用于细胞植入的补片植入物组合物
阅读：355发布：2020-05-08
专利汇可以提供用于细胞植入的补片植入物组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了通过植入策略来将细胞移植到实体器官中的组合物和方法。这些方法和组合物可用于修复患病器官或在实验宿主中建立 疾病 状态模型。所述方法涉及将 补片 植入物 即“绷带样” 覆盖 物附接至组织或器官的表面，所述“绷带样”覆盖物含有上皮细胞以及支持性早期谱系期间充质细胞。所述细胞被结合到凝胶形成 生物 材料 中，所述生物材料在无血清、确定条件下制备，所述条件共同支持所述供 体细胞 的干性。所述植入物覆盖有可 生物降解 的、 生物相容性 的、可生物再吸收的基底，所述基底用于将所述植入物固定于靶标部位。所述植入物中的所述细胞迁移到所述组织并且在整个所述组织中迁移，使得它们在两周内均匀分散于所述接受者(宿主)组织内。供体细胞植入和整合到所述器官或组织中的机制涉及MMP的多个膜相关和分泌形式。，下面是用于细胞植入的补片植入物组合物专利的具体信息内容。
1.一种用于保持和维持混合细胞群的补片植入物，所述补片植入物包括：
(a)具有两种或更多种细胞类型的混合群，其中至少一种类型处于能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的早期谱系期，所述混合群被支持于水凝胶中的培养基中，所述水凝胶具有足以允许所述混合群在所述补片植入物内或远离所述补片植入物迁移的粘弹性；以及
(b)包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述混合群在所述基底或屏障的方向上迁移的粘弹性，
所述补片植入物被构造为保持和维持所述混合群，同时抑制所述至少一种早期谱系期细胞类型分化或进一步成熟为不再能够表达膜相关的和/或分泌的MMP的晚期谱系期。
2.如权利要求1所述的补片植入物，其中所述基底包括输注有水凝胶的多孔网。
3.如权利要求1所述的补片植入物，还包括：
(c)重叠在所述基底的浆膜表面上的水凝胶，所述浆膜表面与接触所述混合群的表面相对。
4.如权利要求1所述的补片植入物，其中要素(a)的所述水凝胶包含一种或多种透明质酸。
5.如权利要求2所述的补片植入物，其中要素(b)的所述水凝胶包含一种或多种透明质酸。
6.如权利要求3所述的补片植入物，其中要素(c)的所述水凝胶包含一种或多种透明质酸。
7.如权利要求1所述的补片植入物，其中所述培养基包括库部塔培养基或支持“干性”的其他培养基。
8.如权利要求1所述的补片植入物，其中所述混合群包含间充质细胞和上皮细胞。
9.如权利要求8所述的补片植入物，其中所述间充质细胞包括早期谱系期间充质细胞(ELSMC)。
10.如权利要求9所述的补片植入物，其中所述ELSMC包括成血管细胞、内皮的前体、或星状细胞的前体或间充质干细胞(MSC)中的一者或多者。
11.如权利要求8所述的补片植入物，其中所述上皮细胞包括上皮干细胞。
12.如权利要求8所述的补片植入物，其中所述上皮细胞包括胆系干细胞(BTSC)。
13.如权利要求8所述的补片植入物，其中所述上皮细胞包括定向和/或成熟上皮细胞。
14.如权利要求13所述的补片植入物，其中所述定向和/或成熟上皮细胞包括成熟实质细胞。
15.如权利要求14所述的补片植入物，其中所述成熟实质细胞包括肝细胞、胆管上皮细胞和胰岛细胞中的一者或多者。
16.如权利要求8所述的补片植入物，其中所述间充质细胞和上皮细胞二者均包括干细胞。
17.如权利要求1所述的补片植入物，其中所述混合群包含自体和/或同种异体细胞。
18.如权利要求1所述的补片植入物，其中一种或多种细胞类型是经遗传修饰的。
19.如权利要求1所述的补片植入物，其中所述基底包括多孔网、支架或膜。
20.如权利要求1所述的补片植入物，其中所述基底包含无孔材料。
21.如权利要求20所述的补片植入物，其中所述无孔材料选自丝、羊膜、胎盘、网膜、合成织物、前述的衍生物、或它们的组合。
22.如权利要求1所述的补片植入物，其中所述基底具有足以承受机械力的弹性，能够栓系至靶标器官或组织，并且具有足以栓系至具有弯曲的位置的柔性。
23.如权利要求1所述的补片植入物，其中可以采用任何生物材料(除水凝胶之外)，条件是所述生物材料能够保持和维持所述细胞群，并且具有足以允许所述细胞群在所述补片植入物内或远离所述补片植入物迁移的流变性质(例如，粘弹性)。
24.一种用于保持和维持细胞群的补片植入物，所述补片植入物包括：
(a)细胞群(任选地单个类型的细胞群)，所述细胞群被支持于水凝胶或具有足以允许所述细胞在所述补片植入物内或远离所述补片植入物迁移的流变性质(例如，粘弹性)的其他生物材料中的培养基中；以及
(b)包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述细胞群在所述基底的方向上迁移(或提供迁移的屏障)的粘弹性。
25.一种用于补片植入物或组织的覆盖物或涂层，所述覆盖物或涂层包含水凝胶或具有足以承受机械力的粘弹性和弹性的其他生物材料，所述机械力包括诸如来自其他组织和器官的力。
26.一种防止涉及或由机械力或来自其他器官和组织的接触产生的粘连的方法，所述方法包括用水凝胶或其他可比的生物材料覆盖或涂覆表面。
27.一种将细胞植入靶标组织的方法，所述方法包括使所述靶标组织与补片植入物接触，所述补片植入物包括：
(a)具有两种或更多种细胞类型的混合群，其中至少一种类型处于能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的早期谱系期，所述混合群被支持于水凝胶中的培养基中，所述水凝胶具有足以允许所述混合群朝向靶标组织迁移和迁移到所述靶标组织中的粘弹性；以及
(b)包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述混合群远离靶标组织和穿过所述基底或屏障迁移的粘弹性。
28.如权利要求27所述的方法，还包括允许所述补片植入物中含有的所述细胞结合到所述组织中。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述靶标组织选自肝脏、胰腺、胆系、甲状腺、胸腺、胃肠道、肺、前列腺、乳腺、脑、膀胱、脊髓、皮肤、子宫、肾脏、肌肉、血管、心脏、软骨、肌腱和骨骼组织。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述靶标组织是肝脏组织。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述靶标组织是胰腺组织。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述靶标组织是胆系组织。
33.如权利要求29所述的方法，其中所述靶标组织是胃肠道组织。
34.如权利要求29所述的方法，其中所述靶标组织是肾脏组织。
35.如权利要求29所述的方法，其中所述靶标组织是器官。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述器官是肌肉骨骼系统、消化系统、呼吸系统、泌尿系统、女性生殖系统、男性生殖系统、内分泌系统、循环系统、淋巴系统、神经系统或外皮系统的器官。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述器官选自肝脏、胰腺、胆系、甲状腺、胸腺、肠、肺、前列腺、乳腺、脑、膀胱、脊髓、皮肤、子宫、肾脏、肌肉、血管、心脏、软骨、肌腱和骨骼。
38.一种将细胞植入靶标组织的方法，所述方法包括使靶标组织与补片植入物接触，所述补片植入物包括：
(a)细胞群，包括具有早期谱系期的一个群体，所述群体包含单个类型或多个类型的细胞，所述细胞被支持于水凝胶或具有足以允许所述群体的细胞在所述补片植入物内或远离所述补片植入物迁移的流变性质(例如，粘弹性)的其他生物材料中的培养基中；以及(b)包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述群体的细胞在所述基底的方向上迁移(或提供迁移的屏障)的流变性质(例如，粘弹性)，
所述补片植入物被构造为保持和维持所述细胞群，同时抑制所述具有早期谱系期的一个群体分化或进一步成熟为晚期谱系期。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述具有早期谱系期的一个群体能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)。
40.一种治疗患有肝脏疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括使所述受试者的肝脏接触补片植入物，所述补片植入物包括：(a)具有两种或更多种细胞类型的混合群，其中至少一种类型处于能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的早期谱系期，所述混合群被支持于水凝胶中的培养基中，所述水凝胶具有足以允许所述混合群朝向靶标组织迁移和迁移到所述靶标组织中的粘弹性；以及
(b)包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述混合群在远离所述靶标组织的方向上和穿过所述基底或屏障迁移的粘弹性，以及
允许所述补片植入物中含有的所述细胞结合到所述肝脏中，从而恢复某种肝功能。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述肝脏疾病或障碍是肝纤维化、肝硬化、血色素沉着症、肝癌、胆道闭锁、非酒精性脂肪肝疾病、肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、片吸虫病、酒精性肝病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、II型糖原贮积症、转甲状腺素蛋白相关的遗传性淀粉样变性、吉尔伯特综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、巴德-吉亚利(Budd-Chiari)综合征、肝脏创伤或威尔逊病。
42.一种治疗患有胰腺疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括使所述受试者的胰腺接触补片植入物，所述补片植入物包括：(a)具有两种或更多种细胞类型的混合群，其中至少一种类型处于能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的早期谱系期，所述混合群被支持于水凝胶中的培养基中，所述水凝胶具有足以允许所述混合群朝向靶标组织迁移和迁移到所述靶标组织中的粘弹性；以及
(b)包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述混合群在远离所述靶标组织的方向上和穿过所述基底或屏障迁移的粘弹性，以及
允许所述补片植入物中含有的所述细胞结合到所述胰腺中，从而恢复某种胰腺功能。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述胰腺疾病或障碍是糖尿病、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、胰腺癌、奥迪(Oddi)括约肌功能障碍、囊性纤维化、胰腺分裂、环状胰腺、胰腺创伤或胰管出血。
44.一种治疗患有胃肠道疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括使所述受试者的一个或多个肠接触补片植入物，所述补片植入物包括：(a)具有两种或更多种细胞类型的混合群，其中至少一种类型处于能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的早期谱系期，所述混合群被支持于水凝胶中的培养基中，所述水凝胶具有足以允许所述混合群朝向靶标组织迁移和迁移到所述靶标组织中的粘弹性；以及
(b)包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述混合群在远离所述靶标组织的方向上和穿过所述基底或屏障迁移的粘弹性，以及
允许所述补片植入物中含有的所述细胞结合到所述肠中，从而恢复某种肠功能。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述胃肠道疾病或障碍是肠胃炎、胃肠道癌、回肠炎、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、消化性溃疡病、乳糜泻、纤维化、血管发育不良、赫希施普龙病、假膜性结肠炎或胃肠道创伤。
46.一种治疗患有肾脏疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括使所述受试者的一个或多个肾脏接触补片植入物，所述补片植入物包括：(a)具有两种或更多种细胞类型的混合群，其中至少一种类型处于能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的早期谱系期，所述混合群被支持于水凝胶中的培养基中，所述水凝胶具有足以允许所述混合群朝向靶标组织迁移和迁移到所述靶标组织中的粘弹性；以及
(b)包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述混合群在远离所述靶标组织的方向上和穿过所述基底或屏障迁移的粘弹性，以及
允许所述补片植入物中含有的所述细胞结合到所述肾脏中，从而恢复某种肾脏功能。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述肾脏疾病或障碍是肾炎、肾病、肾炎综合征、肾病综合征、慢性肾病、急性肾损伤、肾脏创伤、囊性肾病、多囊性肾病、肾小球肾炎、IgA肾病、狼疮性肾炎、肾癌、奥尔波特(Alport)综合征、淀粉样变性、古德巴斯捷氏综合征或韦格纳氏肉芽肿病。
用于细胞植入的补片植入物组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2017年6月12日提交的美国专利申请号62/518,380和2018年4月30日提交的美国专利申请号62/664,694的优先权，这些
专利申请的内容据此以引用的方式整体并入。
专利申请的内容据此以引用的方式整体并入。
技术领域
[0003] 本发明整体涉及细胞移植或组织植入领域。更具体而言，涉及从实体器官或组织向实体器官或组织的植入，尤其是向内部器官的植入。本发明涉及提供用于将细胞快速移
植、植入和整合到实体器官和组织，以治疗实体器官或组织的疾病或病症，或建立疾病的模型系统的策略的组合物和方法。这种潜力的代表性实例是用于治疗肝脏或胰腺疾病的细胞
疗法。
植、植入和整合到实体器官和组织，以治疗实体器官或组织的疾病或病症，或建立疾病的模型系统的策略的组合物和方法。这种潜力的代表性实例是用于治疗肝脏或胰腺疾病的细胞
疗法。
背景技术
[0004] 长期以来，一直需要用于来自实体器官的细胞的植入策略、不同于用于造血细胞移植或用于间充质干/祖细胞移植的策略。Turner,R.等人Transplantation90,807-810
(2010)；Gattinoni,L.等人Nature Medicine 23,18-27(2017)；Trounson A.等人Cell
Stem Cell 17,11-22(2015)；Sun B.K.等人Science 346,941-945(2014)；Lainas,P.等人J Hepatol 49,354-362(2008)。造血细胞和间充质细胞的移植通常通过经由血管沟的细胞递
送来进行，并且由于微环境信号传导(一种称为“归巢”的过程)，当在相关靶标部位中时，取决于所移植的细胞中粘附分子的活化。用于皮肤的方法(对于眼睛靶标使用类似的方法)采
用将细胞直接施加于靶标部位的植入方法。Sun B.K.等人Science 346,941-945(2014)。很多用于皮肤的植入方法可用于来自实体内部器官的细胞，但是需要进行大量修饰，以使这
些细胞适应这些内部器官的微环境。植入物必须与组织和器官的彼此相互作用所施加的机
械力抗衡；实例包含在呼吸过程中肺的作用，或肝脏对隔膜的压迫，或在食物加工期间肠道对邻近组织所施加的机械力的瞬时作用。植入物，尤其是用于内部器官的那些植入物，由于除明显的动态机械力之外的大小、形状和器官结构的复杂性方面的问题，在设计上是具有
挑战性的。
(2010)；Gattinoni,L.等人Nature Medicine 23,18-27(2017)；Trounson A.等人Cell
Stem Cell 17,11-22(2015)；Sun B.K.等人Science 346,941-945(2014)；Lainas,P.等人J Hepatol 49,354-362(2008)。造血细胞和间充质细胞的移植通常通过经由血管沟的细胞递
送来进行，并且由于微环境信号传导(一种称为“归巢”的过程)，当在相关靶标部位中时，取决于所移植的细胞中粘附分子的活化。用于皮肤的方法(对于眼睛靶标使用类似的方法)采
用将细胞直接施加于靶标部位的植入方法。Sun B.K.等人Science 346,941-945(2014)。很多用于皮肤的植入方法可用于来自实体内部器官的细胞，但是需要进行大量修饰，以使这
些细胞适应这些内部器官的微环境。植入物必须与组织和器官的彼此相互作用所施加的机
械力抗衡；实例包含在呼吸过程中肺的作用，或肝脏对隔膜的压迫，或在食物加工期间肠道对邻近组织所施加的机械力的瞬时作用。植入物，尤其是用于内部器官的那些植入物，由于除明显的动态机械力之外的大小、形状和器官结构的复杂性方面的问题，在设计上是具有
挑战性的。
[0005] 几十年来，尝试使用经由血管途径或通过直接注射到组织中的移植来进行针对来自除皮肤之外的实体器官的细胞的细胞疗法。当通过这些策略中的任何一种递送时，大多
数移植的细胞会死亡或被运输到异位部位，它们可以在这些部位存活数月并且在不合适的
部位形成组织，从而可能产生临床不良反应。Turner,R.等人Transplantation 90,807-810(2010)；Lanzoni,G.等人Stem Cells 31,2047-2060(2013)。通过用透明质酸涂覆细胞并且将它们经血管递送至肝脏可以改善肝脏的植入；植入效率的提高是由于肝脏对透明质酸的
自然清除过程。Nevi等人Stem Cell Research&Therapy 8,68,2017。然而，这些改善仍然不如植入策略的改善有效，并且重要的是，仍然允许细胞至异位部位的递送。
数移植的细胞会死亡或被运输到异位部位，它们可以在这些部位存活数月并且在不合适的
部位形成组织，从而可能产生临床不良反应。Turner,R.等人Transplantation 90,807-810(2010)；Lanzoni,G.等人Stem Cells 31,2047-2060(2013)。通过用透明质酸涂覆细胞并且将它们经血管递送至肝脏可以改善肝脏的植入；植入效率的提高是由于肝脏对透明质酸的
自然清除过程。Nevi等人Stem Cell Research&Therapy 8,68,2017。然而，这些改善仍然不如植入策略的改善有效，并且重要的是，仍然允许细胞至异位部位的递送。
[0006] 仍然需要细胞向实体器官的植入的改善的方法。本公开满足了这种需要并且提供了相关的优点。
发明内容
[0007] 长期以来，一直需要用于来自实体器官的细胞的植入策略(Turner,R.等人,Transplantation 90,807-810(2010))，不同于用于造血细胞、间充质干细胞移植或用于皮肤的策略。造血细胞和间充质细胞的移植通常经由血管沟来进行，并且由于微环境信号传
导(一种称为“归巢”的过程)，取决于相关靶标部位中粘附分子的活化。用于皮肤的方法采用将细胞直接施加于靶标部位的植入方法。
导(一种称为“归巢”的过程)，取决于相关靶标部位中粘附分子的活化。用于皮肤的方法采用将细胞直接施加于靶标部位的植入方法。
[0008] 来自除皮肤之外的实体器官的细胞的移植已长期用于血管输送。这是不合逻辑的，因为这些细胞上的粘附分子始终是活化的，并且导致快速(几秒钟)细胞聚集，所述细胞聚集可以产生危及生命的栓塞。即使成功地控制栓塞从而使健康风险降至最低，对于成体
细胞，细胞植入效率也很低(仅～20％)，对于干细胞/祖细胞，细胞植入效率甚至更低(<
5％)。大多数移植的细胞会死亡或被运输到异位部位，它们可以在这些部位存活数月，在不合适的部位形成组织，从而可能产生临床不良反应。植入靶标部位的一小部分细胞慢慢整
合，需要数周至数月才能成为组织的重要部分。如果细胞涂覆有透明质酸，并且由于组织的(例如肝脏的)透明质酸清除而经血管递送，则肝脏中的植入会有所改善。(Nevi等人,Stem Cell Research&Therapy 8,68,2017)。
细胞，细胞植入效率也很低(仅～20％)，对于干细胞/祖细胞，细胞植入效率甚至更低(<
5％)。大多数移植的细胞会死亡或被运输到异位部位，它们可以在这些部位存活数月，在不合适的部位形成组织，从而可能产生临床不良反应。植入靶标部位的一小部分细胞慢慢整
合，需要数周至数月才能成为组织的重要部分。如果细胞涂覆有透明质酸，并且由于组织的(例如肝脏的)透明质酸清除而经血管递送，则肝脏中的植入会有所改善。(Nevi等人,Stem Cell Research&Therapy 8,68,2017)。
[0009] 申请人提出了一种截然不同的方法，一种被发现甚至比用透明质酸涂覆细胞更成功的方法：将植入物直接放置于靶标部位的表面上，并且当它们处于增强移植的植入生物
材料的条件下时，使用植入生物材料和某些细胞的独特表型性状。这与用于皮肤的细胞疗
法的策略的一些方面相似，但是由于机械作用、彼此靠近的器官的磨损或压缩，以及由于特定器官周围的独特流体微环境和器官的大小、结构和复杂性，需要针对内部器官进行实质
性修改。
材料的条件下时，使用植入生物材料和某些细胞的独特表型性状。这与用于皮肤的细胞疗
法的策略的一些方面相似，但是由于机械作用、彼此靠近的器官的磨损或压缩，以及由于特定器官周围的独特流体微环境和器官的大小、结构和复杂性，需要针对内部器官进行实质
性修改。
[0010] 本文描述了用于细胞向组织和实体器官的移植的新型补片植入物组合物和方法。在一些实施方案中，所述方法和植入物适用于内部器官，它们的设计特征取决于细胞的成
熟水平，尤其是细胞为干细胞还是成熟细胞。在一些实施方案中，本文公开了用于补片植入物的供体细胞(任选地自体细胞或同种异体细胞)，这些供体细胞任选地作为细胞混合物或
类器官形式、上皮干细胞的聚集体及其天然的谱系期适合的间充质细胞搭配物–例如间充
质干细胞/祖细胞(诸如早期谱系期间充质细胞(ELSMC))被结合到植入物生物材料中。在一
些实施方案中，供体细胞是以成体上皮的细胞悬浮液结合到植入物材料中并且与间充质干
细胞/祖细胞(任选地ELSMC)以一定的比率搭配的成体细胞，所述比率被设计为优化干细
胞/祖细胞的膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的表达。在一些实施方案中，其他重要的变量是植入生物材料和基底材料，在对供体细胞的分化的作用中，要求这两种材料
是中性。
熟水平，尤其是细胞为干细胞还是成熟细胞。在一些实施方案中，本文公开了用于补片植入物的供体细胞(任选地自体细胞或同种异体细胞)，这些供体细胞任选地作为细胞混合物或
类器官形式、上皮干细胞的聚集体及其天然的谱系期适合的间充质细胞搭配物–例如间充
质干细胞/祖细胞(诸如早期谱系期间充质细胞(ELSMC))被结合到植入物生物材料中。在一
些实施方案中，供体细胞是以成体上皮的细胞悬浮液结合到植入物材料中并且与间充质干
细胞/祖细胞(任选地ELSMC)以一定的比率搭配的成体细胞，所述比率被设计为优化干细
胞/祖细胞的膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的表达。在一些实施方案中，其他重要的变量是植入生物材料和基底材料，在对供体细胞的分化的作用中，要求这两种材料
是中性。
[0011] 本公开的方面涉及用于保持和维持单细胞群或混合细胞群的补片植入物，所述补片植入物包含(a)单细胞类型或具有两种或更多种细胞类型的混合群，其中至少一种类型
处于能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)，或包含来自另一个来源的MMP
(例如，纯化的或重组MMP)的早期谱系期，所述细胞群或混合群被支持于水凝胶基质中存在的培养基中，所述水凝胶基质具有足以允许所述混合群迁移(任选地，在所述水凝胶内或远离所述水凝胶迁移和/或在所述补片植入物内或远离所述补片植入物迁移)的粘弹性；(b)
包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述混合群在所述基
底的方向上迁移的粘弹性；以及任选地(c)重叠在所述基底的浆膜(即外部)表面上的水凝
胶，所述浆膜表面与接触所述混合群的表面相对，并且在补片植入物栓系至靶标部位的实
施方案中，与接触靶标部位(例如器官或组织)的一侧相对。在一些实施方案中，该层通过其他组织或器官来防止或抑制粘连，或者防止或抑制与其他组织或器官的粘连。在一些实施
方案中，补片植入物被构造为保持和维持所述混合群，同时抑制所述至少一种早期谱系期
细胞类型分化或进一步成熟为不再能够表达膜相关的和/或分泌的MMP的晚期谱系期。补片
植入物可以是单层加基底或多层。
处于能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)，或包含来自另一个来源的MMP
(例如，纯化的或重组MMP)的早期谱系期，所述细胞群或混合群被支持于水凝胶基质中存在的培养基中，所述水凝胶基质具有足以允许所述混合群迁移(任选地，在所述水凝胶内或远离所述水凝胶迁移和/或在所述补片植入物内或远离所述补片植入物迁移)的粘弹性；(b)
包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述混合群在所述基
底的方向上迁移的粘弹性；以及任选地(c)重叠在所述基底的浆膜(即外部)表面上的水凝
胶，所述浆膜表面与接触所述混合群的表面相对，并且在补片植入物栓系至靶标部位的实
施方案中，与接触靶标部位(例如器官或组织)的一侧相对。在一些实施方案中，该层通过其他组织或器官来防止或抑制粘连，或者防止或抑制与其他组织或器官的粘连。在一些实施
方案中，补片植入物被构造为保持和维持所述混合群，同时抑制所述至少一种早期谱系期
细胞类型分化或进一步成熟为不再能够表达膜相关的和/或分泌的MMP的晚期谱系期。补片
植入物可以是单层加基底或多层。
[0012] 在一些实施方案中，所述基底是多孔的或无孔的。在一些实施方案中，基底包括多孔网、支架或膜。在一些实施方案中，基底包括丝；合成织物；或天然材料(诸如羊膜、胎盘或网膜)；或它们的组合。在一些实施方案中，所述基底包括输注有水凝胶的多孔网。在另外的实施方案中，此类输注防止远离靶标器官或组织的细胞迁移。在一些实施方案中，所述基底包括固体材料。
[0013] 在一些实施方案中，所述水凝胶中的一者或多者包括透明质酸。
[0014] 在一些实施方案中，所述培养基包括库部塔(Kubota’s)培养基或支持干细胞并且能够维持干性的另一种培养基。
[0015] 在一些实施方案中，所述混合群包含间充质细胞和上皮细胞。在一些实施方案中，所述上皮细胞可以是外胚层细胞、内胚层细胞或中胚层细胞。在一些实施方案中，所述间充质细胞包括早期谱系期间充质细胞(ELSMC)。在一些实施方案中，所述ELSMC包括成血管细胞、内皮的前体、星状细胞的前体和间充质干细胞(MSC)中的一者或多者。在一些实施方案中，所述上皮细胞包括上皮干细胞。在一些实施方案中，所述上皮细胞包括胆系干细胞
(BTSC)。在一些实施方案中，所述上皮细胞包括定向和/或成熟上皮细胞。在一些实施方案中，所述定向和/或成熟上皮细胞包括成熟实质细胞。在一些实施方案中，所述成熟实质细胞包括肝细胞、胆管上皮细胞和胰岛细胞中的一者或多者。在一些实施方案中，所述间充质细胞和上皮细胞二者都包括干细胞。
(BTSC)。在一些实施方案中，所述上皮细胞包括定向和/或成熟上皮细胞。在一些实施方案中，所述定向和/或成熟上皮细胞包括成熟实质细胞。在一些实施方案中，所述成熟实质细胞包括肝细胞、胆管上皮细胞和胰岛细胞中的一者或多者。在一些实施方案中，所述间充质细胞和上皮细胞二者都包括干细胞。
[0016] 在某个实施方案中，所述混合群包含自体细胞和/或同种异体细胞。
[0017] 在一些实施方案中，一种或多种细胞类型是经遗传修饰的。
[0018] 另外的方面涉及采用所公开的补片植入物组合物的方法。因此，本文提供了将细胞植入靶标组织中的方法，所述方法包括使靶标组织接触上文公开的补片植入物、由该步
骤组成或基本上由该步骤组成。
骤组成或基本上由该步骤组成。
[0019] 在所述方法的一些实施方案中，靶标组织选自肝脏、胰腺、胆系、甲状腺、胸腺、胃肠道、肺、前列腺、乳腺、脑、膀胱、脊髓、皮肤和皮下真皮组织、子宫、肾脏、肌肉、血管、心脏、软骨、肌腱和骨骼组织。在所述方法的一些实施方案中，靶标组织是肝脏组织。在所述方法的一些实施方案中，靶标组织是胰腺组织。在所述方法的一些实施方案中，靶标组织是胆系组织。在所述方法的一些实施方案中，靶标组织是胃肠道组织。在一些实施方案中，组织是患病的、受损的或患有障碍。在所述方法的一些实施方案中，靶标组织是肾组织。
[0020] 在所述方法的一些实施方案中，靶标组织是器官。在所述方法的一些实施方案中，器官是肌肉骨骼系统、消化系统、呼吸系统、泌尿系统、女性生殖系统、男性生殖系统、内分泌系统、循环系统、淋巴系统、神经系统或外皮系统的器官。在所述方法的一些实施方案中，器官选自肝脏、胰腺、胆系、甲状腺、胸腺、胃、肠、肺、前列腺、乳腺、脑、膀胱、脊髓、皮肤和皮下真皮组织、子宫、肾脏、肌肉、血管、心脏、软骨、肌腱和骨骼。在一些实施方案中，器官是患病的、受损的或患有障碍。
[0021] 本文还提供了治疗患有肝脏疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括使受试者的肝脏接触上文公开的补片植入物、由该步骤组成或基本上由该步骤组成。在所述方法的
一些实施方案中，肝脏疾病或障碍是肝纤维化、肝硬化、血色素沉着症、肝癌、胆道闭锁、非酒精性脂肪肝疾病、肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、片吸虫病、酒精性肝病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、II型糖原贮积症、转甲状腺素蛋白相关的遗传性淀粉样变性、吉尔伯特
(Gilbert’s)综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、巴德-吉亚利(Budd-
Chiari)综合征、肝脏创伤或威尔逊(Wilson)病。
一些实施方案中，肝脏疾病或障碍是肝纤维化、肝硬化、血色素沉着症、肝癌、胆道闭锁、非酒精性脂肪肝疾病、肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、片吸虫病、酒精性肝病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、II型糖原贮积症、转甲状腺素蛋白相关的遗传性淀粉样变性、吉尔伯特
(Gilbert’s)综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、巴德-吉亚利(Budd-
Chiari)综合征、肝脏创伤或威尔逊(Wilson)病。
[0022] 在其他方面，本文提供了治疗患有胰腺疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括使受试者的胰腺接触上文公开的补片植入物、由该步骤组成或基本上由该步骤组成。在
所述方法的一些实施方案中，胰腺疾病或障碍是糖尿病、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、胰腺癌、奥迪(Oddi)括约肌功能障碍、囊性纤维化、胰腺分裂、环状胰腺、胰腺创伤或胰管出血。
所述方法的一些实施方案中，胰腺疾病或障碍是糖尿病、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、胰腺癌、奥迪(Oddi)括约肌功能障碍、囊性纤维化、胰腺分裂、环状胰腺、胰腺创伤或胰管出血。
[0023] 在其他方面，本文提供了治疗患有胃肠道疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括使受试者的一条或多条肠子接触上文公开的补片植入物、由该步骤组成或基本上由该
步骤组成。在一些实施方案中，胃肠道疾病或障碍是肠胃炎、胃肠道癌、回肠炎、炎性肠病、克罗恩(Crohn’s)病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、消化性溃疡病、乳糜泻、纤维化、血管发育不良、赫希施普龙(Hirschsprung’s)病、假膜性结肠炎或胃肠道创伤。
步骤组成。在一些实施方案中，胃肠道疾病或障碍是肠胃炎、胃肠道癌、回肠炎、炎性肠病、克罗恩(Crohn’s)病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、消化性溃疡病、乳糜泻、纤维化、血管发育不良、赫希施普龙(Hirschsprung’s)病、假膜性结肠炎或胃肠道创伤。
[0024] 在一些方面，本文提供了治疗患有肾脏疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括使受试者的一个或多个肾接触上文公开的补片植入物、由该步骤组成或基本上由该步骤
组成。在所述方法的一些实施方案中，肾脏疾病或障碍是肾炎、肾病、肾炎综合征、肾病综合征、慢性肾病、急性肾损伤、肾脏创伤、囊性肾病、多囊性肾病、肾小球肾炎、IgA肾病、狼疮性肾炎、肾癌、奥尔波特(Alport)综合征、淀粉样变性、古德巴斯捷氏(Goodpasture)综合征或韦格纳氏(Wegener’s)肉芽肿病。
附图说明
组成。在所述方法的一些实施方案中，肾脏疾病或障碍是肾炎、肾病、肾炎综合征、肾病综合征、慢性肾病、急性肾损伤、肾脏创伤、囊性肾病、多囊性肾病、肾小球肾炎、IgA肾病、狼疮性肾炎、肾癌、奥尔波特(Alport)综合征、淀粉样变性、古德巴斯捷氏(Goodpasture)综合征或韦格纳氏(Wegener’s)肉芽肿病。
附图说明
[0025] 图1A-1D提供了关于针对补片植入物的猪供体细胞的信息。图1A是制备类器官、组装补片植入物和进行手术的过程和所需的预估时间的示意图。在图1B中，从来自转基因猪
的胆系组织的细胞悬浮液分离针对干细胞补片植入物的供体细胞；在无血清库部塔培养基
中和低贴壁培养皿上将细胞制成类器官。胆系干细胞(BTSC)及其早期谱系期间充质细胞
(ELSMC)搭配物、成血管细胞以及内皮和星状细胞前体的类器官。它们在相差显微照片中与展示出转基因、绿色荧光蛋白(GFP)表达的细胞对比显示。)。聚集体的所有细胞都是绿色
的，因为转基因存在于上皮细胞和间充质细胞中。转基因与组蛋白(H-2B)基因座偶联。石蜡包埋、切片和用苏木精/伊红染色的干细胞类器官的组织学。(d)BTSC和ELSMC的类器官的放大图。图1C显示了展示出干细胞、肝脏和胰腺标记物的表达的免疫组织化学(IHC)，这表明这些细胞是肝脏和胰腺二者的前体。IHC测定法通过中期干细胞标志物(诸如EpCAM)标示出
外层，并且标示出表达非常原始的基因(诸如多能性基因和内胚层转录因子(例如，SOX17、SOX9、PDX1))的内部细胞。图1D是评估各种基因在类器官中的表达的代表性qRT-PCR测定
法，这表明细胞是干细胞或早期祖细胞。对照是来自小猪肝脏的成熟肝细胞。
的胆系组织的细胞悬浮液分离针对干细胞补片植入物的供体细胞；在无血清库部塔培养基
中和低贴壁培养皿上将细胞制成类器官。胆系干细胞(BTSC)及其早期谱系期间充质细胞
(ELSMC)搭配物、成血管细胞以及内皮和星状细胞前体的类器官。它们在相差显微照片中与展示出转基因、绿色荧光蛋白(GFP)表达的细胞对比显示。)。聚集体的所有细胞都是绿色
的，因为转基因存在于上皮细胞和间充质细胞中。转基因与组蛋白(H-2B)基因座偶联。石蜡包埋、切片和用苏木精/伊红染色的干细胞类器官的组织学。(d)BTSC和ELSMC的类器官的放大图。图1C显示了展示出干细胞、肝脏和胰腺标记物的表达的免疫组织化学(IHC)，这表明这些细胞是肝脏和胰腺二者的前体。IHC测定法通过中期干细胞标志物(诸如EpCAM)标示出
外层，并且标示出表达非常原始的基因(诸如多能性基因和内胚层转录因子(例如，SOX17、SOX9、PDX1))的内部细胞。图1D是评估各种基因在类器官中的表达的代表性qRT-PCR测定
法，这表明细胞是干细胞或早期祖细胞。对照是来自小猪肝脏的成熟肝细胞。
[0026] 图2A-2F提供了关于补片植入物的主要组件的信息。图2A是固定至猪肝脏的补片植入物的示意图，右图是该植入物的组成。上皮细胞和间充质细胞二者的早期谱系期细胞
是产生植入的关键调节因子基质金属蛋白酶(MMP)的来源。供体细胞所放置的植入生物材
料的基质组分是软的(～100Pa)，未发生(或发生最小的)硫酸化，诸如透明质酸水凝胶。植入物的结构由生物材料层和栓系至靶标部位的细胞构成。培养基组分不含影响供体细胞分
化的血清、生长因子和细胞因子，并且应该是为早期谱系期细胞(诸如干细胞/祖细胞)的存活和扩增而定制的组分。基底具有足以用于手术程序的抗拉强度，但是在其对供体细胞(应避免I型胶原蛋白的细胞)分化的作用方面是中性的。基底浸渍涂覆有更稠的10×水凝胶
(～700Pa)，以作为使供体细胞的迁移定向至靶标组织和使粘连最小化的屏障。在附接至靶标部位后，添加2×HA水凝胶(充分流动以涂覆或涂布在浆膜表面)，并且该水凝胶用于使粘
连进一步最小化。图2B描绘了固定至宿主的肝脏或胰腺的植入物。图2C是植入物的示意图，它展示了构成植入物组合物的层。图2D描绘了凭经验评估特定水凝胶层的流变或粘弹性性
质(剪切和压缩机械力)的测定法的结果。图2E提供了3层水凝胶的粘弹性性质的配方。图2F是缝合至猪肝脏表面的补片植入物的近视图。
是产生植入的关键调节因子基质金属蛋白酶(MMP)的来源。供体细胞所放置的植入生物材
料的基质组分是软的(～100Pa)，未发生(或发生最小的)硫酸化，诸如透明质酸水凝胶。植入物的结构由生物材料层和栓系至靶标部位的细胞构成。培养基组分不含影响供体细胞分
化的血清、生长因子和细胞因子，并且应该是为早期谱系期细胞(诸如干细胞/祖细胞)的存活和扩增而定制的组分。基底具有足以用于手术程序的抗拉强度，但是在其对供体细胞(应避免I型胶原蛋白的细胞)分化的作用方面是中性的。基底浸渍涂覆有更稠的10×水凝胶
(～700Pa)，以作为使供体细胞的迁移定向至靶标组织和使粘连最小化的屏障。在附接至靶标部位后，添加2×HA水凝胶(充分流动以涂覆或涂布在浆膜表面)，并且该水凝胶用于使粘
连进一步最小化。图2B描绘了固定至宿主的肝脏或胰腺的植入物。图2C是植入物的示意图，它展示了构成植入物组合物的层。图2D描绘了凭经验评估特定水凝胶层的流变或粘弹性性
质(剪切和压缩机械力)的测定法的结果。图2E提供了3层水凝胶的粘弹性性质的配方。图2F是缝合至猪肝脏表面的补片植入物的近视图。
[0027] 图3A-3D描绘了肝脏补片植入物的免疫组织化学(IHC)和组织学结果。图3A示出了补片植入物一周时的三色染色结果。三色可识别胶原蛋白(蓝色)、细胞质(红色)和细胞核
(黑色)，并且被用于识别格利森氏(Glisson’s)囊(通常邻近肝脏小叶的表面)和粘连(在植入物的浆膜表面)。在浆膜表面的层中存在高水平的蓝色染色，这意味着与植入物粘连。另外，植入物在基底和宿主之间的界面处与宿主组织分离；由于在该界面处产生大量MMP，因此经常出现这种情况。重塑区提供了肝脏的经典小叶结构丧失的证据；它们会产生这样的
区：其中供体细胞迁移至组织，并且平行地改变宿主组织结构。在低放大率图(a)中，放置于肝脏上的植入物的三色染色证实发生了格利森氏囊的广泛重塑，并且通常会导致植入物和
宿主肝脏之间的分离。在高放大率图(b)中，重塑区非常宽并且由植入物附近的区域(c)(该处的肝脏小叶结构完全缺失)和其余肝脏小叶内的区(d)(在重塑过程中遭受破坏)构成。图
3B示出了补片植入物三周时的三色染色结果。植入物中的透明质酸已被再吸收，只留下基
底(a)。随着HA的再吸收，格利森氏囊重新出现(b)，并且植入物附近的肝脏小叶再次稳定为其典型的组织学模式，诸如肝脏的小叶和腺泡。(b)中的箭头指示了在格利森氏囊的再形成过程中胶原蛋白的重新出现。图3C和图3D示出了在植入后一周(C)和植入后两周(D)来自植
入物的切片的苏木精/伊红染色结果。上图为40×。图(a、b、c)中的部位是放大100×的放大图；每个这些放大图下面的矩形图放大200×。图中示出了植入物的3个部位：(a)基底和相
关植入物生物材料内的部位；(b)植入物和宿主组织之间的界面处的部位；以及(c)肝脏小
叶内的部位。苏木精/伊红染色得到有助于理解结合了炎性过程特征的植入和迁移过程的
图像。
(黑色)，并且被用于识别格利森氏(Glisson’s)囊(通常邻近肝脏小叶的表面)和粘连(在植入物的浆膜表面)。在浆膜表面的层中存在高水平的蓝色染色，这意味着与植入物粘连。另外，植入物在基底和宿主之间的界面处与宿主组织分离；由于在该界面处产生大量MMP，因此经常出现这种情况。重塑区提供了肝脏的经典小叶结构丧失的证据；它们会产生这样的
区：其中供体细胞迁移至组织，并且平行地改变宿主组织结构。在低放大率图(a)中，放置于肝脏上的植入物的三色染色证实发生了格利森氏囊的广泛重塑，并且通常会导致植入物和
宿主肝脏之间的分离。在高放大率图(b)中，重塑区非常宽并且由植入物附近的区域(c)(该处的肝脏小叶结构完全缺失)和其余肝脏小叶内的区(d)(在重塑过程中遭受破坏)构成。图
3B示出了补片植入物三周时的三色染色结果。植入物中的透明质酸已被再吸收，只留下基
底(a)。随着HA的再吸收，格利森氏囊重新出现(b)，并且植入物附近的肝脏小叶再次稳定为其典型的组织学模式，诸如肝脏的小叶和腺泡。(b)中的箭头指示了在格利森氏囊的再形成过程中胶原蛋白的重新出现。图3C和图3D示出了在植入后一周(C)和植入后两周(D)来自植
入物的切片的苏木精/伊红染色结果。上图为40×。图(a、b、c)中的部位是放大100×的放大图；每个这些放大图下面的矩形图放大200×。图中示出了植入物的3个部位：(a)基底和相
关植入物生物材料内的部位；(b)植入物和宿主组织之间的界面处的部位；以及(c)肝脏小
叶内的部位。苏木精/伊红染色得到有助于理解结合了炎性过程特征的植入和迁移过程的
图像。
[0028] 图4A-4C示出了在一周内植入、迁移并快速成熟为成体的命运。图4A是在一周后猪肝脏表面上的补片植入物的低放大率图。虚线表示植入物和宿主肝脏的界面。通过用GFP的抗体和偶联至红色荧光探针Novo Red的二抗标记来可视化供体GFP+细胞(细胞核为粉红
色；白色箭头表示具有大量供体GFP+干细胞的区域)。用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)将
细胞核染成蓝色，能够识别仅具有蓝色细胞核的宿主细胞和具有粉红色细胞核的供体细胞
(DAPI和Novo Red的合并图)。宿主组织(a)延伸至植入物的透明质酸(HA，黑色背景)；靠近基底的组织偶尔含有类器官(插图)，但是大多数供体细胞分散在单细胞中；在整个宿主组
织中可见大量分散的供体GFP+干细胞(b)。在构成重塑区的该区域中不存在格利森氏囊的
证据。图4B展示出供体细胞的植入和迁移是快速的；在一周内，所有供体细胞都在宿主肝脏内；在植入物部位附近以及肝脏叶的相对侧上均有供体细胞(与植入物的估算距离为至少
1.5cm)。正在进行的研究是分析更远距离处的小猪肝脏区(即肝脏的其他叶)，以更精确地
定义供体细胞在一段确定的时间期内能够迁移多远。图中示出了肝脏叶远离植入物部位一
侧上的宿主成熟肝细胞小叶(森林绿色来自脂褐素的自体荧光)附近的供体细胞(粉红色细
胞核)。图4C示出了与被再吸收的HA平行出现的供体细胞成熟为成体的命运。包含宿主肝细胞(颜色为森林绿色(脂褐素的自体荧光))附近的供体GFP+细胞(具有粉红色细胞核的单细
胞)的区域(a)的放大图，宿主肝细胞很容易与成熟供体来源(b)的肝细胞(颜色为淡紫色)
区分开(粉红色--GFP、蓝色—DAPI和绿色--脂褐素的合并图)，也就是说它们是从供体GFP+干细胞限制的谱系。通过其他IHC测定法(数据未示出)，宿主和供体肝细胞二者的平板中的亮春绿色细胞被证明是内皮和星状细胞。
色；白色箭头表示具有大量供体GFP+干细胞的区域)。用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)将
细胞核染成蓝色，能够识别仅具有蓝色细胞核的宿主细胞和具有粉红色细胞核的供体细胞
(DAPI和Novo Red的合并图)。宿主组织(a)延伸至植入物的透明质酸(HA，黑色背景)；靠近基底的组织偶尔含有类器官(插图)，但是大多数供体细胞分散在单细胞中；在整个宿主组
织中可见大量分散的供体GFP+干细胞(b)。在构成重塑区的该区域中不存在格利森氏囊的
证据。图4B展示出供体细胞的植入和迁移是快速的；在一周内，所有供体细胞都在宿主肝脏内；在植入物部位附近以及肝脏叶的相对侧上均有供体细胞(与植入物的估算距离为至少
1.5cm)。正在进行的研究是分析更远距离处的小猪肝脏区(即肝脏的其他叶)，以更精确地
定义供体细胞在一段确定的时间期内能够迁移多远。图中示出了肝脏叶远离植入物部位一
侧上的宿主成熟肝细胞小叶(森林绿色来自脂褐素的自体荧光)附近的供体细胞(粉红色细
胞核)。图4C示出了与被再吸收的HA平行出现的供体细胞成熟为成体的命运。包含宿主肝细胞(颜色为森林绿色(脂褐素的自体荧光))附近的供体GFP+细胞(具有粉红色细胞核的单细
胞)的区域(a)的放大图，宿主肝细胞很容易与成熟供体来源(b)的肝细胞(颜色为淡紫色)
区分开(粉红色--GFP、蓝色—DAPI和绿色--脂褐素的合并图)，也就是说它们是从供体GFP+干细胞限制的谱系。通过其他IHC测定法(数据未示出)，宿主和供体肝细胞二者的平板中的亮春绿色细胞被证明是内皮和星状细胞。
[0029] 图5A-5C比较了在移植后一周和两周后肝脏补片植入物中的细胞的植入和成熟。图5A是在补片植入后1周猪肝脏的检查。使用胶原蛋白染色的偶氮染料天狼星红染料，对连续3-μm切片进行泛细胞角蛋白(pCK)和Sox9的免疫组织化学；和免疫荧光(IF)染色。在补片植入物部位，所植入的供体细胞与肝脏小叶合并。在上图(原始放大率＝5×)中，补片植入
物由间充质和上皮pCK+细胞(箭头)组成。在中图中，提供了更高的放大率(20×)。上皮细胞显示出表达胆细胞角蛋白(pCK)和内胚层干细胞标志物Sox9的胆系干细胞(BTSC)典型的免
疫表型。补片植入物内的BTSC排列成再组装胆小管的细胞串(箭头)，并且与邻近的肝脏小
叶的肝细胞平板保持直接连续性(楔形符号)。小叶中的宿主肝细胞是pCK和Sox9阴性的。在下图(原始放大率＝20×)中，GFP的免疫荧光允许识别单个植入的细胞及其子代。邻近补片
植入物的小叶中的肝细胞是GFP阳性的，这表示这些细胞是已经与宿主肝脏实质合并的供
体细胞来源的细胞。在补片植入物和肝脏小叶之间的界面处，pCK+/GFP+小管(即供体来源的胆管上皮细胞)与小叶内的GFP+/pCK-细胞(供体来源的肝细胞)保持直接连续性(楔形符
号)，这表明植入细胞成熟为肝细胞的命运。图5B是在补片植入后2周猪肝脏的检查。IF染色显示，GFP+细胞存在于远离植入部位的小叶内。它们是均匀分散的，所以处于宿主细胞(具有来自DAPI的蓝色细胞核的细胞)和供体细胞(DAPI的蓝色和GFP标记的红色合并产生的粉
红色/紫色细胞核)的混合物中。它们共表达成熟肝细胞标记物，诸如肝细胞核因子(HNF)4α(绿色和粉红色/紫色细胞核的混合物)和白蛋白(绿色细胞质和粉红色/紫色细胞核)。单独
或合并的通道被包括在内。细胞核以蓝色(DAPI)显示。原始放大率：40×。图5C是在补片植入后一周猪肝脏的评估，图中展示出在补片植入物和宿主组织之间的界面处出现宽阔的重
塑区。低放大率图和1的放大图中的切片是苏木精/伊红(浅染色)；2中的切片用Vector-SG
染色，提供蓝色/灰色；3中的切片对甲胎蛋白染色，背景是苏木精/伊红。5C中的特定部位是编号的，并且与表示小叶内出现的变化的放大图相关联。由于大量MMP流入宿主肝脏小叶和腺泡以及供体细胞，因此宿主肝脏小叶和腺泡区域被破坏。在小叶的边界区观察到供体细
胞，这些部位还展示出肝特异性标记物，诸如HNF4-a和甲胎蛋白，这意味着这些细胞成熟为肝脏的命运。这些性状不由BTSC表达，所以这些性状是供体细胞经历成熟为肝脏命运的指
示。
物由间充质和上皮pCK+细胞(箭头)组成。在中图中，提供了更高的放大率(20×)。上皮细胞显示出表达胆细胞角蛋白(pCK)和内胚层干细胞标志物Sox9的胆系干细胞(BTSC)典型的免
疫表型。补片植入物内的BTSC排列成再组装胆小管的细胞串(箭头)，并且与邻近的肝脏小
叶的肝细胞平板保持直接连续性(楔形符号)。小叶中的宿主肝细胞是pCK和Sox9阴性的。在下图(原始放大率＝20×)中，GFP的免疫荧光允许识别单个植入的细胞及其子代。邻近补片
植入物的小叶中的肝细胞是GFP阳性的，这表示这些细胞是已经与宿主肝脏实质合并的供
体细胞来源的细胞。在补片植入物和肝脏小叶之间的界面处，pCK+/GFP+小管(即供体来源的胆管上皮细胞)与小叶内的GFP+/pCK-细胞(供体来源的肝细胞)保持直接连续性(楔形符
号)，这表明植入细胞成熟为肝细胞的命运。图5B是在补片植入后2周猪肝脏的检查。IF染色显示，GFP+细胞存在于远离植入部位的小叶内。它们是均匀分散的，所以处于宿主细胞(具有来自DAPI的蓝色细胞核的细胞)和供体细胞(DAPI的蓝色和GFP标记的红色合并产生的粉
红色/紫色细胞核)的混合物中。它们共表达成熟肝细胞标记物，诸如肝细胞核因子(HNF)4α(绿色和粉红色/紫色细胞核的混合物)和白蛋白(绿色细胞质和粉红色/紫色细胞核)。单独
或合并的通道被包括在内。细胞核以蓝色(DAPI)显示。原始放大率：40×。图5C是在补片植入后一周猪肝脏的评估，图中展示出在补片植入物和宿主组织之间的界面处出现宽阔的重
塑区。低放大率图和1的放大图中的切片是苏木精/伊红(浅染色)；2中的切片用Vector-SG
染色，提供蓝色/灰色；3中的切片对甲胎蛋白染色，背景是苏木精/伊红。5C中的特定部位是编号的，并且与表示小叶内出现的变化的放大图相关联。由于大量MMP流入宿主肝脏小叶和腺泡以及供体细胞，因此宿主肝脏小叶和腺泡区域被破坏。在小叶的边界区观察到供体细
胞，这些部位还展示出肝特异性标记物，诸如HNF4-a和甲胎蛋白，这意味着这些细胞成熟为肝脏的命运。这些性状不由BTSC表达，所以这些性状是供体细胞经历成熟为肝脏命运的指
示。
[0030] 图6A-6D提供了关于栓系至胰腺的干细胞类器官的补片植入物的信息。图6A是已植入大部分胰腺和十二指肠的粘膜下层(含有布隆纳氏(Brunner’s)腺的区域)的GFP+供体
细胞的低放大率(全景扫描)图。补片植入物部位中的猪胰腺、肝脏和十二指肠的免疫荧光
染色。GFP(绿色)、胰岛素(红色)、DAPI(蓝色)。供体来源的GFP+细胞出现在补片植入物定位的部位附近，并且显示出整合至胰腺实质中。观察到SERI手术支架的丝网介入胰腺、肝脏和十二指肠之间。图6B显示，供体细胞成熟为功能性胰岛。在高放大率下，观察到供体来源的GFP+/胰岛素β细胞(黄色-来自GFP和胰岛素染色的红色的合并色)与胰腺实质中的宿主
GFP-/胰岛素+(红色)β细胞混合在一起。胰岛细胞周围是大量GFP+细胞，它们展示出与胰腺外分泌细胞(包括腺泡和导管细胞)一致的形态。C和D中的发现结果，即实际上这些细胞正
在产生淀粉酶(一种经典的腺泡标记物)，支持了该解释。图6C和图6D示出了来源于供体干
细胞的功能性腺泡细胞的证据。来自补片植入物部位中的相同组织块的连续切片的免疫荧
光染色，聚焦于植入的GFP+供体细胞的区域。淀粉酶(绿色)、胰岛素(红色)、胰高血糖素(白色-在C中的全景扫描中不可见，但是在D中的高放大率下可见)、DAPI(蓝色)。淀粉酶+腺泡细胞是胰腺的外分泌组织的绝大部分。通过比较低放大率和高放大率下连续切片中存在的
染色，可以推断胰腺中的大部分供体来源的GFP+细胞已经获得淀粉酶+腺泡的命运。
细胞的低放大率(全景扫描)图。补片植入物部位中的猪胰腺、肝脏和十二指肠的免疫荧光
染色。GFP(绿色)、胰岛素(红色)、DAPI(蓝色)。供体来源的GFP+细胞出现在补片植入物定位的部位附近，并且显示出整合至胰腺实质中。观察到SERI手术支架的丝网介入胰腺、肝脏和十二指肠之间。图6B显示，供体细胞成熟为功能性胰岛。在高放大率下，观察到供体来源的GFP+/胰岛素β细胞(黄色-来自GFP和胰岛素染色的红色的合并色)与胰腺实质中的宿主
GFP-/胰岛素+(红色)β细胞混合在一起。胰岛细胞周围是大量GFP+细胞，它们展示出与胰腺外分泌细胞(包括腺泡和导管细胞)一致的形态。C和D中的发现结果，即实际上这些细胞正
在产生淀粉酶(一种经典的腺泡标记物)，支持了该解释。图6C和图6D示出了来源于供体干
细胞的功能性腺泡细胞的证据。来自补片植入物部位中的相同组织块的连续切片的免疫荧
光染色，聚焦于植入的GFP+供体细胞的区域。淀粉酶(绿色)、胰岛素(红色)、胰高血糖素(白色-在C中的全景扫描中不可见，但是在D中的高放大率下可见)、DAPI(蓝色)。淀粉酶+腺泡细胞是胰腺的外分泌组织的绝大部分。通过比较低放大率和高放大率下连续切片中存在的
染色，可以推断胰腺中的大部分供体来源的GFP+细胞已经获得淀粉酶+腺泡的命运。
[0031] 图7A-7H提供了基质金属蛋白酶(MMP)的表征。MMP由溶解胞外基质组分的大基因家族的钙依赖性、含锌酶组成。已知在猪中有至少24种同种型，这些同种型的一个子集是分泌因子(例如MMP1、MMP2、MMP7、MMP9)，另一个子集是膜相关因子(例如MMP14、MMP15)。MMP1通过IHC来鉴定，尤其是在重塑区域中，但是不能通过RNA-seq来鉴定，因为猪MMP1的注释形式尚不能用于RNA seq分析。图7A、图7B、图7C和图7D显示，分泌和膜相关种类的同种型由干细胞/祖细胞和成熟细胞二者表达。表达水平的定量表明，对于干细胞/祖细胞和成熟细胞
二者，膜相关形式是相似的(注意图7D中的比较)。相比之下，分泌形式在干细胞/祖细胞中以非常高的水平表达，并且在成熟细胞类型中以低水平或可忽略的水平表达。所分析的成
体细胞的细胞群从小猪肝脏和胆系组织的悬浮液分离，并且由CD45+细胞(造血细胞)、
CD146+细胞(星状细胞)、CD31+细胞(内皮)、EpCAM+/CD45-细胞(成体二倍体肝细胞和胆管
上皮细胞)组成。这些EpCAM+/CD45-细胞是小猪肝脏中存在的成熟实质细胞。BTSC通过实例中给出的方案从胆系分离。图7E示出了具有BTSC/ELSMC植入物的重塑区中的代表性MMP表
达。在邻近BTSC/ELSMC的补片植入物的切片中，用表示重塑区(括号)的三色进行染色。该区域以红色和蓝色的线性条带出现，细胞和基质组分经历MMP“海”的溶解。条带在小叶的边缘处结束，所述小叶大部分仍然是完整的，但是由于来源于入侵细胞的MMP的作用在边界处开始“磨损”。图7F示出了针对MMP1(Novo-red+)的IHC测定法的代表性图像。甲基绿色是背景染色。肝脏的小叶/腺泡结构溶解在细胞的波形卷曲中，并且以MMP1(MMP的分泌同种型)的
强表达标记。图7G示出了对MMP2(Novo-red+)染色的切片。苏木精是背景染色。肝脏的小叶/腺泡结构已经消失，并且已经被具有对MMP2(锈褐色)的强染色的细胞的混合物替代。图7H
示出了肝脏小叶内正在进行的重塑过程。肝脏小叶已成为散布于入侵细胞间的细胞的条
带；MMP2+表达(铁锈色)非常高并且有助于小叶/腺泡结构的丧失。随着透明质酸的清除(2-
3周)，小叶结构重新出现。
二者，膜相关形式是相似的(注意图7D中的比较)。相比之下，分泌形式在干细胞/祖细胞中以非常高的水平表达，并且在成熟细胞类型中以低水平或可忽略的水平表达。所分析的成
体细胞的细胞群从小猪肝脏和胆系组织的悬浮液分离，并且由CD45+细胞(造血细胞)、
CD146+细胞(星状细胞)、CD31+细胞(内皮)、EpCAM+/CD45-细胞(成体二倍体肝细胞和胆管
上皮细胞)组成。这些EpCAM+/CD45-细胞是小猪肝脏中存在的成熟实质细胞。BTSC通过实例中给出的方案从胆系分离。图7E示出了具有BTSC/ELSMC植入物的重塑区中的代表性MMP表
达。在邻近BTSC/ELSMC的补片植入物的切片中，用表示重塑区(括号)的三色进行染色。该区域以红色和蓝色的线性条带出现，细胞和基质组分经历MMP“海”的溶解。条带在小叶的边缘处结束，所述小叶大部分仍然是完整的，但是由于来源于入侵细胞的MMP的作用在边界处开始“磨损”。图7F示出了针对MMP1(Novo-red+)的IHC测定法的代表性图像。甲基绿色是背景染色。肝脏的小叶/腺泡结构溶解在细胞的波形卷曲中，并且以MMP1(MMP的分泌同种型)的
强表达标记。图7G示出了对MMP2(Novo-red+)染色的切片。苏木精是背景染色。肝脏的小叶/腺泡结构已经消失，并且已经被具有对MMP2(锈褐色)的强染色的细胞的混合物替代。图7H
示出了肝脏小叶内正在进行的重塑过程。肝脏小叶已成为散布于入侵细胞间的细胞的条
带；MMP2+表达(铁锈色)非常高并且有助于小叶/腺泡结构的丧失。随着透明质酸的清除(2-
3周)，小叶结构重新出现。
[0032] 图8是肝脏中和胰腺上的植入和整合现象的示意图。
[0033] 图9A-9E提供了关于与成熟间充质细胞(MMC)(诸如内皮或星状细胞)搭配的成熟(成体)肝细胞的补片植入物的信息。这些补片植入物不能植入。如果肝细胞与早期谱系期
间充质细胞(ELSMC)(此处是猪间充质干细胞(MSC))搭配，则植入是可实现的。如果与ELSMC一起存在，则会发生植入，但是仅限于植入附近的区域。图9A示出了正常猪肝脏的三色染
色。对于低放大率图(a)，条柱为200μm，对于高放大率图(b)，条柱为50μm。注意格利森氏囊中的胶原蛋白和肝脏腺泡之间的边界。图9B示出了正常的与成熟间充质细胞(MMC)、内皮和星状细胞搭配的成体肝细胞的补片植入物的三色染色，该补片植入物不能植入。在低放大
率图(a)中，注意格利森氏囊是完整的，并且细胞仍然在囊的顶部。(b)在高放大率下，有证据表明在植入物旁的小叶中细胞具有一定程度的重塑(可塑性现象)(肝细胞内的斑状红
色)。这种可塑性被认为是由于已知存在于干细胞和成体细胞二者上的膜相关的MMP。图9C
示出了针对正常的与成熟间充质细胞(MMC)搭配的成体肝细胞的补片植入物的IHC测定法。
切片用针对RBMY-1的抗体进行染色，苏木精作为复染剂。格利森氏囊是完整的，小叶之间的边界区也是完整的。在高放大率下(b)，显然没有发生植入。(d)表示非特异性染色的阴性对照(不使用一抗的染色)。图9D示出了正常的与ELSMC搭配的成体肝细胞的补片植入物的三
色染色，该补片植入物在此处是发挥MMP的细胞来源作用的猪间充质干细胞(MSC)。植入物
在植入物和宿主组织之间的界面处分离。括号表示重塑区。注意肝脏小叶已丧失通常构成
它们之间的边界区的基质，并且在边缘处出现磨损。在高放大率中(a)在整个图像中可见供体细胞(浅红色，而小叶中央的供体细胞为深红色)；(b)中是显示补片下和(c)中的格利森
氏囊显著较薄(与方框左侧的区域相比)的区域的放大图。邻近植入物的细胞中有明显的广
泛重塑(c)。图9E示出了在一周后与ELSMC(猪MSC)搭配的肝细胞的补片植入物。切片(a)用
针对RBMY-1的抗体(褐色)进行染色，甲基绿作为复染剂。供体细胞植入(锈红色的区域)并
成熟为植入物附近的腺泡中的成体实质细胞。切片(b)示出了变薄的格利森氏囊的其余部
分附近的图像的放大图，该图显示供体细胞(深褐色细胞核)均匀散布于宿主细胞(细胞核
为甲基绿颜色)中。切片(c)是(b)的阴性对照。切片(d)用针对GFP的抗体(与Novus red偶
联，产生锈褐色)进行染色，甲基绿作为复染剂。大部分细胞已植入并形成宿主肝脏腺泡内的供体(成熟)肝细胞的深红色带。格利森氏囊保留下来，但是厚度有所减少。在实验的三周时间框内未观察到超出植入物附近的肝脏区域的迁移。
间充质细胞(ELSMC)(此处是猪间充质干细胞(MSC))搭配，则植入是可实现的。如果与ELSMC一起存在，则会发生植入，但是仅限于植入附近的区域。图9A示出了正常猪肝脏的三色染
色。对于低放大率图(a)，条柱为200μm，对于高放大率图(b)，条柱为50μm。注意格利森氏囊中的胶原蛋白和肝脏腺泡之间的边界。图9B示出了正常的与成熟间充质细胞(MMC)、内皮和星状细胞搭配的成体肝细胞的补片植入物的三色染色，该补片植入物不能植入。在低放大
率图(a)中，注意格利森氏囊是完整的，并且细胞仍然在囊的顶部。(b)在高放大率下，有证据表明在植入物旁的小叶中细胞具有一定程度的重塑(可塑性现象)(肝细胞内的斑状红
色)。这种可塑性被认为是由于已知存在于干细胞和成体细胞二者上的膜相关的MMP。图9C
示出了针对正常的与成熟间充质细胞(MMC)搭配的成体肝细胞的补片植入物的IHC测定法。
切片用针对RBMY-1的抗体进行染色，苏木精作为复染剂。格利森氏囊是完整的，小叶之间的边界区也是完整的。在高放大率下(b)，显然没有发生植入。(d)表示非特异性染色的阴性对照(不使用一抗的染色)。图9D示出了正常的与ELSMC搭配的成体肝细胞的补片植入物的三
色染色，该补片植入物在此处是发挥MMP的细胞来源作用的猪间充质干细胞(MSC)。植入物
在植入物和宿主组织之间的界面处分离。括号表示重塑区。注意肝脏小叶已丧失通常构成
它们之间的边界区的基质，并且在边缘处出现磨损。在高放大率中(a)在整个图像中可见供体细胞(浅红色，而小叶中央的供体细胞为深红色)；(b)中是显示补片下和(c)中的格利森
氏囊显著较薄(与方框左侧的区域相比)的区域的放大图。邻近植入物的细胞中有明显的广
泛重塑(c)。图9E示出了在一周后与ELSMC(猪MSC)搭配的肝细胞的补片植入物。切片(a)用
针对RBMY-1的抗体(褐色)进行染色，甲基绿作为复染剂。供体细胞植入(锈红色的区域)并
成熟为植入物附近的腺泡中的成体实质细胞。切片(b)示出了变薄的格利森氏囊的其余部
分附近的图像的放大图，该图显示供体细胞(深褐色细胞核)均匀散布于宿主细胞(细胞核
为甲基绿颜色)中。切片(c)是(b)的阴性对照。切片(d)用针对GFP的抗体(与Novus red偶
联，产生锈褐色)进行染色，甲基绿作为复染剂。大部分细胞已植入并形成宿主肝脏腺泡内的供体(成熟)肝细胞的深红色带。格利森氏囊保留下来，但是厚度有所减少。在实验的三周时间框内未观察到超出植入物附近的肝脏区域的迁移。
[0034] 图10是比较干细胞与成体细胞的植入的示意图。
[0035] 图11示出的证据表明，植入过程涉及细胞在宿主组织内迁移相当长的距离。此处展示了针对BTSC/ELSMC植入物的移植后一周的类器官。被分成8个不同区域的肝脏的示意
图用于表示被用于评估供体细胞的存在的区域。切片从区域1-8制备，然后对切片进行染色以鉴定供体细胞。表中汇总了发现结果，这些发现结果示出了植入物和每个区域之间的距
离和所存在的GFP+细胞的复制。表格左侧的图像是来自每个区的代表性切片的扫描图。在
植入物附近的6中深褐色染色最强，并且随着与植入物的距离增加而变浅，区域1最浅。
图用于表示被用于评估供体细胞的存在的区域。切片从区域1-8制备，然后对切片进行染色以鉴定供体细胞。表中汇总了发现结果，这些发现结果示出了植入物和每个区域之间的距
离和所存在的GFP+细胞的复制。表格左侧的图像是来自每个区的代表性切片的扫描图。在
植入物附近的6中深褐色染色最强，并且随着与植入物的距离增加而变浅，区域1最浅。
[0036] 图12A-12E提供了供体细胞在整个宿主肝脏中的迁移的证据。GFP+细胞用Novo-red(锈褐色)染色；宿主细胞用甲基绿染色。图12A是植入物和宿主肝脏的界面的低放大率
图。植入物与宿主肝脏的分离通常可见(注意图3中也如此)；并且显示出与异常高水平的分泌的MMP相关联。区域(a)和(b)的放大图在下文给出。注意低放大率图中和(b)的放大图中
的区域，其中染色是斑状的，并且这些区域显示出模糊的外观，并且由于组织中的透明质酸水平而得到证实。图12B描绘了细胞迁移到的中间区。供体细胞在胆管和腺泡实质二者中的整个组织中。图12C示出了细胞迁移到的远处区。注意仅胆管被染色。图12D提供了示出胆管中的供体细胞的放大图。图12E和图12F提供了实质内的放大图，该图显示供体细胞在细胞
核中具有GFP标记。
图。植入物与宿主肝脏的分离通常可见(注意图3中也如此)；并且显示出与异常高水平的分泌的MMP相关联。区域(a)和(b)的放大图在下文给出。注意低放大率图中和(b)的放大图中
的区域，其中染色是斑状的，并且这些区域显示出模糊的外观，并且由于组织中的透明质酸水平而得到证实。图12B描绘了细胞迁移到的中间区。供体细胞在胆管和腺泡实质二者中的整个组织中。图12C示出了细胞迁移到的远处区。注意仅胆管被染色。图12D提供了示出胆管中的供体细胞的放大图。图12E和图12F提供了实质内的放大图，该图显示供体细胞在细胞
核中具有GFP标记。
[0038] 图14示出了针对上皮细胞(图14A)和间充质细胞(图14B)的两个谱系期以及对应的生物标志物谱的图表。
[0039] 图15示出了植入肾的H2B-GFP+BTSC/ELSMC补片的类器官。评估在植入后1周进行。图A示出了植入的肾的三色染色。以横切方式制备肾，以暴露具有“V”形植入物的更深的层。
被染成亮蓝色的下半部分“V”是肾上的植入侧；图中的上半部分“V”是比植入层更深的层。
图B示出了针对植入的肾的相同切片的H&E染色。图C是补片植入的肾的更高放大率图。植入物下的肾囊以类似于肝脏中的方式松弛(来自通过MMP的溶解)。图D示出了在补片下的层处
植入肾的GFP+细胞(深红色)的IHC染色。图E示出了GFP+细胞(深红色)在肾的更深层的植
入。尸检报告表明，在植入的肾中或接受补片植入物的动物中的其他部位不存在坏死。
被染成亮蓝色的下半部分“V”是肾上的植入侧；图中的上半部分“V”是比植入层更深的层。
图B示出了针对植入的肾的相同切片的H&E染色。图C是补片植入的肾的更高放大率图。植入物下的肾囊以类似于肝脏中的方式松弛(来自通过MMP的溶解)。图D示出了在补片下的层处
植入肾的GFP+细胞(深红色)的IHC染色。图E示出了GFP+细胞(深红色)在肾的更深层的植
入。尸检报告表明，在植入的肾中或接受补片植入物的动物中的其他部位不存在坏死。
[0040] 附表说明
[0041] 表1提供了针对补片植入物的手术或其他方法汇总。
[0042] 表2提供了针对示例性补片植入物测试的基底的比较。
[0043] 表3提供了在实例中用于IHC和IF的抗体的汇总。
[0044] 表4提供了用于qRT-PCR测定法的引物的汇总。
具体实施方式
[0045] 在下文中将更全面地描述根据本公开的实施方案。然而，本公开的方面可以以不同的形式实施并且不应被解释为限于本文阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案是为
了使本公开更为彻底和完整，并且将本发明的范围完全传达给本领域的技术人员.本文的
描述中所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的并且不旨在对本发明进行限制。本文提
到的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献以引用的方式整体并入。
了使本公开更为彻底和完整，并且将本发明的范围完全传达给本领域的技术人员.本文的
描述中所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的并且不旨在对本发明进行限制。本文提
到的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献以引用的方式整体并入。
[0046] 除非另外定义，否则本文所用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。还将理解，术语(诸如在常用词典中定义的那些术语)应被解释为具有与它们在本专利申请和相关领域的上下文中的含义一致的含
义，并且除非本文如此明确定义，否则将不会在理想化的或过于正式的意义上对这些术语
进行解释。虽然下文未明确定义，但是此类术语应根据它们常见的含义进行解释。
义，并且除非本文如此明确定义，否则将不会在理想化的或过于正式的意义上对这些术语
进行解释。虽然下文未明确定义，但是此类术语应根据它们常见的含义进行解释。
[0047] 除非另外指明，否则本技术的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术都在本领域的技术范围内。参见例如，Sambrook和Russell编(2012)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第4版；Ausubel
等人编(2012)Current Protocols in Molecular Biology系列；Methods in Enzymology
系列(Academic Press,Inc.,N.Y.)；MacPherson等人(1991)PCR 1:A Practical Approach
(IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson等人(1995)PCR 2:A Practical
Approach；Harlow和Lane编(2014)Antibodies,A Laboratory Manual，第2版；Freshney
(2011)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique，第6版；Gait编(1984)
Oligonucleotide Synthesis；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编(1985)Nucleic
Acid Hybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编
(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press
(1986))；Perbal(1984)A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller和Calos编
(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring Harbor
Laboratory)；Makrides编(2003)Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；
Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology
(Academic Press,London)；和Herzenberg等人编(1996)Weir’s Handbook of
Experimental Immunology。
等人编(2012)Current Protocols in Molecular Biology系列；Methods in Enzymology
系列(Academic Press,Inc.,N.Y.)；MacPherson等人(1991)PCR 1:A Practical Approach
(IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson等人(1995)PCR 2:A Practical
Approach；Harlow和Lane编(2014)Antibodies,A Laboratory Manual，第2版；Freshney
(2011)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique，第6版；Gait编(1984)
Oligonucleotide Synthesis；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编(1985)Nucleic
Acid Hybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编
(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press
(1986))；Perbal(1984)A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller和Calos编
(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring Harbor
Laboratory)；Makrides编(2003)Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；
Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology
(Academic Press,London)；和Herzenberg等人编(1996)Weir’s Handbook of
Experimental Immunology。
[0048] 除非上下文另外指明，否则特别意图是本文所述的本发明的各种特征可以以任何组合使用。此外，本公开还设想，在一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。出于展示目的，如果说明书指出复合物包含组分A、B和C，则特别意图是A、B或C中的任一者或它们的组合可以单独地或以任何组合形式省略和放弃。
[0049] 所有数值名称，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，它们视情况而定以1.0或0.1的增量(+)或(-)变化，或者差异为+/-15％、或者10％、或者5％、或者2％。应当理解，虽然并不总是明确指出，但是所有数值名称之前均带有术语“约”。还应当理解，虽然并不总是明确指出，但是本文所述的试剂仅仅是示例性的，并且此类试剂的等同物是本领域已知的。
[0050] 定义
[0053] 当用于描述任何组分、范围、剂型等的选择时，本文公开的术语或“可接受的”、“有效的”或“充分的”意指所述组分、范围、剂型等适用于所公开的目的。
[0054] 同样如本文所用，“和/或”是指和涵盖一个或多个相关联的所列项目的任何和全部可能的组合，以及当以替代性方式(“或”)解释时组合的缺乏。
[0055] 如本文所用，术语“包含”意指组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。如本文所用，过渡短语“基本上由……组成”(和语法变体)应被解释为涵盖所引述的或步骤，以及“不对所引述的实施方案的一个或多个基本和新型特征产生实质性影响的那些材料步骤”。参见，In re Herz,537F.2d 549,551-52,190U.S.P.Q.461,463(CCPA 1976)(强调为原文所有)；还可参见MPEP§2111.03。如本文所用，术语“基本上由……组成”不应解释为等同于“包含”。“由……组成”应指排除超过痕量的其他成分要素和用于施用本文公开的组合物的基本方法步骤。由这些过渡术语中的每个限定的方面都在本公开的范围内。
[0056] 如本文所用，术语“补片植入物”是指包埋或包含在适当的生物材料中以允许将供体细胞(同种异体或自体)移植到宿主的细胞的组合物。在一些实施方案中，该术语是指包埋或包含在适当的生物材料中以允许将供体细胞移植到宿主的细胞的组合物。生物材料是
可以在指定条件下制备(例如，任选地补充的基础培养基和/或营养因子、维生素、氨基酸、碳水化合物、矿物、胰岛素、运铁蛋白/Fe和/或脂质(与纯化的白蛋白加脂蛋白载体分子(诸如高密度脂蛋白)复合的纯化的游离脂肪酸)的培养基)，包含(任选地固化)在软凝胶中(小
于200Pa，任选地大约100Pa)，并且覆盖有基底的生物材料，所述基底具有足够的抗拉强度，以允许手术附接或者栓系至宿主的组织或器官，但是具有对供体细胞分化的具有最小影响
的化学性质。应避免使用含有可能驱动细胞(尤其是早期谱系期间充质细胞(ELSMC))的分
化的因子的补充剂；这些因子包括血清、生长因子和影响ELSMC的细胞因子以及成熟基质组分(例如I型胶原蛋白)。
可以在指定条件下制备(例如，任选地补充的基础培养基和/或营养因子、维生素、氨基酸、碳水化合物、矿物、胰岛素、运铁蛋白/Fe和/或脂质(与纯化的白蛋白加脂蛋白载体分子(诸如高密度脂蛋白)复合的纯化的游离脂肪酸)的培养基)，包含(任选地固化)在软凝胶中(小
于200Pa，任选地大约100Pa)，并且覆盖有基底的生物材料，所述基底具有足够的抗拉强度，以允许手术附接或者栓系至宿主的组织或器官，但是具有对供体细胞分化的具有最小影响
的化学性质。应避免使用含有可能驱动细胞(尤其是早期谱系期间充质细胞(ELSMC))的分
化的因子的补充剂；这些因子包括血清、生长因子和影响ELSMC的细胞因子以及成熟基质组分(例如I型胶原蛋白)。
[0057] 如本文所用，术语“基底”是指作为补片植入物表面上的基底或屏障的材料，所述材料能够将植入物栓系至靶标部位和/或有利于细胞在其中迁移至靶标部位和/或防止或抑制细胞向基底迁移。基底为或包括“可生物降解的、生物相容性材料”、“生物相容性的、可生物降解材料”或它们的任何变体，是指这样的材料：(i)针对接受该材料移植的受试者具有生物相容性，(ii)表现出承受器官和组织上出现的压缩力和剪切力(尤其是内部的一者)
的机械弹性，这继而使该材料作为手术组织发挥功能，并且(iii)对于接触该材料的细胞的分化状态具有中性或最小作用。在一些实施方案中，补片植入物的基底包含这种材料。在此类实施方案中，(ii)的机械弹性应使得基底可以将植入物栓系至靶标部位。在另外的此类
实施方案中，基底引导细胞向靶标部位迁移–例如通过影响在远离靶标部位的方向上迁移
的那些细胞的分化或通过物理阻止所述迁移来实现。就此而言，合适的材料包括但不限于
Seri-silk(任选地仿形Seri-Silk或其衍生物)、羊膜(例如，面向胎儿一侧的羊膜)或其提
取物和/或由PGA和/或PLLA组成的补片或织物。合适的合成材料补片的非限制性实例包括
由91％PGA-9％PLLA共聚物组成的织造补片、由91％PGA-9％PLLA共聚物组成的编织补片或
由100％PGA组成的非织造补片。更一般而言，合适的基底可以包括蚕蛾丝形式(诸如SeriR
手术丝支架(Sofregen,New York,NY))，蚕蛾丝的其他衍生物和合成织物(诸如聚乙醇酸-
聚-L-乳酸共聚物(PGA/PLLA)形式)。
的机械弹性，这继而使该材料作为手术组织发挥功能，并且(iii)对于接触该材料的细胞的分化状态具有中性或最小作用。在一些实施方案中，补片植入物的基底包含这种材料。在此类实施方案中，(ii)的机械弹性应使得基底可以将植入物栓系至靶标部位。在另外的此类
实施方案中，基底引导细胞向靶标部位迁移–例如通过影响在远离靶标部位的方向上迁移
的那些细胞的分化或通过物理阻止所述迁移来实现。就此而言，合适的材料包括但不限于
Seri-silk(任选地仿形Seri-Silk或其衍生物)、羊膜(例如，面向胎儿一侧的羊膜)或其提
取物和/或由PGA和/或PLLA组成的补片或织物。合适的合成材料补片的非限制性实例包括
由91％PGA-9％PLLA共聚物组成的织造补片、由91％PGA-9％PLLA共聚物组成的编织补片或
由100％PGA组成的非织造补片。更一般而言，合适的基底可以包括蚕蛾丝形式(诸如SeriR
手术丝支架(Sofregen,New York,NY))，蚕蛾丝的其他衍生物和合成织物(诸如聚乙醇酸-
聚-L-乳酸共聚物(PGA/PLLA)形式)。
[0058] 在一些实施方案中，基底也是可生物再吸收的。如本文所用，“可生物再吸收的”是指可以被植入物的宿主或接受者的身体分解且不需要机械除去的材料。在一些实施方案中，可生物再吸收的基底在约2至约10周、约2至约20周、约2至约52周、约4至约16周、约4至约12周或约4至约8周的范围内是可生物再吸收的。在一些实施方案中，可生物再吸收的基
底在约4至约8周；约4至约12周、约4至约16周、约4至约20周和约4至约52周的范围内是可生物再吸收的。
底在约4至约8周；约4至约12周、约4至约16周、约4至约20周和约4至约52周的范围内是可生物再吸收的。
[0059] 如本文所用，植入物的生物材料和独立于基底的植入物的生物材料包括可以形成水凝胶的生物材料。术语“凝胶”是指可以具有从软和弱到硬和韧的范围内的性质的固体胶状材料。凝胶被定义为基本上稀释的交联体系，当处于稳态时它表现出不流动状态。按重量计，凝胶主要为液体，然而由于液体内的三维交联网络，它们的行为类似于固体。正是流体内的交联赋予凝胶以结构(硬度、稠度、机械或粘弹性性质)以及有助于凝胶的粘附性。这
样，凝胶是固体内的液体分子的分散体，其中固体是连续相，并且液体是非连续相。“水凝胶”在本文中也称为“水凝胶基质”，是由聚合物链网络构造的大分子聚合物凝胶组成的凝胶的非限制性实例。水凝胶从亲水性单体或亲水性二聚体(例如就透明质酸而言)通过链生
长或逐步生长以及网络形成来合成。网状结构以及空隙缺陷增强了水凝胶经由氢键吸收大
量水的能力。因此，水凝胶产生特征性的坚固而有弹性的机械性质。当材料内的旧键断裂
时，它们能够经历新键的自发形成。水凝胶的结构以及静电引力驱动通过非共价氢键的新
键形成。
样，凝胶是固体内的液体分子的分散体，其中固体是连续相，并且液体是非连续相。“水凝胶”在本文中也称为“水凝胶基质”，是由聚合物链网络构造的大分子聚合物凝胶组成的凝胶的非限制性实例。水凝胶从亲水性单体或亲水性二聚体(例如就透明质酸而言)通过链生
长或逐步生长以及网络形成来合成。网状结构以及空隙缺陷增强了水凝胶经由氢键吸收大
量水的能力。因此，水凝胶产生特征性的坚固而有弹性的机械性质。当材料内的旧键断裂
时，它们能够经历新键的自发形成。水凝胶的结构以及静电引力驱动通过非共价氢键的新
键形成。
[0060] 用于植入物的生物材料具有机械性质、稠度，它们可以更严格地定义为生物材料的粘弹性。参见https://en.wikipedia.org/wiki/Viscoelasticity。有助于植入的植入物生物材料必须非常软(例如，约100Pa)，允许供体细胞保持不成熟条件(Lozoya等人,
Biomaterials 2011；32(30):7389-7402)，所以能够产生MMP的膜相关和/或分泌形式。
Biomaterials 2011；32(30):7389-7402)，所以能够产生MMP的膜相关和/或分泌形式。
[0061] 如本文所用，术语“粘弹性”是指当经历变形时表现出粘性和弹性两个特征的材料的性质。粘性材料能够像蜂蜜一样抵抗剪切流，并且当施加应力时随时间推移而发生线性应变。弹性材料在拉伸时发生应变，一旦移除应力，即迅速恢复原始状态。粘弹性材料具有这两个性质的要素，因此表现出时间依赖性应变。弹性通常是有序固体中沿结晶平面的键
拉伸的结果，而粘度是无定形材料内部原子或分子扩散的结果。虽然有很多测试材料的机
械和粘弹性响应的仪器，但是宽带粘弹性光谱仪(BVS)和共振超声光谱仪(RUS)更常用于测
试粘弹性行为，因为它们可以在高于和低于环境温度下使用，并且对于测试粘弹性更具特
异性。这两个仪器采用在各种频率下和时间范围内的阻尼机制，不要求时间–温度叠加。使用BVS和RUS来研究材料的机械性质对于理解表现出粘弹性的材料如何发挥性能是重要的。
拉伸的结果，而粘度是无定形材料内部原子或分子扩散的结果。虽然有很多测试材料的机
械和粘弹性响应的仪器，但是宽带粘弹性光谱仪(BVS)和共振超声光谱仪(RUS)更常用于测
试粘弹性行为，因为它们可以在高于和低于环境温度下使用，并且对于测试粘弹性更具特
异性。这两个仪器采用在各种频率下和时间范围内的阻尼机制，不要求时间–温度叠加。使用BVS和RUS来研究材料的机械性质对于理解表现出粘弹性的材料如何发挥性能是重要的。
[0062] 如本文所用，术语“透明质酸”(hyaluronan或hyaluronic acid)是指由通过β1-4、β1-3键连接的葡萄糖胺和葡萄糖醛酸[1-3]组成的二糖单元的聚合物及其盐。因此，术语透明质酸是指透明质酸的天然形式和合成形式二者。天然存在的透明质酸(HA)、包含D-葡萄糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰基-D-葡萄糖胺(GlcNAc)的二糖单元(这些二糖单元交替连接，形
成直链聚合物)的水溶性多糖。高分子量HA可以包含100至10,000个二糖单元。HA通常以钠
盐(透明质酸钠)的形式天然存在。HA；透明质酸钠，和HA或透明质酸钠的制备物通常称为
“透明质酸(hyaluronan)”。可接受的透明质酸盐的非限制性实例包括透明质酸钾、透明质酸镁和透明质酸钙。
成直链聚合物)的水溶性多糖。高分子量HA可以包含100至10,000个二糖单元。HA通常以钠
盐(透明质酸钠)的形式天然存在。HA；透明质酸钠，和HA或透明质酸钠的制备物通常称为
“透明质酸(hyaluronan)”。可接受的透明质酸盐的非限制性实例包括透明质酸钾、透明质酸镁和透明质酸钙。
[0063] 其他糖胺聚糖(GAG)也可以用于水凝胶中。这些糖胺聚糖包括硫酸软骨素(CS)和硫酸皮肤素(DS)形式、葡萄糖醛酸和半乳糖胺的聚合物、以及硫酸乙酰肝素(HS)和肝素
(HP)、葡萄糖醛酸和葡萄糖胺的聚合物。这些GAG的硫酸化程度和模式至关重要，因为硫酸化模式决定了与多个家族的蛋白质(例如凝血蛋白、生长因子、细胞因子、嗜中性酶)的复合物的形成。参见例如，Powell AK,Yates EA,Fernig DG,Turnbull JE.Interactions of
heparin/heparan sulfate with proteins:appraisal of structural factors and
experimental approaches.Glycobiology.2004年4月；14(4):17R-30R]适用于优化植入的
补片植入物的那些包括透明质酸、非硫酸化GAG和硫酸化程度最小的GAG(诸如干细胞龛中
存在的硫酸软骨素形式)，如Karumbaiah L等人,Chondroitin Sulfate
Glycosaminoglycan Hydrogels Create Endogenous Niches for Neural Stem
Cells.Bioconjug Chem.2015年12月16日；26(12):2336-49和Hayes AJ等人,Chondroitin
sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular
cartilage progenitor cells.J Histochem Cytochem.2008年2月；56(2):125-38所示(以
引用的方式并入本文)。
(HP)、葡萄糖醛酸和葡萄糖胺的聚合物。这些GAG的硫酸化程度和模式至关重要，因为硫酸化模式决定了与多个家族的蛋白质(例如凝血蛋白、生长因子、细胞因子、嗜中性酶)的复合物的形成。参见例如，Powell AK,Yates EA,Fernig DG,Turnbull JE.Interactions of
heparin/heparan sulfate with proteins:appraisal of structural factors and
experimental approaches.Glycobiology.2004年4月；14(4):17R-30R]适用于优化植入的
补片植入物的那些包括透明质酸、非硫酸化GAG和硫酸化程度最小的GAG(诸如干细胞龛中
存在的硫酸软骨素形式)，如Karumbaiah L等人,Chondroitin Sulfate
Glycosaminoglycan Hydrogels Create Endogenous Niches for Neural Stem
Cells.Bioconjug Chem.2015年12月16日；26(12):2336-49和Hayes AJ等人,Chondroitin
sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular
cartilage progenitor cells.J Histochem Cytochem.2008年2月；56(2):125-38所示(以
引用的方式并入本文)。
[0064] 如本文所用，术语“细胞”是指植入物中的一种或多种细胞。本公开的细胞是真核细胞。在一些实施方案中，该细胞是动物来源的，任选地来自人类器官，并且可以是干细胞、成熟体细胞、祖细胞或从干细胞至成熟细胞的谱系期中的中间细胞。术语“细胞群”或“细胞”是指相同或不同来源的、相同或不同细胞类型的一种或多种细胞的组合；该术语在本文中可与术语“供体细胞”互换使用，“供体细胞”意指可以是自体或同种异体的细胞。在一些实施方案中，该细胞群可以来源于细胞系，来自新鲜分离的细胞，或者在一些实施方案中，该细胞群可以来源于器官或组织的一部分，任选地来自供体或接受者。
[0065] 术语“干细胞”是指可以自我复制(产生与母细胞相同的子细胞)并且具有多分化能性(即可以产生多于一种类型的成体细胞)的细胞群。如本文所用，术语“祖细胞”或“前体”被广义地定义为涵盖干细胞的子代及其后代。祖细胞是可以具有多分化能性、双分化能性或单分化能性，但是自我复制能力最小(如果有的话)的细胞群。定向祖细胞是具有单分
化能性并且可以分化为特定谱系，从而仅产生一种成熟细胞类型的祖细胞。干细胞的非限
制性实例包括但不限于胚胎干(ES)细胞、诱导性多能干(iPS)细胞、胚层干细胞、确定的干细胞(外胚层干细胞、中胚层干细胞或内胚层干细胞)、围产期干细胞、羊水来源的干细胞、间充质干细胞(MSC)、成血管细胞以及来源于脐带、华通氏(Wharton’s)胶和/或胎盘的那些干细胞。干细胞和定向祖细胞之间的中间细胞包括细胞群，诸如肝母细胞和胰管祖细胞以
及可以具有多分化能性，但具有广泛增殖潜力，但自我复制能力更有限(如果有的话)的其
他形式的短暂增殖细胞。
化能性并且可以分化为特定谱系，从而仅产生一种成熟细胞类型的祖细胞。干细胞的非限
制性实例包括但不限于胚胎干(ES)细胞、诱导性多能干(iPS)细胞、胚层干细胞、确定的干细胞(外胚层干细胞、中胚层干细胞或内胚层干细胞)、围产期干细胞、羊水来源的干细胞、间充质干细胞(MSC)、成血管细胞以及来源于脐带、华通氏(Wharton’s)胶和/或胎盘的那些干细胞。干细胞和定向祖细胞之间的中间细胞包括细胞群，诸如肝母细胞和胰管祖细胞以
及可以具有多分化能性，但具有广泛增殖潜力，但自我复制能力更有限(如果有的话)的其
他形式的短暂增殖细胞。
[0066] 术语“间充质细胞”是指来源于间充质的细胞，包括但不限于成血管细胞、内皮的前体、星状细胞的前体、内皮、星状细胞、基质细胞、成熟细胞和祖细胞的各种亚群、和间充质干细胞(MSC)(它们是多分化能性基质细胞)以及成熟间充质细胞和祖间充质细胞的各种亚群。MSC是通过培养选择过程从组织制备的细胞群(Cathery等人Stem Cells 2018；PMID:
29732653；Graceb等人Biochimie2018:PMID 29698670；Caplan AI.Stem Cells Int.2015；
PMID:26273305。成熟间充质细胞至少有两大类：(a)成熟间充质细胞(星状细胞/基质细
胞)，它们产生胞外基质形式并且被胞外基质形式包围，该胞外基质形式包含纤维状胶原蛋白(例如I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白)和相关的基质组分(纤连蛋白、硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖)以及形成复合物的结合信号(例如生长因子、细胞因
子)和形成与通常为线性(串状)细胞群的细胞相关的复合物的结合信号(例如生长因子/细
胞因子)。此类细胞的非限制性实例包括星状细胞、肌腱、基质和肌纤维母细胞。(b)成熟间充质细胞，诸如内皮，它们产生胞外基质形式并且被胞外基质形式包围，该胞外基质形式包含网络状胶原蛋白(例如IV型胶原蛋白、VI型胶原蛋白、VIII型胶原蛋白、X型胶原蛋白)和相关的基质分子(粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、肝素蛋白聚糖)以及共同与具有更多
鳞状或立方或鹅卵石形态的细胞相关的结合信号(例如生长因子、细胞因子)。此类细胞的
非限制性实例包括内皮和肌上皮。
29732653；Graceb等人Biochimie2018:PMID 29698670；Caplan AI.Stem Cells Int.2015；
PMID:26273305。成熟间充质细胞至少有两大类：(a)成熟间充质细胞(星状细胞/基质细
胞)，它们产生胞外基质形式并且被胞外基质形式包围，该胞外基质形式包含纤维状胶原蛋白(例如I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白)和相关的基质组分(纤连蛋白、硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖)以及形成复合物的结合信号(例如生长因子、细胞因
子)和形成与通常为线性(串状)细胞群的细胞相关的复合物的结合信号(例如生长因子/细
胞因子)。此类细胞的非限制性实例包括星状细胞、肌腱、基质和肌纤维母细胞。(b)成熟间充质细胞，诸如内皮，它们产生胞外基质形式并且被胞外基质形式包围，该胞外基质形式包含网络状胶原蛋白(例如IV型胶原蛋白、VI型胶原蛋白、VIII型胶原蛋白、X型胶原蛋白)和相关的基质分子(粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、肝素蛋白聚糖)以及共同与具有更多
鳞状或立方或鹅卵石形态的细胞相关的结合信号(例如生长因子、细胞因子)。此类细胞的
非限制性实例包括内皮和肌上皮。
[0067] 这些间充质细胞类型的前体包括但不限于成血管细胞，它们具有多分化能性并且可以分化为内皮谱系(它们的晚期是窗孔内皮)或星状细胞(它们的晚期是肌纤维母细胞
(基质)。前体还包括间充质干细胞(MSC)，它们是多分化能性细胞并且可以分化为成纤维细胞(基质)、成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞(软骨细胞)、肌肉细胞(肌细胞)和脂肪细胞(脂细胞))。MSC可以任选地通过培养选择方法来制备(Cathery等人Stem Cells 2018；PMID:
29732653；Graceb等人Biochimie2018:PMID 29698670；Caplan AI.Stem Cells Int.2015；
PMID:26273305)。
(基质)。前体还包括间充质干细胞(MSC)，它们是多分化能性细胞并且可以分化为成纤维细胞(基质)、成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞(软骨细胞)、肌肉细胞(肌细胞)和脂肪细胞(脂细胞))。MSC可以任选地通过培养选择方法来制备(Cathery等人Stem Cells 2018；PMID:
29732653；Graceb等人Biochimie2018:PMID 29698670；Caplan AI.Stem Cells Int.2015；
PMID:26273305)。
[0068] 术语“上皮细胞扩增”与上皮细胞集落的直径相关联，这些上皮细胞通常形成立方或鹅卵石形态的集落，并且生长的估算值与集落的细胞的直径的复合物相关联。相比之下，间充质细胞集落的生长的估算值与集落的密度相关联，因为间充质细胞更易迁移和活动，并且集落密度是保留在集落边界内的细胞的净总数的反映。
[0069] 术语“上皮细胞”是指来源于上皮的细胞，提供针对宿主的组织和/或全身需要的多种功能的特化细胞。它们被认为具有作为前体或不成熟细胞迁移的能力；随着成熟，它们变得静止并且形成具有顶面、基面和侧面的鳞状或鹅卵石样或柱状极化细胞，并且通过各
种连接(连接蛋白、紧密连接、贴壁)彼此结合。它们的扩增潜力以集落的直径(而不是以密度)表示。成熟上皮细胞提供多种功能，诸如特化产物的分泌或有助于代谢(肝细胞、胆管上皮细胞)、解毒(肝细胞)、酶的产生(腺泡细胞)、内分泌因子的产生(例如胰岛或其他内分泌细胞)、电活动性(神经元细胞)和吸收(肠细胞)。
种连接(连接蛋白、紧密连接、贴壁)彼此结合。它们的扩增潜力以集落的直径(而不是以密度)表示。成熟上皮细胞提供多种功能，诸如特化产物的分泌或有助于代谢(肝细胞、胆管上皮细胞)、解毒(肝细胞)、酶的产生(腺泡细胞)、内分泌因子的产生(例如胰岛或其他内分泌细胞)、电活动性(神经元细胞)和吸收(肠细胞)。
[0070] 术语“胆系干细胞”(BTSC)是指整个胆系中存在的并且定位于壁外和壁内以及胆囊绒毛的隐窝内胆囊周腺(PBG)、布隆纳氏腺内的上皮干细胞。它们具有转化为定向肝脏
和/或胰腺祖细胞的能力。肝脏后代经由赫林(Hering)管进入肝窦状隙；胰腺祖细胞存在于胰腺管腺(PDG)内，定位于胰腺内的胆系的区域。
和/或胰腺祖细胞的能力。肝脏后代经由赫林(Hering)管进入肝窦状隙；胰腺祖细胞存在于胰腺管腺(PDG)内，定位于胰腺内的胆系的区域。
[0071] 迄今为止，已通过重叠性状鉴定出干细胞群的至少7个亚群，这些亚群的范围从极其原始的BTSC到可定义为肝脏干细胞或胰腺干细胞的干细胞群。下文给出了对这些已知内
容的描述。最原始的细胞存在于壁外胆囊周腺–栓系至胆管表面的细胞–和壁内胆囊周腺–存在于胆管壁内的细胞二者中。胆管壁中心中的纤维肌肉层附近的壁内胆囊周腺(PBG)也
可以被认为是隐窝(与肠隐窝平行)，其中存在最原始的干细胞群的龛。胆系网络内的大量
PBG存在于肝胰总管内和大肝内胆管内。PBG不出现于胆囊中，而胆囊内的干细胞龛是含有
中期至晚期干细胞群(肝脏干细胞的前体)的胆囊绒毛的底部。BTSC是肝和胰腺二者的前
体。它们产生肝脏干细胞(肝脏的前体)和胰腺干细胞(胰腺的前体)，并且这些干细胞存在
于整个胆系中，但是数量受到靠近肝脏还是胰腺的影响。因此，少量胰腺干细胞和大量肝脏干细胞定位于大肝内胆管的PBG中，而少量肝脏干细胞和大量胰腺干细胞定位于肝胰总管
的PBG中。
容的描述。最原始的细胞存在于壁外胆囊周腺–栓系至胆管表面的细胞–和壁内胆囊周腺–存在于胆管壁内的细胞二者中。胆管壁中心中的纤维肌肉层附近的壁内胆囊周腺(PBG)也
可以被认为是隐窝(与肠隐窝平行)，其中存在最原始的干细胞群的龛。胆系网络内的大量
PBG存在于肝胰总管内和大肝内胆管内。PBG不出现于胆囊中，而胆囊内的干细胞龛是含有
中期至晚期干细胞群(肝脏干细胞的前体)的胆囊绒毛的底部。BTSC是肝和胰腺二者的前
体。它们产生肝脏干细胞(肝脏的前体)和胰腺干细胞(胰腺的前体)，并且这些干细胞存在
于整个胆系中，但是数量受到靠近肝脏还是胰腺的影响。因此，少量胰腺干细胞和大量肝脏干细胞定位于大肝内胆管的PBG中，而少量肝脏干细胞和大量胰腺干细胞定位于肝胰总管
的PBG中。
[0072] 图中提供了遗传标志的汇总。通常，所有BTSC亚群都表达一般生物标志物，这些生物标志物包括针对肝脏和胰腺二者的内胚层转录因子(例如SOX9、SOX17、PDX1)、多能性基因(例如OCT4、SOX2、NANOG、SALL4、KLF4/KLF5、BMI-1)；CD44的透明质酸受体同种型(标准和/或变体同种型)中的一者或多者；CXCR4；以及细胞角蛋白8和细胞角蛋白18。胆系和PBG内的干细胞亚群包括(1)十二指肠的粘膜下层中的布隆纳氏腺干细胞，它们表达CK7、TRA-160和181，并且具有可与肠道中的干细胞区分的性状；(2)早期壁内胆系干细胞(BTSC)，它们表达钠碘同向转运体(NIS)和CXCR4、OCT4、SOX2、NANOG，但是不表达LGR5或EpCAM；(3)中期壁内BTSC，它们表达的NIS很少，但是获得LGR5而不是EpCAM的表达；(4)晚期壁内BTSC(仅胆囊中存在的BTSC)，并且还大量存在于大肝内胆管中和肝胰总管中。它们表达LGR5和
EpCAM二者。这些细胞是肝脏干细胞的前体(在肝脏中并且表达SOX17而不是PDX1)和胰腺干
细胞的前体(在肝胰总管中并且表达PDX1而不是SOX17)；(5)肝脏干细胞可以存在于赫林管
中、大肝内胆小管的PBG中、肝外胆系中的PBG中；以及肝胰总管的PBG中，但是最高数量是肝内部位处的那些。肝脏干细胞保留自我复制能力并且具有多分化能性。针对这些细胞的生
物标志物包括SOX9、SOX17、HNF-4α、ITGB1(CD29)、ONECUT 2、SALL4、LGR5、CD44、细胞质和质膜中存在的上皮细胞粘附分子(EpCAM)、神经细胞粘附分子(NCAM)、CD133(prominin)、可忽略水平(或更高)白蛋白、完全不存在甲胎蛋白(AFP)、不存在P450A7以及不存在分泌素受体(SR)。肝脏干细胞和肝母细胞表达细胞角蛋白8、细胞角蛋白18和细胞角蛋白19；(6)胰腺干细胞少量存在于整个胆系中(甚至大肝内胆管中的PBG中)，但是大量存在于肝胰总管的PBG
中。它们具有多能性基因以及所有干细胞群中提及的其他基因的表达，但是它们的不同之
处在于不再具有SOX17；谱系仅分化为胰岛的亚群表达NGN3。它们在整个细胞中和质膜处表达EpCAM，并且表达低水平的(或不表达)胰岛素。它们的成熟与胰岛素表达的增加以及其他胰岛激素(例如胰高血糖素)的表达相关联。成熟为腺泡群体的那些细胞将表达MUC6和淀粉
酶。
EpCAM二者。这些细胞是肝脏干细胞的前体(在肝脏中并且表达SOX17而不是PDX1)和胰腺干
细胞的前体(在肝胰总管中并且表达PDX1而不是SOX17)；(5)肝脏干细胞可以存在于赫林管
中、大肝内胆小管的PBG中、肝外胆系中的PBG中；以及肝胰总管的PBG中，但是最高数量是肝内部位处的那些。肝脏干细胞保留自我复制能力并且具有多分化能性。针对这些细胞的生
物标志物包括SOX9、SOX17、HNF-4α、ITGB1(CD29)、ONECUT 2、SALL4、LGR5、CD44、细胞质和质膜中存在的上皮细胞粘附分子(EpCAM)、神经细胞粘附分子(NCAM)、CD133(prominin)、可忽略水平(或更高)白蛋白、完全不存在甲胎蛋白(AFP)、不存在P450A7以及不存在分泌素受体(SR)。肝脏干细胞和肝母细胞表达细胞角蛋白8、细胞角蛋白18和细胞角蛋白19；(6)胰腺干细胞少量存在于整个胆系中(甚至大肝内胆管中的PBG中)，但是大量存在于肝胰总管的PBG
中。它们具有多能性基因以及所有干细胞群中提及的其他基因的表达，但是它们的不同之
处在于不再具有SOX17；谱系仅分化为胰岛的亚群表达NGN3。它们在整个细胞中和质膜处表达EpCAM，并且表达低水平的(或不表达)胰岛素。它们的成熟与胰岛素表达的增加以及其他胰岛激素(例如胰高血糖素)的表达相关联。成熟为腺泡群体的那些细胞将表达MUC6和淀粉
酶。
[0073] 值得注意的是，当肝脏干细胞和胰腺干细胞处于早期发育阶段(例如作为ESC或其他细胞)时，它们也可以存在于它们各自的来源器官中，并且本文公开的那些细胞中的任一种可以可替代地通过诱导产生(即作为iPSC)。
[0074] 如本文所用，术语“支持性”用于描述能够帮助细胞从另一个谱系期增殖或通过产生“旁分泌信号”来为邻近的细胞提供协助的细胞，所述“旁分泌信号”是就存活、扩增、迁移、分化和成熟而言在对邻近细胞的作用方面具有活性的因子。例如，支持性间充质细胞可以通过它们影响上皮细胞，任选地通过基质金属蛋白酶(MMP)和/或一种或多种旁分泌信号或生长因子的分泌来影响上皮细胞的能力来定义。很多这些细胞在最近的综述中有所概
述。(Cathery等人Stem Cells2018；PMID:29732653；Graceb等人Biochimie 2018:PMID
29698670；Caplan AI.Stem Cells Int.2015；PMID:26273305)。
述。(Cathery等人Stem Cells2018；PMID:29732653；Graceb等人Biochimie 2018:PMID
29698670；Caplan AI.Stem Cells Int.2015；PMID:26273305)。
[0075] 术语“谱系期搭配物”在本文中是指适于支持细胞植入的谱系期的间充质细胞和/或上皮细胞。对于肝脏干细胞或胆系干细胞，这些搭配物由成血管细胞(CD117+、CD133+、VEGFr+、CD31阴性)及其直接后代、内皮的前体(CD133+、VEGFr+、CD31+、温韦伯氏因子(vWF+))和星状细胞的前体(CD146+、ICAM-1+、α-平滑肌肌动蛋白+(ASMA)、维生素A阴性)组成。
它们可以部分和/或在某种程度上通过使用间充质干细胞(MSC)(诸如但不限于来源于骨髓
或脂肪组织的干细胞)来模拟。不受理论的束缚，据信此类细胞应在从组织中分离后或在无血清条件下最小理想传代后立即使用。这些细胞在本文中统称为早期谱系期间充质细胞
(ELSMC)。
它们可以部分和/或在某种程度上通过使用间充质干细胞(MSC)(诸如但不限于来源于骨髓
或脂肪组织的干细胞)来模拟。不受理论的束缚，据信此类细胞应在从组织中分离后或在无血清条件下最小理想传代后立即使用。这些细胞在本文中统称为早期谱系期间充质细胞
(ELSMC)。
[0076] 谱系网络中的中间细胞称为“短暂增殖细胞”，它们是可以具有双分化能性(或多分化能性)、具有相当大的增殖潜力但展示出很少(如果有的话)的真实自我复制、具有低至中(或甚至无)多能性基因表达、以及表达指示定向至肝脏(例如白蛋白、甲胎蛋白)或胰腺
(例如胰岛素、MUC6、淀粉酶)命运的性状的细胞。这些细胞包含肝母细胞(该网络产生肝脏)和胰管祖细胞(该网络产生胰腺)。
(例如胰岛素、MUC6、淀粉酶)命运的性状的细胞。这些细胞包含肝母细胞(该网络产生肝脏)和胰管祖细胞(该网络产生胰腺)。
[0077] 如本文所用，术语“胰管祖细胞”是指胰腺内的胰管腺(PDG)内存在的并且产生腺泡细胞和胰岛的双分化能性细胞。在我们的研究中，我们发现它们表达SOX9、PDX1、PTF1a、HNF1β、EpCAM、LGR5、ICAM-1、CD44，并且亚群表达NGN3或MUC6或淀粉酶。它们也在其他研究中广泛地表征。参见例如，Rezanejad H,Ouziel-Yahalom L,Keyzer CA,Sullivan BA,
Hollister-Lock J,Li WC,Guo L,Deng S,Lei J,Markmann J,Bonner-Weir
S.Heterogeneity of SOX9and HNF1βis dynamic.Stem Cell Reports.2018年3月13日；10(3):725-738。
Hollister-Lock J,Li WC,Guo L,Deng S,Lei J,Markmann J,Bonner-Weir
S.Heterogeneity of SOX9and HNF1βis dynamic.Stem Cell Reports.2018年3月13日；10(3):725-738。
[0078] 如本文所用，术语“肝母细胞”是指可以产生肝细胞和胆管上皮细胞谱系并且存在于赫林管中或附近或者存在于大肝内胆管内的PBG中的双分化能性肝脏细胞。它们具有非凡的增殖(即扩增)能力，但是相对于肝脏干细胞或BTSC中的观察结果而言自我复制能力很
低(如果有的话)。这些细胞的特征在于与肝脏干细胞或胆系干细胞重叠，但不同于肝脏干
细胞或胆系干细胞的生物标志物谱。它们表达SOX9、低(或甚至可忽略)水平的SOX17、高水平的LGR5、HNF4-α和EpCAM，这些表达主要存在于质膜处，并且表达P450A7、细胞角蛋白7、分泌素受体、所有肝母细胞中白蛋白的稳定表达、高水平的甲胎蛋白(AFP)、胞间粘附分子
(ICAM-1)但不表达NCAM、以及可忽略水平或不表达多能性基因(例如SALL4、KL4/KLF5、
OCT4、SOX2、NANOG)并且不表达成熟肝脏实质标记物(例如P450，诸如P4503A)。
低(如果有的话)。这些细胞的特征在于与肝脏干细胞或胆系干细胞重叠，但不同于肝脏干
细胞或胆系干细胞的生物标志物谱。它们表达SOX9、低(或甚至可忽略)水平的SOX17、高水平的LGR5、HNF4-α和EpCAM，这些表达主要存在于质膜处，并且表达P450A7、细胞角蛋白7、分泌素受体、所有肝母细胞中白蛋白的稳定表达、高水平的甲胎蛋白(AFP)、胞间粘附分子
(ICAM-1)但不表达NCAM、以及可忽略水平或不表达多能性基因(例如SALL4、KL4/KLF5、
OCT4、SOX2、NANOG)并且不表达成熟肝脏实质标记物(例如P450，诸如P4503A)。
[0079] 如本文所用，术语“定向祖细胞”是指产生单细胞类型(例如定向肝细胞祖细胞)的单分化能性祖细胞。在一些实施方案中，它们不表达多能性基因。定向肝细胞祖细胞通过白蛋白、AFP、糖原、ICAM-1、涉及糖原合成的各种酶以及间隙连接基因(连接蛋白28)的表达来识别。这些细胞产生肝细胞。定向胆(或胆管上皮细胞)祖细胞产生胆管上皮细胞，并且通过EpCAM、细胞角蛋白7和细胞角蛋白19、水通道蛋白、CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节因子)和胆汁产生相关的膜泵的表达来识别。在一些实施方案中，定向胰岛祖细胞表达胰岛素、胰高血糖素和其他胰岛激素，虽然表达水平很低；随着成熟，胰岛激素的表达水平增加，但是特定的细胞优先表达某些激素。
[0080] 如本文所用，术语“聚集体”是指聚集在一起的多个细胞。聚集体的大小和形状可以变化，或者大小和/或形状可以是基本上均一的。本文所用的细胞聚集体可以具有各种形状，例如球状、圆柱体(优选地高度和直径相等)或棒状等等。虽然可以使用其他形状的聚集体，但是在本公开的一个实施方案中，聚集体为球状或圆柱体通常是优选的。术语“非聚集的”是指单个或单细胞的干细胞和/或祖细胞或成熟细胞。在一些实施方案中，本文提供的组合物可以包含基本上聚集的细胞、基本上非聚集的细胞或它们的混合物。
[0081] 术语“类器官”在本文中是指通过本文所述的简单淘选方法自组装的供体上皮细胞与间充质细胞的特定细胞聚集体。在一些实施方案中，间充质细胞是支持性间充质细胞。
在一些实施方案中，类器官在低贴壁培养皿上、无血清确定条件下培养后形成，这些条件为悬浮液中的聚集细胞的多个谱系期而定制。其他研究也采用特定的基质提取物(诸如
Matrigel)来制备类器官。实际上，已知该物质是行业标准品。参见Hindley等人
Dev.Biology 2016；420:251-261。PMID:27364469。对于这些类器官在本发明所述的补片植入物中的使用，维持这些类器官的所描述条件将无法成功进行。因子(诸如Matrigel中存在的那些因子)将阻止或基本上减少这些补片植入物的成功所需的细胞的MMP产生。此外，
Matrigel不能作为细胞在临床上用于人或兽医目的的条件的组分。
在一些实施方案中，类器官在低贴壁培养皿上、无血清确定条件下培养后形成，这些条件为悬浮液中的聚集细胞的多个谱系期而定制。其他研究也采用特定的基质提取物(诸如
Matrigel)来制备类器官。实际上，已知该物质是行业标准品。参见Hindley等人
Dev.Biology 2016；420:251-261。PMID:27364469。对于这些类器官在本发明所述的补片植入物中的使用，维持这些类器官的所描述条件将无法成功进行。因子(诸如Matrigel中存在的那些因子)将阻止或基本上减少这些补片植入物的成功所需的细胞的MMP产生。此外，
Matrigel不能作为细胞在临床上用于人或兽医目的的条件的组分。
[0082] 术语“培养”或“细胞培养”意指细胞在人工体外环境中的维持。“细胞培养体系”在本文中用于指细胞群可以离体(在身体外部)生长的培养条件。
[0083] “培养基”在本文中用于指用于细胞培养、生长或增殖的营养溶液。培养基的特征可以是这样的功能性质：诸如但不限于将细胞在特定状态(例如多能性状态、增殖状态、静息状态等)下维持至成熟细胞的能力–在一些情况下，具体而言，促进祖细胞分化为特定谱系的细胞的能力。培养基的非限制性实例是血清补充培养基(SSM)，它们是补充有一定水平(通常约10％至约20％)的血清的任何基础培养基。血清可以是自体的(与细胞相同的物种)，或者更常见地来自出于商业目的而常规屠宰的动物(例如鸡、奶牛、猪等)的血清。值得注意的是，涉及干细胞的本发明的实施方案采用避免结合到驱动分化的血清和/或血清组
分的培养基。库部塔培养基是针对内胚层干细胞/祖细胞而设计的无血清培养基，它包含基础培养基(营养物、氨基酸、维生素、盐、碳水化合物)，不含铜、含少量钙(<0.5mM)，补充有硒、锌、胰岛素、运铁蛋白、脂质，但不含细胞因子或生长因子。据发现支持干细胞的其他培养基也是可以使用的，但是它们必须避免引起细胞分化的任何因子，因为成熟过程将导致
膜相关的和/或分泌的MMP产生的沉默。
分的培养基。库部塔培养基是针对内胚层干细胞/祖细胞而设计的无血清培养基，它包含基础培养基(营养物、氨基酸、维生素、盐、碳水化合物)，不含铜、含少量钙(<0.5mM)，补充有硒、锌、胰岛素、运铁蛋白、脂质，但不含细胞因子或生长因子。据发现支持干细胞的其他培养基也是可以使用的，但是它们必须避免引起细胞分化的任何因子，因为成熟过程将导致
膜相关的和/或分泌的MMP产生的沉默。
[0084] 基础培养基是用于细胞培养的缓冲液，并且由氨基酸、糖、脂质、维生素、矿物、盐、痕量元素以及模拟细胞周围的间隙液的化学成分的组合物中的各种营养物组成。此外，细胞培养基通常由补充有少量(通常2％-10％)血清的基础培养基组成。对于本文所述的植入
技术，所述条件被用于将细胞维持为干细胞或早期祖细胞，所以应避免血清或可能驱动细
胞朝向成熟细胞命运的任何典型补充物。除常规基础培养基之外，还有各种营养补充物、脂质(游离脂肪酸与白蛋白和载体分子(诸如高密度脂蛋白)复合的混合物)。只添加两种激
素/生长因子：胰岛素(碳水化合物代谢所需)和运铁蛋白(作为聚合酶的Fe载体所需)。库部塔培养基是针对内胚层干细胞/祖细胞而设计的无血清培养基，它包含基础培养基，不含
铜、含少量钙(<0.5mM)，补充有锌、硒、胰岛素、运铁蛋白、脂质，但不含细胞因子或生长因子。应避免使用其他生长因子和细胞因子，尤其是血清，因为它们会诱导供体细胞的分化，从而使植入和迁移过程所需的MMP的产生最小化。
技术，所述条件被用于将细胞维持为干细胞或早期祖细胞，所以应避免血清或可能驱动细
胞朝向成熟细胞命运的任何典型补充物。除常规基础培养基之外，还有各种营养补充物、脂质(游离脂肪酸与白蛋白和载体分子(诸如高密度脂蛋白)复合的混合物)。只添加两种激
素/生长因子：胰岛素(碳水化合物代谢所需)和运铁蛋白(作为聚合酶的Fe载体所需)。库部塔培养基是针对内胚层干细胞/祖细胞而设计的无血清培养基，它包含基础培养基，不含
铜、含少量钙(<0.5mM)，补充有锌、硒、胰岛素、运铁蛋白、脂质，但不含细胞因子或生长因子。应避免使用其他生长因子和细胞因子，尤其是血清，因为它们会诱导供体细胞的分化，从而使植入和迁移过程所需的MMP的产生最小化。
[0085] 如本文所用，“库部塔培养基”是指不含铜、含钙(<0.5mM)、硒、锌、胰岛素、运铁蛋白/Fe、结合至纯化的白蛋白的游离脂肪酸的混合物、以及任选地还含高密度脂蛋白(HDL)的任何培养基。在一些实施方案中，库部塔培养基包括不含铜、含少量钙(例如，0.3mM)、～
10-9M硒、～0.1％牛血清白蛋白或人血清白蛋白(高度纯化且不含脂肪酸)、～4.5mM烟酰
胺、～0.1nM硫酸锌七水合物、～10-8M氢化可的松(用于肝脏前体而不是胰腺前体的任选组分)、～5μg/ml运铁蛋白/Fe、～5μg/ml胰岛素、～10μg/ml高密度脂蛋白以及纯化的游离脂肪酸的混合物(在游离脂肪酸结合至纯化的血清白蛋白之后添加)的任何培养基(例如，
RPMI 1640或DMEM-F12)。游离脂肪酸混合物由～100mM棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和硬脂酸中的每者组成。用于制备该培养基的非限制性示例性方法已在其他地方有所
公开，例如Kubota H,Reid LM,Proc.Nat.Acad.Scien.(USA)2000；97:12132-12137，该文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。
10-9M硒、～0.1％牛血清白蛋白或人血清白蛋白(高度纯化且不含脂肪酸)、～4.5mM烟酰
胺、～0.1nM硫酸锌七水合物、～10-8M氢化可的松(用于肝脏前体而不是胰腺前体的任选组分)、～5μg/ml运铁蛋白/Fe、～5μg/ml胰岛素、～10μg/ml高密度脂蛋白以及纯化的游离脂肪酸的混合物(在游离脂肪酸结合至纯化的血清白蛋白之后添加)的任何培养基(例如，
RPMI 1640或DMEM-F12)。游离脂肪酸混合物由～100mM棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和硬脂酸中的每者组成。用于制备该培养基的非限制性示例性方法已在其他地方有所
公开，例如Kubota H,Reid LM,Proc.Nat.Acad.Scien.(USA)2000；97:12132-12137，该文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0086] 因此，在一些实施方案中，这些补片植入物的条件与补充有少量(通常2％-10％)血清的培养基的常规使用相反。长期以来一直添加血清以提供驱动生物学过程(例如增殖、分化)所需的必需信号传导分子(激素、生长因子、细胞因子)。在一些实施方案中，不包括血清以避免细胞的分化和/或避免MMP(尤其是分泌形式)的产生的失活或沉默。
[0087] 如本文所用，术语“有效量”(amount effective或effective amount)是指足以治疗疾病状态或状况(例如肝脏疾病或胰腺疾病)的量。有效量可以在一次或多次施用、施涂或剂量中施用。这种递送取决于很多变量，包括使用单个剂量单位的时间期、组合物的生物利用率、给药途径等。然而，应当理解，对于任何特定患者，组合物的具体量取决于多种因素，包括所采用的具体试剂的活性、患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食、施用时间、排泄率、组合物组合、待治疗的特定疾病(例如肝脏疾病或胰腺疾病)的严重度以及给药形式。
[0088] 当涉及特定分子、生物学材料或细胞材料时，术语“等同物”或“生物学等同物”可互换使用，并且意指具有最小同源性同时仍维持期望的结构或功能的那些物质。
[0089] 如本文所用，术语“表达”是指多核苷酸转录为mRNA的过程和/或转录的mRNA随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程，如果多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可以包括mRNA在真核细胞中的剪接。可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白质的量来测定基因的表达
水平；另外，可以测定多个基因的表达水平以建立特定样品的表达谱。
水平；另外，可以测定多个基因的表达水平以建立特定样品的表达谱。
[0090] 如本文所用，术语“功能”可以用于修饰任何分子、生物学材料或细胞材料，以使其实现特定的指定效果。
[0091] 如本文所用，术语“基因”意指广泛地包括转录为RNA分子的任何核酸序列，无论RNA是编码的(例如，mRNA)还是非编码的(例如，ncRNA)。
[0092] 如本文所用，当涉及使本公开的类器官产生的方法步骤时，术语“产生”(generate)及其等同形式(例如，generating、generated等)可与“生产”及其等同形式互换使用。
[0093] 如本文所用，术语“分离的”是指基本上不含其他材料的分子或生物制品或细胞材料。
[0094] 术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物。多核苷酸可以具有任何三维(3D)结构，并且可以执行任何已知的或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、RNAi、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的DNA、具有任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。
[0095] 多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，核苷酸结构的修饰可以在多核苷酸组装之前或之后实施。核苷酸的序列可以被非核
苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合来修饰。该术语还指双链和单链分子二者。除非另外指明或要求，否则该技术(即多核苷酸技术)的任何
方面涵盖双链形式以及已知或预测构成双链形式的两个互补的单链形式中的每个。
苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合来修饰。该术语还指双链和单链分子二者。除非另外指明或要求，否则该技术(即多核苷酸技术)的任何
方面涵盖双链形式以及已知或预测构成双链形式的两个互补的单链形式中的每个。
[0096] 术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，并且在最广泛的意义上是指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可以通过肽键来连接。在另一个方面，亚基可以通过其他键(例如，酯键、醚键等)来连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数没有限制。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸以及D和L两种光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。
[0097] 如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用，并且旨在表示任何动物。在一些实施方案中，受试者可以是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是牛、马、猪、犬、猫、猿猴、鼠、人或大鼠。在一些实施方案中，受试者是人。
[0098] 术语“组织”在本文中用于指活的或死的生物体的组织，或者来源于或设计为模拟活的或死的生物体的任何组织。组织可以是健康的、患病的、受到创伤的、受损的和/或具有遗传突变的。如本文所用，术语“天然组织”或“生物学组织”及其变形是指当来源于生物体时以天然状态或未经修饰的状态存在的生物学组织。“微器官”是指模拟“天然组织”的“生物工程化组织”的一部分。
[0099] 生物学组织可以包括任何单个组织(例如，可以互连的细胞的集合)或构成生物体的器官或部分或区域的一群组织。组织可以包括均质的细胞材料，或它可以是复合结构，诸如包括胸部的身体的区域中存在的复合结构，所述胸部例如可以包括肺组织、骨骼组织和/或肌肉组织。示例性组织包括但不限于来源于肝脏、胰腺、胆系、肺、肠、甲状腺、胸腺、膀胱、肾脏、前列腺、子宫、乳腺、皮肤和皮下真皮组织、脑、脊髓、血管(例如主动脉、髂静脉)、心脏、肌肉的那些组织，包括它们的任何组合。
[0100] 如本文所用，“治疗”(treating或treatment)受试者中的疾病是指(1)预防易患或尚未表现出疾病的症状的受试者中症状或疾病的出现；(2)抑制疾病或阻止其发展；或者(3)改善或引起疾病或疾病的症状的消退。如本领域中所理解，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。出于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但
不限于减轻或改善一种或多种症状、减轻病症(包括疾病)的程度、稳定病症(包括疾病)的
状态(即，不恶化)、延缓或减慢病症(包括疾病)、进展、改善或缓和病症(包括疾病)、状态以及可检测的或不可检测的缓解(部分缓解或完全缓解)中的一者或多者。
不限于减轻或改善一种或多种症状、减轻病症(包括疾病)的程度、稳定病症(包括疾病)的
状态(即，不恶化)、延缓或减慢病症(包括疾病)、进展、改善或缓和病症(包括疾病)、状态以及可检测的或不可检测的缓解(部分缓解或完全缓解)中的一者或多者。
[0101] 缩写
[0102] AFP，甲胎蛋白；ALB，白蛋白；BTSC，胆系干细胞；CD，共同决定簇；CD44，透明质酸受体；CD133，prominin；CFTR，囊性纤维化跨膜传导调节因子；CK，细胞角蛋白；CXCR4，CXC-趋化因子受体4(也称为融合病毒蛋白或CD184；也称为血小板因子4)；EGF，表皮生长因子；ELSMC，早期谱系期间充质细胞，由成血管细胞及其后代、内皮的前体和星状细胞的前体组成；EpCAM，上皮细胞粘附分子；FGF，成纤维细胞生长因子；HB，肝母细胞；HGF，肝细胞生长因子；HpSC，肝脏干细胞；KM，库部塔培养基，一种针对内胚层干细胞而设计的无血清培养基；
KRT，细胞角蛋白基因；LGR5，结合至R-spondin的含有富含亮氨酸的重复序列的G蛋白偶联受体5；MMP，基质金属蛋白酶，与胞外基质的溶解、细胞迁移和再生反应相关的蛋白酶大家族；NANOG，关键地涉及自我更新的转录因子；NCAM，神经细胞粘附分子；NIS，钠/碘同向转运体；OCT4，(结合八聚体的转录因子4)也称为POU5F1(POU结构域，5类，转录因子1)，由干细胞表达的基因；PDX1，胰腺和十二指肠同源框1，胰腺发育关键的转录因子；PBG，胆囊周腺，胆系干细胞的干细胞龛；SALL4，Sal样蛋白4，据发现对于干细胞的自我复制是重要的；SOX，Sry相关的HMG盒；SOX2，对于维持自我更新、或胚胎干细胞和确定的干细胞的多能性重要的转录因子。SOX9，与内胚层组织(肝脏、肠和胰腺)相关的转录因子；SOX17，对于肝脏的分化重要的转录因子；VEGF，血管内皮细胞生长因子；vWF，血管性血友病因子。
KRT，细胞角蛋白基因；LGR5，结合至R-spondin的含有富含亮氨酸的重复序列的G蛋白偶联受体5；MMP，基质金属蛋白酶，与胞外基质的溶解、细胞迁移和再生反应相关的蛋白酶大家族；NANOG，关键地涉及自我更新的转录因子；NCAM，神经细胞粘附分子；NIS，钠/碘同向转运体；OCT4，(结合八聚体的转录因子4)也称为POU5F1(POU结构域，5类，转录因子1)，由干细胞表达的基因；PDX1，胰腺和十二指肠同源框1，胰腺发育关键的转录因子；PBG，胆囊周腺，胆系干细胞的干细胞龛；SALL4，Sal样蛋白4，据发现对于干细胞的自我复制是重要的；SOX，Sry相关的HMG盒；SOX2，对于维持自我更新、或胚胎干细胞和确定的干细胞的多能性重要的转录因子。SOX9，与内胚层组织(肝脏、肠和胰腺)相关的转录因子；SOX17，对于肝脏的分化重要的转录因子；VEGF，血管内皮细胞生长因子；vWF，血管性血友病因子。
[0103] 本公开的实施方式
[0104] 在本文提供的实例中，申请人建立了补片植入物、一种用于将细胞移植到内部器官中的新方法，该方法的设计特征取决于细胞是干细胞还是成熟细胞。申请人在本文中展
示了这些方法，其中胆系干细胞(BTSC)、肝脏和胰腺的前体的植入物被移植到肝脏或胰腺
中。用于开发这些方法的宿主是家猪(Sus scrofa domestics)的品种。它们是用于转化研
究、手术模型和程序训练的主要动物物种，并且在临床前研究中越来越多地被用作猴子的
替代物。
示了这些方法，其中胆系干细胞(BTSC)、肝脏和胰腺的前体的植入物被移植到肝脏或胰腺
中。用于开发这些方法的宿主是家猪(Sus scrofa domestics)的品种。它们是用于转化研
究、手术模型和程序训练的主要动物物种，并且在临床前研究中越来越多地被用作猴子的
替代物。
[0105] 使用胆系干细胞(BTSC)、肝脏和胰腺的前体的类器官，与早期谱系期间充质细胞(ELSMC)搭配，并且包含在软质(～100Pa)透明质酸(HA)水凝胶中取得了示例性的成功。将
含有类器官的HA水凝胶放置于Seri-silk基底(网状材料)上，在Seri-silk基底的浆膜侧上
用更稠的HA水凝胶(～700Pa)进行浸渍，所述HA水凝胶通过手术或者栓系至肝脏或胰腺的
表面。在一周内，植入物引起器官囊和邻近组织，以及任选地远处实质组织的重塑，随后供体细胞和宿主细胞合并。到两周时，供体细胞已成熟为功能性成体命运，诸如肝细胞(白蛋白)或胰岛(β细胞胰岛素)。到三周时，随着HA的清除，器官囊和正常组织的组织学得到恢复。据证实，植入/迁移/整合过程取决于细胞表达的多个质膜相关的和分泌的基质金属蛋
白酶。
含有类器官的HA水凝胶放置于Seri-silk基底(网状材料)上，在Seri-silk基底的浆膜侧上
用更稠的HA水凝胶(～700Pa)进行浸渍，所述HA水凝胶通过手术或者栓系至肝脏或胰腺的
表面。在一周内，植入物引起器官囊和邻近组织，以及任选地远处实质组织的重塑，随后供体细胞和宿主细胞合并。到两周时，供体细胞已成熟为功能性成体命运，诸如肝细胞(白蛋白)或胰岛(β细胞胰岛素)。到三周时，随着HA的清除，器官囊和正常组织的组织学得到恢复。据证实，植入/迁移/整合过程取决于细胞表达的多个质膜相关的和分泌的基质金属蛋
白酶。
[0106] 这些实例的这些结果与过去的从实体器官至内部器官的细胞移植工作形成对比，其中移植通过直接注射或通过经由血管途径的细胞递送来实现(参见Bhatia等人、Lanzoni
等人、Weber等等的综述)。过去的移植方法产生了少量待植入的细胞，具有可能危及生命的栓塞风险，以及显著的异位细胞分布水平。这些问题会导致针对内部实体器官的细胞疗法
最低程度地使用或无法完全使用。
等人、Weber等等的综述)。过去的移植方法产生了少量待植入的细胞，具有可能危及生命的栓塞风险，以及显著的异位细胞分布水平。这些问题会导致针对内部实体器官的细胞疗法
最低程度地使用或无法完全使用。
[0107] 补片植入物策略提供了一种细胞疗法的替代性方法，所述细胞疗法能够递送足够数量的细胞并使它们整合到组织中，从而显著地恢复一种或多种功能。这些实例展示出安
全性，条件是所用的生物材料和基底支持维持一些或全部供体细胞的不成熟状态，所以能
够产生MMP的相关库。失败的常见原因是导致供体细胞分化的任何因素。不受理论的束缚，本文设想可以将纯化的MMP结合到植入物生物材料中和/或可以使用重组表达系统或其他
遗传修饰技术来转化细胞以分泌MMP，作为在天然产生必需的MMP植入物中提供细胞的替代
方式。在此类实施方案中，结合到或经由构建体转导的MMP的组合应包括在以下实例提供的表达谱中鉴定的那些MMP。
全性，条件是所用的生物材料和基底支持维持一些或全部供体细胞的不成熟状态，所以能
够产生MMP的相关库。失败的常见原因是导致供体细胞分化的任何因素。不受理论的束缚，本文设想可以将纯化的MMP结合到植入物生物材料中和/或可以使用重组表达系统或其他
遗传修饰技术来转化细胞以分泌MMP，作为在天然产生必需的MMP植入物中提供细胞的替代
方式。在此类实施方案中，结合到或经由构建体转导的MMP的组合应包括在以下实例提供的表达谱中鉴定的那些MMP。
[0108] 补片植入物的组合物
[0109] 本文公开的方面涉及包含含有单个细胞群或者两个或更多个细胞群(例如可以是自体的或同种异体的供体细胞)的层和MMP的来源以及含有生物相容性的、可生物降解材料
(它可以用于将植入物栓系至靶标部位)的基底的补片植入物。在一些实施方案中，一个或
多个细胞群包括上皮细胞群和间充质细胞群。在一些实施方案中，细胞群必须作为植入物
的一部分维持在特定状态或“谱系期”，这意味着它们不会分化或进一步成熟直到结合到器官中。这可以通过保持涉及细胞来源、MMP含量、所用的培养基和基底质量的变量的平衡来实现。这些方面中的每个在下文中更详细地描述。
(它可以用于将植入物栓系至靶标部位)的基底的补片植入物。在一些实施方案中，一个或
多个细胞群包括上皮细胞群和间充质细胞群。在一些实施方案中，细胞群必须作为植入物
的一部分维持在特定状态或“谱系期”，这意味着它们不会分化或进一步成熟直到结合到器官中。这可以通过保持涉及细胞来源、MMP含量、所用的培养基和基底质量的变量的平衡来实现。这些方面中的每个在下文中更详细地描述。
[0110] 不受理论的束缚，据信具有以下组分的补片植入物可以获得成功(1)在培养基和水凝胶中的最佳细胞群或细胞的混合物–例如供体上皮细胞和产生膜相关的和/或分泌的
MMP的支持性间充质干细胞/祖细胞群–所述培养基和水凝胶不会导致支持性间充质干细
胞/祖细胞群的分化或者含有适当的MMP，以及(2)基底，所述基底适合将植入物栓系至靶标部位，并且防止植入物中的细胞朝向基底、远离靶标部位迁移。
MMP的支持性间充质干细胞/祖细胞群–所述培养基和水凝胶不会导致支持性间充质干细
胞/祖细胞群的分化或者含有适当的MMP，以及(2)基底，所述基底适合将植入物栓系至靶标部位，并且防止植入物中的细胞朝向基底、远离靶标部位迁移。
[0111] 示例性细胞
[0112] 不受理论的束缚，细胞可以是任何成熟谱系期，包括胚胎干(ES)细胞、诱导性多能干(iPS)细胞、确定的干细胞、定向祖细胞、短暂增殖细胞或成熟细胞。然而，在某些实施方案中，MMP的来源必须存在于补片植入物中。因此，本文设想了用于补片植入物的MMP的细胞来源。此类细胞来源必须处于能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶的早期谱系期。这种早期谱系期的非限制性实例是早期谱系期间充质干细胞(ESMLC)。
[0113] 在一些实施方案中，待植入的细胞是与间充质细胞搭配的上皮细胞。在一些实施方案中，上皮细胞包括上皮干细胞。在一些实施方案中，上皮细胞包括定向和/或成熟上皮细胞。在一些实施方案中，定向和/或成熟上皮细胞包括成熟实质细胞。在一些实施方案中，成熟实质细胞包括肝细胞、胆管上皮细胞或胰岛细胞中的一者或多者。在一些实施方案中，间充质细胞包括ELSMC。在一些实施方案中，ELSMC包括成血管细胞、内皮的前体、星状细胞的前体和MSC中的一者或多者。在一些实施方案中，上皮细胞和间充质细胞是彼此的谱系期搭配物。在一些实施方案中，上皮细胞和间充质细胞不是彼此的谱系期搭配物，例如分别不处于大致相同的谱系期或成熟期。在一些实施方案中，上皮细胞是成熟细胞。在一些实施方案中，间充质细胞是ELSMC。
[0114] 在一些实施方案中，上皮细胞和间充质细胞中的至少一者来源于供体。在一些实施方案中，供体是需要组织移植的受试者。在一些实施方案中，供体是用于组织移植的健康细胞的来源。在一些实施方案中，上皮细胞和间充质细胞中的至少一者是补片植入物的预
期接受者自体的。在一些实施方案中，所有细胞(即上皮和间充质细胞)都是植入物的预期
接受者自体的。在一些实施方案中，细胞的供体可以是除接受者(同种异体)之外的供体，或者也可以是具有患病的或功能障碍性病症的内部器官的受试者(自体)，任选地，其中从未
患病或具有功能障碍的和/或已对细胞进行遗传修饰以恢复功能的内部器官的一部分获
得。
期接受者自体的。在一些实施方案中，所有细胞(即上皮和间充质细胞)都是植入物的预期
接受者自体的。在一些实施方案中，细胞的供体可以是除接受者(同种异体)之外的供体，或者也可以是具有患病的或功能障碍性病症的内部器官的受试者(自体)，任选地，其中从未
患病或具有功能障碍的和/或已对细胞进行遗传修饰以恢复功能的内部器官的一部分获
得。
[0115] 在另一个方面，间充质细胞是供体细胞的谱系期搭配物，例如处于可比的或对应的谱系期。在另一个方面，间充质细胞不是供体细胞的谱系期合适的搭配物。间充质谱系期细胞可以是成血管细胞、内皮和/或星状细胞的早期谱系期前体、间充质干细胞、内皮或星状细胞或这些细胞群的衍生物。
[0116] 对于干细胞移植，上皮细胞应与天然的谱系期搭配物间充质细胞(成血管细胞和/或内皮或星状细胞的前体)搭配。对于成体上皮细胞，适当的搭配物包括由成血管细胞和/
或星状细胞和内皮细胞的前体组成的早期谱系期间充质细胞(ELSMC)。申请人已经展示，可以使用间充质干细胞(MSC)与成体细胞组合的制备物来实现植入。在一些实施方案中，某些MSC可以优于其他MSC。不受理论的束缚，据信可以通过选择需要最少(如果有的话)细胞培
养以及将避免血清和可以驱动细胞分化的基质组分的细胞组合来优化植入物。不受理论的
束缚，还应理解，上皮-间充质关系是重要的，因为旁分泌信号传导支持MMP的产生。然而，与成熟内皮搭配的成熟上皮细胞将在植入物中存活，并且将是功能性细胞，但不能植入。因
此，如果成熟上皮细胞与成熟基质搭配形成植入物，则所得的植入物可能会发生纤维化。
或星状细胞和内皮细胞的前体组成的早期谱系期间充质细胞(ELSMC)。申请人已经展示，可以使用间充质干细胞(MSC)与成体细胞组合的制备物来实现植入。在一些实施方案中，某些MSC可以优于其他MSC。不受理论的束缚，据信可以通过选择需要最少(如果有的话)细胞培
养以及将避免血清和可以驱动细胞分化的基质组分的细胞组合来优化植入物。不受理论的
束缚，还应理解，上皮-间充质关系是重要的，因为旁分泌信号传导支持MMP的产生。然而，与成熟内皮搭配的成熟上皮细胞将在植入物中存活，并且将是功能性细胞，但不能植入。因
此，如果成熟上皮细胞与成熟基质搭配形成植入物，则所得的植入物可能会发生纤维化。
[0117] 对于患病或具有功能障碍的器官的治疗，细胞可以来自除接受者(同种异体移植物)之外的供体，或也可以是自体移植物，所以来自具有患病或功能障碍病症的内部器官的受试者，任选地，其中从未患病或具有功能障碍的和/或已对细胞进行遗传修饰以恢复功能的内部器官的一部分获得。
[0118] 对于建立用于研究疾病的模型系统，细胞可以是患有疾病并且移植到实验宿主中的正常组织之上/之中的细胞。
[0119] 在一些实施方案中，上皮细胞可以是与支持性间充质细胞(任选地ELSMC)组合以形成类器官(任选地自组装)的干细胞。这些类器官可以包埋或包含在透明质酸水凝胶中。
本公开的干细胞和/或祖细胞可以包括本领域已知的任何干细胞和/或祖细胞，包括例如胚
胎干细胞(ESC)、胚胎生殖细胞(EGC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、胰腺干细胞(PSC)、肝脏干细胞(HpSC)、胆系干细胞(BTSC)、肝母细胞、胰管祖细胞、定向胰腺祖细胞或定向肝脏祖细胞。在一些实施方案中，细胞群仅包括干细胞，诸如胰腺干细胞、肝脏干细胞、胆系干细胞(BTSC)或布隆纳氏腺干细胞。在其他实施方案中，细胞仅包括多分化能性祖细胞亚群，诸如肝母细胞或胰管祖细胞，或植入物可以含有定向单分化能性祖细胞(例如肝细胞或胆或胰
岛或腺泡定向祖细胞)。在其他实施方案中，细胞包括干细胞和祖细胞的混合物。
本公开的干细胞和/或祖细胞可以包括本领域已知的任何干细胞和/或祖细胞，包括例如胚
胎干细胞(ESC)、胚胎生殖细胞(EGC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、胰腺干细胞(PSC)、肝脏干细胞(HpSC)、胆系干细胞(BTSC)、肝母细胞、胰管祖细胞、定向胰腺祖细胞或定向肝脏祖细胞。在一些实施方案中，细胞群仅包括干细胞，诸如胰腺干细胞、肝脏干细胞、胆系干细胞(BTSC)或布隆纳氏腺干细胞。在其他实施方案中，细胞仅包括多分化能性祖细胞亚群，诸如肝母细胞或胰管祖细胞，或植入物可以含有定向单分化能性祖细胞(例如肝细胞或胆或胰
岛或腺泡定向祖细胞)。在其他实施方案中，细胞包括干细胞和祖细胞的混合物。
[0120] 如果使用成体上皮细胞，则它们可以以相关比率与ELSMC混合至植入生物材料中。可以确定细胞混合物的比率以模拟靶标组织。替代地或另外，可以通过类器官的自组装来
确定比率。类器官或细胞混合物包埋在软质植入生物材料(诸如软质透明质酸水凝胶)中。
如果植入干细胞，则本公开的干细胞和/或祖细胞可以包括本领域已知的任何干细胞和/或
祖细胞，包括例如胚胎干细胞(ESC)、胚胎生殖细胞(EGC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、布隆纳氏腺干细胞(BGSC)、胆系干细胞(BTSC)、胰腺干细胞(PSC)、肝脏干细胞(HpSC)、短暂增殖细胞(例如肝母细胞或胰管祖细胞)和定向单分化能性祖细胞(例如定向胰腺祖细胞或肝细
胞祖细胞或胆管上皮细胞祖细胞)。在一些实施方案中，细胞群仅包括干细胞。在其他实施方案中，细胞仅包括祖细胞亚群。在其他实施方案中，细胞包括干细胞和祖细胞的混合物或干细胞/祖细胞和更成熟的细胞的混合物。在另外的其他实施方案中，可以存在成体细胞
(例如肝细胞、胆管上皮细胞、肠上皮细胞、胰岛)和ELSMC的嵌合混合物。
确定比率。类器官或细胞混合物包埋在软质植入生物材料(诸如软质透明质酸水凝胶)中。
如果植入干细胞，则本公开的干细胞和/或祖细胞可以包括本领域已知的任何干细胞和/或
祖细胞，包括例如胚胎干细胞(ESC)、胚胎生殖细胞(EGC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、布隆纳氏腺干细胞(BGSC)、胆系干细胞(BTSC)、胰腺干细胞(PSC)、肝脏干细胞(HpSC)、短暂增殖细胞(例如肝母细胞或胰管祖细胞)和定向单分化能性祖细胞(例如定向胰腺祖细胞或肝细
胞祖细胞或胆管上皮细胞祖细胞)。在一些实施方案中，细胞群仅包括干细胞。在其他实施方案中，细胞仅包括祖细胞亚群。在其他实施方案中，细胞包括干细胞和祖细胞的混合物或干细胞/祖细胞和更成熟的细胞的混合物。在另外的其他实施方案中，可以存在成体细胞
(例如肝细胞、胆管上皮细胞、肠上皮细胞、胰岛)和ELSMC的嵌合混合物。
[0121] 可以通过本领域技术人员已知的任何方法来鉴定干细胞和/或祖细胞。非限制性实例包括使用定义自我复制能力的测定法和通过形态分析、通过基因和/或蛋白质表达、细胞表面标记物等等来展示多分化能性的测定法的组合。在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞表达表示早期肝脏细胞谱系细胞的至少一种标记物(例如，SOX17、HNF-4α、HNF6、HES1、CK19)和表示早期胰腺细胞谱系的至少一种标记物(例如，PDX1、PROX1、NGN3、HNFβ1)。例如，可以通过SOX9、SOX17、PDX1、CD133、NCAM、音猬因子(sonic hedgehog)(SHH)、钠碘同向转运体(NIS)、LGR5、LGR6、EpCAM、CD44的各种同种型、CXCR4和各种多能性基因(例如OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、KLF5、SALL4、BMi-1)或它们的任何组合的表达来鉴定干细胞和/或祖细胞(尤其是BTSC)。
[0122] 在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞表达表示早期亲本期细胞谱系(诸如肝脏和胰腺的亲本谱系)的至少一种标记物。因此，它们将表达肝脏和胰腺谱系共有的一种或多种标记物(例如SOX9、LGR5/LGR6、EpCAM、CD133、CK19)和肝脏谱系的一种或多种标记物(例如，SOX17、HNF-4-α、HNF6、HES1)和早期胰腺细胞谱系的一种或多种标记物(例如，PDX1、PROX1、NGN3、HNFβ1)。例如，可以通过SOX9、SOX17、PDX1、CD133、NCAM、音猬因子(sonic hedgehog)(SHH)、钠碘同向转运体(NIS)、LGR5、LGR6、EpCAM和各种多能性基因(例如OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、KLF5、SALL4、BMi-1)或它们的任何组合的表达来鉴定干细胞和/或祖细胞(尤其是BTSC)。
[0123] 成熟细胞类型的产生
[0124] 如果需要，干细胞和/或祖细胞也可以分化为更成熟的细胞类型。这可以在体外通过自发分化和/或通过直接分化来进行。直接分化可以涉及使用确定的培养基，遗传修饰干细胞和/或祖细胞，以表达所关注的基因或它们的组合。
[0125] 用于分化细胞的确定的培养基的非限制性实例包括用于使内胚层干细胞分化为成体命运的激素确定的培养基(HDM)。可以将补充物添加至库部塔培养基，以产生无血清
的、激素确定的培养基(HDM)，该培养基有利于正常肝脏或胆系干细胞分化为特定的成体命运。这些补充物包括实现等于或大于0.6mM浓度的钙补充物、1nM三碘甲状腺原氨酸(T3)、
10-12M铜、10nM氢化可的松和20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。除选择性产生肝细胞(HDM-H)与胆管上皮细胞(HDM-C)与胰腺胰岛(HDM-P)所需的培养基条件之外的其他培养
基条件为：
的、激素确定的培养基(HDM)，该培养基有利于正常肝脏或胆系干细胞分化为特定的成体命运。这些补充物包括实现等于或大于0.6mM浓度的钙补充物、1nM三碘甲状腺原氨酸(T3)、
10-12M铜、10nM氢化可的松和20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。除选择性产生肝细胞(HDM-H)与胆管上皮细胞(HDM-C)与胰腺胰岛(HDM-P)所需的培养基条件之外的其他培养
基条件为：
[0126] 1)HDM-H：进一步补充7μg/L胰高血糖素、2g/L半乳糖、10ng/ml表皮生长因子(EGF)和20ng/ml肝细胞生长因子(HGF)；
[0127] 2)HDM-C：进一步补充20ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF)和10ng/ml HGF；以及
[0128] 3)HDM-P：在无糖皮质激素的条件下制备，并进一步补充1％B27、0.1mM抗坏血酸、0.25μM环巴胺、1μM视黄酸、20ng/ml FGF-7，持续4天，然后更换为如下补充物：50ng/ml艾塞那肽-4和20ng/ml HGF，再诱导6天。
[0129] 本文提供的HDM可以补充有另外的生长因子，包括但不限于Wnt信号、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子、各种白介素、白血病抑制因子
(LIF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、干细胞因子(SCF)、集落刺激因子(CSF)、GM-CSF、促红细胞生成素、血小板生成素、肝素结合生长因子、IGF结合蛋白和/或胎盘生长因子。
(LIF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、干细胞因子(SCF)、集落刺激因子(CSF)、GM-CSF、促红细胞生成素、血小板生成素、肝素结合生长因子、IGF结合蛋白和/或胎盘生长因子。
[0130] 本文提供的HDM可以补充有细胞因子，包括但不限于白介素、淋巴因子、单核因子、集落刺激因子、趋化因子、干扰素和肿瘤坏死因子(TNF)。
[0131] 申请人已经展示，透明质酸可以影响干细胞和/或祖细胞，以表达调节细胞贴壁和细胞间相互作用所需的关键细胞粘附分子的因子，以及在细胞悬浮液制备、超低温保存或
移植后防止干细胞和/或祖细胞对那些贴壁因子的内化。此类贴壁因子的非限制性实例包
括整合素。整合素是异源二聚体跨膜糖蛋白大家族，它们的功能是使细胞附接到基底膜的
胞外基质蛋白、其他细胞上的配体以及可溶性配体。整合素含有大亚基和小亚基，分别称为α和β。这种亚基形成αβ异源二聚体，并且至少18个α亚基和八个β亚基在人类中是已知的，可产生24个异源二聚体。在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞表达高水平的整合素亚基，例如ITGα1、ITGα2、ITGα2B、ITGα3、ITGα4、ITGα5、ITGα6、ITGα7、ITGα8、ITGα9、ITGα10、ITGα
11、ITGαD、ITGαE、ITGαL、ITGαM、ITGαV、ITGαX、ITGβ1、ITGβ2、ITGβ3、ITGβ4、ITGβ5、ITGβ6、ITGβ7和ITGβ8。在一个优选的实施方案中，干细胞和/或祖细胞表达高水平的整合素亚基β1(ITGβ1)和/或整合素亚基β4(ITGβ4)。Takada Y.等人(2007)Genome Biol.8(5):215。
移植后防止干细胞和/或祖细胞对那些贴壁因子的内化。此类贴壁因子的非限制性实例包
括整合素。整合素是异源二聚体跨膜糖蛋白大家族，它们的功能是使细胞附接到基底膜的
胞外基质蛋白、其他细胞上的配体以及可溶性配体。整合素含有大亚基和小亚基，分别称为α和β。这种亚基形成αβ异源二聚体，并且至少18个α亚基和八个β亚基在人类中是已知的，可产生24个异源二聚体。在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞表达高水平的整合素亚基，例如ITGα1、ITGα2、ITGα2B、ITGα3、ITGα4、ITGα5、ITGα6、ITGα7、ITGα8、ITGα9、ITGα10、ITGα
11、ITGαD、ITGαE、ITGαL、ITGαM、ITGαV、ITGαX、ITGβ1、ITGβ2、ITGβ3、ITGβ4、ITGβ5、ITGβ6、ITGβ7和ITGβ8。在一个优选的实施方案中，干细胞和/或祖细胞表达高水平的整合素亚基β1(ITGβ1)和/或整合素亚基β4(ITGβ4)。Takada Y.等人(2007)Genome Biol.8(5):215。
[0132] 在一些实施方案中，本公开的干细胞和/或祖细胞不同于天然存在的干细胞和/或祖细胞，至少因为它们以比未经修饰的干细胞和/或祖细胞中的整合素亚基的量多至少
10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、95％、100％、200％的量表达整合素亚基。可以设想，整合素亚基的增加可以有助于干细胞和/或祖细胞附接以形成细胞间相互作用，以及如果需要防止干细胞和/或祖细
胞发生内化。
10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、95％、100％、200％的量表达整合素亚基。可以设想，整合素亚基的增加可以有助于干细胞和/或祖细胞附接以形成细胞间相互作用，以及如果需要防止干细胞和/或祖细
胞发生内化。
[0133] MMP
[0134] MMP是有利于植入和整合的关键因子之一。MMP由很多同种型(至少28种；在猪中，有24种同种型是已知的)组成，一些同种型是分泌的(例如MMP1、MMP2、MMP7、MMP9)，而另一些是质膜相关的(例如MMP14、MMP15)。不受理论的束缚，据信这些同种型的混合物对于植入是必须的，尤其是分泌形式的混合物。所有研究的细胞均产生不同量的分泌形式和膜相关
形式，但是干细胞/祖细胞产生非常高水平的分泌形式。植入取决于这些分泌的MMP(膜相关形式具有一些已知的协同作用)。这些同种型的细胞来源是提供必需的MMP以实现植入的实
用方法。作为一种替代性方法，申请人设想了MMP的纯化/重组形式向植入物生物材料的结
合到和/或植入物中细胞的基因工程以产生必需的MMP。
形式，但是干细胞/祖细胞产生非常高水平的分泌形式。植入取决于这些分泌的MMP(膜相关形式具有一些已知的协同作用)。这些同种型的细胞来源是提供必需的MMP以实现植入的实
用方法。作为一种替代性方法，申请人设想了MMP的纯化/重组形式向植入物生物材料的结
合到和/或植入物中细胞的基因工程以产生必需的MMP。
[0135] 只要存在多种基质金属蛋白酶(MMP)(任选地分泌形式和膜相关形式中的一种或两种)的来源(理想地细胞来源)，细胞即可成功植入。MMP由所有细胞类型(不成熟细胞和成熟细胞二者)产生，但是它们在产生哪种同工型和特定MMP的表达水平如何方面有所不同。
代表性分泌形式包括MMP1、MMP2、MMP7和MMP9。代表性膜相关形式包括MMP14和MMP15。从经验上已经发现，分泌的MMP的最高产量由早期谱系期细胞、干细胞和早期祖细胞产生。植入物的生物材料支持上皮和间充质细胞产生这些多种形式的基质金属蛋白酶(MMP)的能力，
所述基质金属蛋白酶溶解器官或组织周围 并且通过溶解多种形式的胞外基质组分使细
胞迁移。
代表性分泌形式包括MMP1、MMP2、MMP7和MMP9。代表性膜相关形式包括MMP14和MMP15。从经验上已经发现，分泌的MMP的最高产量由早期谱系期细胞、干细胞和早期祖细胞产生。植入物的生物材料支持上皮和间充质细胞产生这些多种形式的基质金属蛋白酶(MMP)的能力，
所述基质金属蛋白酶溶解器官或组织周围 并且通过溶解多种形式的胞外基质组分使细
胞迁移。
[0136] 更一般而言，基质金属蛋白酶(MMP)是锌依赖性蛋白酶大家族，所述锌依赖性蛋白酶涉及胞外基质组分的分解和调节，并且涉及正常和致病过程中的移植、侵袭、血管发生、血管形成和迁移。至少有28种同种型，包括基质蛋白酶、蛇毒蛋白酶、虾红素、沙雷氏菌蛋白酶等。它们在正常过程(诸如胎盘的移植)和致病过程(诸如癌症的侵袭和转移)中的作用已
得到表征。
得到表征。
[0137] 本文所述的研究提供了MMP的全新作用的证据，这些作用有助于移植的细胞的植入、迁移和整合。干细胞/祖细胞(上皮干细胞/祖细胞和间充质干细胞/祖细胞二者)表达多种MMP同种型，所述同种型在这些作用中特别有效。细胞的成熟会导致一种或多种有效的干细胞/祖细胞相关MMP的表达沉默，从而减少侵袭和迁移过程。成体细胞还表达MMP，主要是膜结合的MMP(MT-MMP)，所述MMP涉及可塑性过程，但不涉及细胞向组织的整体植入和整合。
然而，MT-MMP和分泌形式之间存在一些协同作用。这种认识的净总和是，除其他特征之外，植入物生物材料、基底和其他条件必须是优化各种MMP(诸如分泌的MMP)的表达从而使植入
和迁移过程得以发生的特征。所以，驱动移植的细胞的分化的因子将平行地使复合MMP响应沉默。这种认识意味着应避免的因子包括血清(它驱动分化)、驱动分化的可溶性信号(例如某些生长因子、细胞因子和激素)；驱动分化的胞外基质组分(例如胶原蛋白、粘附分子、高度硫酸化糖胺聚糖/蛋白聚糖)；以及有助于植入物的稠度的机械力(粘弹性性质，它驱动分化)。
然而，MT-MMP和分泌形式之间存在一些协同作用。这种认识的净总和是，除其他特征之外，植入物生物材料、基底和其他条件必须是优化各种MMP(诸如分泌的MMP)的表达从而使植入
和迁移过程得以发生的特征。所以，驱动移植的细胞的分化的因子将平行地使复合MMP响应沉默。这种认识意味着应避免的因子包括血清(它驱动分化)、驱动分化的可溶性信号(例如某些生长因子、细胞因子和激素)；驱动分化的胞外基质组分(例如胶原蛋白、粘附分子、高度硫酸化糖胺聚糖/蛋白聚糖)；以及有助于植入物的稠度的机械力(粘弹性性质，它驱动分化)。
[0138] 在一些实施方案中，混合物中的一种或多种细胞是分泌的和/或膜相关的MMP的来源。分泌的MMP可以任选地由上皮或间充质细胞中的一者或多者天然产生，或者任选地由于用重组表达载体转化上皮或间充质细胞中的一者或多者或针对MMP产生的遗传编辑而产
生。在一些实施方案中，诸如但不限于涉及天然分泌MMP的干细胞/祖细胞群的实施方案，沉默MMP表达–任选地膜相关的和/或分泌的MMP表达–的变量在补片植入物中受到控制。此类变量的非限制性实例包括导致干细胞/祖细胞成熟的变量，诸如但不限于培养基或植入物
生物材料的血清补充物、影响上皮和/或间充质细胞的分化的激素或其他可溶性信号、氧水平(因为厌氧条件使细胞保持不成熟状态，而较高的氧水平则促进分化)以及植入物材料的
稠度(因为稠度或机械力(诸如剪切力)和压缩可以驱动分化)。
生。在一些实施方案中，诸如但不限于涉及天然分泌MMP的干细胞/祖细胞群的实施方案，沉默MMP表达–任选地膜相关的和/或分泌的MMP表达–的变量在补片植入物中受到控制。此类变量的非限制性实例包括导致干细胞/祖细胞成熟的变量，诸如但不限于培养基或植入物
生物材料的血清补充物、影响上皮和/或间充质细胞的分化的激素或其他可溶性信号、氧水平(因为厌氧条件使细胞保持不成熟状态，而较高的氧水平则促进分化)以及植入物材料的
稠度(因为稠度或机械力(诸如剪切力)和压缩可以驱动分化)。
[0139] 对于干细胞植入物，上皮细胞及其间充质细胞搭配物最佳地是干细胞或祖细胞，因为它们二者提供多种类型MMP的贡献。为了植入成体细胞，上皮或间充质细胞的MMP应最
佳地提供膜相关的和/或分泌的MMP的细胞来源，例如任选地使用ELSMC作为膜相关的和/或
分泌的MMP的细胞来源。因此，上皮和间充质细胞二者都是成熟细胞类型的植入物不能成功植入。如果具有成熟内皮，则上皮细胞可能存活和增殖并发挥功能，但是不能植入；如果具有成熟基质，则植入物可能会发生纤维化。
佳地提供膜相关的和/或分泌的MMP的细胞来源，例如任选地使用ELSMC作为膜相关的和/或
分泌的MMP的细胞来源。因此，上皮和间充质细胞二者都是成熟细胞类型的植入物不能成功植入。如果具有成熟内皮，则上皮细胞可能存活和增殖并发挥功能，但是不能植入；如果具有成熟基质，则植入物可能会发生纤维化。
[0140] 总之，如果上皮-间充质细胞搭配物是干细胞/祖细胞，或如果上皮或间充质细胞中的至少一者是干细胞，例如任选地使用ELSMC作为基质金属蛋白酶(MMP)的基质相关的
和/或分泌的同种型的来源，或如果那些MMP的纯化/重组形式在植入物生物材料中提供，则将会发生植入。适用于补片植入物的早期谱系期间充质细胞(ELSMC)可以是成血管细胞、内皮的前体、早期谱系期内皮、星状细胞的前体、早期星状细胞或间充质干细胞(MSC)或它们的混合物。
和/或分泌的同种型的来源，或如果那些MMP的纯化/重组形式在植入物生物材料中提供，则将会发生植入。适用于补片植入物的早期谱系期间充质细胞(ELSMC)可以是成血管细胞、内皮的前体、早期谱系期内皮、星状细胞的前体、早期星状细胞或间充质干细胞(MSC)或它们的混合物。
[0141] 因此，本文设想了用作补片植入物的组合物，所述组合物包含至少细胞群(例如上皮和间充质细胞)和MMP的来源(即处于早期谱系期的能够表达膜相关的和/或分泌的基质
金属蛋白酶(MMP)的细胞群，任选地由培养基和/或水凝胶的条件支持)。
金属蛋白酶(MMP)的细胞群，任选地由培养基和/或水凝胶的条件支持)。
[0142] 培养基组分
[0143] 对于与本文公开的细胞和MMP的来源组合使用，可以使用任何培养基(包含营养物、维生素、盐等)加上关键的可溶性因子(诸如胰岛素、运铁蛋白/Fe和脂质，据发现它们用于干细胞/祖细胞的扩增和/或存活)。必须避免导致细胞成熟的所有因子，因为成熟将会导致MMP表达的减少或沉默。应避免的因子包括血清、驱动分化的可溶性信号、驱动分化的胞外基质组分以及稠度或机械力(压缩、磨损)。这种培养基的非限制性实例是库部塔培养基。
[0144] 因此，本文设想了用作补片植入物的组合物，所述组合物包含至少细胞群和MMP的来源(例如处于早期谱系期的能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的细胞
群，被支持于合适的培养基或纯化的MMP中)。合适的培养基的非限制性实例是库部塔培养
基。其他干细胞培养基，诸如用于胚胎干(ES)细胞或诱导性多能干(iPS)细胞的那些培养基同样也适用，条件是它们不含有驱动细胞的分化、作为MMP的来源的可溶性信号或基质信
号，或者只要存在或包括来自其他来源的MMP。
群，被支持于合适的培养基或纯化的MMP中)。合适的培养基的非限制性实例是库部塔培养
基。其他干细胞培养基，诸如用于胚胎干(ES)细胞或诱导性多能干(iPS)细胞的那些培养基同样也适用，条件是它们不含有驱动细胞的分化、作为MMP的来源的可溶性信号或基质信
号，或者只要存在或包括来自其他来源的MMP。
[0145] 水凝胶
[0146] 补片植入物包含一种或多种水凝胶组分。在一些方面，可以形成水凝胶或平行不溶性复合物(例如非胶原蛋白明胶)的生物材料包括透明质酸、硫醇改性的透明质酸、其他
糖胺聚糖(GAG)或它们的组合。固化的触发因素可以是引发基质组分的交联或可以发生凝
胶的那些组分的凝胶作用的任何因素。交联剂可以包括聚(乙二醇)(PEG)或PEG-二丙烯酸
酯(PEGDA)水凝胶或其含二硫键衍生物。值得注意的是，应针对支持所公开的用于补片植入物(例如ELSMC)的一种或多种细胞群的干性的能力而选择包含在水凝胶中的生物材料。
糖胺聚糖(GAG)或它们的组合。固化的触发因素可以是引发基质组分的交联或可以发生凝
胶的那些组分的凝胶作用的任何因素。交联剂可以包括聚(乙二醇)(PEG)或PEG-二丙烯酸
酯(PEGDA)水凝胶或其含二硫键衍生物。值得注意的是，应针对支持所公开的用于补片植入物(例如ELSMC)的一种或多种细胞群的干性的能力而选择包含在水凝胶中的生物材料。
[0147] 可以使用支持干性维持的基质组分，但不能使用驱动分化的组分。支持性组分的非限制性实例包括透明质酸或非硫酸化(或最低硫酸化)糖胺聚糖。这些组分特别有用，因
为可以对它们进行“调整”，即改性为具有不同水平的稠度(任选地以粘弹性测量)。因此，在一些方面，细胞群(任选地分离的内部器官的细胞)可以在将细胞引入宿主之前在生物材料
内离体固化，或者在替代方式中，以流体物质注射并允许它们体内固化。
为可以对它们进行“调整”，即改性为具有不同水平的稠度(任选地以粘弹性测量)。因此，在一些方面，细胞群(任选地分离的内部器官的细胞)可以在将细胞引入宿主之前在生物材料
内离体固化，或者在替代方式中，以流体物质注射并允许它们体内固化。
[0148] 非常软(例如～100Pa)的水凝胶对于维持供体细胞的不成熟状态是理想的。更稠(例如>500Pa)的型式可以用于使细胞成熟，以足以切断MMP产生，从而阻断迁移。更稠的型式也可以使邻近组织的粘连最小化。在某些实施方案中，细胞群和MMP的来源，任选地另一种细胞群(即处于早期谱系期的能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的细
胞群)。
胞群)。
[0149] 不受理论的束缚，据信羊膜中存在的胞外基质形式能够使供体细胞保持不成熟状态。因此，设想可以将羊膜用于水凝胶，并且任选地用作替代性的生物相容性的、可生物降解材料。
[0150] 值得注意的是，已知可以引发成熟的材料包含来源于成熟胞外基质的某些组分，诸如但不限于I型胶原蛋白。这些材料应从补片植入物的所有要素中排除，包括但不限于细胞、水凝胶、培养基、基底和/或任何另外的组分。
[0151] 因此，本文设想了用于补片植入物的组合物，所述组合物包含至少细胞群和MMP的来源(即处于早期谱系期的能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的细胞
群，被支持于合适的培养基中并且包含在水凝胶中)。
群，被支持于合适的培养基中并且包含在水凝胶中)。
[0152] 如上所述，稠度可以驱动细胞分化的能力。另外的稠质水凝胶可以对细胞迁移能力产生影响。由于细胞必须迁移到器官中，因此包含有细胞的水凝胶应具有足以允许所述
细胞任选地在水凝胶和/或补片植入物内或远离水凝胶和/或补片植入物迁移的粘弹性。这
种粘弹性的非限制性实例包括但不限于在约50至约100Pa或约250Pa范围内，例如至少约
50Pa、至少约100Pa、至少约150Pa、至少约200Pa、至多约250Pa、至多约200Pa、至多约150Pa、至多约100Pa，和/或它们之间的任何单个值，诸如但不限于约50Pa、约100Pa、约150Pa、约
200Pa和约250Pa的粘弹性。
细胞任选地在水凝胶和/或补片植入物内或远离水凝胶和/或补片植入物迁移的粘弹性。这
种粘弹性的非限制性实例包括但不限于在约50至约100Pa或约250Pa范围内，例如至少约
50Pa、至少约100Pa、至少约150Pa、至少约200Pa、至多约250Pa、至多约200Pa、至多约150Pa、至多约100Pa，和/或它们之间的任何单个值，诸如但不限于约50Pa、约100Pa、约150Pa、约
200Pa和约250Pa的粘弹性。
[0153] 不受理论的束缚，据信当细胞从补片植入物迁移到靶标器官或组织时，它们与它们相关的或涂覆它们相关的一些水凝胶一起迁移。水凝胶将细胞与组织微环境中的信号隔
离，所述信号会影响细胞分化或成熟，并使细胞保持不成熟状态。这有利于细胞在整个实质组织中迁移。随着水凝胶中的透明质酸逐渐降解和除去，细胞开始分化或成熟并开启成体
细胞功能。
离，所述信号会影响细胞分化或成熟，并使细胞保持不成熟状态。这有利于细胞在整个实质组织中迁移。随着水凝胶中的透明质酸逐渐降解和除去，细胞开始分化或成熟并开启成体
细胞功能。
[0154] 产生类器官的方法
[0155] 不受理论的束缚，已经确定，当早期谱系细胞结合到类器官或聚集体中时，可以具有高植入成功率。这种组织可以任选地包含早期谱系期上皮和间充质细胞。
[0156] 因此，本文提供了一种形成类器官的方法，所述方法包括在适用于组织培养的容器中和在存在培养基的情况下培养上皮细胞和间充质细胞的混合物，通过淘选移除容器表
面上贴壁的成熟细胞以及从培养基中的细胞悬浮液回收自组装的类器官，由这些步骤组成
或基本上由这些步骤组成。本文还公开了包含这样产生的类器官的组合物。
面上贴壁的成熟细胞以及从培养基中的细胞悬浮液回收自组装的类器官，由这些步骤组成
或基本上由这些步骤组成。本文还公开了包含这样产生的类器官的组合物。
[0157] 在一些实施方案中，程序涉及通过使成熟细胞在无血清条件和37℃下选择性、快速(15-30分钟)贴壁至常规培养皿来淘选以除去成熟细胞，因为即使在这些条件下，成熟细胞也表达使细胞贴壁的各种基质组分。多轮(例如4-5轮)这种淘选过程可富集细胞悬浮液
中的早期谱系期细胞。然后将细胞悬浮液转移至低贴壁培养皿，再次置于无血清培养基(该培养基针对早期谱系期细胞而设计)中，并在培养箱中37℃下放置过夜。所述条件促进谱系期匹配的上皮和间充质细胞的自组装为类器官。类器官可以从早期上皮(ES细胞、iPS细胞、确定的干细胞、短暂增殖细胞、祖细胞)与早期间充质细胞(成血管细胞、内皮的前体、星状细胞的前体)的混合物获得。
中的早期谱系期细胞。然后将细胞悬浮液转移至低贴壁培养皿，再次置于无血清培养基(该培养基针对早期谱系期细胞而设计)中，并在培养箱中37℃下放置过夜。所述条件促进谱系期匹配的上皮和间充质细胞的自组装为类器官。类器官可以从早期上皮(ES细胞、iPS细胞、确定的干细胞、短暂增殖细胞、祖细胞)与早期间充质细胞(成血管细胞、内皮的前体、星状细胞的前体)的混合物获得。
[0158] 成体上皮细胞与成熟间充质细胞的混合物以及成熟上皮细胞与早期谱系期间充质细胞(ELSMC)的嵌合混合物通常不产生类器官，但是可以用作植入物生物材料中的悬浮
液中的细胞的混合物。如果成熟上皮(例如肝细胞、胆管上皮细胞、胰岛、腺泡细胞、肠上皮细胞等)与成熟间充质细胞(例如，内皮、星状细胞、基质细胞、肌纤维母细胞)搭配，则混合物将不会引发植入物向靶标部位或器官的成功整合，而是保留在器官或组织的表面。如果
使用包含成体细胞和干细胞/祖细胞(例如成熟肝细胞与成血管细胞)的嵌合混合物，则植
入不会发生，因为存在使细胞发生植入和迁移的MMP的来源。
液中的细胞的混合物。如果成熟上皮(例如肝细胞、胆管上皮细胞、胰岛、腺泡细胞、肠上皮细胞等)与成熟间充质细胞(例如，内皮、星状细胞、基质细胞、肌纤维母细胞)搭配，则混合物将不会引发植入物向靶标部位或器官的成功整合，而是保留在器官或组织的表面。如果
使用包含成体细胞和干细胞/祖细胞(例如成熟肝细胞与成血管细胞)的嵌合混合物，则植
入不会发生，因为存在使细胞发生植入和迁移的MMP的来源。
[0159] 在另一个方面，分离的内部器官的细胞可以在将细胞引入宿主之前在生物材料内离体固化，或者在替代方式中，以流体物质注射并允许它们体内固化至植入物中。优选地，细胞被引入患病的或功能障碍的组织之处或附近，并且可以经由注射引入或植入到组织之
上/之中，或使用适当的手术方法引入。
上/之中，或使用适当的手术方法引入。
[0160] 在另一个方面，可以形成水凝胶或平行不溶性复合物的生物材料可以包括透明质酸、硫醇改性的透明质酸、其他糖胺聚糖(GAG)。固化的触发因素可以是引发基质组分的交联或可以发生凝胶的那些组分的凝胶作用的任何因素。交联剂可以包括聚(乙二醇)(PEG)
或PEG-二丙烯酸酯(PEGDA)水凝胶或其含二硫键衍生物。
或PEG-二丙烯酸酯(PEGDA)水凝胶或其含二硫键衍生物。
[0161] 在另一个方面，本公开提供一种形成类器官的方法，所述方法通过使第一类型的细胞(上皮)与一种或多种第二类型的细胞(间充质细胞)一起培养来进行，其中所述第二类
型的细胞处于成熟期，是第一类型的细胞的适当谱系搭配物。在一些实施方案中，这可以通过以下步骤来实现：通过淘选除去贴壁至培养皿的成熟细胞；将不贴壁的细胞转移至低贴
壁培养皿并置于适当的培养基中；以及回收在这些条件下自组装的类器官。第一类型的细
胞可以是上皮干细胞、上皮细胞的定向祖细胞或成熟细胞(例如肝细胞)。第二类型的细胞
可以是间充质谱系的干细胞(例如成血管细胞、间充质干细胞)、这些谱系的祖细胞(例如内皮或星状细胞祖细胞)或早期谱系期间充质细胞的混合物。至关重要的是，这种形成不能在所有条件下发生。例如，在Matrigel中培养不产生适用于成功补片植入的类器官。虽然
Matrigel制备的类器官可以植入，但是植入程度相对于在确定条件下制备的类器官而言将
降低。此外，Matrigel不能作为将用于临床产物的条件的组分。
型的细胞处于成熟期，是第一类型的细胞的适当谱系搭配物。在一些实施方案中，这可以通过以下步骤来实现：通过淘选除去贴壁至培养皿的成熟细胞；将不贴壁的细胞转移至低贴
壁培养皿并置于适当的培养基中；以及回收在这些条件下自组装的类器官。第一类型的细
胞可以是上皮干细胞、上皮细胞的定向祖细胞或成熟细胞(例如肝细胞)。第二类型的细胞
可以是间充质谱系的干细胞(例如成血管细胞、间充质干细胞)、这些谱系的祖细胞(例如内皮或星状细胞祖细胞)或早期谱系期间充质细胞的混合物。至关重要的是，这种形成不能在所有条件下发生。例如，在Matrigel中培养不产生适用于成功补片植入的类器官。虽然
Matrigel制备的类器官可以植入，但是植入程度相对于在确定条件下制备的类器官而言将
降低。此外，Matrigel不能作为将用于临床产物的条件的组分。
[0162] 在另一个方面，本公开提供一种用于将细胞植入器官的方法，所述方法包括接触补片植入物，所述补片植入物包括多层，所述多层包括生物相容性的、可生物降解基底，所述基底在对供体细胞分化的作用中是中性的；包含可以固化为诸如水凝胶的一种或多种生
物材料(诸如透明质酸)的第二层；结合到已固化的生物材料的上皮细胞和支持性间充质细
胞的混合物；以及通过缝合线或手术胶使该绷带样结构附接到靶标部位。将一层已固化的
生物材料添加到基底的浆膜表面上，所述已固化的生物材料被制备为实现400Pa或更高，该水平为供体细胞所结合到的软质生物材料中存在的水平的至少两倍。补片植入物内的细胞
能够植入并迁移至组织/器官中并遍及组织/器官，然后所述补片植入物取决于它们所处的
微环境成熟为相关的成体命运。生物材料包埋或包含至多孔基底的较高帕斯卡水平会阻止
细胞沿错误的方向迁移，并且添加至植入物的浆膜表面的生物材料会使细胞与其他器官和
组织的粘连最小化。
物材料(诸如透明质酸)的第二层；结合到已固化的生物材料的上皮细胞和支持性间充质细
胞的混合物；以及通过缝合线或手术胶使该绷带样结构附接到靶标部位。将一层已固化的
生物材料添加到基底的浆膜表面上，所述已固化的生物材料被制备为实现400Pa或更高，该水平为供体细胞所结合到的软质生物材料中存在的水平的至少两倍。补片植入物内的细胞
能够植入并迁移至组织/器官中并遍及组织/器官，然后所述补片植入物取决于它们所处的
微环境成熟为相关的成体命运。生物材料包埋或包含至多孔基底的较高帕斯卡水平会阻止
细胞沿错误的方向迁移，并且添加至植入物的浆膜表面的生物材料会使细胞与其他器官和
组织的粘连最小化。
[0163] 类器官
[0164] 根据本文公开的一个实施方案，类器官、胆系干细胞(下文称为“BTSC”)的漂浮聚集体和早期谱系期间充质细胞(下文称为“ELMC”)被证明是将细胞结合到植入物中的最成功的方法。本文公开了如下内容：BTSC和ELMC可以通过淘选除去成熟星状/基质细胞来自选择成为类器官，并且这被证明在建立针对植入物的谱系期合适的上皮-间充质搭配物中更
高效和有效。在另一个方面，本公开提供一种形成类器官的方法，所述方法通过使第一类型的细胞与第二类型的细胞一起培养来进行，其中所述第二类型的细胞是第一类型的细胞的
谱系期合适的搭配物，通过淘选除去贴壁至培养皿的成熟细胞，以及从培养的悬浮液回收
自组装的类器官。第一类型的细胞可以是上皮干细胞或定向上皮细胞。第二类型的细胞可
以是间充质谱系的细胞、间充质干细胞或早期谱系期间充质细胞。其他方面涉及自组装的
类器官及其用途。
高效和有效。在另一个方面，本公开提供一种形成类器官的方法，所述方法通过使第一类型的细胞与第二类型的细胞一起培养来进行，其中所述第二类型的细胞是第一类型的细胞的
谱系期合适的搭配物，通过淘选除去贴壁至培养皿的成熟细胞，以及从培养的悬浮液回收
自组装的类器官。第一类型的细胞可以是上皮干细胞或定向上皮细胞。第二类型的细胞可
以是间充质谱系的细胞、间充质干细胞或早期谱系期间充质细胞。其他方面涉及自组装的
类器官及其用途。
[0165] 在一些实施方案中，供体细胞和/或支持性间充质细胞表达基质金属蛋白酶(下文称为MMP)。不受理论的束缚，据信MMP允许供体和宿主细胞的合并，以及格利森氏囊的溶解(或组织或器官周围的等同囊)。本文的公开内容提供了如下表述，在一些实施方案中，早期干细胞或ELMC表达高水平的MMP，而成熟肝细胞表达低水平的MMP。在一些实施方案中，成熟肝细胞与成熟窦状内皮(CD31+++、VEGF受体+、IV型胶原蛋白+和CD117阴性)的搭配以及针
对与成熟星状和基质细胞(ICAM-1+、ASMA+、维生素A++、I型胶原蛋白+)相关的成体胆管上皮细胞的那些搭配产生保留在器官表面上的细胞聚集体，并且不能有效植入。在一些实施
方案中，成熟上皮细胞的植入要求它们与不成熟间充质细胞搭配，所述不成熟间充质细胞
产生植入和迁移必需的MMP。
对与成熟星状和基质细胞(ICAM-1+、ASMA+、维生素A++、I型胶原蛋白+)相关的成体胆管上皮细胞的那些搭配产生保留在器官表面上的细胞聚集体，并且不能有效植入。在一些实施
方案中，成熟上皮细胞的植入要求它们与不成熟间充质细胞搭配，所述不成熟间充质细胞
产生植入和迁移必需的MMP。
[0166] 根据本文公开的一个实施方案，类器官、干细胞/祖细胞(诸如BTSC和ELSMC)的漂浮聚集体被证明对于补片植入成功是最成功的细胞呈递。本文公开了如下内容：BTSC和
ELSMC可以通过以下步骤来自选择成为类器官：通过针对在无血清条件下贴壁至常规培养
皿的细胞的标准淘选程序来除去成熟间充质细胞，然后在低贴壁培养皿中和无血清确定培
养基中培养其余的细胞(不贴壁的那些细胞)。类器官在这些条件下自组装。
ELSMC可以通过以下步骤来自选择成为类器官：通过针对在无血清条件下贴壁至常规培养
皿的细胞的标准淘选程序来除去成熟间充质细胞，然后在低贴壁培养皿中和无血清确定培
养基中培养其余的细胞(不贴壁的那些细胞)。类器官在这些条件下自组装。
[0167] 在另一个方面，本公开提供一种形成类器官的方法，所述方法通过使第一类型的细胞(上皮)与第二类型的细胞(间充质细胞)一起培养来进行，其中所述第二类型的细胞是
第一类型的细胞的谱系期合适的搭配物，通过淘选程序除去贴壁至常规培养皿的成熟细
胞，以及从低贴壁的培养皿上的培养悬浮液回收自组装的类器官。第一类型的细胞可以是
上皮干细胞、短暂增殖细胞、定向上皮祖细胞。第二类型的细胞可以是间充质细胞的干细
胞、短暂增殖细胞或定向间充质祖细胞。
第一类型的细胞的谱系期合适的搭配物，通过淘选程序除去贴壁至常规培养皿的成熟细
胞，以及从低贴壁的培养皿上的培养悬浮液回收自组装的类器官。第一类型的细胞可以是
上皮干细胞、短暂增殖细胞、定向上皮祖细胞。第二类型的细胞可以是间充质细胞的干细
胞、短暂增殖细胞或定向间充质祖细胞。
[0168] 在一些实施方案中，供体细胞和/或支持性间充质细胞表达基质金属蛋白酶(下文称为MMP)。不受理论的束缚，据信MMP导致组织或器官周围的囊的溶解，并且允许供体和宿主细胞的合并。本文的公开内容提供了如下表述，在一些实施方案中，早期干细胞或ELMC表达高水平的MMP，而成熟肝细胞表达低水平的MMP。在一些实施方案中，成熟肝细胞与成熟窦状内皮(CD31+++、VEGF受体+、IV型胶原蛋白+和CD117阴性)的搭配以及针对与成熟星状和
基质细胞(ICAM-1+、ASMA+、维生素A++、I型胶原蛋白+)相关的成体胆管上皮细胞的那些搭配产生保留在器官表面上的细胞聚集体，并且不能有效植入。在一些实施方案中，成熟上皮细胞的植入要求它们与不成熟间充质细胞搭配，所述不成熟间充质细胞产生植入和迁移必
需的MMP。
基质细胞(ICAM-1+、ASMA+、维生素A++、I型胶原蛋白+)相关的成体胆管上皮细胞的那些搭配产生保留在器官表面上的细胞聚集体，并且不能有效植入。在一些实施方案中，成熟上皮细胞的植入要求它们与不成熟间充质细胞搭配，所述不成熟间充质细胞产生植入和迁移必
需的MMP。
[0169] 根据本文公开的一个实施方案，类器官、干细胞/祖细胞(诸如BTSC和ELSMC)的漂浮聚集体被证明对于补片植入成功是最成功的细胞呈递。本文公开了如下内容：BTSC和
ELSMC可以通过以下步骤来自选择成为类器官：通过针对在无血清条件下贴壁至常规培养
皿的细胞的标准淘选程序来除去成熟间充质细胞，然后在低贴壁培养皿中和无血清确定培
养基中培养其余的细胞(不贴壁的那些细胞)。类器官在这些条件下自组装。
ELSMC可以通过以下步骤来自选择成为类器官：通过针对在无血清条件下贴壁至常规培养
皿的细胞的标准淘选程序来除去成熟间充质细胞，然后在低贴壁培养皿中和无血清确定培
养基中培养其余的细胞(不贴壁的那些细胞)。类器官在这些条件下自组装。
[0170] 在另一个方面，本公开提供一种形成类器官的方法，所述方法通过使第一类型的细胞(上皮)与第二类型的细胞(间充质细胞)一起培养来进行，其中所述第二类型的细胞是
第一类型的细胞的谱系期合适的搭配物，通过淘选程序除去贴壁至常规培养皿的成熟细
胞，以及从低贴壁的培养皿上的培养悬浮液回收自组装的类器官。第一类型的细胞可以是
上皮干细胞、短暂增殖细胞、定向上皮祖细胞。第二类型的细胞可以是间充质细胞的干细
胞、短暂增殖细胞或定向间充质祖细胞。
第一类型的细胞的谱系期合适的搭配物，通过淘选程序除去贴壁至常规培养皿的成熟细
胞，以及从低贴壁的培养皿上的培养悬浮液回收自组装的类器官。第一类型的细胞可以是
上皮干细胞、短暂增殖细胞、定向上皮祖细胞。第二类型的细胞可以是间充质细胞的干细
胞、短暂增殖细胞或定向间充质祖细胞。
[0171] 在一些实施方案中，对于补片植入策略的成功，供体细胞和/或支持性间充质细胞必须表达多种基质金属蛋白酶(下文称为MMP)，尤其是MMP的分泌形式。不受理论的束缚，据信MMP的多种同种型允许器官或组织周围的囊的溶解，然后供体细胞快速迁移至宿主组织。
本文的公开内容提供了如下表述，早期上皮干细胞和/或ELSMC表达高水平的膜相关的和/
或分泌的MMP，而成熟细胞(例如肝细胞)表达低水平的分泌的MMP，即使它们也表达质膜相
关的MMP。此类成体细胞(例如肝细胞、胆管上皮细胞、胰岛、肠上皮细胞等)的植入要求如下：如果植入即将发生，间充质搭配物是MMP(尤其是MMP的分泌形式)的细胞来源。一种替代方式是在植入物的生物材料中提供MMP的相关同种型，即它们的纯化形式。
本文的公开内容提供了如下表述，早期上皮干细胞和/或ELSMC表达高水平的膜相关的和/
或分泌的MMP，而成熟细胞(例如肝细胞)表达低水平的分泌的MMP，即使它们也表达质膜相
关的MMP。此类成体细胞(例如肝细胞、胆管上皮细胞、胰岛、肠上皮细胞等)的植入要求如下：如果植入即将发生，间充质搭配物是MMP(尤其是MMP的分泌形式)的细胞来源。一种替代方式是在植入物的生物材料中提供MMP的相关同种型，即它们的纯化形式。
[0172] 根据本公开，可以使用补片植入物植入的细胞数量非常大(>108)，并且取决于植入物的尺寸、类器官的数量和大小(或细胞的数量—如果不是类器官的一部分)(无论供体
细胞是干细胞还是成熟细胞)，以及分泌的和膜相关的MMP的表达(来自上皮和/或来自间充
质细胞)。这些发现结果完全不同于可用于血管递送或注射植入的有限数量的细胞(例如
105-106)。
细胞是干细胞还是成熟细胞)，以及分泌的和膜相关的MMP的表达(来自上皮和/或来自间充
质细胞)。这些发现结果完全不同于可用于血管递送或注射植入的有限数量的细胞(例如
105-106)。
[0173] 本文公开了如下内容：制备植入物包括将细胞与适当的生物材料混合，所述生物材料可以成为不溶性的并且保持细胞定位于靶标部位。在另一个方面，分离的内部器官的
细胞可以在将细胞引入宿主之前在生物材料内离体固化，或者在替代方式中，以流体物质
注射并允许它们体内固化。在另一个方面，可以形成水凝胶或平行不溶性复合物的生物材
料可以包括透明质酸或其他非硫酸化的或最小硫酸化的糖胺聚糖、硫醇改性的透明质酸钠
或植物源性材料(例如藻酸盐)。固化的触发因素可以是引发基质组分的交联或可以发生凝
胶的那些组分的凝胶作用的任何因素。交联剂可以包括聚乙二醇二丙烯酸酯或其含二硫键
衍生物。优选地，细胞和生物材料的不溶性复合物具有在约0.1至200Pa、优选地约0.1至约
1Pa、约1至约10Pa、约10-100Pa、或约100至约200范围内的粘弹性。
细胞可以在将细胞引入宿主之前在生物材料内离体固化，或者在替代方式中，以流体物质
注射并允许它们体内固化。在另一个方面，可以形成水凝胶或平行不溶性复合物的生物材
料可以包括透明质酸或其他非硫酸化的或最小硫酸化的糖胺聚糖、硫醇改性的透明质酸钠
或植物源性材料(例如藻酸盐)。固化的触发因素可以是引发基质组分的交联或可以发生凝
胶的那些组分的凝胶作用的任何因素。交联剂可以包括聚乙二醇二丙烯酸酯或其含二硫键
衍生物。优选地，细胞和生物材料的不溶性复合物具有在约0.1至200Pa、优选地约0.1至约
1Pa、约1至约10Pa、约10-100Pa、或约100至约200范围内的粘弹性。
[0174] 优选地，细胞被引入患病的或功能障碍的组织之处或附近，并且可以经由注射或手术递送引入。不受理论的束缚，本文假设，更稠的HA水凝胶(例如>500Pa)会触发细胞的分化并减植入，这部分是由于MMP的表达随着成熟而减少以及迁移能力的平行下降。
[0175] 基底
[0176] 对于供体细胞的成熟状态的中性，生物相容性的、可生物降解基底有多种选择。它R们包括蚕蛾丝形式(诸如Seri手术丝支架或仿形Seri-Silk(Sofregen,New York,NY))，蚕
蛾丝的其他衍生物、羊膜衍生物、网膜、胎盘和合成织物或材料(诸如聚乙醇酸-聚-L-乳酸共聚物(PGA/PLLA)形式)。基底的有效性的关键是，它对供体细胞的分化具有最小影响。因此，临床上使用的很多基底形式不能用于补片植入，因为它们由诱导供体细胞分化的组分
(例如胞外基质的成熟类型形式)组成。
蛾丝的其他衍生物、羊膜衍生物、网膜、胎盘和合成织物或材料(诸如聚乙醇酸-聚-L-乳酸共聚物(PGA/PLLA)形式)。基底的有效性的关键是，它对供体细胞的分化具有最小影响。因此，临床上使用的很多基底形式不能用于补片植入，因为它们由诱导供体细胞分化的组分
(例如胞外基质的成熟类型形式)组成。
[0177] 基底必须具有允许植入物通过缝合线或通过手术胶附接到靶标部位的足够抗拉强度。它应由生物相容性的、可生物降解材料组成，所述材料能够在几个月内降解，但是降解产物不会改变供体细胞的成熟状态。因此，产物应对pH或对环境的其他方面具有最小影
响。基底必须还能够贴合靶标部位的表面；所以柔性基底将有利于在明显弯曲的部位上使
用植入物。Seri-Silk是适用于基底的材料的非限制性实例。还设想了用作适用于基底的材料的羊膜源性替代物，诸如但不限于由Osiris Therapeutics,Inc(Columbia,MD)生产的羊
膜源性材料。
响。基底必须还能够贴合靶标部位的表面；所以柔性基底将有利于在明显弯曲的部位上使
用植入物。Seri-Silk是适用于基底的材料的非限制性实例。还设想了用作适用于基底的材料的羊膜源性替代物，诸如但不限于由Osiris Therapeutics,Inc(Columbia,MD)生产的羊
膜源性材料。
[0178] 基底可以来源于多孔支架，诸如Seri-silk，或无孔膜，诸如羊膜或胎盘膜或网膜，或者可以是多孔或无孔合成织物，或者它们的组合。如果基底是多孔的，则它应用生物材料输注/浸渍以密封，从而抑制所述细胞群在基底方向上(即远离靶标部位，或通过基底)的迁移。如上文所定义，基底材料的关键特征是生物相容性、可生物降解性中性的，并且具有如上文所述的足够抗拉强度。另外，材料可以任选地是可生物再吸收的。
[0179] 基底可以根据用途进一步优化。例如，在一些实施方案中，如果补片植入物包括被设计为在空气干燥作用的影响下存活的基底，则它可用于皮肤和皮下真皮组织。
[0180] 上文公开的水凝胶基质还可以用于补片植入物的其他部分。例如，如果生物相容性的、可生物降解基底是多孔的，则水凝胶可用于抑制所述细胞群在基底方向上的迁移。与水凝胶相比，这种水凝胶需要更高的粘弹性，例如高1.5和15倍之间，例如高2倍。合适的粘弹性的非限制性实例包含但不限于在约250至约600Pa范围内，例如至少约250Pa、至少约
300Pa、至少约350Pa、至少约400Pa、至少约450Pa、至少约500Pa、至少约550Pa、至多约
600Pa、至多约550Pa、至多约500Pa、至多约450Pa、至多约400Pa、至多约350Pa、至多约200Pa和/或它们之间的任何单个值，诸如但不限于约250Pa、约300Pa、约350Pa、约400Pa、约
450Pa、约500Pa、约550Pa和约600Pa的粘弹性性质。合适的粘弹性的其他非限制性实例包括但不限于在约600至约800Pa范围内，例如至少约600Pa、至少约650Pa、至少约700Pa、至少约
750Pa、至多约800Pa、至多约750Pa、至多约700Pa、至多约650Pa、至多约600Pa，和/或它们之间的任何单个值，诸如但不限于约600Pa、约650Pa、约700Pa、约750Pa和约800Pa的粘弹性。
另外的非限制性实例包括约250Pa至约800Pa的范围。
300Pa、至少约350Pa、至少约400Pa、至少约450Pa、至少约500Pa、至少约550Pa、至多约
600Pa、至多约550Pa、至多约500Pa、至多约450Pa、至多约400Pa、至多约350Pa、至多约200Pa和/或它们之间的任何单个值，诸如但不限于约250Pa、约300Pa、约350Pa、约400Pa、约
450Pa、约500Pa、约550Pa和约600Pa的粘弹性性质。合适的粘弹性的其他非限制性实例包括但不限于在约600至约800Pa范围内，例如至少约600Pa、至少约650Pa、至少约700Pa、至少约
750Pa、至多约800Pa、至多约750Pa、至多约700Pa、至多约650Pa、至多约600Pa，和/或它们之间的任何单个值，诸如但不限于约600Pa、约650Pa、约700Pa、约750Pa和约800Pa的粘弹性。
另外的非限制性实例包括约250Pa至约800Pa的范围。
[0181] 更进一步地，本文公开的水凝胶可以用作涂层，以防止基底的浆膜表面上的粘附，所述浆膜表面与邻近细胞的基底侧相对。这种水凝胶可以应具有介于适用于包含有细胞的水凝胶和适合密封基底之间的粘弹性。合适的粘弹性的非限制性实例包括但不限于在约
250至约400Pa或约500Pa范围内，例如至少约250Pa、至少约300Pa、至少约350Pa、至少约
400Pa、至少约450Pa、至多约500Pa、至多约450Pa、至多约400Pa、至多约350Pa、至多约
200Pa，和/或它们之间的任何单个值，诸如但不限于约250Pa、约300Pa、约350Pa、约400Pa、约450Pa和约500Pa的粘弹性。
250至约400Pa或约500Pa范围内，例如至少约250Pa、至少约300Pa、至少约350Pa、至少约
400Pa、至少约450Pa、至多约500Pa、至多约450Pa、至多约400Pa、至多约350Pa、至多约
200Pa，和/或它们之间的任何单个值，诸如但不限于约250Pa、约300Pa、约350Pa、约400Pa、约450Pa和约500Pa的粘弹性。
[0182] 植入物，总述
[0183] 一般而言，可以使用前述方法和用于供体(同种异体或自体)细胞向实体器官或组织的移植的组分以及将供体细胞保持和维持在早期成熟谱系期的条件来设计补片植入物。
具体而言，设想了用于供体细胞(同种异体或自体)向实体器官或组织的移植，以及将一些
或全部供体细胞保持和维持在早期成熟谱系期的条件的补片植入物。在一些实施方案中，
供体细胞是上皮和间充质细胞的混合物。在一些实施方案中，两种供体细胞群都是干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，上皮细胞是成熟细胞(例如肝细胞、胰岛等)，间充质细胞是干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，植入物生物材料的条件，例如培养基和基质组分，使两种供体细胞群或至少间充质细胞群保持为干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，培养基包括基础培养基和可溶性信号。在另外的实施方案中，该基础培养基和可溶性信号在两种供体群
体中或至少间充质细胞群中支持干性维持。在一些实施方案中，基质(任选地包括胞外基质组分)及其稠度水平支持供体群或至少间充质细胞群的干性维持。在一些实施方案中，基质包括透明质酸，任选地制备为粘弹性为约50Pa至约150Pa的软质水凝胶。在一些实施方案
中，补片植入物包括具有足以使植入物栓系至靶标部位的机械强度的基底，并且由不会显
著改变供体细胞的成熟谱系期的生物相容性的、可生物降解材料组成。任选地，无需进一步修改，基底本身应足以保护含有不会显著影响供体细胞的成熟谱系期的供体细胞的层。在
一些实施方案中，基底是网或支架，并且用生物材料(诸如透明质酸)进一步浸渍，所述生物材料具有足够高的粘弹性，以使得向其迁移的任何细胞足够成熟，从而消除供体细胞在除
朝向靶标部位之外的方向上的迁移。在一些实施方案中，该粘弹性为约500Pa或更大。在一些实施方案中，植入物的血清学表面涂覆有生物材料，以使来自邻近组织或器官的粘连最
小化。在一些实施方案中，这些生物材料具有约200Pa至约300Pa的粘弹性。
具体而言，设想了用于供体细胞(同种异体或自体)向实体器官或组织的移植，以及将一些
或全部供体细胞保持和维持在早期成熟谱系期的条件的补片植入物。在一些实施方案中，
供体细胞是上皮和间充质细胞的混合物。在一些实施方案中，两种供体细胞群都是干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，上皮细胞是成熟细胞(例如肝细胞、胰岛等)，间充质细胞是干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，植入物生物材料的条件，例如培养基和基质组分，使两种供体细胞群或至少间充质细胞群保持为干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，培养基包括基础培养基和可溶性信号。在另外的实施方案中，该基础培养基和可溶性信号在两种供体群
体中或至少间充质细胞群中支持干性维持。在一些实施方案中，基质(任选地包括胞外基质组分)及其稠度水平支持供体群或至少间充质细胞群的干性维持。在一些实施方案中，基质包括透明质酸，任选地制备为粘弹性为约50Pa至约150Pa的软质水凝胶。在一些实施方案
中，补片植入物包括具有足以使植入物栓系至靶标部位的机械强度的基底，并且由不会显
著改变供体细胞的成熟谱系期的生物相容性的、可生物降解材料组成。任选地，无需进一步修改，基底本身应足以保护含有不会显著影响供体细胞的成熟谱系期的供体细胞的层。在
一些实施方案中，基底是网或支架，并且用生物材料(诸如透明质酸)进一步浸渍，所述生物材料具有足够高的粘弹性，以使得向其迁移的任何细胞足够成熟，从而消除供体细胞在除
朝向靶标部位之外的方向上的迁移。在一些实施方案中，该粘弹性为约500Pa或更大。在一些实施方案中，植入物的血清学表面涂覆有生物材料，以使来自邻近组织或器官的粘连最
小化。在一些实施方案中，这些生物材料具有约200Pa至约300Pa的粘弹性。
[0184] 所提出的基底被设想为具有足以承受机械力的弹性，能够栓系至靶标器官或组织，并且具有足以栓系至具有弯曲的位置的柔性。还可以采用任何生物材料(除水凝胶之
外)，条件是所述生物材料能够保持和维持细胞群，并且具有足以允许细胞群在补片植入物内或远离补片植入物迁移的粘弹性性质。
外)，条件是所述生物材料能够保持和维持细胞群，并且具有足以允许细胞群在补片植入物内或远离补片植入物迁移的粘弹性性质。
[0185] 在另一个实施方案中，补片植入物可用于保持和维持细胞群并且包括：(a)细胞群(任选地单个类型的细胞群)，所述细胞群被支持于水凝胶或具有足以允许细胞在补片植入
物内或远离补片植入物迁移的粘弹性的其他生物材料中的培养基中；以及(b)基底，所述基底包含具有足以抑制细胞群在基底的方向上迁移(或提供所述细胞群迁移的屏障)的粘弹
性的生物相容性的、可生物降解材料。
物内或远离补片植入物迁移的粘弹性的其他生物材料中的培养基中；以及(b)基底，所述基底包含具有足以抑制细胞群在基底的方向上迁移(或提供所述细胞群迁移的屏障)的粘弹
性的生物相容性的、可生物降解材料。
[0186] 重要的是要注意，MMP可以是膜相关的和/或分泌的MMP；它们可以由MMP产生细胞提供，来源于这些细胞，或它们可以添加至所关注的组合物(例如，纯化的或重组产生的组合物)。
[0187] 在另一个实施方案中，提供了用于补片植入物或组织的覆盖物或涂层，所述覆盖物或涂层包含水凝胶或具有足以承受针对覆盖物或涂层施加的机械力(来自其他组织和器
官或由其他组织和器官施加的这些力)的粘弹性和弹性的其他生物材料。通过使用覆盖物
或涂层，提供了一种用于抑制或防止粘连的形成(它可以涉及或由机械力或来自其他器官
和组织的接触产生)的方法，所述方法包括用水凝胶或其他可比的生物材料覆盖或涂覆表
面。
官或由其他组织和器官施加的这些力)的粘弹性和弹性的其他生物材料。通过使用覆盖物
或涂层，提供了一种用于抑制或防止粘连的形成(它可以涉及或由机械力或来自其他器官
和组织的接触产生)的方法，所述方法包括用水凝胶或其他可比的生物材料覆盖或涂覆表
面。
[0188] 在又一个实施方案中，提供了一种将细胞植入靶标组织的方法，所述方法包括使靶标组织接触补片植入物，所述补片植入物包括：(a)细胞群，包括具有早期谱系期的至少一个群体，包括被支持于水凝胶或具有足以允许群体的细胞在补片植入物内或远离补片植
入物迁移的流变性质(例如，粘弹性)的其他生物材料中的培养基的单个类型或多个类型的
细胞；以及(b)基底，所述基底包含具有足以抑制群体的细胞在所述基底的方向上迁移(或
提供群体的细胞迁移的屏障)的流变性质(例如，粘弹性)的生物相容性的、可生物降解材
料，所述补片植入物被构造为保持和维持所述细胞群，同时抑制具有早期谱系期的所述至
少一个群体的分化或进一步成熟为晚期谱系期。在另一个实施方案中，提供了一种这样的
方法：其中具有早期谱系期的一个群体能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶
(MMP)。在另一个实施方案中，细胞不具有该能力，但是来自其他来源(例如重组)的MMP存在或包括在内。
入物迁移的流变性质(例如，粘弹性)的其他生物材料中的培养基的单个类型或多个类型的
细胞；以及(b)基底，所述基底包含具有足以抑制群体的细胞在所述基底的方向上迁移(或
提供群体的细胞迁移的屏障)的流变性质(例如，粘弹性)的生物相容性的、可生物降解材
料，所述补片植入物被构造为保持和维持所述细胞群，同时抑制具有早期谱系期的所述至
少一个群体的分化或进一步成熟为晚期谱系期。在另一个实施方案中，提供了一种这样的
方法：其中具有早期谱系期的一个群体能够表达膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶
(MMP)。在另一个实施方案中，细胞不具有该能力，但是来自其他来源(例如重组)的MMP存在或包括在内。
[0189] 具有MMP的细胞来源的植入物
[0190] 本公开的方面涉及用于保持和维持混合细胞群的补片植入物，所述补片植入物包含(a)具有两种或更多种细胞类型的混合群，其中至少一种类型处于能够表达分泌的和/或
膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的早期谱系期，所述混合群被支持于水凝胶基
质中存在的培养基中，所述水凝胶基质具有足以允许所述混合群迁移(任选地，在所述水凝胶内或远离所述水凝胶迁移和/或在所述补片植入物内或远离所述补片植入物迁移)的粘
弹性；(b)包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述混合群在所述基底的方向上迁移的粘弹性；以及任选地(c)重叠在所述基底的浆膜(即外部)表面
上的水凝胶，所述浆膜表面与接触所述混合群的表面相对，并且在补片植入物栓系至靶标
部位的实施方案中，与接触靶标部位(例如(器官或组织)的一侧相对。在一些实施方案中，该层通过其他组织或器官来防止或抑制粘连，或者防止或抑制与其他组织或器官的粘连。
在一些实施方案中，补片植入物被构造为保持和维持所述混合群，同时抑制所述至少一种
早期谱系期细胞类型分化或进一步成熟为不再能够表达膜相关的和/或分泌的MMP的晚期
谱系期。
膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的早期谱系期，所述混合群被支持于水凝胶基
质中存在的培养基中，所述水凝胶基质具有足以允许所述混合群迁移(任选地，在所述水凝胶内或远离所述水凝胶迁移和/或在所述补片植入物内或远离所述补片植入物迁移)的粘
弹性；(b)包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述混合群在所述基底的方向上迁移的粘弹性；以及任选地(c)重叠在所述基底的浆膜(即外部)表面
上的水凝胶，所述浆膜表面与接触所述混合群的表面相对，并且在补片植入物栓系至靶标
部位的实施方案中，与接触靶标部位(例如(器官或组织)的一侧相对。在一些实施方案中，该层通过其他组织或器官来防止或抑制粘连，或者防止或抑制与其他组织或器官的粘连。
在一些实施方案中，补片植入物被构造为保持和维持所述混合群，同时抑制所述至少一种
早期谱系期细胞类型分化或进一步成熟为不再能够表达膜相关的和/或分泌的MMP的晚期
谱系期。
[0191] 在一些实施方案中，植入物可以仅含有一种细胞类型，诸如胚胎干(ES)细胞或诱导性多能干(iPS)细胞。只要这些细胞是MMP的细胞来源，或者其他来源(诸如MMP的纯化(例如重组)形式)被添加至植入物，就可以获得成功。
[0192] 在一些实施方案中，所述基底是多孔的或无孔的。在一些实施方案中，基底包括多孔和/或无孔网、支架或膜。在一些实施方案中，基底包括丝；合成织物；或天然材料(诸如羊膜、胎盘或网膜或其衍生物)；或它们的组合。在一些实施方案中，所述基底包括输注有水凝胶或被用于转化为屏障的其他生物材料的多孔网。在另外的实施方案中，此类输注防止远离靶标器官或组织的细胞迁移。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述基底包括固体材料。
[0193] 在一些实施方案中，所述水凝胶中的一者或多者包括透明质酸。
[0194] 在一些实施方案中，所述培养基包括库部塔培养基或支持干细胞并且能够维持干性的另一种培养基。
[0195] 在一些实施方案中，所述混合群包含间充质细胞和上皮细胞。在一些实施方案中，所述上皮细胞可以是外胚层细胞、内胚层细胞或中胚层细胞。在一些实施方案中，所述间充质细胞包括早期谱系期间充质细胞(ELSMC)。在一些实施方案中，所述ELSMC包括成血管细胞、内皮的前体、星状细胞的前体和间充质干细胞(MSC)中的一者或多者。在一些实施方案中，所述上皮细胞包括上皮干细胞。在一些实施方案中，所述上皮细胞包括胆系干细胞
(BTSC)。在一些实施方案中，所述上皮细胞包括定向和/或成熟上皮细胞。在一些实施方案中，所述定向和/或成熟上皮细胞包括成熟实质细胞。在一些实施方案中，所述成熟实质细胞包括肝细胞、胆管上皮细胞和胰岛细胞中的一者或多者。在一些实施方案中，所述间充质细胞和上皮细胞二者都包括干细胞。
(BTSC)。在一些实施方案中，所述上皮细胞包括定向和/或成熟上皮细胞。在一些实施方案中，所述定向和/或成熟上皮细胞包括成熟实质细胞。在一些实施方案中，所述成熟实质细胞包括肝细胞、胆管上皮细胞和胰岛细胞中的一者或多者。在一些实施方案中，所述间充质细胞和上皮细胞二者都包括干细胞。
[0196] 在某个实施方案中，所述混合群包含自体细胞和/或同种异体细胞。
[0197] 在一些实施方案中，一种或多种细胞类型是经遗传修饰的。
[0198] “分层”植入物
[0199] 在一些实施方案中，补片植入物被认为是多层植入物。例如，本文提供了补片植入物，所述补片植入物包括多层、由多层组成或基本上由多层组成，所述多层包括至少：(a)软质的水凝胶第一层，所述第一层包含供体细胞，任选地上皮细胞和/或间充质细胞；(b)稠质的水凝胶第二层；以及(c)第三层，所述第三层包含生物相容性的、可生物降解基底。在一些实施方案中，特别是在第三层是多孔的情况下，第二层结合到、浸渍和/或输注到第三层中。在一些实施方案中，补片植入物还包括第四层水凝胶。在补片植入物的一些实施方案中，第四层涂覆或涂布至植入物的浆膜表面上。在补片植入物的一些实施方案中，第一层适用于
直接接触靶标组织或器官。
直接接触靶标组织或器官。
[0200] 如本文所用，“软质”是指表现出如通过帕斯卡(Pa)测定法所定量测定的低水平的内部压力的水凝胶层。一帕斯卡被定义为一牛顿/平方米。在一些实施方案中，软质层具有约10Pa至约300Pa、约50Pa至约250Pa、约100Pa至约250Pa、约50Pa至约200Pa、约150Pa至约200Pa或约100Pa至约200Pa的粘度。在一个特定的实施方案中，软质水凝胶层具有小于或约等于200Pa的粘度。
[0201] 如本文所用，“稠质”是指表现出如通过帕斯卡(Pa)测定法所定量测定的高水平的内部压力的水凝胶层。在一些实施方案中，稠质层具有约300Pa至约3000Pa、约300Pa至约1000Pa、约400Pa至约750Pa、约400Pa至约550Pa、约450Pa至约600Pa或约500Pa至约600Pa的粘度。在一个特定的实施方案中，稠质水凝胶层具有大于或约等于500Pa的粘度。
[0202] 优选地，对于分层植入物的第一层，细胞和生物材料的不溶性复合物具有在约0.1至200Pa、优选地约0.1至约1Pa、约1至约10Pa、约10至100Pa、或约100至约200、或约50至约
250Pa、或约200Pa范围内的粘度或粘弹性。优选地，对于分层植入物的第一层，细胞和生物材料的不溶性复合物具有在约0.1至200Pa、优选地约0.1至约1Pa、约1至约10Pa、约10至
100Pa、或约100至约200范围内的粘弹性。
250Pa、或约200Pa范围内的粘度或粘弹性。优选地，对于分层植入物的第一层，细胞和生物材料的不溶性复合物具有在约0.1至200Pa、优选地约0.1至约1Pa、约1至约10Pa、约10至
100Pa、或约100至约200范围内的粘弹性。
[0203] 在一些实施方案中，混合物中的一种或多种细胞是分泌的和/或膜相关的MMP的来源。在一些实施方案中，诸如但不限于涉及天然分泌MMP的干细胞/祖细胞群的实施方案，沉默MMP表达–任选地分泌的MMP表达–的变量在补片植入物中受到控制。此类变量的非限制性实例包括导致干细胞/祖细胞成熟的变量，诸如但不限于培养基或植入物生物材料的血清
补充物、影响上皮和/或间充质细胞的分化的激素或其他可溶性信号、氧水平(因为厌氧条
件使细胞保持不成熟状态，而较高的氧水平则促进分化)以及植入物材料的刚性(因为机械
力(诸如剪切力)和压缩可以驱动分化)。
补充物、影响上皮和/或间充质细胞的分化的激素或其他可溶性信号、氧水平(因为厌氧条
件使细胞保持不成熟状态，而较高的氧水平则促进分化)以及植入物材料的刚性(因为机械
力(诸如剪切力)和压缩可以驱动分化)。
[0204] 在补片植入物的一些实施方案中，第一层的粘度为约50至约250Pa。在补片植入物的一些实施方案中，第一层的粘度为约200Pa。在补片植入物的一些实施方案中，第二层的粘度为约250Pa至约600Pa。在补片植入物的一些实施方案中，第二层的粘度为约500Pa。在补片植入物的一些实施方案中，第四层的粘度为约250至约500Pa。在补片植入物的一些实
施方案中，第四层的粘度为约400Pa。在补片植入物的一些实施方案中，第二层的粘度大于第1层的粘度。在补片植入物的一些实施方案中，第二层的粘度比第一层的粘度大约1.5至
约15倍。在补片植入物的一些实施方案中，第二层比第一层的粘度大约2倍。
施方案中，第四层的粘度为约400Pa。在补片植入物的一些实施方案中，第二层的粘度大于第1层的粘度。在补片植入物的一些实施方案中，第二层的粘度比第一层的粘度大约1.5至
约15倍。在补片植入物的一些实施方案中，第二层比第一层的粘度大约2倍。
[0205] 在一个实施方案中，补片植入物包括多个层、由多个层组成或基本上由多个层组成，所述层从接触靶标部位之处开始，并且由以下层组成：包埋到软质(<200Pa)水凝胶中的供体细胞，所述软质水凝胶在无血清确定培养基中制备(这些细胞将植入并迁移至组织
中)；水凝胶第二层，所述水凝胶在相同的培养基中制备，并且被触发为具有更高的稠度(例如～500Pa或更高)，以提供针对供体细胞在除朝向靶标组织之外的任何方向上迁移的屏
障；第三层生物相容性的、可生物降解的、可生物再吸收的基底，所述基底在对供体细胞的成熟状态的作用中是中性的，并且可以在手术中使用或通过其他手段将植入物栓系至靶标
部位；以及最后一层水凝胶，所述水凝胶的稠度介于软质水凝胶和非常稠的水凝胶之间，并且可以充分流动以涂布或涂覆至表面，以使组织附近的粘连最小化。
中)；水凝胶第二层，所述水凝胶在相同的培养基中制备，并且被触发为具有更高的稠度(例如～500Pa或更高)，以提供针对供体细胞在除朝向靶标组织之外的任何方向上迁移的屏
障；第三层生物相容性的、可生物降解的、可生物再吸收的基底，所述基底在对供体细胞的成熟状态的作用中是中性的，并且可以在手术中使用或通过其他手段将植入物栓系至靶标
部位；以及最后一层水凝胶，所述水凝胶的稠度介于软质水凝胶和非常稠的水凝胶之间，并且可以充分流动以涂布或涂覆至表面，以使组织附近的粘连最小化。
[0206] 在补片植入物的一些实施方案中，第一层和第二层分别包含一种或多种透明质酸。在补片植入物的一些实施方案中，第四层包含一种或多种透明质酸。
[0207] 在补片植入物的一些实施方案中，上皮细胞和间充质细胞形成一种或多种聚集体。在补片植入物的一些实施方案中，一种或多种聚集体是类器官。在补片植入物的一些实施方案中，上皮细胞包括上皮干细胞。在补片植入物的一些实施方案中，上皮细胞包括胆上皮细胞。在补片植入物的一些实施方案中，上皮细胞包括定向和/或成熟上皮细胞。在补片植入物的一些实施方案中，定向和/或成熟上皮细胞包括成熟实质细胞。在补片植入物的一些实施方案中，成熟实质细胞包括肝细胞、胆管上皮细胞和胰岛细胞中的一者或多者。
[0208] 在补片植入物的一些实施方案中，间充质细胞是支持性间充质细胞。在补片植入物的一些实施方案中，间充质细胞包括早期谱系期间充质细胞(ELSMC)。在补片植入物的一些实施方案中，ELSMC包括选自成血管细胞、内皮的前体、星状细胞的前体和间充质干细胞(MSC)中的一者或多者。
[0209] 在补片植入物的一些实施方案中，上皮细胞和间充质细胞不是彼此的谱系期搭配物。在补片植入物的一些实施方案中，上皮细胞是成熟细胞。在补片植入物的一些实施方案中，间充质细胞是ELSMC。
[0210] 在补片植入物的一些实施方案中，上皮细胞和间充质细胞中的至少一者来源于供体。在一些实施方案中，供体是需要组织移植的受试者。在一些实施方案中，供体是用于组织移植的健康细胞的来源。在补片植入物的一些实施方案中，上皮细胞和间充质细胞中的
至少一者是补片植入物的预期接受者自体的。在一些实施方案中，所有细胞(即上皮和间充质细胞)都是植入物的预期接受者自体的。在一些实施方案中，细胞的供体可以是除接受者(同种异体)之外的供体，或者也可以是具有患病的或功能障碍性病症的内部器官的受试者
(自体)，任选地，其中从未患病或具有功能障碍的和/或已对细胞进行遗传修饰以恢复功能的内部器官的一部分获得。对于建立用于研究疾病的模型系统，供体细胞可以是患有疾病
并且移植到实验宿主中的正常组织之上/之中的细胞。
至少一者是补片植入物的预期接受者自体的。在一些实施方案中，所有细胞(即上皮和间充质细胞)都是植入物的预期接受者自体的。在一些实施方案中，细胞的供体可以是除接受者(同种异体)之外的供体，或者也可以是具有患病的或功能障碍性病症的内部器官的受试者
(自体)，任选地，其中从未患病或具有功能障碍的和/或已对细胞进行遗传修饰以恢复功能的内部器官的一部分获得。对于建立用于研究疾病的模型系统，供体细胞可以是患有疾病
并且移植到实验宿主中的正常组织之上/之中的细胞。
[0211] 在补片植入物的一些实施方案中，上皮细胞或间充质细胞中的至少一者是经修饰的。在一些实施方案中，所有细胞都是经修饰的。在一些实施方案中，修饰是遗传修饰。在一些实施方案中，一种或多种细胞被修饰为表达治疗性核酸或多肽。在一些实施方案中，一种或多种细胞被修饰为表达核酸或多肽的野生型等位基因。
[0212] 在补片植入物的一些实施方案中，生物相容性的、可生物降解基底是可生物再吸收的。在补片植入物的一些实施方案中，生物相容性的、可生物降解基底包括多孔材料。在补片植入物的一些实施方案中，生物相容性的可生物降解基底包括支架或膜。在补片植入
物的一些实施方案中，支架或膜包括丝、羊膜、合成织物或它们的组合。在一些实施方案中，生物相容性的、可生物降解基底不包括诱导或防止细胞分化的任何因素。在补片植入物的
一些实施方案中，生物相容性的、可生物降解基底不包括来源于成熟胞外基质的一种或多
种组分。在补片植入物的一些实施方案中，来源于成熟胞外基质的组分是I型胶原蛋白。
物的一些实施方案中，支架或膜包括丝、羊膜、合成织物或它们的组合。在一些实施方案中，生物相容性的、可生物降解基底不包括诱导或防止细胞分化的任何因素。在补片植入物的
一些实施方案中，生物相容性的、可生物降解基底不包括来源于成熟胞外基质的一种或多
种组分。在补片植入物的一些实施方案中，来源于成熟胞外基质的组分是I型胶原蛋白。
[0213] 在补片植入物的一些实施方案中，补片植入物还包含一种或多种基质金属蛋白酶(MMP)。在补片植入物的一些实施方案中，MMP是膜相关的MMP。在补片植入物的一些实施方案中，膜相关的MMP由上皮细胞或间充质细胞中的一者或多者提供。在补片植入物的一些实施方案中，MMP是分泌的MMP。分泌的MMP可以任选地由上皮或间充质细胞中的一者或多者天然产生，或者任选地由于用针对MMP产生的重组表达载体转化上皮或间充质细胞中的一者
或多者而产生。
或多者而产生。
[0214] 在一些方面，本文提供了补片植入物，所述补片植入物包括多层、由多层组成或基本上由多层组成，所述多层包括至少：软质的水凝胶第一层，所述第一层包含胆系干细胞；稠质的水凝胶第二层；以及第三层，所述第三层包含生物相容性的、可生物降解基底。
[0215] 在一个实施方案中，补片植入物由材料和细胞层组成，这些层共同形成可以通过手术或其他方式栓系至靶标部位的“绷带样植入物”。紧贴靶标部位的第一层包含软质水凝胶(小于200Pa)，所述软质水凝胶接种有上皮细胞和支持性间充质细胞的混合物，所述上皮细胞和支持性间充质细胞悬浮于确定的无血清富含营养物的培养基中，所述培养基培养基
针对细胞的扩增和/或存活而设计；第二层含有水凝胶，所述水凝胶在相同的培养基中制
备，但是胶凝至更稠的水平(即更高的帕斯卡水平)，并且形成阻断细胞在除靶标部位之外
的方向上迁移的屏障；第三水平包含生物相容性的、可生物降解基底，所述基底不影响或最小程度地影响供体细胞的分化水平，但是充当补片的机械支持结构；由可涂布的水凝胶(另外诸如透明质酸)组成的第四层，所述水凝胶的稠度水平介于软质水凝胶与稠质水凝胶之
间，并且用于使从来自邻近组织的细胞向植入物的粘连最小化。水凝胶必须由生物相容性
的、可生物降解和“可调节的”(意味着关于稠度而言是可调控的)材料组成。一种针对水凝胶的成功材料是硫醇改性的透明质酸，当暴露于氧和/或聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)
时，这些透明质酸可以被触发形成水凝胶，并且可容易地通过透明质酸和PEGDA浓度(和/或氧水平)的精确比率来“调节”。
针对细胞的扩增和/或存活而设计；第二层含有水凝胶，所述水凝胶在相同的培养基中制
备，但是胶凝至更稠的水平(即更高的帕斯卡水平)，并且形成阻断细胞在除靶标部位之外
的方向上迁移的屏障；第三水平包含生物相容性的、可生物降解基底，所述基底不影响或最小程度地影响供体细胞的分化水平，但是充当补片的机械支持结构；由可涂布的水凝胶(另外诸如透明质酸)组成的第四层，所述水凝胶的稠度水平介于软质水凝胶与稠质水凝胶之
间，并且用于使从来自邻近组织的细胞向植入物的粘连最小化。水凝胶必须由生物相容性
的、可生物降解和“可调节的”(意味着关于稠度而言是可调控的)材料组成。一种针对水凝胶的成功材料是硫醇改性的透明质酸，当暴露于氧和/或聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)
时，这些透明质酸可以被触发形成水凝胶，并且可容易地通过透明质酸和PEGDA浓度(和/或氧水平)的精确比率来“调节”。
[0216] 在另一个实施方案中，补片植入物包括多层。紧贴靶标部位的第一层是软质水凝胶，所述软质水凝胶是最小硫酸化的或非硫酸化的GAG或可以胶凝或固化并且中间可以放
置供体细胞的其他非硫酸化的或中性生物材料。第二层水凝胶或生物材料是更稠的，并且
中间/上面或内部掺有基底，即允许出于手术或其他目的而处理补片并且作为迫使细胞朝
向靶标组织迁移的屏障的生物相容性的、可生物降解的、可生物再吸收的基底。基底的浆膜侧在手术时涂覆有生物材料，诸如透明质酸(或者其他最小硫酸化的或非硫酸化的GAG或者
可以胶凝或固化的其他材料)，并且其中帕斯卡水平是软质生物材料层中存在的帕斯卡水
平的至少两倍；这用于使来自邻近组织的粘连最小化的目的。补片植入物栓系至靶标器官
或组织，并且细胞能够迁移至组织或器官并完全并入其中。
置供体细胞的其他非硫酸化的或中性生物材料。第二层水凝胶或生物材料是更稠的，并且
中间/上面或内部掺有基底，即允许出于手术或其他目的而处理补片并且作为迫使细胞朝
向靶标组织迁移的屏障的生物相容性的、可生物降解的、可生物再吸收的基底。基底的浆膜侧在手术时涂覆有生物材料，诸如透明质酸(或者其他最小硫酸化的或非硫酸化的GAG或者
可以胶凝或固化的其他材料)，并且其中帕斯卡水平是软质生物材料层中存在的帕斯卡水
平的至少两倍；这用于使来自邻近组织的粘连最小化的目的。补片植入物栓系至靶标器官
或组织，并且细胞能够迁移至组织或器官并完全并入其中。
[0217] 在一个特定实施方案中，补片植入物包括第一层软质生物材料(<200Pa)，诸如软质透明质酸水凝胶，中间放置有将在无血清确定培养基中移植的供体细胞，所述培养基为
细胞的谱系期而定制。该层放置在更稠的层(例如更稠的水凝胶)上，所述更稠的层作为迫
使供体细胞在向靶标组织迁移的过程中导向的屏障。更稠的层在基底(即允许针对手术或
其他程序而处理补片，以将补片固定至靶标部位的生物相容性的、可生物降解基底)上提前制备。最后一层是生物材料，所述生物材料的稠度介于针对靶标组织侧上的供体细胞的稠
度和针对屏障的稠度之间。该层在手术时添加至植入物的浆膜侧之上，并且用于使来自邻
近组织的粘连最小化。生物相容性的、可生物降解基底可以是Seri-silk或其衍生物。
细胞的谱系期而定制。该层放置在更稠的层(例如更稠的水凝胶)上，所述更稠的层作为迫
使供体细胞在向靶标组织迁移的过程中导向的屏障。更稠的层在基底(即允许针对手术或
其他程序而处理补片，以将补片固定至靶标部位的生物相容性的、可生物降解基底)上提前制备。最后一层是生物材料，所述生物材料的稠度介于针对靶标组织侧上的供体细胞的稠
度和针对屏障的稠度之间。该层在手术时添加至植入物的浆膜侧之上，并且用于使来自邻
近组织的粘连最小化。生物相容性的、可生物降解基底可以是Seri-silk或其衍生物。
[0218] 补片植入物的使用和递送方法
[0219] 本公开的方面涉及用于将细胞植入器官的组合物和方法。将来自实体器官的细胞移植到内部器官的工作通常使用经由血管途径的细胞的直接注射或递送。Lanzoni,G.等人
Stem Cells 31,2047-2060(2013)。这些移植方法产生少量被移植到靶标部位的细胞，并且具有可能危及生命的栓塞风险。如果细胞通过“注射植入”来递送(其中所述细胞悬浮于透明质酸中或涂覆有透明质酸)，然后与导致透明质酸原位胶凝的引发剂(PEGDA)一起共注
射，则移植得以改进，如Turner R.等人Hepatology 57,775-784(2013)所述。注射植入方法提供了用于将细胞定位至特定部位的策略，尽管数量很少，通常105-107、106-107或105-106个细胞/注射部位。该策略消除或使异位细胞分布最小化，并且优化细胞在部位中的整合。
然而，如果使用成熟功能细胞，则它们可以具有高免疫原性，这需要长期免疫抑制。另外，能够注射的细胞数量可能不足以实现必需的临床结果。
Stem Cells 31,2047-2060(2013)。这些移植方法产生少量被移植到靶标部位的细胞，并且具有可能危及生命的栓塞风险。如果细胞通过“注射植入”来递送(其中所述细胞悬浮于透明质酸中或涂覆有透明质酸)，然后与导致透明质酸原位胶凝的引发剂(PEGDA)一起共注
射，则移植得以改进，如Turner R.等人Hepatology 57,775-784(2013)所述。注射植入方法提供了用于将细胞定位至特定部位的策略，尽管数量很少，通常105-107、106-107或105-106个细胞/注射部位。该策略消除或使异位细胞分布最小化，并且优化细胞在部位中的整合。
然而，如果使用成熟功能细胞，则它们可以具有高免疫原性，这需要长期免疫抑制。另外，能够注射的细胞数量可能不足以实现必需的临床结果。
[0220] 本文所述的“补片植入”策略克服了这些障碍和问题。在一些实施方案中，“绷带样”植入物通过手术或其他方式栓系至器官或组织的表面；植入物的条件使细胞完全植入部位中，在整个器官/组织上迁移，然后成熟为相关的成体细胞类型。通过补片的大小、植入物内的细胞数或混合物以及多种形式MMP的来源(理想地MMP的细胞来源)来形成或确定大
量细胞(>108个细胞)的移植潜力。此外，在一些实施方案中，类器官的使用有助于储存供体细胞的能力，在确定的无血清条件下超低温保存类器官的方式更利于这种能力的发挥。
量细胞(>108个细胞)的移植潜力。此外，在一些实施方案中，类器官的使用有助于储存供体细胞的能力，在确定的无血清条件下超低温保存类器官的方式更利于这种能力的发挥。
[0221] 本文提供的补片植入物组合物涉及将细胞直接植入组织或实体器官。该方法是安全的，避免了栓塞和异位细胞分布，并且优化了细胞数植入以及在组织中和整个组织的分
布。
布。
[0222] 因此，本文提供了将细胞植入靶标组织中的方法，所述方法包括使靶标组织接触上文公开的补片植入物、由该步骤组成或基本上由该步骤组成。
[0223] 在所述方法的一些实施方案中，靶标组织选自肝脏、胰腺、胆系、甲状腺、胸腺、胃肠道、肺、前列腺、乳腺、脑、膀胱、脊髓、皮肤和皮下真皮组织、子宫、肾脏、肌肉、血管、心脏、软骨、肌腱和骨骼组织。在所述方法的一些实施方案中，靶标组织是肝脏组织。在所述方法的一些实施方案中，靶标组织是胰腺组织。在所述方法的一些实施方案中，靶标组织是胆系组织。在所述方法的一些实施方案中，靶标组织是胃肠道组织。在一些实施方案中，组织是患病的、受损的或患有障碍。在所述方法的一些实施方案中，靶标组织是肾组织。
[0224] 在所述方法的一些实施方案中，靶标组织是器官。在所述方法的一些实施方案中，器官是肌肉骨骼系统、消化系统、呼吸系统、泌尿系统、女性生殖系统、男性生殖系统、内分泌系统、循环系统、淋巴系统、神经系统或外皮系统的器官。在所述方法的一些实施方案中，器官选自肝脏、胰腺、胆系、甲状腺、胸腺、胃肠道、肺、前列腺、乳腺、脑、膀胱、脊髓、皮肤和皮下真皮组织、子宫、肾脏、肌肉、血管、心脏、软骨、肌腱和骨骼。在一些实施方案中，器官是患病的、受损的或患有障碍。
[0225] 本文还提供了治疗患有肝脏疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括使受试者的肝脏接触上文公开的补片植入物、由该步骤组成或基本上由该步骤组成。在所述方法的
一些实施方案中，肝脏疾病或障碍是肝纤维化、肝硬化、血色素沉着症、肝癌、胆道闭锁、非酒精性脂肪肝疾病、肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、片吸虫病、酒精性肝病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、II型糖原贮积症、转甲状腺素蛋白相关的遗传性淀粉样变性、吉尔伯特
(Gilbert’s)综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、巴德-吉亚利(Budd-
Chiari)综合征、肝脏创伤或威尔逊(Wilson)病。
一些实施方案中，肝脏疾病或障碍是肝纤维化、肝硬化、血色素沉着症、肝癌、胆道闭锁、非酒精性脂肪肝疾病、肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、片吸虫病、酒精性肝病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、II型糖原贮积症、转甲状腺素蛋白相关的遗传性淀粉样变性、吉尔伯特
(Gilbert’s)综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、巴德-吉亚利(Budd-
Chiari)综合征、肝脏创伤或威尔逊(Wilson)病。
[0226] 在其他方面，本文提供了治疗患有胰腺疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括使受试者的胰腺接触上文公开的补片植入物、由该步骤组成或基本上由该步骤组成。在
所述方法的一些实施方案中，胰腺疾病或障碍是糖尿病、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、胰腺癌、奥迪(Oddi)括约肌功能障碍、囊性纤维化、胰腺分裂、环状胰腺、胰腺创伤或胰管出血。
所述方法的一些实施方案中，胰腺疾病或障碍是糖尿病、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、胰腺癌、奥迪(Oddi)括约肌功能障碍、囊性纤维化、胰腺分裂、环状胰腺、胰腺创伤或胰管出血。
[0227] 在其他方面，本文提供了治疗患有胃肠道疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括使受试者的一条或多条肠子接触上文公开的补片植入物、由该步骤组成或基本上由该
步骤组成。在一些实施方案中，胃肠道疾病或障碍是肠胃炎、胃肠道癌、回肠炎、炎性肠病、克罗恩(Crohn’s)病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、消化性溃疡病、乳糜泻、纤维化、血管发育不良、赫希施普龙(Hirschsprung’s)病、假膜性结肠炎或胃肠道创伤。
步骤组成。在一些实施方案中，胃肠道疾病或障碍是肠胃炎、胃肠道癌、回肠炎、炎性肠病、克罗恩(Crohn’s)病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、消化性溃疡病、乳糜泻、纤维化、血管发育不良、赫希施普龙(Hirschsprung’s)病、假膜性结肠炎或胃肠道创伤。
[0228] 在一些方面，本文提供了治疗患有肾脏疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括使受试者的一个或多个肾接触上文公开的补片植入物、由该步骤组成或基本上由该步骤
组成。在所述方法的一些实施方案中，肾脏疾病或障碍是肾炎、肾病、肾炎综合征、肾病综合征、慢性肾病、急性肾损伤、肾脏创伤、囊性肾病、多囊性肾病、肾小球肾炎、IgA肾病、狼疮性肾炎、肾癌、奥尔波特(Alport)综合征、淀粉样变性、古德巴斯捷氏(Goodpasture)综合征或韦格纳氏(Wegener’s)肉芽肿病。
组成。在所述方法的一些实施方案中，肾脏疾病或障碍是肾炎、肾病、肾炎综合征、肾病综合征、慢性肾病、急性肾损伤、肾脏创伤、囊性肾病、多囊性肾病、肾小球肾炎、IgA肾病、狼疮性肾炎、肾癌、奥尔波特(Alport)综合征、淀粉样变性、古德巴斯捷氏(Goodpasture)综合征或韦格纳氏(Wegener’s)肉芽肿病。
[0229] 在疗法方法的一些实施方案中，上皮细胞和间充质细胞中的至少一者来源于供体。在一些实施方案中，供体是需要组织移植的受试者。在一些实施方案中，供体是用于组织移植的健康细胞的来源。在一些实施方案中，上皮细胞和间充质细胞中的至少一者是补
片植入物的预期接受者自体的。在一些实施方案中，所有细胞(即上皮和间充质细胞)都是
植入物的预期接受者自体的。在一些实施方案中，细胞的供体可以是除接受者(同种异体)
之外的供体，或者也可以是具有患病的或功能障碍性病症的内部器官的受试者(自体)，任
选地，其中从未患病或具有功能障碍的和/或已对细胞进行遗传修饰以恢复功能的内部器
官的一部分获得。
片植入物的预期接受者自体的。在一些实施方案中，所有细胞(即上皮和间充质细胞)都是
植入物的预期接受者自体的。在一些实施方案中，细胞的供体可以是除接受者(同种异体)
之外的供体，或者也可以是具有患病的或功能障碍性病症的内部器官的受试者(自体)，任
选地，其中从未患病或具有功能障碍的和/或已对细胞进行遗传修饰以恢复功能的内部器
官的一部分获得。
[0230] 在一些实施方案中，上文公开的方法中所用的补片植入物是包括多层的补片植入物，所述多层包括至少：水凝胶第一层，所述第一层包含上皮细胞和间充质细胞；水凝胶第二层；第三层，所述第三层包含生物相容性的、可生物降解基底；以及任选地水凝胶第四层。
在一些实施方案中，所述方法还包括允许补片植入物中含有的细胞结合到组织中。在所述
方法的一些实施方案中，水凝胶第一层是软质的。在所述方法的一些实施方案中，水凝胶第二层是稠质的。在所述方法的一些实施方案中，间充质细胞是支持性间充质细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括允许补片植入物中含有的细胞结合到组织中。在所述
方法的一些实施方案中，水凝胶第一层是软质的。在所述方法的一些实施方案中，水凝胶第二层是稠质的。在所述方法的一些实施方案中，间充质细胞是支持性间充质细胞。
[0231] 在另一个方面，本公开提供了一种用于将细胞植入器官的方法，所述方法包括补片植入物(即具有多层材料和细胞的绷带样复合物)的使用，这些材料和细胞可以共同通过
手术或其他方式栓系至靶标部位。紧贴靶标部位的第一层包含软质水凝胶(小于200Pa)，所述软质水凝胶接种有上皮细胞和支持性间充质细胞的混合物，所述上皮细胞和支持性间充
质细胞悬浮于确定的无血清富含营养物的培养基中，所述培养基培养基针对细胞的扩增
和/或存活而设计；第二层含有水凝胶，所述水凝胶在相同的培养基中制备，但是胶凝至更稠的水平(即更高的帕斯卡水平)，并且形成阻断细胞在除靶标部位之外的方向上迁移的屏
障；第三水平包含生物相容性的、可生物降解基底，所述基底不影响或最小程度地影响供体细胞的分化水平，因此是“中性的”；由可涂布的水凝胶(另外诸如透明质酸)组成的第四层，所述水凝胶的稠度水平介于软质水凝胶与稠质水凝胶之间，并且用于使从来自邻近组织的
细胞向植入物的粘连最小化。水凝胶必须由生物相容性的、可生物降解和“可调节的”(意味着关于稠度而言是可调控的)材料组成。一种针对水凝胶的成功材料是硫醇改性的透明质
酸，当暴露于氧和/或聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)时，这些透明质酸可以被触发形成水
凝胶，并且可容易地通过透明质酸和PEGDA浓度(和/或氧水平)的精确比率来“调节”。细胞在植入物的生物材料的条件下产生多种基质金属蛋白酶(MMP)，所述基质金属蛋白酶有利
于供体细胞植入、迁移和整合到接受者的组织中。接受者组织的微环境决定了所移植的细
胞的成体命运。
手术或其他方式栓系至靶标部位。紧贴靶标部位的第一层包含软质水凝胶(小于200Pa)，所述软质水凝胶接种有上皮细胞和支持性间充质细胞的混合物，所述上皮细胞和支持性间充
质细胞悬浮于确定的无血清富含营养物的培养基中，所述培养基培养基针对细胞的扩增
和/或存活而设计；第二层含有水凝胶，所述水凝胶在相同的培养基中制备，但是胶凝至更稠的水平(即更高的帕斯卡水平)，并且形成阻断细胞在除靶标部位之外的方向上迁移的屏
障；第三水平包含生物相容性的、可生物降解基底，所述基底不影响或最小程度地影响供体细胞的分化水平，因此是“中性的”；由可涂布的水凝胶(另外诸如透明质酸)组成的第四层，所述水凝胶的稠度水平介于软质水凝胶与稠质水凝胶之间，并且用于使从来自邻近组织的
细胞向植入物的粘连最小化。水凝胶必须由生物相容性的、可生物降解和“可调节的”(意味着关于稠度而言是可调控的)材料组成。一种针对水凝胶的成功材料是硫醇改性的透明质
酸，当暴露于氧和/或聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)时，这些透明质酸可以被触发形成水
凝胶，并且可容易地通过透明质酸和PEGDA浓度(和/或氧水平)的精确比率来“调节”。细胞在植入物的生物材料的条件下产生多种基质金属蛋白酶(MMP)，所述基质金属蛋白酶有利
于供体细胞植入、迁移和整合到接受者的组织中。接受者组织的微环境决定了所移植的细
胞的成体命运。
[0232] 在另一个方面，本公开提供了一种用于将细胞植入器官的方法，所述方法包括接触补片植入物，所述补片植入物包括多层，所述多层包括至少第一层，所述第一层包含生物相容性的、可生物降解基底，第二层，所述第二层包含一种或多种透明质酸，所述透明质酸包括上皮细胞和支持性间充质细胞的混合物，以及第三层，所述第三层包含一种或多种透
明质酸，其中细胞包埋在中间的层是软质的(小于200Pa)；与基底相关的层更稠(～500Pa或更大)；第三层的帕斯卡水平介于其中，并且有助于使组织或器官附近的粘连最小化。在又一个方面，细胞可以植入器官中，所述器官选自肝脏、胰腺、胆系、甲状腺、胸腺、肠、肺、前列腺、乳腺、脑、脊髓、神经节、皮肤和皮下真皮组织、子宫、骨骼、胸腺、肠、子宫、骨骼、肾脏、肌肉、血管或心脏。
明质酸，其中细胞包埋在中间的层是软质的(小于200Pa)；与基底相关的层更稠(～500Pa或更大)；第三层的帕斯卡水平介于其中，并且有助于使组织或器官附近的粘连最小化。在又一个方面，细胞可以植入器官中，所述器官选自肝脏、胰腺、胆系、甲状腺、胸腺、肠、肺、前列腺、乳腺、脑、脊髓、神经节、皮肤和皮下真皮组织、子宫、骨骼、胸腺、肠、子宫、骨骼、肾脏、肌肉、血管或心脏。
[0233] 在又一个方面，细胞可以植入器官中，所述器官选自肝脏、胰腺、胆系、甲状腺、胸腺、肠、肺、前列腺、乳腺、脑、脊髓、神经节、皮肤和皮下真皮组织、子宫、骨骼、肌腱、软骨、肾脏、肌肉、血管或心脏。
[0234] 适用于本文公开的方法的补片植入物的非限制性实例是包含以下组分的补片植入物：(a)具有两种或更多种细胞类型的混合群，其中至少一种类型处于能够表达分泌的
和/或膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的早期谱系期，所述混合群被支持于水
凝胶基质中存在的培养基中，所述水凝胶基质具有足以允许所述混合群迁移(任选地，在所述水凝胶内或远离所述水凝胶迁移和/或在所述补片植入物内或远离所述补片植入物迁
移)的粘弹性；(b)包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述混合群在所述基底的方向上迁移或提供对所述迁移的屏障的粘弹性；以及任选地(c)重叠
在所述基底的浆膜(即外部)表面上的水凝胶，所述浆膜表面与接触所述混合群的表面相
对，并且在补片植入物栓系至靶标部位的实施方案中，与接触靶标部位(例如(器官或组织)的一侧相对。在一些实施方案中，该层通过其他组织或器官来防止或抑制粘连，或者防止或抑制与其他组织或器官的粘连。在一些实施方案中，补片植入物被构造为保持和维持所述
混合群，同时抑制所述至少一种早期谱系期细胞类型分化或进一步成熟为不再能够表达膜
相关的和/或分泌的MMP的晚期谱系期。
和/或膜相关的和/或分泌的基质金属蛋白酶(MMP)的早期谱系期，所述混合群被支持于水
凝胶基质中存在的培养基中，所述水凝胶基质具有足以允许所述混合群迁移(任选地，在所述水凝胶内或远离所述水凝胶迁移和/或在所述补片植入物内或远离所述补片植入物迁
移)的粘弹性；(b)包含生物相容性的、可生物降解材料的基底，所述材料具有足以抑制所述混合群在所述基底的方向上迁移或提供对所述迁移的屏障的粘弹性；以及任选地(c)重叠
在所述基底的浆膜(即外部)表面上的水凝胶，所述浆膜表面与接触所述混合群的表面相
对，并且在补片植入物栓系至靶标部位的实施方案中，与接触靶标部位(例如(器官或组织)的一侧相对。在一些实施方案中，该层通过其他组织或器官来防止或抑制粘连，或者防止或抑制与其他组织或器官的粘连。在一些实施方案中，补片植入物被构造为保持和维持所述
混合群，同时抑制所述至少一种早期谱系期细胞类型分化或进一步成熟为不再能够表达膜
相关的和/或分泌的MMP的晚期谱系期。
[0235] 在一些实施方案中，所述基底是多孔的或无孔的。在一些实施方案中，基底包括多孔网、支架或膜。在一些实施方案中，基底包括丝；合成织物；或天然材料(诸如羊膜、胎盘或网膜)；或它们的组合。在一些实施方案中，所述基底包括输注有水凝胶的多孔网。在另外的实施方案中，此类输注防止远离靶标器官或组织的细胞迁移。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述基底包括固体材料。
[0236] 在一些实施方案中，补片植入物还包含重叠在所述基底的浆膜表面上的水凝胶，所述浆膜表面与接触所述单细胞或混合细胞群的表面相对。
[0237] 在一些实施方案中，所述水凝胶中的一者或多者包括透明质酸。
[0238] 在一些实施方案中，所述培养基包括库部塔培养基或支持干细胞并且能够维持干性的另一种培养基。
[0239] 在一些实施方案中，所述混合群包含间充质细胞和上皮细胞。在一些实施方案中，所述上皮细胞可以是外胚层细胞、内胚层细胞或中胚层细胞。在一些实施方案中，所述间充质细胞包括早期谱系期间充质细胞(ELSMC)。在一些实施方案中，所述ELSMC包括成血管细胞、内皮的前体、星状细胞的前体和间充质干细胞(MSC)中的一者或多者。在一些实施方案中，所述上皮细胞包括上皮干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，所述上皮细胞包括胆系干细胞(BTSC)。在一些实施方案中，所述上皮细胞包括定向和/或成熟上皮细胞。在一些实施方案中，所述定向和/或成熟上皮细胞包括成熟实质细胞。在一些实施方案中，所述成熟实质细胞包括肝细胞、胆管上皮细胞和胰岛细胞中的一者或多者。在一些实施方案中，所述间充质细胞和上皮细胞二者都包括干细胞。
[0240] 在某个实施方案中，所述混合群包含自体细胞和/或同种异体细胞。
[0241] 在一些实施方案中，一种或多种细胞类型是经遗传修饰的。
[0242] 实施例
[0243] 以下实施例是非限制性的，并且说明了可用于使本公开生效的各种情况下的程序。另外，下文公开的所有参考文献以引用的方式整体并入。
[0244] 实施例1：用于补片植入物验证的猪模型
[0245] 动物
[0246] 用作宿主或用作细胞的供体的动物维持于NCSU(Raleigh,NC)兽医学院的设施中。手术、尸检和所有生物流体和组织的收集均在这些设施中进行。所有程序均由NCSU的IACUC委员会批准。用作接受者的猪是六种不同品种的混合物：由Yorkshires、Large Whites、
Landraces(来自母猪)、Durocs、Spots和Pietrans(来自公猪)组成的六品种杂交物。这些高度异质的遗传背景是所期望的，因为它相当于人类群体的异质遗传构造。宿主动物都是雌
性，大约六周龄，体重为～15kg。
Landraces(来自母猪)、Durocs、Spots和Pietrans(来自公猪)组成的六品种杂交物。这些高度异质的遗传背景是所期望的，因为它相当于人类群体的异质遗传构造。宿主动物都是雌
性，大约六周龄，体重为～15kg。
[0247] 宿主动物有两类。a)雄猪(大约六周龄，体重为～15kg)被用作向雌猪进行细胞移植的供体；b)携带GFP转基因的转基因供体动物。GFP+供体动物通过标准人工受精使转基因H2B-GFP公猪与野生型小母猪杂交来获得。该模型经由IRES-pH2B-eGFP至内源性β-肌动蛋
白(ACTB)基因座的CRISPR-Cas9介导的同源性指导的修复(HDR)来开发。转基因动物显示出
pH2B-eGFP在所有组织中的遍在表达。GFP与H2B的融合导致GFP标记物定位于核小体，并且
允许清晰的核显示以及染色体动力学研究。已对首建者品系进行广泛和遍在分析，并确认
了核定位表达。此外，杂交表明H2B-GFP传播至下一代。所有动物都是健康的，并且多只动物已怀孕，子代显示出针对pH2B-eGFP的传播的预期孟德尔比率。雄性后代在出生时进行基因分型，对转基因阳性的那些后代实施人道安乐死以收集组织，并分离供体细胞。
白(ACTB)基因座的CRISPR-Cas9介导的同源性指导的修复(HDR)来开发。转基因动物显示出
pH2B-eGFP在所有组织中的遍在表达。GFP与H2B的融合导致GFP标记物定位于核小体，并且
允许清晰的核显示以及染色体动力学研究。已对首建者品系进行广泛和遍在分析，并确认
了核定位表达。此外，杂交表明H2B-GFP传播至下一代。所有动物都是健康的，并且多只动物已怀孕，子代显示出针对pH2B-eGFP的传播的预期孟德尔比率。雄性后代在出生时进行基因分型，对转基因阳性的那些后代实施人道安乐死以收集组织，并分离供体细胞。
[0248] 对于每只供体和接受者动物，已使用引物对猪白细胞抗原I类(SLA-I)和II类(SLA-II)基因座进行PCR扩增，所述引物被设计为根据PCR序列特异性引物策略扩增这些区
域中的已知等位基因。该系统由扩增SLA-1、SLA-2和SLA-3基因座53的47个区分性SLA-I引物组，以及扩增DRB1、DQB1和DQA基因座的47个区分性SLA-II引物组组成。已经开发了这些引物组以通过共有相似的序列基序的群组来区分等位基因，并且已经容易地和明确地显示出
检测已知的SLA-I和SLA-II等位基因。当这些引物组一起使用时，它们能够为每只测试动物有效地提供单倍型，从而提供容易地确认供体和接受者动物中的匹配或错配单倍型的测定
法。
域中的已知等位基因。该系统由扩增SLA-1、SLA-2和SLA-3基因座53的47个区分性SLA-I引物组，以及扩增DRB1、DQB1和DQA基因座的47个区分性SLA-II引物组组成。已经开发了这些引物组以通过共有相似的序列基序的群组来区分等位基因，并且已经容易地和明确地显示出
检测已知的SLA-I和SLA-II等位基因。当这些引物组一起使用时，它们能够为每只测试动物有效地提供单倍型，从而提供容易地确认供体和接受者动物中的匹配或错配单倍型的测定
法。
[0249] 培养基和溶液
[0250] 所有培养基都经无菌过滤(0.22μm过滤器)，并在使用前在4℃下避光保存。基础培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBCO/Invitrogen。所有生长因子均购自R&D Systems。除已有说明之外，所有其他试剂均从Sigma获得。
[0251] 细胞洗涤剂用补充有0.5克血清白蛋白(Sigma，#A8896-5G，无脂肪酸)、10-9M硒和5ml抗生素(Gibco#35240-062，AAS)的599ml基础培养基(例如RPMI1640；Gibco#11875-093)来配制。它用于在处理期间洗涤组织和细胞。
[0252] 制备胶原蛋白酶缓冲液，该缓冲液由补充有胶原蛋白酶(Sigma#C5138)(对于胆系(胆管)组织，终浓度为600U/ml(R1451 25mg)，对于器官实质组织(肝脏、胰腺)，终浓度为
300U/ml(12.5mg))的100ml细胞洗涤剂组成。
300U/ml(12.5mg))的100ml细胞洗涤剂组成。
[0253] 库部塔培养基(为内胚层干细胞/祖细胞而设计的确定的无血清培养基)用于制备细胞悬浮液、类器官和HA水凝胶。该培养基由不含铜、含少量钙(0.3mM)、1nM硒、0.1％牛血清白蛋白(纯化的，不含脂肪酸；级分V)、4.5mM烟酰胺、0.1nM硫酸锌七水合物、5μg/ml运铁蛋白/Fe、5μg/ml胰岛素、10μg/ml高密度脂蛋白以及纯化的游离脂肪酸的混合物(与无脂肪酸的、高度纯化的白蛋白复合提供)的任何基础培养基(此处是RPMI 1640)组成。它的制备
在方法综述中详细给出57。另外，它可以从PhoenixSongs Biologicals(Branford,CT)商购获得。
在方法综述中详细给出57。另外，它可以从PhoenixSongs Biologicals(Branford,CT)商购获得。
[0254] 可溶性长链形式的HA(Sigma产品目录#52747)用于类器官培养物的稳定以及超低温保存。用于制备水凝胶的那些HA(硫醇改性的HA)从Biotime的子公司Glycosan
Biosciences获得。这些硫醇改性的HA的组分在ISO 9001:2000过程中使用枯草芽孢杆菌
(bacillus subtilis)作为宿主通过专有的细菌发酵过程来制备
(www.biopolymer.novozymes.com/)。这些组分由Novozymes以商品名 生产，并
且100％不含动物源性原材料和有机溶剂残留物。动物源性成分不用于生产，并且蛋白质水平非常低并且不含内毒素。生产遵循欧洲药典(European Pharmacopoeia)制定的标准。HA
水凝胶使用Glycosil( HA，ESI BIO-CG313)硫醇改性的HA来制备，可使用聚乙二
醇二丙烯酸酯(PEGDA)触发Glycosil形成二硫化物。在1％磷酸缓冲盐水(PBS)中使用脱气
水，或者在我们的情况下在库部塔培养基中将 复原为硫醇化HA的1％溶液。在复
原时，它保持液态数小时，但是如果暴露于氧气中，它可能经历一定的凝胶作用。如果用导致在几分钟内发生凝胶作用的交联剂(诸如PEGDA)来处理Glycosil，则在无温度或pH变化
的情况下会发生更精确的凝胶作用。
Biosciences获得。这些硫醇改性的HA的组分在ISO 9001:2000过程中使用枯草芽孢杆菌
(bacillus subtilis)作为宿主通过专有的细菌发酵过程来制备
(www.biopolymer.novozymes.com/)。这些组分由Novozymes以商品名 生产，并
且100％不含动物源性原材料和有机溶剂残留物。动物源性成分不用于生产，并且蛋白质水平非常低并且不含内毒素。生产遵循欧洲药典(European Pharmacopoeia)制定的标准。HA
水凝胶使用Glycosil( HA，ESI BIO-CG313)硫醇改性的HA来制备，可使用聚乙二
醇二丙烯酸酯(PEGDA)触发Glycosil形成二硫化物。在1％磷酸缓冲盐水(PBS)中使用脱气
水，或者在我们的情况下在库部塔培养基中将 复原为硫醇化HA的1％溶液。在复
原时，它保持液态数小时，但是如果暴露于氧气中，它可能经历一定的凝胶作用。如果用导致在几分钟内发生凝胶作用的交联剂(诸如PEGDA)来处理Glycosil，则在无温度或pH变化
的情况下会发生更精确的凝胶作用。
[0255] 交联水平决定了稠度水平，并且可以由硫醇改性的HA与PEGDA的比率精确定义。在先前研究中，干细胞群在不同稠度水平的HA水凝胶中测试，并且发现它们仅在稠度水平小
于200Pa的情况下保留为抗原性和功能性(即就迁移能力而言)干细胞23。我们使用这一发现结果来设计在浆膜侧具有非常软的层和更稠的层的透明质酸水凝胶的植入物，以形成在除
靶标组织之外的方向上迁移的屏障，以及使来自组织附近的细胞的粘连最小化。3种具有不同稠度水平的水凝胶型式在图2中表征，即包括流变性质的直接测量值的表征。10×HA水凝
胶(稠度＝760Pa)的最稠的屏障在基底上提前制备，如果需要可以超低温保存。在手术时，供体细胞在软质1×HA水凝胶(稠度＝60Pa)中制备；放置于更稠的10×水凝胶(已经在基底
上)中；并且补片栓系至靶标部位。在栓系后，使用具有BD Micro-FineTM IV永久附接针的NORM-JECT 4010.200V0塑料注射器用2×HA水凝胶(稠度＝106Pa)涂覆或涂布植入物的浆
膜侧。
于200Pa的情况下保留为抗原性和功能性(即就迁移能力而言)干细胞23。我们使用这一发现结果来设计在浆膜侧具有非常软的层和更稠的层的透明质酸水凝胶的植入物，以形成在除
靶标组织之外的方向上迁移的屏障，以及使来自组织附近的细胞的粘连最小化。3种具有不同稠度水平的水凝胶型式在图2中表征，即包括流变性质的直接测量值的表征。10×HA水凝
胶(稠度＝760Pa)的最稠的屏障在基底上提前制备，如果需要可以超低温保存。在手术时，供体细胞在软质1×HA水凝胶(稠度＝60Pa)中制备；放置于更稠的10×水凝胶(已经在基底
上)中；并且补片栓系至靶标部位。在栓系后，使用具有BD Micro-FineTM IV永久附接针的NORM-JECT 4010.200V0塑料注射器用2×HA水凝胶(稠度＝106Pa)涂覆或涂布植入物的浆
膜侧。
[0256] 使用应力控制的锥板流变仪(TA Instruments，AR-G2，40mm圆锥直径，1°角)来确定水凝胶的大规模流变性质。凝胶在流变仪上活性聚合，同时以1rad/s的频率和0.6Pa应力幅度振荡，并连续监测模量，以查询交联反应是否充分完成。一旦平衡，即可使水凝胶经受振荡频率扫描(应力幅度：0.6Pa，频率范围：0.01-100Hz)。所用的3种透明质酸水凝胶的粘弹性(流变)性质汇总于图2。
[0257] 最常用的供体细胞来源于如上文所述的转基因H2B-GFP猪。它们提供了用于细胞移植研究的显著优点，因为所有细胞都用GFP标记。荧光蛋白作为分子标签的用途允许在移植后的迁移和植入中追踪供体细胞。该融合蛋白靶向核小体，从而产生细胞核/染色质GFP
信号。在所描述的植入物中，干细胞在整个细胞核中表达GFP，但是限制于成体细胞类型的那些谱系可以在细胞质或细胞核中具有GFP。注意细胞质GFP水平在第一周特别高并且随时
间推移而降低。这是因为植入/侵袭/整合过程导致对细胞产生影响，从而可以导致H2B连接的GFP在细胞质中存在。这并不意味着细胞正在死亡，而是意味着它们对作为重塑区的一部分的高水平MMP和相关信号传导作出反应。实际上，所检测的GFP+细胞都明显具有活力并增殖，它们都表达各种成体功能(例如白蛋白、HNF4a、AFP、胰岛素、胰高血糖素或淀粉酶)。
信号。在所描述的植入物中，干细胞在整个细胞核中表达GFP，但是限制于成体细胞类型的那些谱系可以在细胞质或细胞核中具有GFP。注意细胞质GFP水平在第一周特别高并且随时
间推移而降低。这是因为植入/侵袭/整合过程导致对细胞产生影响，从而可以导致H2B连接的GFP在细胞质中存在。这并不意味着细胞正在死亡，而是意味着它们对作为重塑区的一部分的高水平MMP和相关信号传导作出反应。实际上，所检测的GFP+细胞都明显具有活力并增殖，它们都表达各种成体功能(例如白蛋白、HNF4a、AFP、胰岛素、胰高血糖素或淀粉酶)。
[0258] 如在植入物的表征中更详细地描述，鉴于波长与GFP重叠，成熟肝细胞中的基底(春绿色)以及脂褐素(暗森林绿色)二者的自体荧光提出了挑战。所以，申请人使用GFP的抗体和具有红色荧光探针的抗体的二抗将GFP+信号转换为粉红色或玫瑰色。这会导致干细胞
被识别为具有粉红色细胞核的小细胞(细胞核蓝色DAPI染色与抗体标记的玫瑰色GFP+标记
的合并色)。成熟为肝细胞的任何供体细胞被识别为具有来自绿色自体荧光(脂褐素)、蓝色(DAPI)和玫瑰色(GFP)的合并色淡紫色(图4)。
被识别为具有粉红色细胞核的小细胞(细胞核蓝色DAPI染色与抗体标记的玫瑰色GFP+标记
的合并色)。成熟为肝细胞的任何供体细胞被识别为具有来自绿色自体荧光(脂褐素)、蓝色(DAPI)和玫瑰色(GFP)的合并色淡紫色(图4)。
[0259] 猪肝外胆系组织(胆囊、总管、肝管)从转基因猪获得。用灭菌不锈钢锤敲打组织，以除去实质细胞，小心地保持肝内和肝外胆管的连接。然后用“细胞洗涤”缓冲液洗涤胆系，-9所述缓冲液由补充有抗生素、0.1％血清白蛋白和1nM硒(10 M)的无菌、无血清基础培养基
组成。然后用十字解剖刀机械分离胆系，并将聚集体酶解分散于补充有0.1％牛血清白蛋白(BSA)、1nM硒、300U/ml IV型胶原蛋白酶、0.3mg/ml脱氧核糖核酸酶(DNA酶)和抗生素的
RPMI-1640中的细胞悬浮液中。消化在32℃不断搅拌下进行30-60分钟。大多数组织需要两
轮消化，然后在4℃下以1100rpm离心。将细胞沉淀组合并重悬于细胞洗涤剂中。在4℃下以
30G离心细胞悬浮液5分钟以除去红细胞。将细胞沉淀再次重悬于细胞洗涤剂中，滤过40μm尼龙细胞滤网(Becton Dickenson Falcon#352340)，并用新鲜的细胞洗涤剂洗涤。测定细
胞数量并使用台盼蓝评估活力。常规观察到细胞活力大于90％-95％。
组成。然后用十字解剖刀机械分离胆系，并将聚集体酶解分散于补充有0.1％牛血清白蛋白(BSA)、1nM硒、300U/ml IV型胶原蛋白酶、0.3mg/ml脱氧核糖核酸酶(DNA酶)和抗生素的
RPMI-1640中的细胞悬浮液中。消化在32℃不断搅拌下进行30-60分钟。大多数组织需要两
轮消化，然后在4℃下以1100rpm离心。将细胞沉淀组合并重悬于细胞洗涤剂中。在4℃下以
30G离心细胞悬浮液5分钟以除去红细胞。将细胞沉淀再次重悬于细胞洗涤剂中，滤过40μm尼龙细胞滤网(Becton Dickenson Falcon#352340)，并用新鲜的细胞洗涤剂洗涤。测定细
胞数量并使用台盼蓝评估活力。常规观察到细胞活力大于90％-95％。
[0260] 在先前研究中，申请人定义了间充质细胞群的抗原谱，所述抗原谱提供了肝脏和胆系干细胞所需的关键旁分泌信号与成熟实质细胞所需的其他信号。与BTSC搭配的间充质
细胞是不含MHC抗原、具有低侧向散射的亚群，并且可被鉴定为成血管细胞(CD117+、CD133+、VEGF受体+和CD31阴性)、内皮的前体(CD133+、VEGF受体+和CD31+)和星状细胞的前体
(CD146+、ICAM1+、VCAM+、α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)+和维生素A阴性)。这3个亚群统称为早期谱系期间充质细胞(ELSMC)。相比之下，成体肝细胞与成熟窦状内皮(CD31+++、IV型胶原蛋白+、VEGF受体+和CD117阴性)以及针对与成熟星状和基质细胞(ICAM-1+、ASMA+、维生素A++、I型胶原蛋白+)相关的成体胆管上皮细胞的那些细胞相关。
细胞是不含MHC抗原、具有低侧向散射的亚群，并且可被鉴定为成血管细胞(CD117+、CD133+、VEGF受体+和CD31阴性)、内皮的前体(CD133+、VEGF受体+和CD31+)和星状细胞的前体
(CD146+、ICAM1+、VCAM+、α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)+和维生素A阴性)。这3个亚群统称为早期谱系期间充质细胞(ELSMC)。相比之下，成体肝细胞与成熟窦状内皮(CD31+++、IV型胶原蛋白+、VEGF受体+和CD117阴性)以及针对与成熟星状和基质细胞(ICAM-1+、ASMA+、维生素A++、I型胶原蛋白+)相关的成体胆管上皮细胞的那些细胞相关。
[0261] 将细胞悬浮液添加至多孔平底细胞培养板(Corning#353043)的无血清库部塔培养基中，并且在37℃下温育～一小时，以促进成熟间充质细胞的贴壁。即使培养基是无血清的，成熟间充质细胞也在10-15分钟内贴壁至培养皿。将保留在悬浮液中的细胞转移至另一个培养皿，并再次温育最多一小时。重复该步骤以剔除大部分成熟间充质细胞。在成熟间充质细胞剔除后，将其余的漂浮细胞以～2×105个细胞/孔接种于Corning的超低贴壁培养皿
(Corning#3471)中的无血清库部塔培养基中，并且在CO2培养箱中37℃下温育过夜。类器官由胆系干细胞(BTSC)和过夜形成的ELMSC组成(图1)。这些类器官培养物在库部塔培养基中
存活数周，尤其是在培养基补充(0.1％)有HA的可溶性形式(Sigma)的情况下；它们也可以
如下文所述超低温保存。我们从每克新生猪胆系组织获得～1.5×107个细胞。在6孔超低贴
5
壁板中，我们使用～3-6×10 个细胞/孔，并且在无血清库部塔培养基中温育。细胞平均产
生6000至20,000个小类器官(～50-100个细胞/类器官/孔)。对于植入物，我们使用至少
100,000个类器官(>107个细胞)。根据基底的大小，申请人能够使植入物中的类器官数量增加至最多108个类器官(即～109个细胞)，或进一步包埋于3cm×4.5cm基底上的～1ml软质透
明质酸水凝胶中。
(Corning#3471)中的无血清库部塔培养基中，并且在CO2培养箱中37℃下温育过夜。类器官由胆系干细胞(BTSC)和过夜形成的ELMSC组成(图1)。这些类器官培养物在库部塔培养基中
存活数周，尤其是在培养基补充(0.1％)有HA的可溶性形式(Sigma)的情况下；它们也可以
如下文所述超低温保存。我们从每克新生猪胆系组织获得～1.5×107个细胞。在6孔超低贴
5
壁板中，我们使用～3-6×10 个细胞/孔，并且在无血清库部塔培养基中温育。细胞平均产
生6000至20,000个小类器官(～50-100个细胞/类器官/孔)。对于植入物，我们使用至少
100,000个类器官(>107个细胞)。根据基底的大小，申请人能够使植入物中的类器官数量增加至最多108个类器官(即～109个细胞)，或进一步包埋于3cm×4.5cm基底上的～1ml软质透
明质酸水凝胶中。
[0262] 分离的干细胞类器官超低温保存于CS10中，CS10是含有抗冻因子、葡聚糖和DMSO的等渗超低温保存缓冲液(Bioliife,Seattle,Washington；https://www.stemcell.com/
products/cryostor-cs10.html)。通过0.1％HA的补充物(Sigma#52747)进一步改善了细胞
的活力。超低温保存使用CryoMedTM程控冷冻仪进行。解冻时的活力大于90％，解冻后的细胞能够贴壁，从而离体和体内扩增并且体外和体内产生预期的成熟细胞。
products/cryostor-cs10.html)。通过0.1％HA的补充物(Sigma#52747)进一步改善了细胞
的活力。超低温保存使用CryoMedTM程控冷冻仪进行。解冻时的活力大于90％，解冻后的细胞能够贴壁，从而离体和体内扩增并且体外和体内产生预期的成熟细胞。
[0263] 细胞分离和植入物组装在图1的示意图中表征，细节汇总于图2中。通过使用基底(表1)形成植入物，所述基底上放置有包埋于软质透明质酸水凝胶中的干细胞类器官。这些植入物可以很容易地提前制备并且在培养箱中的培养皿中维持过夜。在整个实验过程中，
植入物在靶标部位表现稳定。类器官的超低温保存可以很容易地实现，但是当在软质水凝
胶内时，类器官的超低温保存则未必。这意味着必须在手术前将类器官包埋于软质水凝胶
中。
植入物在靶标部位表现稳定。类器官的超低温保存可以很容易地实现，但是当在软质水凝
胶内时，类器官的超低温保存则未必。这意味着必须在手术前将类器官包埋于软质水凝胶
中。
[0264] 手术
[0265] 通过施用静脉内注射的开他敏/甲苯噻嗪(各2-3mg/kg体重)的组合或肌肉内注射的20mg/kg开他敏加上2gm/kg甲苯噻嗪来诱导麻醉，并且通过经由闭环气体麻醉单元施用
氧气和异氟烷来维持麻醉。
氧气和异氟烷来维持麻醉。
[0266] 将动物置于背卧位，并从剑突至耻骨切下腹部。通过交替的碘擦洗和醇溶液来无菌制备皮肤。在进入手术室后，使用无菌技术重复皮肤的制备，用局部碘溶液覆盖该区域，然后覆盖无菌手术单。外科医生使用适当的无菌技术。从剑突开始，通过皮肤、通过皮下组织和白线作一中腹切口，并向尾部延伸8-12cm。使左肝分裂暴露，并将3×4.5cm补片植入物施用于肝脏的腹部表面，所述补片植入物含有1×HA(～60Pa)，包埋的类器官放置于含有10
×HA(～760Pa)的基底上，并且补片放置为直接接触肝包膜的表面。使用4-6条简单、间断的
4-0聚丙烯缝合线将补片植入物缝合至肝脏。然后用2ml 2×HA水凝胶(～106Pa)处理植入
物的暴露表面，所述水凝胶的稠度水平足以允许其涂布或涂覆于植入物的浆膜侧；它被用
于使来自邻近组织的粘连最小化。在放置手术植入物后，使用0-PDS通过简单连续缝合线来使白线闭合。用肌肉内注射的2mg/kg 0.5％布比卡因来阻断白线。分别用连续的2-0PDS和
3-0Monocryl缝合线来使皮下组织和皮肤闭合。将组织粘合剂放置于皮肤表面。
×HA(～760Pa)的基底上，并且补片放置为直接接触肝包膜的表面。使用4-6条简单、间断的
4-0聚丙烯缝合线将补片植入物缝合至肝脏。然后用2ml 2×HA水凝胶(～106Pa)处理植入
物的暴露表面，所述水凝胶的稠度水平足以允许其涂布或涂覆于植入物的浆膜侧；它被用
于使来自邻近组织的粘连最小化。在放置手术植入物后，使用0-PDS通过简单连续缝合线来使白线闭合。用肌肉内注射的2mg/kg 0.5％布比卡因来阻断白线。分别用连续的2-0PDS和
3-0Monocryl缝合线来使皮下组织和皮肤闭合。将组织粘合剂放置于皮肤表面。
[0267] 从转基因猪至接受者的植入移植物是同种异体的，所以需要免疫抑制。所用的免疫抑制方案是由其他人建立的方案。从手术前24小时开始，所有猪都接受口服剂量的免疫
抑制性药物他克莫司(Tacrolimus)(0.5mg/kg)和霉酚酸(Mycophenolate)(500mg)每天两
次。在整个实验期间连续给予药物。如果这些药物与动物喜欢的食物混合，则可以容易地给予动物。
抑制性药物他克莫司(Tacrolimus)(0.5mg/kg)和霉酚酸(Mycophenolate)(500mg)每天两
次。在整个实验期间连续给予药物。如果这些药物与动物喜欢的食物混合，则可以容易地给予动物。
[0268] 所有动物均在指定的时间点通过开他敏/甲苯噻嗪镇静和异氟烷麻醉来实施人道安乐死，然后静脉内注射致死剂量的戊巴比妥钠。在确认死亡后，仔细解剖尸体，取出靶标器官，并放置于冷却的库部塔培养基中，以运输到实验室。除肝脏之外，还收集肺、心脏、肾和脾，并固定于10％中性福尔马林中。
[0269] 植入物的表征
[0270] 在48+小时的固定后，将组织样品放置于标记盒中的70％乙醇中，并在Leica ASP300S组织处理器中在60度下以长循环处理大约10小时。在过夜处理完成后，使用Leica EG1160包埋机包埋样品。用蜡填充模具，并将样品以正确的方向放置，以便收集所需的切
片。将盒冷却，直到块和组织样品可以作为一个单元从模具中取出。使用Leica RM2235切片机将块切成5微米切片；切片漂浮于水浴中，并放置载玻片上。在染色前允许载玻片风干过夜。使用Richard Allan科学组织学产物品按照制造商推荐的方案对切片进行苏木精和伊
红(H&E；试剂#7211和#7111)或Masson’s三色(Masson’s三色染色：蓝色胶原蛋白试剂盒#
87019)染色；该方案已编程到Leica Autostainer XL中。
片。将盒冷却，直到块和组织样品可以作为一个单元从模具中取出。使用Leica RM2235切片机将块切成5微米切片；切片漂浮于水浴中，并放置载玻片上。在染色前允许载玻片风干过夜。使用Richard Allan科学组织学产物品按照制造商推荐的方案对切片进行苏木精和伊
红(H&E；试剂#7211和#7111)或Masson’s三色(Masson’s三色染色：蓝色胶原蛋白试剂盒#
87019)染色；该方案已编程到Leica Autostainer XL中。
[0271] 组织在OCT中包埋和冷冻，在-20℃下速冻以进行冷冻切片。按照上文所述的方案对冷冻切片进行IHC染色。对于免疫荧光，将冷冻切片在室温下解冻1小时，然后根据抗体说明书固定于10％缓冲甲醛、丙酮或甲醇中。在固定后，在1％磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤切片3次，然后用溶于PBS的2.5％马血清在室温下阻断1小时。添加在溶于PBS的10％山羊血清中稀释的一抗，并在4℃下温育过夜。第二天早晨，用PBS冲洗切片3次，并用在溶于PBS的
2.5％马血清中稀释的二抗在室温下温育2小时。使用Zeiss CLSM 710光谱共聚焦激光扫描
显微镜(Carl Zeiss Microscopy)来采集图像。抗体在表3中列出。
2.5％马血清中稀释的二抗在室温下温育2小时。使用Zeiss CLSM 710光谱共聚焦激光扫描
显微镜(Carl Zeiss Microscopy)来采集图像。抗体在表3中列出。
[0272] 对于图5中的图像，根据标准方案，用苏木精-伊红和天狼星红对切片(3μm)进行染色。对于免疫组织化学，通过在甲醇过氧化氢(2.5％)中温育30min来阻断内源性过氧化物酶活性。如供应商所述，通过在室温下施加蛋白酶K(代码S3020，Dako,Glostrup,Denmark)
10min来回收抗原。然后在4℃下将切片与一抗(泛细胞角蛋白，Dako，代码：Z0622，稀释度：
1:100；Sox9，Millipore，编码：AB5535，稀释度：1:200)一起温育过夜。用PBS冲洗样品两次
5min，用生物素酰化二抗(LSAB+System-HRP，代码K0690；Dako,Glostrup,Denmark)，然后用链霉亲和素-HRP(LSAB+System-HRP，代码K0690，Dako,Glostrup,Denmark)在室温下温育
20min。二氨基联苯胺(Dako,Glostrup,Denmark)作为底物，并用苏木精(PMID:29248458)对切片进行复染。对于免疫荧光，非特异性蛋白结合通过5％正常山羊血清来阻断。将样本与一抗(鸡抗GFP，Abcam，代码：ab13970，稀释度＝1:200；兔抗HNF4α，Abcam，代码：92378，稀释度：1:50，兔抗白蛋白，ab2406，稀释度＝1:500)一起在4℃下温育过夜。用标记的同种型特异性二抗(抗鸡AlexaFluor-546、抗小鼠Alexafluor-488、抗兔Alexafluor-488，
Invitrogen,Life Technologies Ltd,Paisley,UK)洗涤样本和温育1h，并用4,6-二脒基-
2-苯基吲哚(DAPI)复染以显示细胞核(PMID:26610370)。对于所有免疫反应，还包括阴性对照(一抗被替换为免疫前血清)。通过配备有Jenoptik Prog Res C10Plus摄像头(Jena,
Germany)的Leica Microsystems DM 4500B光和荧光显微镜检查(Leica Microsystems,
Weltzlar,Germany)以编码方式检查切片。另外通过共聚焦显微镜检查(Leica TCS-SP2)来
分析免疫荧光染色。载玻片使用图像分析系统(IAS-Delta Sistemi,Roma-Italy)进一步处
理，并且由两名研究人员以盲评方式进行独立评估。免疫荧光染色通过数字扫描仪(Aperio Scanscope FL System,Aperio Technologies,Inc,Oxford,UK)扫描并由ImageScope处理。
10min来回收抗原。然后在4℃下将切片与一抗(泛细胞角蛋白，Dako，代码：Z0622，稀释度：
1:100；Sox9，Millipore，编码：AB5535，稀释度：1:200)一起温育过夜。用PBS冲洗样品两次
5min，用生物素酰化二抗(LSAB+System-HRP，代码K0690；Dako,Glostrup,Denmark)，然后用链霉亲和素-HRP(LSAB+System-HRP，代码K0690，Dako,Glostrup,Denmark)在室温下温育
20min。二氨基联苯胺(Dako,Glostrup,Denmark)作为底物，并用苏木精(PMID:29248458)对切片进行复染。对于免疫荧光，非特异性蛋白结合通过5％正常山羊血清来阻断。将样本与一抗(鸡抗GFP，Abcam，代码：ab13970，稀释度＝1:200；兔抗HNF4α，Abcam，代码：92378，稀释度：1:50，兔抗白蛋白，ab2406，稀释度＝1:500)一起在4℃下温育过夜。用标记的同种型特异性二抗(抗鸡AlexaFluor-546、抗小鼠Alexafluor-488、抗兔Alexafluor-488，
Invitrogen,Life Technologies Ltd,Paisley,UK)洗涤样本和温育1h，并用4,6-二脒基-
2-苯基吲哚(DAPI)复染以显示细胞核(PMID:26610370)。对于所有免疫反应，还包括阴性对照(一抗被替换为免疫前血清)。通过配备有Jenoptik Prog Res C10Plus摄像头(Jena,
Germany)的Leica Microsystems DM 4500B光和荧光显微镜检查(Leica Microsystems,
Weltzlar,Germany)以编码方式检查切片。另外通过共聚焦显微镜检查(Leica TCS-SP2)来
分析免疫荧光染色。载玻片使用图像分析系统(IAS-Delta Sistemi,Roma-Italy)进一步处
理，并且由两名研究人员以盲评方式进行独立评估。免疫荧光染色通过数字扫描仪(Aperio Scanscope FL System,Aperio Technologies,Inc,Oxford,UK)扫描并由ImageScope处理。
[0273] 鉴于肝细胞的高自体荧光(脂褐素)和Seri-Silk基底的荧光，冷冻切片是有问题的。通过制备石蜡切片并使用GFP的兔多克隆抗体(Novus Biologicals,NE600-308)对GFP
进行染色，申请人获得了更大的成功；兔抗GFP抗体与驴抗兔IgG H&L二抗(Alexa Fluor
568；ab175470,Invitrogen)组合使用，而驴抗山羊IgG Alexa Fluor 488抗体用于排除肝
脏自体荧光的非特异性染色。通过使用包括台盼蓝的染料淬灭来减少自体荧光。台盼蓝以
0.4％溶于PBS用于组织/细胞。这显著减少了背景。
进行染色，申请人获得了更大的成功；兔抗GFP抗体与驴抗兔IgG H&L二抗(Alexa Fluor
568；ab175470,Invitrogen)组合使用，而驴抗山羊IgG Alexa Fluor 488抗体用于排除肝
脏自体荧光的非特异性染色。通过使用包括台盼蓝的染料淬灭来减少自体荧光。台盼蓝以
0.4％溶于PBS用于组织/细胞。这显著减少了背景。
[0274] 使用Trizol(Invitrogen)从类器官或植入物提取总RNA。使用Primescript第1链cDNA合成试剂盒(Takara)合成的第一链cDNA被用作PCR扩增的模板。使用Faststart通用探
针模板(Roche Diagnostics)与ABI PRISM 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)来
进行mRNA水平的定量分析。引物在通用探针文库测定设计中心(Universal Probe Library Assay Design Center)(Roche Applied Science)设计。引物序列在表4中列出。引物在50
℃下退火2min，并在95℃下处理10min，然后进行40个循环的95℃(15s)和60℃(1min)。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达通常作为对照和标准品。
针模板(Roche Diagnostics)与ABI PRISM 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)来
进行mRNA水平的定量分析。引物在通用探针文库测定设计中心(Universal Probe Library Assay Design Center)(Roche Applied Science)设计。引物序列在表4中列出。引物在50
℃下退火2min，并在95℃下处理10min，然后进行40个循环的95℃(15s)和60℃(1min)。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达通常作为对照和标准品。
[0275] 使用Qiagen RNeasy试剂盒从细胞纯化RNA，RNA完整性(RIN)分析使用Agilent 2000生物分析仪来进行。使用Illumina TruSeq标准mRNA制备试剂盒来产生cDNA文库，并在Illumina HiSeq 2500平台上进行测序。对每个泳道的两个样品进行测序，对于所有样品
(一个流动池)，这些样品占据总共8个泳道。使用FastQ来完成质量控制分析。通过
MapSplice2使用默认参数来进行序列读段至人类基因组(hg19)的绘图。转录物定量通过
RSEM分析来进行，DESeq用于归一化基因表达和鉴定差异表达的基因。MapSplice2还用于检测候选融合转录物。融合识别基于跨越候选融合连接点的读段的深度和复杂性。使用皮尔
逊(Pearson’s)相关性分析来比较基因表达谱，并且在R中进行层次聚类。按照DESeq包装中提供的差异稳定化转化来进行层次聚类。使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件来
进行通路富集分析。仅对基因进行差异基因表达分析，其中在至少一个种类中最小平均归
一化计数>50。
(一个流动池)，这些样品占据总共8个泳道。使用FastQ来完成质量控制分析。通过
MapSplice2使用默认参数来进行序列读段至人类基因组(hg19)的绘图。转录物定量通过
RSEM分析来进行，DESeq用于归一化基因表达和鉴定差异表达的基因。MapSplice2还用于检测候选融合转录物。融合识别基于跨越候选融合连接点的读段的深度和复杂性。使用皮尔
逊(Pearson’s)相关性分析来比较基因表达谱，并且在R中进行层次聚类。按照DESeq包装中提供的差异稳定化转化来进行层次聚类。使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件来
进行通路富集分析。仅对基因进行差异基因表达分析，其中在至少一个种类中最小平均归
一化计数>50。
[0276] 使用Student’s双尾t检验来计算样品之间的统计学显著性差异，结果以平均值±标准偏差(SD)表示。小于0.05的P值被认为具有统计学显著性。
[0277] 结果
[0278] 在关于注射植入的先前研究中，发现植入需要上皮细胞与它们的谱系期合适的间充质细胞搭配物的共移植。对于肝脏干细胞和胆系干细胞，这些间充质细胞由成血管细胞
(CD117+、CD133+、VEGFr+、CD31阴性)及其直接后代、内皮的前体(CD133+、VEGFr+、CD31+、温韦伯氏因子+)和星状细胞的前体(CD146+、ICAM-1+、α-平滑肌肌动蛋白+(ASMA)、维生素A阴性)组成。申请人是指统称为早期谱系期间充质细胞(ELSMC)的这些细胞。申请人使用分离
的猪间充质干细胞(MSC)也获得了部分成功，所述MSC通过其他以及从新生猪肝脏分离细胞
的方法来制备。
(CD117+、CD133+、VEGFr+、CD31阴性)及其直接后代、内皮的前体(CD133+、VEGFr+、CD31+、温韦伯氏因子+)和星状细胞的前体(CD146+、ICAM-1+、α-平滑肌肌动蛋白+(ASMA)、维生素A阴性)组成。申请人是指统称为早期谱系期间充质细胞(ELSMC)的这些细胞。申请人使用分离
的猪间充质干细胞(MSC)也获得了部分成功，所述MSC通过其他以及从新生猪肝脏分离细胞
的方法来制备。
[0279] 在先前研究中，申请人使用多参数流式细胞术实现了分离匹配的上皮和间充质细胞期，以确定细胞悬浮液中的上皮和间充质细胞的谱系期搭配物的比率，然后通过免疫选
择的细胞来使用那些比率。在这些研究中，申请人发现通过重复淘选程序，然后在低贴壁培养皿上和无血清库部塔培养基中培养其余的细胞悬浮液6-8小时来剔除成熟间充质细胞的
细胞悬浮液是更有效的。类器官自组装，每个聚集体含有大约50-100个细胞。标记物分析表明BTSC与ELSMC搭配(图1)。如图1A中的示意图所汇总，它们可以立即使用或在此前确定的
限定条件下低温保存，并根据需要解冻以用于植入。使用免疫荧光(IF)、qRT-PCR和RNA-seq来表征BTSC/ELSMC的类器官，并且显示出表达BTSC(图1)和ELSMC(数据未示出)的经典性
状。类器官中的BTSC不表达成熟肝脏或胰腺基因，但是表达低水平的多能性基因(例如
OCT4、SOX2)和内胚层干细胞基因(例如EpCAM、SOX 9、SOX17、PDX1、LGR5、CXCR4、MAFA、NGN3和NIS)。代表性qRT-PCR测定法确认了在移植之前针对细胞的来自IF和来自IHC的发现结果
(图1D)。IHC测定法表明，更原始的细胞(例如表达多能性基因的细胞)分布于类器官的内部以及周边的后期成熟谱系期(例如表达EpCAM或白蛋白的细胞)(图1C)。
择的细胞来使用那些比率。在这些研究中，申请人发现通过重复淘选程序，然后在低贴壁培养皿上和无血清库部塔培养基中培养其余的细胞悬浮液6-8小时来剔除成熟间充质细胞的
细胞悬浮液是更有效的。类器官自组装，每个聚集体含有大约50-100个细胞。标记物分析表明BTSC与ELSMC搭配(图1)。如图1A中的示意图所汇总，它们可以立即使用或在此前确定的
限定条件下低温保存，并根据需要解冻以用于植入。使用免疫荧光(IF)、qRT-PCR和RNA-seq来表征BTSC/ELSMC的类器官，并且显示出表达BTSC(图1)和ELSMC(数据未示出)的经典性
状。类器官中的BTSC不表达成熟肝脏或胰腺基因，但是表达低水平的多能性基因(例如
OCT4、SOX2)和内胚层干细胞基因(例如EpCAM、SOX 9、SOX17、PDX1、LGR5、CXCR4、MAFA、NGN3和NIS)。代表性qRT-PCR测定法确认了在移植之前针对细胞的来自IF和来自IHC的发现结果
(图1D)。IHC测定法表明，更原始的细胞(例如表达多能性基因的细胞)分布于类器官的内部以及周边的后期成熟谱系期(例如表达EpCAM或白蛋白的细胞)(图1C)。
[0280] 通过此前建立的方法将来自补片植入物的结果与来自注射植入物进行比较，所述方法由细胞注射组成，并且通过使用聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)来触发透明质酸在几分
钟内胶凝来定位至部位。植入物注入猪肝脏实质会导致基本上100％植入，但是具有最小
(如果有的话)迁移并且向宿主组织的整合会在几周内慢慢出现(数据未示出)。这些发现结
17
果类似于此前使用肝脏干细胞的注射植入物观察到的那些 。通过大管将植入物注入紧邻
肝脏叶尾部的肝脏管/门静脉分支附近的肠系膜是可行的，但是会导致较小者被HA水凝胶
的溶胀作用阻塞并且导致胆汁郁积(图13)。补片植入物的成功使我们放弃了使用注射植入
策略的进一步工作。
钟内胶凝来定位至部位。植入物注入猪肝脏实质会导致基本上100％植入，但是具有最小
(如果有的话)迁移并且向宿主组织的整合会在几周内慢慢出现(数据未示出)。这些发现结
17
果类似于此前使用肝脏干细胞的注射植入物观察到的那些 。通过大管将植入物注入紧邻
肝脏叶尾部的肝脏管/门静脉分支附近的肠系膜是可行的，但是会导致较小者被HA水凝胶
的溶胀作用阻塞并且导致胆汁郁积(图13)。补片植入物的成功使我们放弃了使用注射植入
策略的进一步工作。
[0281] 针对干细胞的植入物的组合物涉及使用具有3个独特层的透明质酸(HA)水凝胶的条件，其中HA与PEGDA的精确浓度用于实现通过流变测定法评估的稠度水平(图2C)。供体细胞包埋于软质HA层(～100Pa)中，并且紧贴肝脏/胰腺表面放置；在这些研究中软质水凝胶
维持干性性状23证明对于植入是重要的。该层放置于稠质(10×；～700Pa)HA层之上，所述稠质HA层在基底上提前制备并且作为迁移的屏障。使用缝合线或手术胶将补片附接至靶标部
位。2×HA水凝胶足够软(稠度＝～200Pa)，以允许在手术时涂布或涂覆于植入物的浆膜表
面，并且用于使组织附近的粘连最小化。
维持干性性状23证明对于植入是重要的。该层放置于稠质(10×；～700Pa)HA层之上，所述稠质HA层在基底上提前制备并且作为迁移的屏障。使用缝合线或手术胶将补片附接至靶标部
位。2×HA水凝胶足够软(稠度＝～200Pa)，以允许在手术时涂布或涂覆于植入物的浆膜表
面，并且用于使组织附近的粘连最小化。
[0282] 补片植入物放置于肝脏表面，即格利森氏囊或胰腺囊的表面，并且通过缝合线或通过手术胶在角上附接(图2F)。Seri-Silk的稠度导致植入物放置于具有最小弯曲的部位
并且远离具有较大机械力的部位(例如靠近隔膜)。在植入胰腺的植入物中，植入物楔入十
二指肠和胰腺之间。
并且远离具有较大机械力的部位(例如靠近隔膜)。在植入胰腺的植入物中，植入物楔入十
二指肠和胰腺之间。
[0283] 尝试然后放弃唯一的补片植入物变体在手术彻底除去囊之后。鉴于血清对供体细胞的不良影响，出血过多地避免了将来在具有与肝衰竭相关的止血改变的宿主中，或甚至
在正常宿主中的使用。如果没有改变器官囊的此类工作，补片植入物就容易进行手术程序。
在正常宿主中的使用。如果没有改变器官囊的此类工作，补片植入物就容易进行手术程序。
[0284] 尝试了很多基底，重点在于在腹部手术中临床使用的基底(表1和表2)。除Seri-Silk之外均会导致问题，这些问题会导致它们的除去，以供进一步考虑。这些问题包括易碎性(例如Seprafilm、Retroglyde)；坏死或纤维化的诱导以及显著的粘连水平(例如
Surgisis、Vetrix)；以及Seri-Silk的丝状海绵型式的严重粘附形成或腹部补充有羧甲基
纤维素(“belly jelly”)的任何基底。在所测试的那些中，SERI手术Silk24-26(Allergan,Inc.Irvine,CA)提供了机械支持和最小粘连的最佳组合，该作用在附接至靶标部位后通过
将2×HA施用于SeriSilk的浆膜表面来进一步增强。该产品是蚕蛾丝的纯化丝心蛋白并且
由David Kaplan(Tuft’s University,Boston,MA)开发。申请人发现它是稠质的，该性质被发现可用于手术操纵和放置于平坦/稠质器官(如肝脏)上。稠质使其难以施用于具有明显
弯曲或需要柔性的部位。另外，就针对供体细胞的成熟作用而言，它的稠质被证明是中性
的，这一发现结果使该基底可用于补片植入物。在3周时的植入物中，Seri-Silk被胶原蛋白带包裹，这表明产生了轻度异物反应。其他候选基底(诸如合成织物)的评估正在进行中。
Surgisis、Vetrix)；以及Seri-Silk的丝状海绵型式的严重粘附形成或腹部补充有羧甲基
纤维素(“belly jelly”)的任何基底。在所测试的那些中，SERI手术Silk24-26(Allergan,Inc.Irvine,CA)提供了机械支持和最小粘连的最佳组合，该作用在附接至靶标部位后通过
将2×HA施用于SeriSilk的浆膜表面来进一步增强。该产品是蚕蛾丝的纯化丝心蛋白并且
由David Kaplan(Tuft’s University,Boston,MA)开发。申请人发现它是稠质的，该性质被发现可用于手术操纵和放置于平坦/稠质器官(如肝脏)上。稠质使其难以施用于具有明显
弯曲或需要柔性的部位。另外，就针对供体细胞的成熟作用而言，它的稠质被证明是中性
的，这一发现结果使该基底可用于补片植入物。在3周时的植入物中，Seri-Silk被胶原蛋白带包裹，这表明产生了轻度异物反应。其他候选基底(诸如合成织物)的评估正在进行中。
[0285] 使用三色染色(图3、7)或番红O验证了在手术后第一周重塑的证据，所述番红O具有对胶原蛋白和其他胞外基质组分进行染色的染料。将用三色染色的植入物的图像(图3A-
B)与相同部位的图像进行比较，并用苏木精/伊红进行染色(图3C-D)。格利森氏囊和小叶的重建在3周时与HA的吸收平行出现。包括重塑区域的带非常大(图3-5、7)。
B)与相同部位的图像进行比较，并用苏木精/伊红进行染色(图3C-D)。格利森氏囊和小叶的重建在3周时与HA的吸收平行出现。包括重塑区域的带非常大(图3-5、7)。
[0286] 来源于转基因GFP+猪的供体细胞可以通过IHC测定法测定的GFP表达容易地鉴定。在胰腺中，通过绿色荧光来鉴定供体细胞。然而，在肝脏中，肝细胞中的脂褐素的自体荧光在与GFP的自体荧光重叠的波长处达到峰值。所以，我们用GFP的抗体(兔抗GFP抗体；Novus，NB600-308)鉴定了肝脏中的供体细胞，并偶联至具有红色荧光探针的二抗(驴抗兔555，
Invitrogen)，从而使供体细胞具有粉红色细胞核(红色荧光探针加上蓝色DAPI)。鉴于宿主细胞的蓝色细胞核(DAPI染色)，可以识别宿主细胞，但是这些宿主细胞没有GFP表达(图4)。
Invitrogen)，从而使供体细胞具有粉红色细胞核(红色荧光探针加上蓝色DAPI)。鉴于宿主细胞的蓝色细胞核(DAPI染色)，可以识别宿主细胞，但是这些宿主细胞没有GFP表达(图4)。
[0287] 成熟肝细胞的肝脏小叶为自体荧光(脂褐素)的森林绿色(图4B)。已成熟为肝细胞的聚集体的供体GFP+细胞为淡紫色，具有粉红色细胞核(图4C)，因为来自GFP的红色荧光探针、来自DAPI的蓝色和来自脂褐素的自体荧光深绿色的合并色，宿主或供体来源的肝细胞
在宿主间充质细胞(内皮、星状细胞)周围聚类，具有亮黄色/绿色自体荧光，我们认为是由于成熟星状细胞中的维生素A(图4C)；内皮和星状细胞的IHC数据未示出。
在宿主间充质细胞(内皮、星状细胞)周围聚类，具有亮黄色/绿色自体荧光，我们认为是由于成熟星状细胞中的维生素A(图4C)；内皮和星状细胞的IHC数据未示出。
[0288] 在一周内，BTSC/ELSMC类器官的补片植入物导致器官囊和邻近小叶的重塑，然后是宿主和供体细胞的合并(图3-5、7)。供体细胞的指状延伸延伸到宿主组织的肝脏小叶；平行地，宿主细胞延伸到植入物的HA(图4)。就胰腺而言，植入物楔入胰腺和十二指肠之间，并且在手术后一周，供体细胞的植入出现在胰腺和十二指肠的粘膜下层的布隆纳氏腺中(图
6)。肝脏(或胰腺)大区域内的细胞整合在2周时完成，此时HA层大部分被吸收；供体细胞具有限制到成体肝脏实质命运(胆管上皮细胞和肝细胞命运)(图5)或胰腺命运(图6)的谱系。
6)。肝脏(或胰腺)大区域内的细胞整合在2周时完成，此时HA层大部分被吸收；供体细胞具有限制到成体肝脏实质命运(胆管上皮细胞和肝细胞命运)(图5)或胰腺命运(图6)的谱系。
[0289] 在3周时，HA层被完全吸收，只留下基底。这与器官囊和囊附近的组织的组织学结构(图3、5、6)或胰腺囊和胰腺组织学结构(图6)的再现相关。在胰腺中，通过功能性标记物来鉴定成熟细胞，所述功能性标记物包括针对胰岛细胞(β细胞)的胰岛素和针对腺泡细胞
的淀粉酶。
的淀粉酶。
[0290] 在一周时，针对肝脏和针对胰腺的植入效率都接近100％，因为据发现所有鉴定的供体细胞都具有活力并且在肝脏或胰腺内；不在器官囊上的植入物的残留物中；并且具有
其他器官(例如肺)中的异位细胞分布的可忽略的证据或无证据。
其他器官(例如肺)中的异位细胞分布的可忽略的证据或无证据。
[0291] 事实证明，BTSC/ELSMC植入物中的供体细胞通过肝脏和通过胰腺的迁移速度非常大，这导致在一周结束时器官(肝脏或胰腺)的大部分区域中具有供体细胞，并且在2-3周时在整个组织(肝脏/胰腺)中具有均匀分散的细胞(图3-6)。
[0292] 多种MMP、已知可溶解胞外基质组分并且与细胞迁移相关的酶的表达升高与格利森氏囊(或胰腺囊)和邻近的肝脏小叶(或胰腺组织)的溶解和重塑相关并且与大量植入相
关。图7中汇总了针对干细胞/祖细胞与成体细胞表达的MMP的来自RNA-seq研究和IHC测定
法的数据。BTSC表达高水平的多种MMP，包括分泌形式(例如MMP2、MMP7)以及膜相关形式(例如MMP14和MMP15)。ELSMC、内皮和星状细胞的前体也有助于多种MMP。
关。图7中汇总了针对干细胞/祖细胞与成体细胞表达的MMP的来自RNA-seq研究和IHC测定
法的数据。BTSC表达高水平的多种MMP，包括分泌形式(例如MMP2、MMP7)以及膜相关形式(例如MMP14和MMP15)。ELSMC、内皮和星状细胞的前体也有助于多种MMP。
[0293] 通过针对MMP基因编码的蛋白质IHC测定法确认了来自RNA-seq数据的发现结果(图7)。IHC测定法确认存在MMP的分泌形式(例如MMP1、MMP2、MMP7、MMP9)，尤其是在重塑区中。MMP1的蛋白质表达存在于BTSC/ELSMC类器官中以及植入物的重塑区中；然而，由于缺乏将用于分析的猪MMP1的注释种类，RNA-seq发现结果的现有数据库不包括MMP1。所以，它的表达的识别基于IHC测定法。
[0294] 导致供体细胞分化的变量导致MMP表达的沉默，尤其是分泌形式，以及平行地丧失植入和迁移的潜力(数据未示出)。这些因素包括血清、已知可影响供体细胞的分化的各种
可溶性调控信号(生长因子、细胞因子、激素)、胞外基质组分(无论在水凝胶中还是在基底(尤其是含I型胶原蛋白的基底)中)以及HA水凝胶的稠度(即Pa水平)。如果ELSMC的分化优
先进展为基质，则植入物会发生纤维化；如果进展为内皮，则植入物保留有活力的细胞和组织，但是保留在器官囊的表面(数据未示出)。
可溶性调控信号(生长因子、细胞因子、激素)、胞外基质组分(无论在水凝胶中还是在基底(尤其是含I型胶原蛋白的基底)中)以及HA水凝胶的稠度(即Pa水平)。如果ELSMC的分化优
先进展为基质，则植入物会发生纤维化；如果进展为内皮，则植入物保留有活力的细胞和组织，但是保留在器官囊的表面(数据未示出)。
[0295] 针对用于植入的细胞，BTSC/ELSMC的类器官被证明是最成功的排列方式。过去，我们使用独特的表面抗原通过流式细胞术从细胞悬浮液免疫选择上皮-间充质搭配物来共移植上皮-间充质搭配物，然后根据新鲜分离的组织的细胞悬浮液中存在的比率来混合上皮-
间充质搭配物17。在这里，我们发现，在通过成熟间充质细胞的淘选除去后，使它们自选择为类器官，在建立谱系期合适的上皮-间充质搭配物(具有针对植入物的相关旁分泌信号传
导)和在确定的(无血清)条件下产生类器官(使它们能够容易和安全地低温保存)方面，被
证明更高效和有效。
间充质搭配物17。在这里，我们发现，在通过成熟间充质细胞的淘选除去后，使它们自选择为类器官，在建立谱系期合适的上皮-间充质搭配物(具有针对植入物的相关旁分泌信号传
导)和在确定的(无血清)条件下产生类器官(使它们能够容易和安全地低温保存)方面，被
证明更高效和有效。
[0296] 植入物的初步设计包括将细胞与适当的生物材料混合，所述生物材料可以成为不溶性的并且保持细胞定位于靶标部位。对于植入物，理想的生物材料被证明是在所有干细
胞龛中存在的非硫酸化的或最小硫酸化的糖胺聚糖(GAG)，诸如透明质酸(HA)，HA的受体具有经典的干细胞性状。将细胞维持为干细胞/祖细胞优化了对植入有效的分泌的和膜相关
的MMP的表达。
胞龛中存在的非硫酸化的或最小硫酸化的糖胺聚糖(GAG)，诸如透明质酸(HA)，HA的受体具有经典的干细胞性状。将细胞维持为干细胞/祖细胞优化了对植入有效的分泌的和膜相关
的MMP的表达。
[0297] 植入过程的证据在重塑区内特别明显，所述重塑区出现于植入物和宿主组织的界面处。为了验证重塑的发现结果，使用具有对胞外基质组分进行染色的染料的三色染色和
番红O，并且与苏木精/伊红染色的邻近切片平行分析(图3、7)。它证实了在手术后一周内器官囊和邻近组织的重塑。在手术后3周，这些测定法表明在HA清除后器官囊和正常组织的组织学的重建。重塑区非常大(图3、7)，尤其是在手术后一周，并且显示出涉及多种形式的MMP(图7)。
番红O，并且与苏木精/伊红染色的邻近切片平行分析(图3、7)。它证实了在手术后一周内器官囊和邻近组织的重塑。在手术后3周，这些测定法表明在HA清除后器官囊和正常组织的组织学的重建。重塑区非常大(图3、7)，尤其是在手术后一周，并且显示出涉及多种形式的MMP(图7)。
[0298] 虽然有很多HA来源和类型，但是最有用的是Glenn Prestwich(University of Utah,Salt Lake City,UT)建立的硫醇改性的HA，所述硫醇改性的HA可以通过PEGDA触发形
成具有精确生物化学和机械性质的水凝胶。HA的这些性质赋予完美的弹性，允许获取血液、淋巴或间隙液中的所有可溶性信号的植入物，并使供体细胞的成熟最小化，直到出现植入
和迁移。通过HA和PEGDA浓度的简单变化来改变流变因素的能力，在引导细胞的迁移方向和使粘连最小化方面提供了另外的优点。软质HA水凝胶(即模拟干细胞龛中的性质的水凝胶)
被允许表达干细胞/祖细胞相关MMP库。因此，HA的机械性质(在骨骼组织的功能方面已对其进行研究多年)在管理植入策略方面也是重要的23。
成具有精确生物化学和机械性质的水凝胶。HA的这些性质赋予完美的弹性，允许获取血液、淋巴或间隙液中的所有可溶性信号的植入物，并使供体细胞的成熟最小化，直到出现植入
和迁移。通过HA和PEGDA浓度的简单变化来改变流变因素的能力，在引导细胞的迁移方向和使粘连最小化方面提供了另外的优点。软质HA水凝胶(即模拟干细胞龛中的性质的水凝胶)
被允许表达干细胞/祖细胞相关MMP库。因此，HA的机械性质(在骨骼组织的功能方面已对其进行研究多年)在管理植入策略方面也是重要的23。
[0299] 含有干细胞/祖细胞的补片植入物导致了植入物在几天内“融化”到组织中的惊人现象，然后是供体和宿主细胞的合并，以及细胞在一至两周时在器官的大部分区域中的分
布。其后，供体细胞的成熟和器官囊的恢复与HA的组织清除平行出现。
布。其后，供体细胞的成熟和器官囊的恢复与HA的组织清除平行出现。
[0300] 植入和整合过程与多种MMP的表达相关联，MMP是降解胞外基质组分的钙依赖性、含锌内肽酶家族。使用RNA-seq研究，我们发现了干细胞/祖细胞相关MMP的模式，所述MMP由高水平的分泌形式(例如MMP2、MMP7)以及膜相关形式(例如MMP14、MMP15)组成。IHC测定法表明，分泌的MMP(例如MMP1、MMP2、MMP7)的蛋白质水平被发现在重塑区域中丰富表达(图
7)。导致供体细胞分化的条件(可溶性生长因子、细胞因子、血清、基质组分、机械力)使MMP(尤其是分泌形式)减少，以及平行地植入过程的消除。
7)。导致供体细胞分化的条件(可溶性生长因子、细胞因子、血清、基质组分、机械力)使MMP(尤其是分泌形式)减少，以及平行地植入过程的消除。
[0301] 植入物的生物材料(尤其是HA)已显示出离体和体内维持细胞的干性性状。因为植入物不含可触发命运确定的已知信号，所以供体细胞成熟为独特的成体命运的发现结果，
取决于植入物放置于肝脏还是胰腺上，暗示了宿主组织的局部微环境是针对成熟过程的相
关因子的逻辑来源。
取决于植入物放置于肝脏还是胰腺上，暗示了宿主组织的局部微环境是针对成熟过程的相
关因子的逻辑来源。
[0302] 可植入的细胞数量很多(>108)，并且取决于植入物的尺寸、细胞的数量以及分泌的和质膜相关的MMP库。这些发现结果与可用于血管递送或注射植入的有限数量的细胞(例
如105-106)相反。
如105-106)相反。
[0303] 补片植入物是一种安全策略，通过该策略可以将大量细胞移植到实体器官(包括内部器官)中，并且可以被证明对患者的治疗有用，尤其是在疾病条件下可以充分发生植入的情况。尽管存在如下问题：在组织发生纤维化或受到肝硬化的影响的情况下，可以发生异常植入。因此，本文提供了确定针对方法方面的补片植入物的功效的实施例。
[0304] 实施例2：肝病的治疗。
[0305] 本实施例描述了使用补片植入物来治疗患有肝脏疾病或障碍的受试者的一种示例性方法。供体细胞被制备为如本文所述的胆系干细胞(BTSC)、肝脏和胰腺的前体、由成血管细胞及其早期谱系期后代组成的早期谱系期间充质细胞(ELSMC)的聚集体、内皮的前体
和星状细胞的前体的类器官。BTSC/ELSMC类器官包埋于软质透明质酸水凝胶(<200Pa)中，
所述水凝胶放置于栓系至受试者的肝脏的靶标部位的基底上。
和星状细胞的前体的类器官。BTSC/ELSMC类器官包埋于软质透明质酸水凝胶(<200Pa)中，
所述水凝胶放置于栓系至受试者的肝脏的靶标部位的基底上。
[0306] 在施用补片植入物后，监测受试者的肝功能改善。常用的检查肝功能的测试包括但不限于丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白和胆红素测试。ALT和AST测试测量肝脏响应于损伤或疾病而释放的酶。白蛋白和胆红素测试测
量肝脏如何产生白蛋白(蛋白质)以及如何处理胆红素(血液的废产物)。预期在约2周至约
36周后，将检测到肝功能改善。通过检测一种或多种肝功能测试相对于植入物施用之前的
值的改进值和/或肝脏疾病或障碍的一种或多种症状的改进或改善来确定改善。
量肝脏如何产生白蛋白(蛋白质)以及如何处理胆红素(血液的废产物)。预期在约2周至约
36周后，将检测到肝功能改善。通过检测一种或多种肝功能测试相对于植入物施用之前的
值的改进值和/或肝脏疾病或障碍的一种或多种症状的改进或改善来确定改善。
[0307] 实施例3：胰腺疾病的治疗。
[0308] 本实施例描述了使用补片植入物来治疗患有胰腺疾病或障碍的受试者的一种示例性方法。供体细胞被制备为如本文所述的胆系干细胞(BTSC)、由成血管细胞及其早期谱
系期后代组成的早期谱系期间充质细胞(ELSMC)的聚集体、内皮的前体和星状细胞的前体
的类器官。BTSC/ELSMC类器官包埋于软质透明质酸水凝胶(<200Pa)中，所述水凝胶放置于
栓系至受试者的胰腺的靶标部位的基底上。
系期后代组成的早期谱系期间充质细胞(ELSMC)的聚集体、内皮的前体和星状细胞的前体
的类器官。BTSC/ELSMC类器官包埋于软质透明质酸水凝胶(<200Pa)中，所述水凝胶放置于
栓系至受试者的胰腺的靶标部位的基底上。
[0309] 在施用补片植入物后，监测受试者的胰腺功能改善。常用的检查胰腺功能的测试包括但不限于胰腺酶淀粉酶和脂肪酶的水平的血液测试、在施用分泌素或缩胆囊肽后的直
接胰腺功能测试、粪便弹性蛋白酶测试、使用对比染料的CT扫描、腹部超声检查、内窥镜逆行胰胆管造影术(ERCP)、内窥镜超声检查和磁共振胰胆管造影术。预期在约2周至约36周
后，将检测到胰腺功能改善。通过检测一种或多种胰腺功能测试相对于植入物施用之前的
值的改进值和/或胰腺疾病或障碍的一种或多种症状的改进或改善来确定改善。
接胰腺功能测试、粪便弹性蛋白酶测试、使用对比染料的CT扫描、腹部超声检查、内窥镜逆行胰胆管造影术(ERCP)、内窥镜超声检查和磁共振胰胆管造影术。预期在约2周至约36周
后，将检测到胰腺功能改善。通过检测一种或多种胰腺功能测试相对于植入物施用之前的
值的改进值和/或胰腺疾病或障碍的一种或多种症状的改进或改善来确定改善。
[0310] 实施例4：肾脏疾病的治疗。
[0311] 本实施例描述了使用补片植入物来治疗患有肾脏疾病或障碍的受试者的一种示例性方法。供体细胞被制备为如本文所述的胆系干细胞(BTSC)、由成血管细胞及其早期谱
系期后代组成的早期谱系期间充质细胞(ELSMC)的聚集体、内皮的前体和星状细胞的前体
的类器官。BTSC/ELSMC类器官包埋于软质透明质酸水凝胶(<200Pa)中，所述水凝胶放置于
栓系至受试者的肾脏的靶标部位的基底上。
系期后代组成的早期谱系期间充质细胞(ELSMC)的聚集体、内皮的前体和星状细胞的前体
的类器官。BTSC/ELSMC类器官包埋于软质透明质酸水凝胶(<200Pa)中，所述水凝胶放置于
栓系至受试者的肾脏的靶标部位的基底上。
[0312] 在施用补片植入物后，监测受试者的肾功能改善。常用的检查胰腺功能的测试包括但不限于本领域已知的肾脏功能的临床相关终点。预期在约2周至约36周后，将检测到肾功能改善。通过检测一种或多种肾功能测试相对于植入物施用之前的值的改进值和/或胰
腺疾病或障碍的一种或多种症状的改进或改善来确定改善。
腺疾病或障碍的一种或多种症状的改进或改善来确定改善。
[0313] 实施例5：胃肠道疾病的治疗。
[0314] 本实施例描述了使用补片植入物来治疗患有胃肠道疾病或障碍的受试者的一种示例性方法。供体细胞被制备为如本文所述的胆系干细胞(BTSC)、由成血管细胞及其早期
谱系期后代组成的早期谱系期间充质细胞(ELSMC)的聚集体、内皮的前体和星状细胞的前
体的类器官。BTSC/ELSMC类器官包埋于软质透明质酸水凝胶(<200Pa)中，所述水凝胶放置
于栓系至受试者的肠的靶标部位的基底上。
谱系期后代组成的早期谱系期间充质细胞(ELSMC)的聚集体、内皮的前体和星状细胞的前
体的类器官。BTSC/ELSMC类器官包埋于软质透明质酸水凝胶(<200Pa)中，所述水凝胶放置
于栓系至受试者的肠的靶标部位的基底上。
[0315] 在施用补片植入物后，监测受试者的肠功能改善。常用的检查肠功能的测试包括但不限于本领域已知的肠功能的临床相关终点。预期在约2周至约36周后，将检测到肠功能改善。通过检测一种或多种肠功能测试相对于植入物施用之前的值的改进值和/或胃肠道
疾病或障碍的一种或多种症状的改进或改善来确定改善。
疾病或障碍的一种或多种症状的改进或改善来确定改善。
[0316] 说明书附件
[0317] 表1-4 Patch Grafts(补片植入物)2018
[0318]
[0319]
[0320]
[0321]
[0322]
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