低的解离
-11
常数(KD)和还更加优选地以10 M或更低的解离常数(KD)与其同源抗原结合。
或KD低于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-
12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的那些结合亲和力。通常，抗体以10-7M或更低的解离常数(KD)与其预定抗原结合。优选地，抗体以10-9M或更低的解离
-11
常数(KD)和还更加优选地以10 M或更低的解离常数(KD)与其同源抗原结合。
[0245] 抗体的修饰：
[0246] 可进一步修饰免疫球蛋白或其编码cDNA。因此，在又一个实施方式中，本发明的方法包括产生嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段、双特异抗体、融合抗体、标记抗体或
这些中任一种的类似物的一个或多个步骤中的任一个步骤。相应方法对于本领域技术人员
是已知的，并且例如在Harlow和Lane的"Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,
Cold Spring Harbor,1988中进行了描述。当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物
时，BIAcore系统中采用的表面等离子体共振法可以用于增加与和由本发明提供的抗体中
任一种的表位相同的表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier,Human Antibodies
Hybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。例如，在
国际申请WO89/09622中描述了嵌合抗体的产生。例如，欧洲申请EP-A10239400和国际申请
WO90/07861中描述了用于产生人源化抗体的方法。按照本发明要利用的抗体的其他来源是
所谓的异种抗体。例如，国际申请WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096和WO96/33735中描
述了用于在小鼠中产生异种抗体(例如人抗体)的一般原理。如上所述，除了完全抗体之外，
本发明的抗体还可以以各种形式存在，包括例如Fv、Fab和F(ab)2、以及单链；参见例如国际
申请WO88/09344。
这些中任一种的类似物的一个或多个步骤中的任一个步骤。相应方法对于本领域技术人员
是已知的，并且例如在Harlow和Lane的"Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,
Cold Spring Harbor,1988中进行了描述。当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物
时，BIAcore系统中采用的表面等离子体共振法可以用于增加与和由本发明提供的抗体中
任一种的表位相同的表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier,Human Antibodies
Hybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。例如，在
国际申请WO89/09622中描述了嵌合抗体的产生。例如，欧洲申请EP-A10239400和国际申请
WO90/07861中描述了用于产生人源化抗体的方法。按照本发明要利用的抗体的其他来源是
所谓的异种抗体。例如，国际申请WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096和WO96/33735中描
述了用于在小鼠中产生异种抗体(例如人抗体)的一般原理。如上所述，除了完全抗体之外，
本发明的抗体还可以以各种形式存在，包括例如Fv、Fab和F(ab)2、以及单链；参见例如国际
申请WO88/09344。
[0247] 使用本领域已知的传统技术(例如，通过单独地或组合地使用本领域已知的氨基酸的一个或多个缺失、一个或多个插入、一个或多个替换、一个或多个添加和/或一个或多
个重组和/或一个或多个其他修饰)可以进一步修饰本发明的抗体或其对应的一种或多种
免疫球蛋白链。用于在免疫球蛋白链的氨基酸序列所基于的DNA序列中引入这种修饰的方
法对于本领域技术人员而言是熟知的；参见，例如，Sambrook,Molecular Cloning A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel,Current
Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley
Interscience,N.Y.(1994)。本发明的抗体的修饰包括在一个或多个组成氨基酸处的化学
和/或酶衍生化，包括：侧链修饰；主链修饰；以及N端和C端修饰，包括乙酰化、羟基化、甲基
化、酰胺化以及碳水化合物或脂质部分、辅因子等的附着。同样地，本发明包括嵌合蛋白的
产生，该嵌合蛋白包括在氨基端融合至异源分子(诸如标记物或药物)的所描述的抗体或其
一些片段。以此方式生成的抗原结合分子可以用于将药物分别定位至表达患病细胞和组织
的适当表面结构的细胞。这种对细胞的靶向和结合可以有助于治疗或诊断活性剂的递送以
及基因治疗/基因递送。具有本发明的抗体的分子/颗粒会特异性结合至表达特定的感兴趣
抗原的细胞/组织，并因此可以具有诊断和治疗用途。
个重组和/或一个或多个其他修饰)可以进一步修饰本发明的抗体或其对应的一种或多种
免疫球蛋白链。用于在免疫球蛋白链的氨基酸序列所基于的DNA序列中引入这种修饰的方
法对于本领域技术人员而言是熟知的；参见，例如，Sambrook,Molecular Cloning A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel,Current
Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley
Interscience,N.Y.(1994)。本发明的抗体的修饰包括在一个或多个组成氨基酸处的化学
和/或酶衍生化，包括：侧链修饰；主链修饰；以及N端和C端修饰，包括乙酰化、羟基化、甲基
化、酰胺化以及碳水化合物或脂质部分、辅因子等的附着。同样地，本发明包括嵌合蛋白的
产生，该嵌合蛋白包括在氨基端融合至异源分子(诸如标记物或药物)的所描述的抗体或其
一些片段。以此方式生成的抗原结合分子可以用于将药物分别定位至表达患病细胞和组织
的适当表面结构的细胞。这种对细胞的靶向和结合可以有助于治疗或诊断活性剂的递送以
及基因治疗/基因递送。具有本发明的抗体的分子/颗粒会特异性结合至表达特定的感兴趣
抗原的细胞/组织，并因此可以具有诊断和治疗用途。
[0248] 样本/样品：
[0249] 如本文所使用的，术语“样本/样品”或“生物样本/样品”是指从受试者或患者获得的任何生物材料。在一个方面中，样本可以包括血液、脑脊髓液(“CSF”)或尿液。在其他方面
中，样本可以包括全血、血浆、由外周血富集的单核细胞(PBMC)(诸如淋巴细胞(即T细胞，NK
细胞或B-细胞)、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜碱细胞)以及培养的细胞(例如，来自受
试者的B细胞)。样本还可以包括活检或组织样本(包括肿瘤组织)。在又一些其他方面中，样
本可以包括全细胞和/或该细胞的裂解物。在一个实施方式中，样本包含外周血单核细胞
(PBMC)。可以通过本领域已知的方法收集样本。
中，样本可以包括全血、血浆、由外周血富集的单核细胞(PBMC)(诸如淋巴细胞(即T细胞，NK
细胞或B-细胞)、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜碱细胞)以及培养的细胞(例如，来自受
试者的B细胞)。样本还可以包括活检或组织样本(包括肿瘤组织)。在又一些其他方面中，样
本可以包括全细胞和/或该细胞的裂解物。在一个实施方式中，样本包含外周血单核细胞
(PBMC)。可以通过本领域已知的方法收集样本。
[0250] 抗IL-32抗体的鉴定、对应B细胞的分离和抗IL-32抗体的重组表达
[0251] 通常可以按国际申请WO2013/098419 A1和WO2013/098420 A1中所描述的执行对特异性于本发明的抗IL-32抗体的B细胞(如表1中所列出的以及如关于IL-32γ同型所例示
的)的鉴定和显示出感兴趣特异性及抗体重组表达和功能特征的抗体的分子克隆；参见上
述国际申请中的实施例部分，特别是WO2013/098419 A1第118-120页的实施例1和2以及
WO2013/098420 A1第27-31页的实施例1至4，其公开内容通过引用并入到本文中。
的)的鉴定和显示出感兴趣特异性及抗体重组表达和功能特征的抗体的分子克隆；参见上
述国际申请中的实施例部分，特别是WO2013/098419 A1第118-120页的实施例1和2以及
WO2013/098420 A1第27-31页的实施例1至4，其公开内容通过引用并入到本文中。
[0252] 简言之，在本发明的一个实施方式中，如该实施例所描述的，培养单个或寡克隆B细胞的培养物，并且针对特异性于一种或多种IL-32同型的抗体的存在和亲和力对包含由
所述B细胞产生的抗体的培养物的上清液进行筛选。在另一个实施方式中，首先针对抗IL-
32同型的自身抗体的存在对患者血清进行筛选，然后选择具有高滴度(titer，效价)的那些
用于外周血单核细胞分离；参见WO2013/098419 A1第118-120页的实施例2，其公开内容通
过引用并入到本文中。筛选过程包括针对结合IL-32同型的片段、肽或衍生物进行筛选。随
后，分离检测到结合的抗体或生产所述抗体的细胞；参见WO2013/098419 A1第120页的实施
例3，其公开内容通过引用并入到本文中。因此，可使用包含抗体分泌细胞(如总外周血或血
清)的样本对候选供体组执行初步筛选。特别地，可使用用于分离外周血单核细胞(PBMC)的
标准分离技术诸如梯度离心从血液或淋巴组织分离单核细胞。在此分离步骤之后和/或之
前，可以使用用于检测抗体和抗体分泌细胞的存在的标准技术(例如ELISA、BIACORE、蛋白
印迹法(Western blot)、FACS、SERPA、抗原阵列法(antigen arrays)、细胞培养系统中的病
毒感染的中和、或ELISPOT测定)预筛选(从不同患者、不同组织和/或在不同时间点获得的)
血清(或者血浆)、细胞培养物上清液或细胞的样本。该文献提供了示出例如使用ELISPOT用
于表征接种供体中免疫反应(Crotty等人,Immunol Meth.286(2004),111-122)、使用抗原
微阵列作为用于新感染患者的诊断工具(Mezzasoma等人,Clin Chem.48(2002),121-130)
的这些技术以及用于测量抗原特异性免疫反应的其他技术(Kern等人,Trends Immunol.26
(2005),477-484)的若干实例。
所述B细胞产生的抗体的培养物的上清液进行筛选。在另一个实施方式中，首先针对抗IL-
32同型的自身抗体的存在对患者血清进行筛选，然后选择具有高滴度(titer，效价)的那些
用于外周血单核细胞分离；参见WO2013/098419 A1第118-120页的实施例2，其公开内容通
过引用并入到本文中。筛选过程包括针对结合IL-32同型的片段、肽或衍生物进行筛选。随
后，分离检测到结合的抗体或生产所述抗体的细胞；参见WO2013/098419 A1第120页的实施
例3，其公开内容通过引用并入到本文中。因此，可使用包含抗体分泌细胞(如总外周血或血
清)的样本对候选供体组执行初步筛选。特别地，可使用用于分离外周血单核细胞(PBMC)的
标准分离技术诸如梯度离心从血液或淋巴组织分离单核细胞。在此分离步骤之后和/或之
前，可以使用用于检测抗体和抗体分泌细胞的存在的标准技术(例如ELISA、BIACORE、蛋白
印迹法(Western blot)、FACS、SERPA、抗原阵列法(antigen arrays)、细胞培养系统中的病
毒感染的中和、或ELISPOT测定)预筛选(从不同患者、不同组织和/或在不同时间点获得的)
血清(或者血浆)、细胞培养物上清液或细胞的样本。该文献提供了示出例如使用ELISPOT用
于表征接种供体中免疫反应(Crotty等人,Immunol Meth.286(2004),111-122)、使用抗原
微阵列作为用于新感染患者的诊断工具(Mezzasoma等人,Clin Chem.48(2002),121-130)
的这些技术以及用于测量抗原特异性免疫反应的其他技术(Kern等人,Trends Immunol.26
(2005),477-484)的若干实例。
[0253] 在分别鉴定候选抗IL-32抗体和分泌该抗体的B细胞之后，获得对感兴趣抗体编码的核酸序列，包括如下步骤：制备B细胞，和获得/排序来自B细胞的对感兴趣抗体编码的核
酸，以及进一步地将所述核酸插入或使用所述核酸来制备能够表达感兴趣抗体的表达宿
主，在感兴趣抗体被表达的情况下培养或传代培养表达宿主，以及可选地纯化感兴趣抗体。
不言而喻，可以在中间操作该核酸，以引入限制位点、改变密码子使用和/或添加或优化转
录和/或翻译调节序列。这些技术为现有技术，并且可以由本领域技术人员在无过度负担的
情况下执行。例如，重链恒定区可以与不同种型的重链恒定区交换或被整个消除。可以连接
可变区，以对单链Fv区编码。可以连接多个Fv区以向多于一种靶赋予结合能力，或可以采用
嵌合重链和轻链组合。一旦基因材料是可获得的，如上所述的保留其结合期望靶的能力的
类似物的设计就明确了。用于克隆抗体可变区和生成重组抗体的方法对本领域技术人员而
言是已知的，并且其在例如Gilliland等人,Tissue Antigens 47(1996),1-20；Doenecke等
人,Leukemia 11(1997),1787-1792中有描述。然而，在本发明的一个优选实施方式中，通过
国际申请WO2013/098420 A1，特别是其第28-30页的实施例3中所述的方法，获得B细胞和表
达对应的抗体，上述申请的公开内容通过引用并入到本文中。
酸，以及进一步地将所述核酸插入或使用所述核酸来制备能够表达感兴趣抗体的表达宿
主，在感兴趣抗体被表达的情况下培养或传代培养表达宿主，以及可选地纯化感兴趣抗体。
不言而喻，可以在中间操作该核酸，以引入限制位点、改变密码子使用和/或添加或优化转
录和/或翻译调节序列。这些技术为现有技术，并且可以由本领域技术人员在无过度负担的
情况下执行。例如，重链恒定区可以与不同种型的重链恒定区交换或被整个消除。可以连接
可变区，以对单链Fv区编码。可以连接多个Fv区以向多于一种靶赋予结合能力，或可以采用
嵌合重链和轻链组合。一旦基因材料是可获得的，如上所述的保留其结合期望靶的能力的
类似物的设计就明确了。用于克隆抗体可变区和生成重组抗体的方法对本领域技术人员而
言是已知的，并且其在例如Gilliland等人,Tissue Antigens 47(1996),1-20；Doenecke等
人,Leukemia 11(1997),1787-1792中有描述。然而，在本发明的一个优选实施方式中，通过
国际申请WO2013/098420 A1，特别是其第28-30页的实施例3中所述的方法，获得B细胞和表
达对应的抗体，上述申请的公开内容通过引用并入到本文中。
[0254] 疾病和失调：
[0255] 除非另有说明，术语“失调”和“疾病”在本文可互换使用。如本文所使用的术语“自身免疫性疾病”是起因于和针对个体自身组织或器官或者其共分离或表现或由其引起病症
的疾病或失调。自身免疫性疾病主要是由适应性免疫应答的异常调节引起，并且形成了针
对自身结构的自身抗体或自身反应性T细胞。几乎所有自身免疫性疾病均具有炎性成分。自
身炎症性疾病主要是炎症性的，并且一些经典的自身炎症性疾病是由先天炎症通路中的基
因缺陷引起的。在自身炎症性疾病中，未发现自身反应性T细胞或自身抗体。在许多这些自
身免疫性和自身炎症性疾病中，可能存在许多临床和实验室指标，包括但不限于血丙种球
蛋白过多、自身抗体水平高、组织中的抗原-抗体复合物沉积、来自皮质类固醇或免疫抑制
治疗的益处、以及在已感染组织中的淋巴样细胞聚集。在不受关于B细胞介导的自身免疫性
疾病的理论限制的情况下，据信B细胞通过多种机械途径证实了在人自身免疫性疾病中的
致病作用，该机械途径包括自身抗体生产、免疫复合物形成、树突细胞和T细胞活化、细胞因
子合成、直接趋化因子释放，以及提供用于异位新淋巴液生成的病灶。这些途径中的每一种
可以不同程度地参与自身免疫性疾病的病理中。
的疾病或失调。自身免疫性疾病主要是由适应性免疫应答的异常调节引起，并且形成了针
对自身结构的自身抗体或自身反应性T细胞。几乎所有自身免疫性疾病均具有炎性成分。自
身炎症性疾病主要是炎症性的，并且一些经典的自身炎症性疾病是由先天炎症通路中的基
因缺陷引起的。在自身炎症性疾病中，未发现自身反应性T细胞或自身抗体。在许多这些自
身免疫性和自身炎症性疾病中，可能存在许多临床和实验室指标，包括但不限于血丙种球
蛋白过多、自身抗体水平高、组织中的抗原-抗体复合物沉积、来自皮质类固醇或免疫抑制
治疗的益处、以及在已感染组织中的淋巴样细胞聚集。在不受关于B细胞介导的自身免疫性
疾病的理论限制的情况下，据信B细胞通过多种机械途径证实了在人自身免疫性疾病中的
致病作用，该机械途径包括自身抗体生产、免疫复合物形成、树突细胞和T细胞活化、细胞因
子合成、直接趋化因子释放，以及提供用于异位新淋巴液生成的病灶。这些途径中的每一种
可以不同程度地参与自身免疫性疾病的病理中。
[0256] 如本文中所使用的，“自身免疫性疾病”可以是器官特异性疾病(即免疫应答特异性地针对器官系统，诸如内分泌系统、造血系统、皮肤、心肺系统、胃肠和肝系统、肾系统、甲
状腺、耳、神经肌肉系统、中枢神经系统等)或者为可能影响多个器官系统的全身性疾病(包
括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、多肌炎、自身免疫性多内分泌腺病综
合征1型(APS1)/自身免疫性多内分泌腺病-念珠菌病-外胚层营养不良(APECED))等。优选
的这种疾病包括但不限于多发性硬化(MS)、各种形式的自身免疫性风湿病(包括但不限于
类风湿性关节炎、脊柱关节炎、牛皮癣性关节炎、干燥综合征、硬皮病、狼疮(包括但不限于
SLE和狼疮肾炎)、多肌炎/皮肌炎和银屑病关节炎)、自身免疫性皮肤病(包括但不限于牛皮
癣、天疱疮组疾病、大疱性类天疱疮疾病和皮肤红斑狼疮)以及自身免疫性内分泌失调(包
括但不限于糖尿病相关的自身免疫性疾病诸如1型或胰岛素依赖型糖尿病(T1DM或IDDM)、
自身免疫甲状腺病(包括但不限于格雷夫斯病和甲状腺炎))以及影响自身免疫性生成的疾
病(包括但不限于自身免疫性多内分泌腺病综合征1型(APS1)/自身免疫性多内分泌腺病-
念珠菌病-外胚层营养不良(APECED)、重症肌无力(MG/胸腺瘤))。
状腺、耳、神经肌肉系统、中枢神经系统等)或者为可能影响多个器官系统的全身性疾病(包
括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、多肌炎、自身免疫性多内分泌腺病综
合征1型(APS1)/自身免疫性多内分泌腺病-念珠菌病-外胚层营养不良(APECED))等。优选
的这种疾病包括但不限于多发性硬化(MS)、各种形式的自身免疫性风湿病(包括但不限于
类风湿性关节炎、脊柱关节炎、牛皮癣性关节炎、干燥综合征、硬皮病、狼疮(包括但不限于
SLE和狼疮肾炎)、多肌炎/皮肌炎和银屑病关节炎)、自身免疫性皮肤病(包括但不限于牛皮
癣、天疱疮组疾病、大疱性类天疱疮疾病和皮肤红斑狼疮)以及自身免疫性内分泌失调(包
括但不限于糖尿病相关的自身免疫性疾病诸如1型或胰岛素依赖型糖尿病(T1DM或IDDM)、
自身免疫甲状腺病(包括但不限于格雷夫斯病和甲状腺炎))以及影响自身免疫性生成的疾
病(包括但不限于自身免疫性多内分泌腺病综合征1型(APS1)/自身免疫性多内分泌腺病-
念珠菌病-外胚层营养不良(APECED)、重症肌无力(MG/胸腺瘤))。
[0257] 优选的疾病包括例如SLE、RA、脊柱关节炎、牛皮癣性关节炎、T1DM、MS、牛皮癣、干燥综合征、格雷夫斯病、甲状腺炎和肾小球性肾炎以及APS1。还更优选的是RA、SLE和MS，并
且最优选的是SLE。
且最优选的是SLE。
[0258] 标记和诊断：
[0259] 标记剂可以直接或间接偶联到本发明的抗体或抗原。间接偶联的一个实例为使用间隔基(spacer)部分。此外，本发明的抗体可以包括其他结构域，所述结构域通过共价或非
共价键连接。该连接可以基于根据本领域已知的和上文描述的方法的基因融合，或者可以
通过例如如例如国际申请WO94/04686中描述的化学交联来执行。存在于包括本发明的抗体
的融合蛋白中的其他结构域可以优选地通过柔性接头(linker)、有利地通过多肽接头连
接，其中所述多肽接头包含多个亲水性肽键合的氨基酸，其长度足以跨越所述其他结构域
的C端端部和本发明的抗体的N端端部(或反之亦然)之间的距离。治疗或诊断活性剂可以通
过各种方式偶联至本发明的抗体或其抗原结合片段。这包括例如包含通过共价方法如肽键
偶联至治疗或诊断活性剂的本发明的抗体可变区的单链融合蛋白。其他实例包括包含共价
或非共价地偶联至其他分子(包括以下非限制性说明性列表中的那些)的至少一种抗原结
合片段的分子。Traunecker,Int.J.Cancer Surp.SuDP 7(1992),51-52描述了双特异性试
剂janusin，其中针对CD3的Fv区偶联至可溶的CD4或其他配体，如OVCA和IL-7。同样地，本发
明的抗体的可变区可以被构建为Fv分子并且偶联至替换配体(如所引用文献中示出的那
些)。Higgins,J.Infect.Disease 166(1992),198-202描述了由与针对GP120V3区中特异序
列的抗体交联的OKT3组成的异轭合抗体(异缀合抗体，hetero-conjugate antibody)。这样
的异轭合抗体也可以使用包含于本发明方法的抗体中的至少可变区来构建。特异性抗体的
其他实例包括Fanger,Cancer Treat.Res.68(1993),181-194和Fanger,
Crit.Rev.Immunol.12(1992),101-124中描述的那些抗体。轭合物(缀合物，conjugate)，即
包括常规抗体的免疫毒素，已经在本领域中得到广泛描述。毒素可以通过常规偶联技术偶
联至抗体，或者可以将含有蛋白毒素部分的免疫毒素生产为融合蛋白。可以以相应的方式
使用本发明的抗体，以获得这样的免疫毒素。这样的免疫毒素的实例为Byers,Seminars
Cell.Biol.2(1991),59-70和Fanger,Immunol.Today 12(1991),51-54中描述的那些。
共价键连接。该连接可以基于根据本领域已知的和上文描述的方法的基因融合，或者可以
通过例如如例如国际申请WO94/04686中描述的化学交联来执行。存在于包括本发明的抗体
的融合蛋白中的其他结构域可以优选地通过柔性接头(linker)、有利地通过多肽接头连
接，其中所述多肽接头包含多个亲水性肽键合的氨基酸，其长度足以跨越所述其他结构域
的C端端部和本发明的抗体的N端端部(或反之亦然)之间的距离。治疗或诊断活性剂可以通
过各种方式偶联至本发明的抗体或其抗原结合片段。这包括例如包含通过共价方法如肽键
偶联至治疗或诊断活性剂的本发明的抗体可变区的单链融合蛋白。其他实例包括包含共价
或非共价地偶联至其他分子(包括以下非限制性说明性列表中的那些)的至少一种抗原结
合片段的分子。Traunecker,Int.J.Cancer Surp.SuDP 7(1992),51-52描述了双特异性试
剂janusin，其中针对CD3的Fv区偶联至可溶的CD4或其他配体，如OVCA和IL-7。同样地，本发
明的抗体的可变区可以被构建为Fv分子并且偶联至替换配体(如所引用文献中示出的那
些)。Higgins,J.Infect.Disease 166(1992),198-202描述了由与针对GP120V3区中特异序
列的抗体交联的OKT3组成的异轭合抗体(异缀合抗体，hetero-conjugate antibody)。这样
的异轭合抗体也可以使用包含于本发明方法的抗体中的至少可变区来构建。特异性抗体的
其他实例包括Fanger,Cancer Treat.Res.68(1993),181-194和Fanger,
Crit.Rev.Immunol.12(1992),101-124中描述的那些抗体。轭合物(缀合物，conjugate)，即
包括常规抗体的免疫毒素，已经在本领域中得到广泛描述。毒素可以通过常规偶联技术偶
联至抗体，或者可以将含有蛋白毒素部分的免疫毒素生产为融合蛋白。可以以相应的方式
使用本发明的抗体，以获得这样的免疫毒素。这样的免疫毒素的实例为Byers,Seminars
Cell.Biol.2(1991),59-70和Fanger,Immunol.Today 12(1991),51-54中描述的那些。
[0260] 上述融合蛋白还可以包括蛋白酶的可切割接头或切割位点。这些间隔基部分进而可以是不可溶或可溶的(Diener等人,Science 231(1986),148)，并且可以被选择用以使药
品能够在靶位点从抗原释放。可以偶联至本发明的抗体和抗原用于免疫治疗的治疗剂的实
例为趋化因子、归巢分子、药物、放射性同位素、凝集素和毒素。可以与本发明的抗体和抗原
轭合的药物取决于意在使用所轭合分子的疾病情况。例如，对有利于治疗肿瘤性疾病的靶
特异性的抗体可以轭合至被经典地称为抗肿瘤药物(如丝裂霉素C、柔红霉素和长春花碱)
的化合物。在使用本发明的放射性同位素轭合的抗体或抗原用于例如肿瘤免疫治疗的情况
下，取决于诸如白细胞分布以及稳定性和发射这类因素，某些同位素可比其他同位素更加
优选。取决于自身免疫应答，某些发射体可比其他发射体优选。一般而言，发射放射性同位
212
素的α和β粒子在免疫疗法中是优选的。优选的是短距离高能量的α发射体，如 Bi。可以结
合至本发明的抗体或抗原用于治疗目的的放射性同位素的实例为125I、131I、90Y、67Cu、212Bi
、212At、211Pb、47Sc、109Pd和188Re。本领域普通技术人员已知或可以容易确定可以偶联至本发
明的抗体或抗原的其他治疗剂以及体外和体内治疗方案。用于标记的合适放射性核素的非
限制性实例为198Au、212Bi、11C、14C、57Co、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、197Hg、166Ho、111In、113mIn、123I、125I、127I、131I、111In、177Lu、15O、13N、32P、33P、203Pb、186Re、188Re、105Rh、97Ru、35S、153Sm和99mTc。适用于标记的其他分子为荧光或发光染料、磁性粒子、金属以及可通过二次酶促或结合步骤
检测到的分子(诸如酶或肽标签)。第八版荧光探针和研究产品手册(Handbook of
Fluorescent Probes and Research Products)列出了适合在本发明中用作标记物的商用
荧光探针，该文献的公开内容通过引用并入到本文中。适用于基于磁性粒子的测定(MPA)的
磁性粒子可以选自顺磁材料、抗磁材料、铁磁材料、铁磁材料和超顺磁材料。
品能够在靶位点从抗原释放。可以偶联至本发明的抗体和抗原用于免疫治疗的治疗剂的实
例为趋化因子、归巢分子、药物、放射性同位素、凝集素和毒素。可以与本发明的抗体和抗原
轭合的药物取决于意在使用所轭合分子的疾病情况。例如，对有利于治疗肿瘤性疾病的靶
特异性的抗体可以轭合至被经典地称为抗肿瘤药物(如丝裂霉素C、柔红霉素和长春花碱)
的化合物。在使用本发明的放射性同位素轭合的抗体或抗原用于例如肿瘤免疫治疗的情况
下，取决于诸如白细胞分布以及稳定性和发射这类因素，某些同位素可比其他同位素更加
优选。取决于自身免疫应答，某些发射体可比其他发射体优选。一般而言，发射放射性同位
212
素的α和β粒子在免疫疗法中是优选的。优选的是短距离高能量的α发射体，如 Bi。可以结
合至本发明的抗体或抗原用于治疗目的的放射性同位素的实例为125I、131I、90Y、67Cu、212Bi
、212At、211Pb、47Sc、109Pd和188Re。本领域普通技术人员已知或可以容易确定可以偶联至本发
明的抗体或抗原的其他治疗剂以及体外和体内治疗方案。用于标记的合适放射性核素的非
限制性实例为198Au、212Bi、11C、14C、57Co、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、197Hg、166Ho、111In、113mIn、123I、125I、127I、131I、111In、177Lu、15O、13N、32P、33P、203Pb、186Re、188Re、105Rh、97Ru、35S、153Sm和99mTc。适用于标记的其他分子为荧光或发光染料、磁性粒子、金属以及可通过二次酶促或结合步骤
检测到的分子(诸如酶或肽标签)。第八版荧光探针和研究产品手册(Handbook of
Fluorescent Probes and Research Products)列出了适合在本发明中用作标记物的商用
荧光探针，该文献的公开内容通过引用并入到本文中。适用于基于磁性粒子的测定(MPA)的
磁性粒子可以选自顺磁材料、抗磁材料、铁磁材料、铁磁材料和超顺磁材料。
[0261] 可以在标准教科书中发现可用于诊断目的的分子和细胞生化通用方法，这类标准教科书诸如第三版Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)
(Sambrook等人,Harbor Laboratory出版社2001)、第四版Short Protocols in Molecular
Biology(精编分子生物学实验指南)，(Ausubel等人编,John Wiley&Sons1999)、Protein
Methods(蛋白方法)(Bollag等人,John Wiley&Sons 1996)。用于诊断目的的试剂、检测装
置(手段，方法，means)和试剂盒可以从商业供应商(诸如Pharmacia Diagnostics公司、
Amersham公司、BioRad公司、Stratagene公司、Invitrogen公司和Sigma-Aldrich公司)以及
从本文中引用的任一个参考文献特别是专利文献中给出的来源获得。
(Sambrook等人,Harbor Laboratory出版社2001)、第四版Short Protocols in Molecular
Biology(精编分子生物学实验指南)，(Ausubel等人编,John Wiley&Sons1999)、Protein
Methods(蛋白方法)(Bollag等人,John Wiley&Sons 1996)。用于诊断目的的试剂、检测装
置(手段，方法，means)和试剂盒可以从商业供应商(诸如Pharmacia Diagnostics公司、
Amersham公司、BioRad公司、Stratagene公司、Invitrogen公司和Sigma-Aldrich公司)以及
从本文中引用的任一个参考文献特别是专利文献中给出的来源获得。
[0262] 治疗和药物：
[0263] 如本文中所使用的，术语“医治/治疗/处理(treat)”或“医治/治疗/处理(treatment)”是指治疗处理和预防性(prophylactic)或防范性(preventative)措施，其中
目的是防止或减缓(减轻)不期望的生理学变化或失调，如自身免疫和/或自身炎性疾病的
发展。有益或期望的临床效果，无论是可检测的还是不可检测的，包括但不限于：症状减轻、
疾病程度减弱、疾病的稳定(即不恶化)状态、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和、
以及缓解(无论是部分的还是全部的)。“治疗”还可以指与如果不接受治疗的预期存活相比
延长存活。需要治疗的那些对象包括：已经患有病症或失调的那些对象，以及易患有病症或
失调的那些对象，或要预防病症或失调的表现的那些对象。
目的是防止或减缓(减轻)不期望的生理学变化或失调，如自身免疫和/或自身炎性疾病的
发展。有益或期望的临床效果，无论是可检测的还是不可检测的，包括但不限于：症状减轻、
疾病程度减弱、疾病的稳定(即不恶化)状态、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和、
以及缓解(无论是部分的还是全部的)。“治疗”还可以指与如果不接受治疗的预期存活相比
延长存活。需要治疗的那些对象包括：已经患有病症或失调的那些对象，以及易患有病症或
失调的那些对象，或要预防病症或失调的表现的那些对象。
[0264] 如果没有另外说明，那么术语“药物”、“药品/药剂”或“药”在本文中可互换使用，并且应包括但不限于所有下述：(A)内用或外用的物品、药品和制剂，和意用于诊断、治愈、
缓解、治疗或预防人或其他动物的疾病的任何物质或物质混合物；和(B)意用于影响人体或
其他动物体的结构或任何功能的物品、药品和制剂(食品除外)；和(C)意在用作(A)项和(B)
项中规定的任何物品的组分的物品。术语“药物”、“药品”或“药/药剂”应包括意用于人或其
他动物的完整制剂配方，包括一种或多种“剂/试剂/药剂(agent)”、“化合物”、“物质”或
“(化学)组分/成分/组成”并且在一些其他情形下还包括其他药学上无活性的赋形剂，作为
填料、崩解剂、润滑剂、助流剂、粘合剂或确保“药物”、“药品”或“药/药剂”在人或其他动物的身体内的预期靶位置(如皮肤、胃部或肠脏)处的易运输、崩解、解聚、溶解和生物可用性。
术语“剂/试剂/药剂”、“化合物”或“物质”在本文中可互换使用，并在更具体的情况下应包
括但不限于所有药理活性剂，即诱导期望的生物或药理作用的或通过本发明的方法研究或
测试了诱导这种可能药理作用的能力的剂/试剂/药剂。
缓解、治疗或预防人或其他动物的疾病的任何物质或物质混合物；和(B)意用于影响人体或
其他动物体的结构或任何功能的物品、药品和制剂(食品除外)；和(C)意在用作(A)项和(B)
项中规定的任何物品的组分的物品。术语“药物”、“药品”或“药/药剂”应包括意用于人或其
他动物的完整制剂配方，包括一种或多种“剂/试剂/药剂(agent)”、“化合物”、“物质”或
“(化学)组分/成分/组成”并且在一些其他情形下还包括其他药学上无活性的赋形剂，作为
填料、崩解剂、润滑剂、助流剂、粘合剂或确保“药物”、“药品”或“药/药剂”在人或其他动物的身体内的预期靶位置(如皮肤、胃部或肠脏)处的易运输、崩解、解聚、溶解和生物可用性。
术语“剂/试剂/药剂”、“化合物”或“物质”在本文中可互换使用，并在更具体的情况下应包
括但不限于所有药理活性剂，即诱导期望的生物或药理作用的或通过本发明的方法研究或
测试了诱导这种可能药理作用的能力的剂/试剂/药剂。
[0265] “抗风湿药物”和免疫抑制药物的实例包括氯喹、羟基氯喹、硫代苯酸金钠(myocrisin)、金诺芬(auranofm)、柳氮磺胺吡啶、甲氨蝶呤、来氟米特、依那西普、英夫利昔
单抗(加口服和皮下用甲氨蝶呤)、阿达木单抗等、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金盐(口服的)、金盐
(肌内的)、米诺环素、包括环孢素A和外用环孢素的环孢素、他克莫司、霉酚酸酯、环磷酰胺、
金黄色葡萄球菌蛋白A(Goodyear和Silverman,J.Exp.Med.,197(2003),125-39)，包括其盐
和衍生物等。
单抗(加口服和皮下用甲氨蝶呤)、阿达木单抗等、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金盐(口服的)、金盐
(肌内的)、米诺环素、包括环孢素A和外用环孢素的环孢素、他克莫司、霉酚酸酯、环磷酰胺、
金黄色葡萄球菌蛋白A(Goodyear和Silverman,J.Exp.Med.,197(2003),125-39)，包括其盐
和衍生物等。
[0266] “非甾体抗炎药物”或“NSAID”的实例包括阿司匹林、乙酰水杨酸、布洛芬和布洛芬缓释(retard)、非诺洛芬、吡罗昔康、氟比洛芬、萘普生、酮洛芬、萘普生、替诺昔康、贝诺酯、
双氯芬酸、萘普生、萘丁美酮、消炎痛(indometacin)、酮洛芬、甲灭酸、双氯芬酸、芬布芬、阿
扎丙宗、阿西美辛、噻洛芬酸、消炎痛、舒林酸、托美丁、保泰松、双氯芬酸和双氯芬酸缓释、
环氧合酶(COX)-2抑制剂(诸如GR 253035、MK966、塞来昔布( 4-(5-(4-甲
基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基))、苯磺酰胺和伐地考昔 以及美洛
昔康 包括其盐和衍生物等。优选地，“非甾体抗炎药物”或“NSAID”为阿司匹
林、萘普生、布洛芬、消炎痛或托美丁。这样的NSAID可选地与镇痛剂(诸如可待因
(codenine)、曲马多，和/或双氢可待因)或麻醉药(如吗啡)一起使用。
双氯芬酸、萘普生、萘丁美酮、消炎痛(indometacin)、酮洛芬、甲灭酸、双氯芬酸、芬布芬、阿
扎丙宗、阿西美辛、噻洛芬酸、消炎痛、舒林酸、托美丁、保泰松、双氯芬酸和双氯芬酸缓释、
环氧合酶(COX)-2抑制剂(诸如GR 253035、MK966、塞来昔布( 4-(5-(4-甲
基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基))、苯磺酰胺和伐地考昔 以及美洛
昔康 包括其盐和衍生物等。优选地，“非甾体抗炎药物”或“NSAID”为阿司匹
林、萘普生、布洛芬、消炎痛或托美丁。这样的NSAID可选地与镇痛剂(诸如可待因
(codenine)、曲马多，和/或双氢可待因)或麻醉药(如吗啡)一起使用。
[0267] “受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指对其而言期望进行诊断、预后、预防或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如人类患者。
[0268] 药物载体：
[0269] 可以从本领域技术人员已知的相应文献中获取药学上可接受的载体和给药途径。本发明的药物组合物可以根据本领域熟知的方法配制；参见例如费城理工大学
(University of Sciences in Philadelphia)的Remington：The Science and Practice
of Pharmacy(2000),ISBN 0-683-306472,Robinson等人的第二版Vaccine Protocols.,
Humana出版社,Totowa,New Jersey,USA,2003；Banga的由Taylor和Francis编辑的第二版
Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and Delivery Systems
(2006),ISBN:0-8493-1630-8。合适药物载体的实例是本领域中熟知的，包括磷酸盐缓冲盐
溶液、水、乳剂(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包括这样的载体的组合物
可以通过熟知的常规方法配制。这些药物组合物可以以合适的剂量对受试者施用。合适组
合物的给药可通过不同途径进行。实例包括通过口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌
内、皮下、真皮下、经皮、鞘内和颅内方法来施用含有药学上可接受的载体的组合物。气雾剂
制剂(诸如鼻喷雾制剂)包括具有防腐剂和等渗剂的活性剂的纯化水溶液或其他溶液。这样
的制剂优选地调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。本发明中还构思出用于口服给药的药
物组合物，例如单域抗体分子(例如，“NanobodiesTM”)等。这样的口服制剂可以是片剂、胶囊
剂、粉剂、液体或半固体形式。片剂可以包括固态载体，如明胶或佐剂。用于直肠或阴道给药
的制剂可以呈现为具有合适载体的栓剂；也参见O'Hagan等人,Nature Reviews,Drug
Discovery 2(9)(2003),727-735。可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mace
Publishing Company,Philadelphia,PA,17thed.(1985)和其相应的更新版本中发现关于适
于各种类型的给药的制剂的其他指导。关于用于药物递送的方法的简要回顾，请参见
Langer,Science 249(1990),1527-1533。
(University of Sciences in Philadelphia)的Remington：The Science and Practice
of Pharmacy(2000),ISBN 0-683-306472,Robinson等人的第二版Vaccine Protocols.,
Humana出版社,Totowa,New Jersey,USA,2003；Banga的由Taylor和Francis编辑的第二版
Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and Delivery Systems
(2006),ISBN:0-8493-1630-8。合适药物载体的实例是本领域中熟知的，包括磷酸盐缓冲盐
溶液、水、乳剂(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包括这样的载体的组合物
可以通过熟知的常规方法配制。这些药物组合物可以以合适的剂量对受试者施用。合适组
合物的给药可通过不同途径进行。实例包括通过口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌
内、皮下、真皮下、经皮、鞘内和颅内方法来施用含有药学上可接受的载体的组合物。气雾剂
制剂(诸如鼻喷雾制剂)包括具有防腐剂和等渗剂的活性剂的纯化水溶液或其他溶液。这样
的制剂优选地调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。本发明中还构思出用于口服给药的药
物组合物，例如单域抗体分子(例如，“NanobodiesTM”)等。这样的口服制剂可以是片剂、胶囊
剂、粉剂、液体或半固体形式。片剂可以包括固态载体，如明胶或佐剂。用于直肠或阴道给药
的制剂可以呈现为具有合适载体的栓剂；也参见O'Hagan等人,Nature Reviews,Drug
Discovery 2(9)(2003),727-735。可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mace
Publishing Company,Philadelphia,PA,17thed.(1985)和其相应的更新版本中发现关于适
于各种类型的给药的制剂的其他指导。关于用于药物递送的方法的简要回顾，请参见
Langer,Science 249(1990),1527-1533。
[0270] 给药方案
[0271] 给药方案将由主治医生和临床因素确定。如医学领域中众所周知的，用于任一例患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性
别、给药的时间和途径、总体健康状况、以及同时施用的其他药物。典型剂量可以例如在
0.001至1000μg的范围内(或在此范围内核酸表达或抑制表达)；然而，特别是考虑到上述因
素，还设想到低于或高于该示例性范围的剂量。通常，药物组合物的常规施用方案应在每天
1μg到10mg单位的范围内。如果方案为连续输注，也应当分别在每分钟每千克体重1μg到
10mg单位的范围内。可以通过定期评估来监测进程。用于肠胃外给药的制剂包括无菌的含
水或非水溶液剂、悬浮剂和乳剂。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、
和可注射有机酯(如油酸乙酯)。含水载体包括水、含醇/含水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水
和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液
或固定油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的那
些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此
外，根据药物组合物的预期用途，本发明的药物组合物可以包含其他药剂，如抗肿瘤剂和细
胞毒性药物。
别、给药的时间和途径、总体健康状况、以及同时施用的其他药物。典型剂量可以例如在
0.001至1000μg的范围内(或在此范围内核酸表达或抑制表达)；然而，特别是考虑到上述因
素，还设想到低于或高于该示例性范围的剂量。通常，药物组合物的常规施用方案应在每天
1μg到10mg单位的范围内。如果方案为连续输注，也应当分别在每分钟每千克体重1μg到
10mg单位的范围内。可以通过定期评估来监测进程。用于肠胃外给药的制剂包括无菌的含
水或非水溶液剂、悬浮剂和乳剂。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、
和可注射有机酯(如油酸乙酯)。含水载体包括水、含醇/含水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水
和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液
或固定油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的那
些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此
外，根据药物组合物的预期用途，本发明的药物组合物可以包含其他药剂，如抗肿瘤剂和细
胞毒性药物。
[0272] 另外，其他药剂的共同施用或顺序施用可以是可取的。治疗上有效的剂量或量是指足以减轻症状或病症的活性成分的量。在细胞培养物或实验动物中，这样的化合物的治
疗功效和毒性可以通过标准药物程序确定，例如ED 50(在50％的群体中治疗有效的剂量)
和LD 50(对50％的群体致命的剂量)。在治疗和毒性作用之间的剂量比为治疗指数，并且其
可以被表示为比率，LD50/ED50。
疗功效和毒性可以通过标准药物程序确定，例如ED 50(在50％的群体中治疗有效的剂量)
和LD 50(对50％的群体致命的剂量)。在治疗和毒性作用之间的剂量比为治疗指数，并且其
可以被表示为比率，LD50/ED50。
[0273] 优选地，组合物中的治疗剂以足以预防炎症或抑制免疫应答的量存在。
[0274] 通过本发明的说明书和实施例公开并涵盖了这些和其他实施方式。可以使用例如电子设备从公共图书馆和数据库来检索关于根据本发明要使用的材料、方法、用途和化合
物中任一者的其他文献。例如，可以利用由美国国家生物技术信息中心和/或美国国立卫生
研究院的国家医学图书馆主办的公共数据库“Medline”。其他数据库和网址(如欧洲生物信
息研究所(EBI)，即欧洲分子生物学实验室(EMBL)一部分的那些数据库和网址)对于本领域
技术人员是已知的，并且可以利用互联网搜索引擎获得。Berks,TIBTECH 12(1994),352-
364中给出了生物技术专利信息的综述和可用于回溯检索和最新情报通告的专利信息相关
来源的调查。
物中任一者的其他文献。例如，可以利用由美国国家生物技术信息中心和/或美国国立卫生
研究院的国家医学图书馆主办的公共数据库“Medline”。其他数据库和网址(如欧洲生物信
息研究所(EBI)，即欧洲分子生物学实验室(EMBL)一部分的那些数据库和网址)对于本领域
技术人员是已知的，并且可以利用互联网搜索引擎获得。Berks,TIBTECH 12(1994),352-
364中给出了生物技术专利信息的综述和可用于回溯检索和最新情报通告的专利信息相关
来源的调查。
[0275] 上述公开内容大体上描述了本发明。在整个说明书文本中引用了若干文献。在紧接权利要求书之前的说明书末尾处可以找到完整的文献资料出处。所有引用的参考文献
(包括贯穿本申请所引用的文献参考、授权的专利、公布的专利申请，包括在背景技术部分
公开的内容，和制造商的规格说明书、使用说明书等)的内容通过引用明确地并入到本文
中；然而，并未承认任何引用的文件确实是关于本发明的现有技术。
(包括贯穿本申请所引用的文献参考、授权的专利、公布的专利申请，包括在背景技术部分
公开的内容，和制造商的规格说明书、使用说明书等)的内容通过引用明确地并入到本文
中；然而，并未承认任何引用的文件确实是关于本发明的现有技术。
[0276] 通过参照以下具体实施例可以获得更全面的理解，本文中提供这些具体实施例仅用于说明性的目的而非意在限制本发明的范围。
[0277] 实施例
[0278] 后面的实施例1至6以及对应的图1至图12进一步说明了本发明，但不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。在所引用的文献中可以找到常规方法(文中所使用的那些)
的详细说明；也参见Beers和Berkow编辑的第十七版"The Merck Manual of Diagnosis
and Therapy"(Merck&Co.公司,2003)。
的详细说明；也参见Beers和Berkow编辑的第十七版"The Merck Manual of Diagnosis
and Therapy"(Merck&Co.公司,2003)。
[0279] 除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域的技术内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。
[0280] 分子遗传学和基因工程的方法通常描述在以下文献的现行版本中：Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册),(Sambrook等人,(1989)；Molecular
Cloning:A Laboratory Manual,第二版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor
Laboratory Press))；DNA Cloning,卷I和II(Glover编,1985)；Oligonucleotide
Synthesis(Gait编,1984)；Nucleic Acid Hybridization(Hames和Higgins编，1984)；
Transcription And Translation(Hames和Higgins编，1984)；Culture Of Animal Cells
(Freshney和Alan,Liss,Inc.,1987)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells
(Miller和Calos编)；Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols
in Molecular Biology,第三版(Ausubel等人编)；以及Recombinant DNA Methodology(Wu
编,Academic出版社(Academic Press))；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells
(Miller和Calos编,1987,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory))；
Methods In Enzymology,卷154和155(Wu等人编)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL
出版社(IRL Press),1986)；Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；
the treatise,Methods In Enzymology(Academic出版社(Academic Press),N.Y.)；
Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编,Academic
出版社(Academic Press),London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,卷I-
IV(Weir和Blackwell编,1986)。本发明中所指的用于基因操作的试剂、克隆载体和试剂盒
可以从商业供应商(诸如BioRad公司、Stratagene公司、Invitrogen公司和Clontech公司)
获得。在Large Scale Mammalian Cell Culture(Hu等人,Curr.Opin.Biotechnol.8
(1997),148)；Serum-free Media(Kitano,Biotechnology17(1991),73)；Large Scale
Mammalian Cell Culture(Curr.Opin.Biotechnol.2(1991),375)；以及Suspension
Culture of Mammalian Cells(Birch等人,Bioprocess Technol.19(1990),251中概述了
细胞培养和培养基收集的通用技术。
Cloning:A Laboratory Manual,第二版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor
Laboratory Press))；DNA Cloning,卷I和II(Glover编,1985)；Oligonucleotide
Synthesis(Gait编,1984)；Nucleic Acid Hybridization(Hames和Higgins编，1984)；
Transcription And Translation(Hames和Higgins编，1984)；Culture Of Animal Cells
(Freshney和Alan,Liss,Inc.,1987)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells
(Miller和Calos编)；Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols
in Molecular Biology,第三版(Ausubel等人编)；以及Recombinant DNA Methodology(Wu
编,Academic出版社(Academic Press))；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells
(Miller和Calos编,1987,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory))；
Methods In Enzymology,卷154和155(Wu等人编)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL
出版社(IRL Press),1986)；Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；
the treatise,Methods In Enzymology(Academic出版社(Academic Press),N.Y.)；
Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编,Academic
出版社(Academic Press),London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,卷I-
IV(Weir和Blackwell编,1986)。本发明中所指的用于基因操作的试剂、克隆载体和试剂盒
可以从商业供应商(诸如BioRad公司、Stratagene公司、Invitrogen公司和Clontech公司)
获得。在Large Scale Mammalian Cell Culture(Hu等人,Curr.Opin.Biotechnol.8
(1997),148)；Serum-free Media(Kitano,Biotechnology17(1991),73)；Large Scale
Mammalian Cell Culture(Curr.Opin.Biotechnol.2(1991),375)；以及Suspension
Culture of Mammalian Cells(Birch等人,Bioprocess Technol.19(1990),251中概述了
细胞培养和培养基收集的通用技术。
[0281] 材料和方法：
[0282] 如在国际申请WO2013/098419A1和WO2013/098420 A1中描述的执行患者选择、从APECED/APS1患者的记忆B细胞培养物分离外周血单核细胞(PBMC)、以及抗体分离，但区别
在于所分离和分析的抗体的特异性针对如上下文所定义的IL-32同型而非上述PCT申请中
具体使用的IL-17和IL-22；参见其中的实施例部分，特别是WO2013/098419 A1第117-120页
的实施例1和2和第168-171页的实施例17，以及WO2013/098420 A1第27-31页的实施例1至
4，其公开内容通过引用并入到本文中。
在于所分离和分析的抗体的特异性针对如上下文所定义的IL-32同型而非上述PCT申请中
具体使用的IL-17和IL-22；参见其中的实施例部分，特别是WO2013/098419 A1第117-120页
的实施例1和2和第168-171页的实施例17，以及WO2013/098420 A1第27-31页的实施例1至
4，其公开内容通过引用并入到本文中。
[0283] 本发明的人抗体的分子克隆和随后的抗体产生和纯化如国际申请WO2013/098419A1所描述的执行，参见该申请的实施例部分，特别是其中第117-120页的实施例1至
3，其公开内容通过引用并入到本文中。
3，其公开内容通过引用并入到本文中。
[0284] 对AIRE基因的突变分析按国际申请WO2013/098419 A1所描述的执行；参见其中的实施例，特别是第115-116页的实施例的材料和方法中的“AIRE基因的突变分析”部分，其公
开内容通过引用并入到本文中，同时按WO99/15559中所描述的进行特定步骤。关于这一点，
AIRE(APECED)基因中各突变的基因分型按国际申请WO99/15559第12-13页的实施例2所描
述的执行；对AIRE基因的外显子2和6的突变的确定按国际申请WO99/15559第13页第5行到
第14页第13行的实施例3中所描述的执行，该申请的全部公开内容通过引用并入到本文中。
特别地，对于突变分析，DNA样本由来自患APECED的患者和来自疑似携带者的外周血单核细
胞以及正常健康对照纯化(根据Sambrook等人1989,Molecular Cloning.A Laboratory
Manual.CSH出版社(CSH Press))，并且利用对所有鉴定的外显子特异性的引物进行PCR。
开内容通过引用并入到本文中，同时按WO99/15559中所描述的进行特定步骤。关于这一点，
AIRE(APECED)基因中各突变的基因分型按国际申请WO99/15559第12-13页的实施例2所描
述的执行；对AIRE基因的外显子2和6的突变的确定按国际申请WO99/15559第13页第5行到
第14页第13行的实施例3中所描述的执行，该申请的全部公开内容通过引用并入到本文中。
特别地，对于突变分析，DNA样本由来自患APECED的患者和来自疑似携带者的外周血单核细
胞以及正常健康对照纯化(根据Sambrook等人1989,Molecular Cloning.A Laboratory
Manual.CSH出版社(CSH Press))，并且利用对所有鉴定的外显子特异性的引物进行PCR。
[0285] 实施例1：通过ELISA检测患者血清中的人细胞因子特异抗体
[0286] 通过在申请人的国际申请WO2013/098419A1第128页的实施例7中描述的和第128至130页的表1和2所示出的Protoarray分析，已经得到患有基因病症APECED(自身免疫性多
内分泌腺病-念珠菌病-表皮发育不良，也称为自身免疫性多内分泌腺病1型(APS1))的患者
的血清中各种细胞因子和疾病特异性抗体的一般存在，该国际申请的公开内容通过引用并
入到本文中。此外，ELISA(酶联免疫吸附测定)用于患有基因病症APECED(自身免疫性多内
分泌腺病-念珠菌病-表皮发育不良，也称为自身免疫性多内分泌腺病1型(APS1)的患者的
血清中IL-32γ相对于IL-32α分析的差异分析。总之，测定中使用由APS1-1至APS1-30的代
码表示的来自30例患者的血清(参见图2)。
内分泌腺病-念珠菌病-表皮发育不良，也称为自身免疫性多内分泌腺病1型(APS1))的患者
的血清中各种细胞因子和疾病特异性抗体的一般存在，该国际申请的公开内容通过引用并
入到本文中。此外，ELISA(酶联免疫吸附测定)用于患有基因病症APECED(自身免疫性多内
分泌腺病-念珠菌病-表皮发育不良，也称为自身免疫性多内分泌腺病1型(APS1)的患者的
血清中IL-32γ相对于IL-32α分析的差异分析。总之，测定中使用由APS1-1至APS1-30的代
码表示的来自30例患者的血清(参见图2)。
[0287] ELISA-IL-32γ和IL-32α
[0288] 用人IL-32γ(R&D公司)或IL-32α(ImmunoTools公司)涂覆96孔微孔板(Costar公司，美国)。用PBS-T清洗板，并在室温下用含有2％的BSA(Sigma公司，布克斯，瑞士)的PBS封
闭1小时。患者血清、B细胞条件培养基或重组抗体制剂在室温下培养2小时。用辣根过氧化
物酶轭合的山羊抗人Fc-γ特异性抗体(Jackson Immuno Research，Europe Ltd.，剑桥郡，
英国)来测定人IgG与感兴趣抗原的结合，接着使用TMB底物溶液(TMB，Sigma公司，布克斯，
瑞士)测量HRP活性。
闭1小时。患者血清、B细胞条件培养基或重组抗体制剂在室温下培养2小时。用辣根过氧化
物酶轭合的山羊抗人Fc-γ特异性抗体(Jackson Immuno Research，Europe Ltd.，剑桥郡，
英国)来测定人IgG与感兴趣抗原的结合，接着使用TMB底物溶液(TMB，Sigma公司，布克斯，
瑞士)测量HRP活性。
[0289] 实施例2：本发明的抗体的EC50的ELISA确定
[0290] 通过ELISA来测定本发明的示例性抗-IL-32抗体与IL-32γ(R&D公司)或IL-32α(ImmunoTools公司)结合的EC50。将MAB的系列稀释液(从100000ng/ml下降到1.69ng/ml)用
涂覆有抗原的板(以1μg/ml在PBS中涂覆整晚，接着用含有2％的BSA的PBS清洗和封闭)培养
2小时。随后对板进行清洗，并且利用抗人HRP轭合的Fc-γ特异性二级抗体(Jackson
ImmunoResearch，Europe Ltd.，剑桥郡，英国)来检测MAB的结合。使用Prism 4GraphPad软
件在通过标绘浓度对数与OD 450nm测量值获得的S型剂量-应答曲线(可变斜率，4个参数)
上计算引起与各抗原的最大结合的一半的MAB浓度(EC50,ng/ml)；关于结果参见图3和下表
4。
涂覆有抗原的板(以1μg/ml在PBS中涂覆整晚，接着用含有2％的BSA的PBS清洗和封闭)培养
2小时。随后对板进行清洗，并且利用抗人HRP轭合的Fc-γ特异性二级抗体(Jackson
ImmunoResearch，Europe Ltd.，剑桥郡，英国)来检测MAB的结合。使用Prism 4GraphPad软
件在通过标绘浓度对数与OD 450nm测量值获得的S型剂量-应答曲线(可变斜率，4个参数)
上计算引起与各抗原的最大结合的一半的MAB浓度(EC50,ng/ml)；关于结果参见图3和下表
4。
[0291]
[0292] 表3：MAB与IL-32γ和IL-32α结合的EC50值的汇总
[0293] 在测试的最高浓度(100μg/ml)时，MAB 14B3、19A1、26A6与IL-32α不结合。MAB 2C2仅在非常高的浓度时与IL-32α结合，表明了EC50结合高于30μg/ml。
[0294] 实施例3：IL-6中和测定
[0295] 对所研究的细胞因子应答的细胞系执行中和测定。结合至受体的配体通常激活对应的信号传导通路，使转录因子易位至细胞核，并且上调应答者基因(responder gene)转
录、翻译以及(如果适用)产品分泌。从剂量-应答曲线的线性部分的始端选择所使用的细胞
因子浓度，以使测定的灵敏度最大化。为了测试抗体的中和能力，利用血清的系列稀释液、
上清液的或纯化的抗体样本预培养最佳浓度的靶细胞因子。结果被表示为示出介于阳性对
照和阴性对照之间的中间值的抗体的滴度或浓度。虽然尚未报道白细胞介素-32受体，但是
已知的是，白细胞介素-32可以在体内或在体外诱导来自单核细胞/巨噬细胞的其他炎性细
胞因子(诸如IL-6)(Shoda等人,Arthritis Res Ther.8(2006)；R166)。因此，在本发明的中
和测定中，所分泌的IL-6可以是且用作IL-32活性的读出(readout)和用市售ELISA试剂盒
(Biolegend公司)来定量。
录、翻译以及(如果适用)产品分泌。从剂量-应答曲线的线性部分的始端选择所使用的细胞
因子浓度，以使测定的灵敏度最大化。为了测试抗体的中和能力，利用血清的系列稀释液、
上清液的或纯化的抗体样本预培养最佳浓度的靶细胞因子。结果被表示为示出介于阳性对
照和阴性对照之间的中间值的抗体的滴度或浓度。虽然尚未报道白细胞介素-32受体，但是
已知的是，白细胞介素-32可以在体内或在体外诱导来自单核细胞/巨噬细胞的其他炎性细
胞因子(诸如IL-6)(Shoda等人,Arthritis Res Ther.8(2006)；R166)。因此，在本发明的中
和测定中，所分泌的IL-6可以是且用作IL-32活性的读出(readout)和用市售ELISA试剂盒
(Biolegend公司)来定量。
[0296] 使RAW 264.7巨噬细胞处于无血清DMEM中适应过夜。于37℃下在96孔培养板的孔中用无血清DMEM中表达指示单克隆抗体的HEK293T细胞的无血清上清液的连续稀释液预培
养IL-32γ(R&D公司，终浓度50ng/ml)2个小时。以每孔10000个细胞加入细胞，并于37℃下
在CO2培养箱中培养18小时。接着，利用IL-6的分泌来监测本发明的抗IL-32抗体的中和活
性；参见图4B。
养IL-32γ(R&D公司，终浓度50ng/ml)2个小时。以每孔10000个细胞加入细胞，并于37℃下
在CO2培养箱中培养18小时。接着，利用IL-6的分泌来监测本发明的抗IL-32抗体的中和活
性；参见图4B。
[0297] 实施例4：受试者抗体的验证
[0298] 耳炎症测定
[0299] 通过在既定的第1天、第4天、第6天和第8天隔天地使用30号针头向8周龄C57BL/6J(WT；来自Charles River公司)小鼠的每只耳朵中皮内注射含人细胞因子IL-32γ或IgG对
照的20μl的PBS(或PBS对照)(20μl/耳、125ng/耳、250μg/小鼠/天)，诱发小鼠耳炎症表型。
关于本发明的示例性抗IL-322C2抗体减少所诱发的耳部发炎表型的中和潜力，在这些动物
上测试使用该抗体的治疗。在耳部炎症的诱发之前，在第0天对动物施用仅一次2C2或对照
人IgG的IP(腹腔内)注射[200μg、100μg或50μg/IP]。在第11天处死小鼠。
照的20μl的PBS(或PBS对照)(20μl/耳、125ng/耳、250μg/小鼠/天)，诱发小鼠耳炎症表型。
关于本发明的示例性抗IL-322C2抗体减少所诱发的耳部发炎表型的中和潜力，在这些动物
上测试使用该抗体的治疗。在耳部炎症的诱发之前，在第0天对动物施用仅一次2C2或对照
人IgG的IP(腹腔内)注射[200μg、100μg或50μg/IP]。在第11天处死小鼠。
[0300] 为了测试本发明的抗体的潜在治疗效果，通过IL-32注射之前的每日测量在IL-32给药期间利用Mitutoyo数字测微计进行动物的耳厚度测量。
[0301] 此外，在治疗期间已经监测体重，然而，由于施用治疗，未在任何的动物组中观察到显著的重量变化；参见图7。此外，处死动物后，执行耳朵的H&E(苏木紫(hematoxylin)和
曙红(eosin)；参见Harris,H.F.,J.Appl.Microscopy III(1900),777-781和Mallory,
F.B.:Pathological technique.Philadelphia,Saunders,1938)组织学染色。
曙红(eosin)；参见Harris,H.F.,J.Appl.Microscopy III(1900),777-781和Mallory,
F.B.:Pathological technique.Philadelphia,Saunders,1938)组织学染色。
[0302] 两个独立实验的组合表明，在2C2中和抗体存在时通过皮内注射人IL-32γ对耳部肿胀的诱导降低；参见图5和6。对于100μg(各50μg/IP)的较低抗体剂量，这在第9天是显著
的；参见图5C、D和图6C、D。对于200μg/IP的最高剂量，甚至从第5天开始就可观察到耳部肿
胀的显著减少；参见图5B和图6B。连续皮内注射PBS对照之后的耳部肿胀的水平不受IgG或
2C2的存在的影响；参见图6A-D。
的；参见图5C、D和图6C、D。对于200μg/IP的最高剂量，甚至从第5天开始就可观察到耳部肿
胀的显著减少；参见图5B和图6B。连续皮内注射PBS对照之后的耳部肿胀的水平不受IgG或
2C2的存在的影响；参见图6A-D。
[0303] 示例性抗IL-32抗体2C2表明了剂量依赖性影响，并能中和小鼠模型中所注射的IL-32γ。此外，如图9和10中所示，在CytoEar测定中与抗体2C2相比，抗体19A1有效地中和
了hIL-32γ诱导的炎症。因此，本文呈现的数据表明了，在细胞因子诱导的耳部炎症实验中
本发明的抗IL-32抗体针对IL-32γ是有效的，说明本发明的IL-32特异性结合分子的治疗
价值。
了hIL-32γ诱导的炎症。因此，本文呈现的数据表明了，在细胞因子诱导的耳部炎症实验中
本发明的抗IL-32抗体针对IL-32γ是有效的，说明本发明的IL-32特异性结合分子的治疗
价值。
[0304] CytoAnkle测定：
[0305] 尽管事实是还未有IL-32的小鼠同源物被鉴定出，但由于例如如上文所描述的所诱导的耳部肿胀表型，存在小鼠中也存在IL-32通路的至少一些成员的迹象。此外，Joosten
等人(2006年)已将人IL-32注入小鼠的膝关节中，这导致诱发关节肿胀，并使用这样的实验
作为用于RA的模型。还进行了与本发明有关的这类实验，然而，已证明在IL-32注射后动物
没有可测量的肿胀，这可能是由于通过介入肌肉组织测量膝盖厚度的难度。由于这个事实，
如下所述，本发明建立了一种新测定，以测试小鼠中IL-32特别是本发明的示例性抗IL-32
抗体的效果。
等人(2006年)已将人IL-32注入小鼠的膝关节中，这导致诱发关节肿胀，并使用这样的实验
作为用于RA的模型。还进行了与本发明有关的这类实验，然而，已证明在IL-32注射后动物
没有可测量的肿胀，这可能是由于通过介入肌肉组织测量膝盖厚度的难度。由于这个事实，
如下所述，本发明建立了一种新测定，以测试小鼠中IL-32特别是本发明的示例性抗IL-32
抗体的效果。
[0306] 在该测定中，每48-72小时将含有62.5-250ng细胞因子(例如，IL-32同型(诸如IL-32γ或IL-32α)或几种IL-32同型的混合物)的10μl的PBS(或PBS对照)关节内(IA)注射到小
鼠群组(C57/BL6，7-8周龄)的踝关节中。然后用Mitutoyo数字测微计进行轴向踝关节厚度
测量。每天对动物进行称重，并且在用异氟醚对小鼠进行麻醉时施用相应一种或多种IL-32
同型。按如上所示的设计针对耳朵炎症测定的实验时间架构(time frame)，如上所述，通过
注射本发明的一种或多种抗IL-32抗体，各对照组获得具有IL32非相关结合特异性的PBS或
人IgG。使用踝关节肿胀的降低作为本发明的抗体的治疗效果的读出。
鼠群组(C57/BL6，7-8周龄)的踝关节中。然后用Mitutoyo数字测微计进行轴向踝关节厚度
测量。每天对动物进行称重，并且在用异氟醚对小鼠进行麻醉时施用相应一种或多种IL-32
同型。按如上所示的设计针对耳朵炎症测定的实验时间架构(time frame)，如上所述，通过
注射本发明的一种或多种抗IL-32抗体，各对照组获得具有IL32非相关结合特异性的PBS或
人IgG。使用踝关节肿胀的降低作为本发明的抗体的治疗效果的读出。
[0307] 此外，在治疗期间监测抗IL-32抗体治疗的动物和对照动物的体重，并且在处死动物之后进行耳部的H&E(苏木紫和曙红)组织学染色。
[0308] 图11示出了CytoAnkle测定的示例性实验设置(图11A、B)和在CytoAnkle测定中的IL-32在诱导炎症方面的剂量依赖性(图11C、D)。如图12中还示出的，在CytoAnkle测试中可
确定2C2抗体的抗IL-32炎症效果(图12C-E)。
确定2C2抗体的抗IL-32炎症效果(图12C-E)。
[0309] 实施例5：示例性IL-32抗体的表位作图
[0310] 作为作图的第一步，检查IL-32MAB与不同抗原结合位点的不同结合，以确定不同结合位点的数目。
[0311] 为此，使用了两种方法。在第一种方法中，用人(hMAB)或小鼠(hmMAB)Fc表达MAB，并且通过在板上涂覆抗原和通过在大量过量的人MAB的存在下检测hmMAB的结合来进行交
叉竞争实验。通过针对一级抗体的Fc部分的HRP轭合的二级抗体来进行对结合至配体的
hmMAB的检测。
叉竞争实验。通过针对一级抗体的Fc部分的HRP轭合的二级抗体来进行对结合至配体的
hmMAB的检测。
[0312] 随后通过PepStarTM分析尝试用MAB与其各抗原的结合区作图。本文中，设计了重叠20聚体肽(15个氨基酸重叠)以覆盖感兴趣IL-32同型，例如IL-32γ、IL-32α、IL-32δ、IL32β
和余下的同型5和6，包括所有已知的变体。将肽和全长抗原(作为阳性对照)点在微阵列上，
并且利用一级抗体，然后针对一级抗体的Fc部分的荧光标记的二级抗体来培养肽微阵列。
为了避免由位阻引起的假阴性，在玻璃表面和抗原衍生的肽序列之间插入优化的亲水接头
部分。
和余下的同型5和6，包括所有已知的变体。将肽和全长抗原(作为阳性对照)点在微阵列上，
并且利用一级抗体，然后针对一级抗体的Fc部分的荧光标记的二级抗体来培养肽微阵列。
为了避免由位阻引起的假阴性，在玻璃表面和抗原衍生的肽序列之间插入优化的亲水接头
部分。
[0313] 实施例6：使用SPR技术的抗体亲和力测量
[0314] 对于本发明的抗体的亲和力测定，使用ProteOnTMXPR36仪器，根据制造商的使用说明书(BIO-RAD公司；Hercules CA，美国)在类似的实验装置中使用本发明的感兴趣分子进
行表面等离子共振SPR测量，如在国际申请WO2013/098419A1第163-165页的实施例14中描
述的，该国际申请的公开内容通过引用并入到本文中。通过该方法，通过SPR已测定本发明
的示例性IL-32抗体2C2的亲和力在约4nM的纳摩尔范围中；参见图8和图8C中的表。
行表面等离子共振SPR测量，如在国际申请WO2013/098419A1第163-165页的实施例14中描
述的，该国际申请的公开内容通过引用并入到本文中。通过该方法，通过SPR已测定本发明
的示例性IL-32抗体2C2的亲和力在约4nM的纳摩尔范围中；参见图8和图8C中的表。
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