通过抑制α蛋白激酶1治疗炎症和相关疾病和病症的方法
阅读：538发布：2020-05-11
专利汇可以提供通过抑制α蛋白激酶1治疗炎症和相关疾病和病症的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开提供涉及抑制α-激酶1(ALPK1)来 治疗 炎症 和炎症性 疾病 、病症和病况，以及治疗自身免疫疾病、由细菌感染引起的疾病或病症、或癌症的方法。，下面是通过抑制α蛋白激酶1治疗炎症和相关疾病和病症的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于治疗需要此类治疗的受试者中的炎症的方法，该方法包括向该受试者施用α-激酶1(ALPK1)抑制剂。
2.一种用于治疗炎症性疾病、病症或病况的方法，该方法包括向需要此类治疗的受试者施用α-激酶1(ALPK1)抑制剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述炎症性疾病或病症选自由于过度产生促炎性细胞因子的炎症性肠病、关节炎、肥胖症、辐射诱导的炎症、银屑病、T细胞介导的超敏性疾病、过敏性疾病、特应性皮炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、阿尔茨海默氏病、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性甲状腺炎(格雷夫氏病)、多发性硬化症、强直性脊柱炎和大疱病。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述炎症性疾病或病症选自炎症性肠病、关节炎、肥胖症和辐射诱导的炎症。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述炎症性肠病选自克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述ALPK1抑制剂是激酶抑制剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述激酶抑制剂是1-苄基-3-十六烷基-2-甲基-
1H-咪唑-3-碘化盐，或其其他卤素盐。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述ALPK1抑制剂是针对ALPK1的抗体或抗ALPK1-Fc融合蛋白。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述ALPK1抑制剂是ALPK1反义多核苷酸。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述ALPK1抑制剂是针对ALPK1的干扰RNA，该干扰RNA选自微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)。
11.一种药物组合物，其包含权利要求7所述的激酶抑制剂，和载剂或赋形剂。
12.一种ALPK1的抑制剂，其供在治疗有需要的受试者中的炎症的方法中使用。
13.一种ALPK1的抑制剂，其供在治疗炎症性疾病、病症或病况的方法中使用，该炎症性疾病、病症或病况选自由于过产生促炎性细胞因子的炎症性肠病、关节炎、肥胖症、辐射诱导的炎症、银屑病、T细胞介导的超敏性疾病、过敏性疾病和特应性皮炎。
14.权利要求12所述的ALPK1的抑制剂，用于治疗炎症性肠病、关节炎、肥胖症或辐射诱导的炎症的方法中。
15.权利要求13所述的ALPK1的抑制剂，用于治疗克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的方法中。
16.权利要求11所述的药物组合物，其供在治疗炎症性疾病、病症或病况的方法中使用，该炎症性疾病、病症或病况选自由于过产生促炎性细胞因子的炎症性肠病、关节炎、肥胖症、辐射诱导的炎症、银屑病、T细胞介导的超敏性疾病、过敏性疾病和特应性皮炎。
17.权利要求11所述的药物组合物，其供在治疗克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的方法中使用。
18.一种用于治疗需要此类治疗的受试者中的自身免疫疾病、由细菌感染引起的疾病或病症、或癌症的方法，该方法包含括向该受试者施用α-激酶1(ALPK1)抑制剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法是治疗癌症的方法。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述癌症选自软组织肉瘤、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、恶性血液病、成胶质细胞瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、梅克尔细胞癌、小肠癌、甲状腺癌、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、胃癌、胃肠道间质瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、肝癌、白血病、淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、脑癌和多发性骨髓瘤。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法是用于治疗自身免疫疾病的方法。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述自身免疫疾病选自系统性血管炎、肾小球肾炎(链球菌感染后肾小球肾炎)、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、银屑病性关节炎、痛风、痛风性关节炎、反应性关节炎、感染性休克、格雷夫斯氏病、古德帕斯丘综合征(Goodpasture syndrome)、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性肌炎、恶性贫血、乳糜泻、湿疹、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性心肌炎、乳糜泻、幼年特发性关节炎、格雷夫氏眼病、风湿性多肌痛、自身免疫性葡萄膜炎、局限性脱发、wegener、白癜风、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬变，自身免疫性肝炎、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barré syndrome)、抗磷脂综合征、结节病疼痛、局限性脱发、郎伯肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)、自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素病、温自身免疫性溶血性贫血、嗜酸性肉芽肿伴多血管炎(丘-施二氏综合征(Churg-Strauss syndrome))和贝切特氏病(Behcet's disease)。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法是用于治疗由细菌感染引起的疾病或病症的方法。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述疾病或病症选自慢性感染、败血病和细胞因子风暴。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述疾病或病症是由选自奈瑟氏菌属
(Neisseria)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏杆菌属(Shigella)、弧菌属(Vibrio)、缠绕杆菌属(Helicobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、博德特氏菌属(Bordetella)、弗朗西丝菌属(Francisella)、巴斯德菌属(Pasteurella)、包柔螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、耶尔森菌属(Yersinia)、立克次氏体(Rickettsia)、密螺旋体属(Treponema)、衣原体(Chlamydia)和布鲁氏杆菌属(Brucella)的细菌引起的。
通过抑制α蛋白激酶1治疗炎症和相关疾病和病症的方法
发明领域
[0001] 本发明涉及通过抑制α蛋白激酶1(ALPK1)治疗炎症和相关疾病和病症的方法。
[0002] 发明背景
[0004] α激酶代表一种新型的蛋白激酶超家族，与常规蛋白激酶表现出很少的序列相似性。已经鉴定了总共六种α激酶成员，包括α-蛋白激酶1(ALPK1)、ALPK2、ALPK3、延伸的因子-2激酶(eEF2K)、和瞬时受体电位阳离子通道M6和M7(TRPM6和TRPM7)。Ryazanov AG等,CurrBiol 1999,9(2):R43-45；Ryazanov AG等,Proc Natl AcadSci USA 1997,94(10):
4884-4889。
4884-4889。
[0005] ALPK1被鉴定为上皮细胞中含有筏(raft)的蔗糖异构酶(SI)囊泡的新组成。Heinet M等，J.Biol.Chem.(2005)280(27):25637-25643。已表明了ALPK1使肌球蛋白1磷酸化，并在胞外转运至顶端质膜中起至关重要的作用。在小鼠中转座子插入的ALPK1纯合子失活性突变导致运动协调缺陷，其可通过过表达全长ALPK1来补救。Chen M等，(2011)BMC Neurosci.12:1。
[0006] 几项遗传学相关性研究表明ALPK1有痛风风险，尽管并非所有已鉴定的多态性都能在所有群体中复制。Wang SJ等，(2011)J.Mol.Med.89:1241-1251；Ko AM等，(2013)J.Intl.Epidemiol.42:466-474；Chiba T等，(2015)Human Cell 28:1-4。其他遗传学相关性研究将ALPK1视为慢性肾病、心肌梗塞和糖尿病的风险因素。Yamada Y等(2013)J Med Genet 50:410-418；Fujimaki T等,(2014)Biomed Report。2:127-131；Shimotaka S等,(2013)Biomed Report.1:940-944；Yamada Y等，(2015)Biomed.ReportDOI:10.3892/br.2015.439。
[0007] 额外的功能研究已经表明ALPK1参与免疫应答。例如，通过促进TIFA寡聚化和对福氏志贺氏杆菌(S.flexneri)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)的感染的应答而促进IL-8表达，ALPK1被认为是针对细菌的固有免疫的调节剂。Milivojevic M等，(2017)PLoS Pathog 13(2):e1006224。在小鼠ALPK1中过表达ALPK1导致了更低的睾酮水平，增加的促炎性细胞因子IL-1β和TGF-β的产生，这表明ALPK1和睾酮之间的平衡可能在睾酮介导的抑制促炎性细胞因子中起作用。Kuo TM等，(2015)J Steroid BiochemMolBiol(2015)154:150-158。最近，显示出肌球蛋白IIA与ALPK1相互作用，调节痛风发作中的TNF运输。Lee CP等,(2016)Sci.Report 6:25740。
[0008] 在某些癌症中也已发现了ALPK1表达和突变，所述癌症包括肺癌、结直肠癌和乳腺癌。Liao HF等(2016)Scientific Reports.6:27350；Strietz J等,(2016)Oncotarget 1-16。
[0009] 在高血糖症的小鼠模型，ALPK1的过度表达加速了多种早期肾病。Kuo TM等,(2016).BiochimkaBiophysikaActa 1862:2034-2042。
[0010] 有许多疾病、病症和病况的临床表现是由过度和/或慢性炎症造成的。需要用于抑制和/或减少靶组织中的炎症以治疗此类疾病、病症和病况的新方法。本公开解决了此需求。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明部分地基于以下发现：抑制ALPK1可有效降低若干不同的炎症动物模型中的炎症及其临床效应，以及减少不同人和鼠细胞系中促炎性细胞因子的产生。因此，本公开提供了治疗需要此类治疗的受试者中的炎症的方法，该方法包括向该受试者施用ALPK1抑制剂。本公开还提供了用于治疗炎症性疾病、病症或病况的方法，该方法包括向需要此类治疗的受试者施用ALPK1抑制剂。在实施方案中，所述炎症性疾病、病症或病况的特征在于慢性或过度炎症。
[0013] 在实施方案中，所述炎症性疾病或病症选自由于过度产生促炎性细胞因子导致的炎症性肠病、关节炎、肥胖症、痛风、辐射诱导的炎症、银屑病、心血管疾病、糖尿病、包括肺、结肠和乳腺的癌症的上皮癌、T细胞介导的超敏性疾病、过敏性疾病、特应性皮炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、阿尔茨海默氏病、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性甲状腺炎(格雷夫氏病)、多发性硬化症、强直性脊柱炎和大疱病。
[0014] 在实施方案中，所述炎症性疾病或病症选自炎症性肠病、关节炎、肥胖症和辐射诱导的炎症。在实施方案中，所述炎症性肠病选自克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。
[0015] 在实施方案中，所述ALPK1抑制剂是激酶抑制剂。在实施方案中，所述激酶抑制剂是1-苄基-3-十六烷基-2-甲基-1H-咪唑-3-碘化盐，或其其他卤素盐。
[0016] 在实施方案中，所述ALPK1抑制剂是针对ALPK1的抗体或抗ALPK1-Fc融合蛋白。
[0017] 在实施方案中，所述ALPK1抑制剂是ALPK1反义多核苷酸。在实施方案中，所述ALPK1抑制剂是针对ALPK1的干扰RNA，该干扰RNA选自微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)。
[0018] 在实施方案中，本公开还提供了一种药物组合物，其包含ALPK1抑制剂和载剂或赋形剂，供在本文所述的方法中使用。在实施方案中，所述ALPK1抑制剂是激酶抑制剂。在实施方案中，所述激酶抑制剂是1-苄基-3-十六烷基-2-甲基-1H-咪唑-3-碘化盐，或其其他卤素盐。在实施方案中，所述药物组合物经配制用于通过口或直肠途径递送。在实施方案中，所述药物组合物被配制成片剂或胶囊形式的口服剂型。在实施方案中，所述药物组合物被配制成软膏、栓剂或灌肠剂形式的直肠剂型。在实施方案中，所述药物组合物被配制成肠胃外剂型。在实施方案中，所述肠胃外剂量适用于通过静脉内、动脉内或肌肉内途径的施用，例如通过注射水性液体。
[0019] 本公开还提供了用于治疗需要此类治疗的受试者中的自身免疫疾病、由细菌感染引起的疾病或病症、或癌症的方法，该方法包括向该受试者施用α-激酶1(ALPK1)抑制剂。
[0020] 在所述方法是治疗癌症的方法的实施方案中，所述癌症可选自肺癌、结直肠癌和乳腺癌。
[0021] 在所述方法是用于治疗自身免疫疾病的方法的实施方案中，所述自身免疫疾病可选自系统性血管炎、肾小球肾炎(链球菌感染后肾小球肾炎)、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、银屑病性关节炎、痛风、痛风性关节炎、反应性关节炎、感染性休克、格雷夫斯氏病、古德帕斯丘综合征、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性肌炎、恶性贫血、乳糜泻、湿疹、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性心肌炎、乳糜泻、幼年特发性关节炎、格雷夫氏眼病、风湿性多肌痛、自身免疫性葡萄膜炎、局限性脱发、wegener(wegener)、白癜风、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性肝炎、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome)、抗磷脂综合征、结节病疼痛、局限性脱发、郎伯肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)、自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素病、温自身免疫性溶血性贫血、嗜酸性肉芽肿伴多血管炎(丘-施二氏综合征(Churg-Strauss syndrome))和贝切特氏病(Behcet's disease)。
[0022] 在所述方法是用于治疗由细菌感染引起的疾病或病症的方法的实施方案中，所述疾病或病症可选自慢性感染、败血病和细胞因子风暴。在实施方案中，所述疾病或病症可以是由选自奈瑟氏菌属(Neisseria)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏杆菌属(Shigella)、弧菌属(Vibrio)、缠绕杆菌属(Helicobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、博德特氏菌属(Bordetella)、弗朗西丝菌属(Francisella)、巴斯德菌属(Pasteurella)、包柔螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、耶尔森菌属(Yersinia)、立克次氏体(Rickettsia)、密螺旋体属(Treponema)、衣原体(Chlamydia)和布鲁氏杆菌属(Brucella)的细菌引起的。
[0024] 图1：失活性ALPK1突变赋予了对DSS诱导的结肠炎的抵抗力。体重百分比变化(％)，三角形，野生型(WT)；菱形，杂合突变体(HE)；正方形，纯合突变体(HO)。
[0025] 图2A-B：失活性ALPK1突变赋予了对辐射诱导的重量减轻(A(y-轴显示百分比重量变化))和致命性(B(y-轴显示存活))的抵抗力。
[0026] 图3：失活性ALPK1突变赋予了对高脂肪饮食诱导的肥胖症的抵抗力。“HFD”是指“高脂肪饮食处理的”，y-轴显示百分比重量变化。
[0027] 图4A-B：失活性ALPK1突变赋予了对胶原诱导的关节炎的抵抗力。A，ALPK1突变体雄性足垫(footpad)RA得分。B，ALPK1突变体雄性左右后足垫厚度差异。
[0028] 图5：通过siRNA敲低ALPK1导致HEK293T细胞中细胞因子表达降低。
[0029] 图6A-B：A，敲低HEK293T细胞中的ALPK1导致在福氏志贺氏杆菌细胞裂解物诱导和人和鼠ALPK1的过表达后细胞因子的表达降低。B，测量IL8表达以显示通过标记-ALPK1、小鼠ALPK1、6*His-ALPK1-3*标记、6*His-ALPK1进行高效的IL8表达，而非通过6*His-ALPK1-E突变体。ALPK1可补救受损的细胞因子表达，但不针对激酶死亡突变体。
[0030] 图7A-B：CRISPR/Cas9敲除HEK293T细胞中的ALPK1导致在福氏志贺氏杆菌细胞裂解物诱导后细胞因子表达和分泌降低。A，对野生型HEK293T对照归一化的相对表达。B，福氏志贺氏杆菌细胞裂解物诱导后4小时，HEK293T条件培养基中的IL8浓度。
[0031] 图8：敲低HEK293细胞中的ALPK1导致在福氏志贺氏杆菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞裂解物诱导后细胞因子的表达降低。
[0032] 图9A-B：在LPS诱导(A)和无LPS诱导(B)的情况下，通过短发夹RNA(shRNA)敲低THP-1巨噬细胞中ALPK1导致促炎性细胞因子的表达降低。
[0033] 图10A-B：通过shRNA敲低THP-1巨噬细胞中的ALPK1导致TNFα(Α)和IL1β(Β)的分泌的抑制。
[0034] 图11：通过siRNA敲低MDA-MB-468人乳腺癌细胞系巨噬细胞中的ALPK1导致TNFα、IL1β和IL8的表达减少
[0035] 图12A-B：在LPS的存在(A)或缺少(B)下通过shRNA敲低RAW264.7鼠巨噬细胞样细胞系中的ALPK1导致细胞因子表达降低。
[0036] 图13：在从携带失活性ALPK1突变的小鼠分离的骨髓衍生的巨噬细胞中促炎性细胞因子表达是降低的。
[0037] 图14：ALPK1抑制剂MI6C改善DSS诱导的结肠炎模型中的恢复。从第0天至第5天用3％DDS处理小鼠，然后变为饮用水处理，用溶解在DMSO中的MI6C(1mg/kg)(n＝6)或仅DMSO(n＝5)每日IP注射。Y-轴显示相对于第0天的重量变化，X-轴显示时间(天数)。
[0038] 图15A-D：ALPK1突变降低MMTV-PyVT乳腺癌模型中的肿瘤生长和转移。在每组中，携带ALPK1突变的小鼠通过深色柱形表示，且模拟转基因对照由浅色柱形表示。A，乳腺肿瘤出现龄；B，乳腺肿瘤出现后10周时的乳腺肿瘤负荷；C，乳腺肿瘤出现后10周时肺肿瘤数目(从乳腺肿瘤的转移)；D，乳腺肿瘤发作后10周时的肺重量(从乳腺肿瘤的转移)。
[0039] 图16：人ALPK1同种型1的氨基酸序列。同种型2的序列与同种型1区别如下：
[0040] 1-92:MNNQKVVAVL...VIGAGLQQLL→MCRKRTRARTSAAE
[0041] 发明详述
[0042] 本发明部分地基于以下发现：ALPK1是多种炎症细胞和动物模型中炎症应答的有效诱导剂，使得其抑制有效抑制炎症并减轻其有害作用。因此，本公开提供了用于通过向需要此类治疗的受试者施用ALPK1抑制剂或通过例如使用基因治疗方法抑制该受试者中的ALPK1来治疗炎症和治疗其特征在于过度和/或慢性炎症的疾病、病症和病况的方法，以及治疗自身免疫疾病、由细菌感染引起的疾病和病症、和癌症的方法以及相关的组合物。
[0043] 除非文本明确提及特定的同种型，否则本文中使用的术语“ALPK1”可互换地指由UniProtKB-Q96QP1(ALPK1_HUMAN)鉴定的人序列的同工型1(Q96QP1-1)或可替换的剪接变体同种型2(Q96QP1-2)。参见图16和SEQ ID NO:1。同种型2与同种型1区别如下：
[0044] 1-92:MNNQKVVAVL...VIGAGLQQLL→MCRKRTRARTSAAE。
[0045] 在实施方案中，所述炎症性疾病或病症选自由于过度产生促炎性细胞因子导致的炎症性肠病、关节炎、肥胖症、痛风、辐射诱导的炎症、银屑病、心血管疾病、糖尿病、包括肺、结肠和乳腺的癌症的上皮癌、T细胞介导的超敏性疾病、过敏性疾病和特应性皮炎。
[0046] 在实施方案中，所述炎症性疾病或病症选自炎症性肠病、关节炎、肥胖症和辐射诱导的炎症。在实施方案中，所述炎症性肠病选自克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。
[0047] 在实施方案中，所述自身免疫疾病选自系统性血管炎、肾小球肾炎(链球菌感染后肾小球肾炎)、干燥综合征、银屑病性关节炎、痛风、痛风性关节炎、反应性关节炎、感染性休克、格雷夫斯氏病、古德帕斯丘综合征、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性肌炎、恶性贫血、乳糜泻、湿疹、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性心肌炎、乳糜泻、幼年特发性关节炎、格雷夫氏眼病、风湿性多肌痛、自身免疫性葡萄膜炎、局限性脱发、wegener、白癜风、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性肝炎、吉兰-巴雷综合征、抗磷脂综合征、结节病疼痛、局限性脱发、郎伯肌无力综合征、自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素病、温自身免疫性溶血性贫血、嗜酸性肉芽肿伴多血管炎(丘-施二氏综合征)和贝切特氏病。
[0048] 在实施方案中，所述由细菌感染引起的疾病或病症选自慢性感染、败血病和细胞因子风暴。在实施方案中，所述疾病或病症是由选自奈瑟氏菌属、埃希氏杆菌属、克雷白氏杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏杆菌属、弧菌属、缠绕杆菌属、假单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、嗜血杆菌属、摩拉克氏菌属、博德特氏菌属、弗朗西丝菌属、巴斯德菌属、包柔螺旋体属、弯曲杆菌属、耶尔森菌属、立克次氏体、密螺旋体属、衣原体和布鲁氏杆菌属的细菌引起的。
[0049] 在实施方案中，所述癌症选自软组织肉瘤、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、恶性血液病、成胶质细胞瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、梅克尔细胞癌、小肠癌、甲状腺癌、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、胃癌、胃肠道间质瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、肝癌、白血病、淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、脑癌和多发性骨髓瘤。
[0050] 在实施方案中，所述ALPK1抑制剂是激酶抑制剂。在一个实施方案中，所述激酶抑制剂是1-苄基-3-十六烷基-2-甲基-1H-咪唑-3-(也称为NH-125，CAS 278603-08-0，其在本文中可称作MI6或MI6C)：
[0051] 在实施方案中，所述ALPK1抑制剂是1-苄基-3-十六烷基-2-甲基-1H-咪唑-3-的卤素盐。在实施方案中，所述卤素选自氟、氯、溴、碘和砹。在实施方案中，所述卤素是碘。
[0052] 在实施方案中，所述ALPK1抑制剂是针对ALPK1的抗体或抗ALPK1-Fc融合蛋白。在实施方案中，所述抗体是全人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体、单链Fv(scFv)、二硫化物连接的Fv(sdFv)、Fab片段或前述任一的抗原结合片段。一般术语‘抗体’包括免疫球蛋白分子及其抗原结合活性片段，即，含有抗原结合位点的分子。此类片段可以或可以不与另一免疫球蛋白域融合，该另一免疫球蛋白域包括，但不限于，Fc区或其片段。抗原结合片段包括，例如，Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。这些片段缺少完整抗体的重链恒定片段(Fc)，且有时是优选的，因为它们比完整抗体易于从循环中更快速地清除，且具有较少的非特异性结合。使用本领域中已知的方法，例如通过用诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)和胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段)的酶进行蛋白水解切割，从完整抗体产生此类片段。优选地，抗原结合片段是重链(骆驼抗体)、单链Fvs(scFv)、二硫化物连接的Fv(sdFv)、Fab片段或F(ab')片段的二聚体。本领域技术人员将会将理解，可以生成其他融合产物，包括但不限于，scFv-Fc融合物、可变区(例如，VL和VH)-Fc融合物和scFv-scFv-Fc融合物。免疫球蛋白分子可以是任何型的，包括IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY，以及可以是任何类的，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，或可以是任何亚类的。
[0053] 优选地，用于本文所述方法中的治疗用途的抗体是单克隆抗体，优选为IgG抗体。单克隆抗体衍生自对特定抗原特异的基本上同源的抗体群，该群含有基本上相似的表位结合位点。此类抗体可以是任何免疫球蛋白类(包括IgG、IgM、IgE、IgA)的，及其任何亚类的抗体。用于单克隆抗体产生的方法在本领域中是已知的，例如，杂交瘤技术。在实施方案中，所述抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体，或其抗原结合片段，优选是，当其被施用至受试者时表现出低毒性的抗体，所述受试者优选为人受试者。
[0054] 在实施方案中，所述ALPK1抑制剂是ALPK1反义多核苷酸。在实施方案中，所述ALPK1抑制剂是针对ALPK1的干扰RNA，该干扰RNA选自微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)。
[0055] 在实施方案中，基因治疗方法可用于抑制ALPK1。在实施方案中，所述基因治疗方法可包括使用基因编辑技术在ALPK1中引入失活性突变。在实施方案中，所述基因编辑技术可包括基于大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas-9的基因编辑技术。
[0056] 在本文所述的方法的上下文中，术语“治疗”可以指改善或稳定与所治疗的疾病、病症或病况相关联的一种或多种症状。术语“治疗”还可涵盖疾病、病症或病况的管理，其是指受试者从疗法中获得的有益效果，但该疗法不会导致潜在疾病、病症或病况的治愈。在本公开的上下文中，术语“预防”是指预防疾病、病症或病况的一种或多种症状的复发、发展、进展或发作。
[0057] 在治疗有效量的组合物被施用至受试者的实施方案中，所述治疗有效量是足以实现期望的治疗结果(例如改善或稳定所治疗的疾病、病症或病况的一种或多种症状)的量，或在预防的上下文中，是足以实现该疾病、病症或病况的一种或多种症状的复发、发展、进展或发作的预防的量。
[0058] 在实施方案中，治疗有效量是与标准疗法相比实现至少等同治疗效果所需的量。标准疗法的实例是FDA批准的指示用于治疗相同疾病、病症或病况的药物。
[0059] 在本文所述的任何方法的上下文中，所述受试者优选是人，但可以是非人哺乳动物，优选为非人灵长类动物。在其他实施方案中，非人哺乳动物可以是，例如，狗、猫、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔子)、马、牛、绵羊、山羊或任何其他非人哺乳动物。
[0060] 在实施方案中，所述人受试者选自成年人类、小儿人类或老年人类，因为这些术语是执业医师所理解的，例如如由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)定义的。
[0061] 在实施方案中，本公开提供了小有机分子形式的ALPK1抑制剂(例如，1-苄基-3-十六烷基-2-甲基-1H-咪唑-3-碘化盐或其其他卤素盐)，或大生物分子形式的ALPK1抑制剂，诸如蛋白质(例如，针对ALPK1的抗体或其Fc片段)或核酸(例如，针对ALPK1的反义多核苷酸，或干扰RNA诸如微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。在本公开的上下文中，通用术语“化合物”意在涵盖小有机分子和大生物分子二者。
[0062] 在实施方案中，本公开提供了包含ALPK1抑制剂和一种或多种赋形剂或载剂(优选为药学上可接受的赋形剂或载剂)的组合物。如本文所用的，词组“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏性应答或其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相称的那些化合物、物质、组合物、载剂和/或剂型。用于制备药物组合物的赋形剂是当被使用至人或动物体时已知安全且无毒的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的实例包括，不限于，无菌液体、水、缓冲的盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、油、去垢剂、混悬剂、碳水化合物(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖或右旋糖酐)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质以及前述任何物质的合适混合物。组合物中利用的特定的赋形剂将取决于多种因素，包括所配制的化合物的化学稳定性和可溶性以及预期的施用途径。
[0063] 药物组合物可以以散装或单位剂型提供。为了易于施用和剂量均匀，以单位剂型配制药物组合物是特别有利的。术语“单位剂型”是指物理上离散的单位，其适合作为针对待治疗的受试者的单位剂量；每个单位含有预定量的活性化合物，该活性化合物经计算可与所需的药物载剂缔合以产生期望的治疗效果。单位剂型可以是安瓿、小瓶、栓剂、糖衣丸(dragee)、片剂、胶囊、IV袋或气雾剂吸入器上的单个泵。
[0064] 在治疗应用中，剂量可取决于活性化合物的化学和物理性质以及受试者的临床特征，包括例如年龄、体重和共病。通常，剂量应为治疗有效量。如临床医师或其他有资格的观察者所指出的，药物组合物的有效量是提供客观可识别的改善的量。例如，缓解病症、疾病或病况的症状。
[0065] 药物组合物可以采取任何合适的形式(例如液体、气雾剂、溶液、吸入剂、雾、喷雾剂；或固体、粉末、软膏剂、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、贴剂等)通过任何期望的途径(例如，肺、吸入、鼻内、口服、含服、舌下，肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、胸膜内、鞘内、经皮、经粘膜、直肠等)施用。在实施方案中，所述药物组合物是口服可接受剂型的形式，包括但不限于，以乳液、水性混悬液、分散体或溶液形式的胶囊、片剂、含服剂、糖锭剂(troche)/锭剂(lozenge)和口服液。胶囊可含有赋形剂，诸如惰性填充剂和/或稀释剂，包括淀粉(例如玉米、马铃薯或木薯淀粉)、糖、人造甜味剂、粉末状纤维素(诸如结晶和微晶纤维素)、面粉、明胶，树胶等。在供口服使用的片剂的情况中，常用的载剂包括乳糖和淀粉。也可以添加润滑剂，诸如硬脂酸镁。
[0066] 在实施方案中，所述药物组合物是片剂形式的。该片剂可包含单位剂量的本文所述的化合物连同惰性稀释剂或载剂，诸如糖或糖醇，例如乳糖、蔗糖、山梨醇或甘露糖醇。该片剂可进一步包含非糖衍生的稀释剂，诸如碳酸钠、磷酸钙、碳酸钙或纤维素或其衍生物，诸如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和淀粉，例如玉米淀粉。该片剂可进一步包含粘合剂和制粒剂，诸如聚乙烯吡咯烷酮、崩解剂(例如可溶胀的交联聚合物，诸如交联的羧甲基纤维素)、润滑剂(例如硬脂酸酯)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯)、抗氧化剂(例如丁基化羟基甲苯)、缓冲剂(例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)和泡腾剂，诸如柠檬酸盐/碳酸氢盐混合物。该片剂可以是包衣片剂。包衣可以是保护膜包衣(例如蜡或涂剂)或设计用于控制活性化合物的释放的包衣，例如延迟释放(在摄入后预定的滞后时间后释放活性剂)或在胃肠道的特定位置处释放。后者可以例如通过使用肠溶薄膜包衣(诸如以商品名销售的肠溶薄膜包衣)来实现。
[0067] 片剂配制剂可通过以下制备：常规压片、湿法制粒或干法制粒方法，并利用药学上可接受的稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、表面改性剂(包括表面活性剂)、悬浮剂或稳定剂，包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微晶纤维素、羧甲基纤维素钙、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、藻酸，阿拉伯树胶、黄原胶、柠檬酸钠、复合硅酸盐、碳酸钙、甘氨酸，糊精，蔗糖，山梨醇，磷酸二钙，硫酸钙，乳糖，高岭土，甘露醇，氯化钠，滑石粉，干淀粉和糖粉。优选的表面改性剂包括非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性实例包括但不限于泊洛沙姆188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、十六醇十八醇混合物(cetostearyl alcohol)、聚西托醇乳化蜡、山梨坦酯、胶体二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、硅酸镁铝和三乙醇胺。
[0068] 在实施方案中，所述药物组合物为硬或软明胶胶囊的形式。根据此配制剂，本发明的化合物可以是固体、半固体或液体形式。
[0069] 在实施方案中，所述药物组合物为适于肠胃外给药的无菌水性溶液或分散体形式。如本文所用的术语肠胃外包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。
[0070] 在实施方案中，所述药物组合物为适于通过直接注射或通过添加至用于静脉内输注的无菌输注液体来施用的无菌水性溶液或分散体形式，并且包含含有水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、其合适的混合物或一种或多种植物油的分散介质。溶液或分散体可在共溶剂或表面活性剂的帮助下在水中制备。适合的表面活性剂的实例包括聚乙二醇(PEG)-脂肪酸和PEG-脂肪酸单酯和二酯、PEG甘油酯、醇-油酯交换产物、聚甘油脂肪酸、丙二醇脂肪酸酯、固醇和固醇衍生物、聚乙二醇脱水山梨醇脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚、糖及其衍生物、聚乙二醇烷基酚、聚氧乙烯-聚氧丙烯(POE-POP)嵌段共聚物、山梨糖醇酐脂肪酸酯、离子型表面活性剂，脂溶性维生素及其盐，水溶性维生素及其两亲性衍生物，氨基酸及其盐以及有机酸及其酯和酸酐。分散体也可以在例如甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备。
[0071] 在实施方案中，本文所述的化合物或组合物可以以单一疗法或辅助疗法施用。在实施方案中，本文所述的化合物或组合物可以单独施用或与一种或多种额外的治疗剂(即额外的API)或疗法(例如作为包括例如，饮食和运动方面)的治疗方案的一部分)组合施用。在实施方案中，本文所述的方法包括施用ALPK1抑制剂作为主要疗法。在其他实施方案中，施用ALPK1抑制剂是辅助疗法。在任一情况中，本发明的方法预期将ALPK1抑制剂与一种或多种额外的治疗剂和/或疗法组合施用，以治疗或预防本文所述的疾病、病症或病况。术语“疗法(therapy、therapies)”是指可用于预防、治疗、管理疾病、病症或病况，或改善其一种或多种症状的任何方法、方案和/或药剂。
[0072] 本公开还提供包含供本文所述的方法使用的药物组合物的包装和试剂盒。该试剂盒可包含一种或多种选自瓶、小瓶、安瓿、泡罩包装和注射器的容器。该试剂盒可进一步包括一个或多个使用说明书、一个或多个注射器、一个或多个涂药器(applicator)、或适于重塑本文所述的化合物或组合物的无菌溶液。
[0073] 除非另有说明，否则本文中使用的所有百分比和比率均以重量计。
[0074] 通过以下非限制性实施例进一步描述和例证了本发明。实施例
[0075] 下列实施例证明了抑制ALPK1可直接或间接地有效治疗炎症。
[0076] 实施例1：失活性ALPK1突变赋予了对DSS诱导的结肠炎的抵抗力
[0077] 右旋糖酐硫酸酯钠(DSS)诱导的结肠炎的鼠模型用于评估通过失活性突变抑制ALPK1(靶向内含子中的两个位点(一个在外显子13之前，一个在外显子13之后)的CRISPR载体被注射到已受精的小鼠胚胎中以产生缺失了外显子13的ALPK1小鼠突变体。外显子13(其编码ALPK1的激酶域的一部分)的缺失杀伤ALPK的激酶活性，可以改善炎症性肠病，诸如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。DSS处理导致结肠上皮细胞破裂并诱发结肠炎，这进而导致体重减轻。重量减轻被用作疾病进展的指标。先前已经例如在Okayasu H等,1990中描述了此模型系统。简而言之，用溶解在高压灭菌的饮用水中的2％DSS(MW 40K-50K,MP BIOANALYTICAL)处理8-9周龄的雌性小鼠7天。每天且在试验期结束时称重小鼠。所有数据均表示为平均值±平均值的标准偏差(SEM)。实验组为ALPK1野生型(WT)(n＝3)；杂合(HE)失活性ALPK1突变(n＝2)；纯合(HO)失活性ALPK1突变(n＝3)。
[0078] 结果：在DSS诱导的结肠炎模型(体重减轻)中，失活性ALPK1突变在疾病进展/严重性的所有三种测量中均显示出保护效果(图1)。
[0079] 实施例2：失活性ALPK1突变赋予了对辐射诱导的炎症的抵抗力
[0080] 辐射诱导的炎症的鼠模型用于评估通过失活性突变抑制ALPK1是否可以改善辐射诱导的炎症。辐射刺激免疫系统，激活炎症性应答。先前已经例如在Biju G等.,2012中描述了此模型系统。简而言之，在第1天，8-9周龄的雌性小鼠中每只小鼠进行9戈瑞(Gy)全身辐射(来自Co60的伽玛射线)照射一次。每天测量动物存活和重量。辐射导致胃肠和造血系统的损害。肠道菌群易位并伴有免疫系统受损可引起败血症和死亡。
[0081] 实验组为ALPK1野生型(WT)(n＝4)；杂合(HE)失活性ALPK1突变(n＝6)；和纯合(HO)失活性ALPK1突变(n＝5)。在此研究中，仅杂合突变对辐射诱导的体重减轻(图2A)和致命性(图2B)显示出防护效果。
[0082] 实施例3：失活性ALPK1突变赋予了对高脂肪饮食的肥胖症的抵抗力
[0083] 高脂肪饮食诱导的肥胖症的鼠模型用于评估通过失活性突变抑制ALPK1是否可以改善此模型系统中的炎症。肥胖与许多慢性疾病共有炎症性组成的存在，这是代谢疾病发展的原因。此炎症性状态反映在促炎症性蛋白循环水平的增加上。高脂肪饮食(HFD)喂养可在啮齿类动物中诱发肥胖和代谢紊乱，类似于人类代谢综合征。先前已经例如在Bourgeois A等,1983；Takahashi I等,1999中描述了此模型系统。简而言之，从第0天起，用HFD(60％脂肪，Research Diets Inc.,New Brunswick,NJ)处理8-9周龄的雄性小鼠。从HFD后的第1天到第84天每周一次地测量体重。百分比体重增加(％g)表示为平均值±标准偏差(SD)。
[0084] 实验组为ALPK1野生型(WT)(n＝6)；杂合(HE)失活性ALPK1突变(n＝5)；和纯合(HO)失活性ALPK1突变(n＝4)。在此研究中，ALPK1的杂合和纯合失活性突变均赋予了针对HFD诱导的重量增加的防护(图3)。
[0085] 实施例4：失活性ALPK1突变赋予了对胶原诱导的关节炎的抵抗力
[0086] 胶原诱导的关节炎的鼠模型用于评估通过失活性突变抑制ALPK1是否可以改善此模型系统中的炎症。类风湿关节炎被认为是一种炎症性免疫过程，其中人体过度敏感的免疫系统会攻击人体自身的组织，诸如关节内膜和软骨。该炎症会导致类风湿关节炎常见的疼痛和肿胀。先前已经例如在Campbell H等,2000中描述了此模型系统。简而言之，通过在一只后脚的足垫上皮下注射20μl牛II型胶原(免疫级别牛II型胶原，溶液(Chondrex，目录号20022)和4mg/ml的完全弗氏佐剂(CFA，灭活的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra(Chondrex，目录号7001))(两者的终浓度均为1mg/ml))，另一只脚注射20μl PBS对照进行对照处理8周龄的雄性小鼠。牛II型胶原由于炎症诱导脚肿胀。评估小鼠的类风湿关节炎评分，并在胶原注射后直至25天每隔一天测量一次爪子肿胀的脚厚度。
类风湿关节炎(RA)得分是所有四个爪子得分的总和，范围为0-16，其中每个爪子的得分如下：
类风湿关节炎(RA)得分是所有四个爪子得分的总和，范围为0-16，其中每个爪子的得分如下：
[0087] 得分0–正常足垫；
[0088] 得分1-一只脚趾发炎并肿胀；
[0089] 得分2–多于一个脚趾，但整个爪子未发炎并肿胀，或整个爪子轻度肿胀；
[0090] 得分3–整个爪子发炎并肿胀；和
[0091] 得分4-爪子完全发炎、肿胀或强直(僵硬或不动)。
[0092] 数据表示为所示的实验组数的平均值±标准偏差。实验组为ALPK1野生型(WT)(n＝8)；杂合(HE)失活性ALPK1突变(n＝7)；和纯合(HO)失活性ALPK1突变(n＝7)。在此研究中，在具有ALPK1的杂合或纯合失活性突变的小鼠中，炎症指标，即足垫RA得分(图4A)和足垫厚度差(图4B)均较低。
[0093] 实施例5：ALPK1敲低抑制人和小鼠各种细胞中的促炎性细胞因子的表达
[0094] 结果总结在表1中，并在下面更详细地描述。
[0095] 表1：在ALPK1敲低的人和鼠细胞中下调的细胞因子
[0096]
[0097]
[0098] 5A.通过siRNA敲低人胚肾293T(HEK293T)细胞中的ALPK1可导致细胞因子表达降低
[0099] 使用 RNAiMAX试剂(Life Technologies Corporation,Grand Island,NY)，用siRNA(ALPK1-siRNA-1、ALPK1-siRNA-2、Scramble siRNA)转染HEK293T细胞。在转染后42小时，收获HEK293T细胞，以使用Trizol试剂(LifeTechnologies Corporation)提取RNA。使用PrimeScriptTMRT试剂盒(Takara Bio Inc.,#RR037A)将RNA反转录为cDNA，并在Applied BiosystemsTMQuantStudioTM7Flex实时PCR系统(Life Technologies Corporation)上使用SYBRGreen I试剂通过qPCR测量RNA。将ALPK1、IL-10、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α中的每一种的基因表达均归一化为GAPDH。ALPK1敲低降低了所有这5种促炎症细胞因子的表达(图5)。
[0100] 5B.敲低HEK293T细胞中的ALPK1导致在福氏志贺氏杆菌细胞裂解物诱导后细胞因子的表达降低，且人或小鼠ALPK1的过表达可补救受损的细胞因子表达，但不能补救激酶死亡突变体。
[0101] 使用 RNAiMAX试剂(Life Technologies Corporation)用ALPK1-siRNA-2或Scramble siRNA转染HEK293T细胞。2天后，使用LIPOFECTAMINE 3000(LIFE)用不含cDNA(空的)的过表达构建体(pCDNA3.1-)或以下来转染细胞：
[0102] ·在N-末端标有1*标记的ALPK1(标记-ALPK1)
[0103] ·带有小鼠c-末端HA标签的ALPK1(小鼠ALPK1)
[0104] ·在N-末端标有6*His标签且在C-末端标有3*标记的ALPK1(6*His-ALPK1-3*标记)
[0105] ·在N-末端标有6*His标签的ALPK1(6*His-ALPK1)
[0106] ·6*His-ALPK1的E1190A突变体(6*His-ALPK1-E突变体)
[0107] 测量ALPK1的基因表达以确认通过siRNA的有效敲低ALPK1和通过过表达载体的ALPK1过表达(图6A)。测量IL8表达(图6B)，以显示通过Flag-ALPK1、小鼠ALPK1、6*His-ALPK1-3*标记、6*His-ALPK1的有效IL8表达，但并非通过6*His-ALPK1-E突变体的有效IL8表达，这表明ALPK1诱导的IL8表达需要ALPK1的激酶活性。
[0108] 5C.CRISPR/Cas9敲除HEK293T细胞中的ALPK1导致在福氏志贺氏杆菌细胞裂解物诱导后细胞因子表达和分泌降低
[0109] CRISPR HEK293T细胞是通过将含有导向序列的CRISPRv1.0转染至ALPK1的外显子3，以及将靶向序列转染至ALPK1的外显子14而产生的。转染后1天，在2.5μg/ml嘌呤霉素上选择HEK293T细胞，持续3天。扩增单个菌落以生成稳定的细胞系。通过用福氏志贺氏杆菌细胞裂解物处理HEK293T细胞来激活NF-κβ信号传导。1％福氏志贺氏杆菌细胞裂解物处理4小时后，收获293T细胞，以使用Trizol试剂(LIFE)分析mRNA表达。将ALPK1、IL-10、IL-1β、IL-
6、IL-8和TNF-α的mRNA水平归一化为GAPDH表达(图7A)。使用人IL-8ELISA试剂盒(BD Biosciences)测量上清液HEK293T细胞培养物中的IL-8分泌(图7B)。
6、IL-8和TNF-α的mRNA水平归一化为GAPDH表达(图7A)。使用人IL-8ELISA试剂盒(BD Biosciences)测量上清液HEK293T细胞培养物中的IL-8分泌(图7B)。
[0110] 5D.敲低HEK293细胞中的ALPK1导致在福氏志贺氏杆菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞裂解物诱导后细胞因子的表达降低
[0111] 福氏志贺氏杆菌细胞裂解物(SFL)和鼠伤寒沙门氏菌细胞裂解物(STL)可诱导HEK293细胞中的促炎性细胞因子IL6、IL8和TNFα的表达。通过siRNA敲低ALPK1降低所有这三种细胞因子的表达(图8)。siRNA如上文5A中所述。
[0112] 5E.在LPS诱导和无LPS诱导的情况下，通过shRNA敲低THP-1巨噬细胞中ALPK1导致细胞因子的表达降低
[0113] 用携带针对ALPK1的shRNA-1190、针对ALPK1的shRNA-2027或空载体(Neg)的慢病毒感染THP-1细胞5天，然后使用嘌呤霉素选择。添加PMA(50ng/ml)以诱导巨噬细胞分化2天，并且添加LPS(10ng/ml)以诱导NFκβ途径。在LPS刺激的细胞(图9A)和未刺激的细胞(图9B)的细胞中，通过shRNA敲低ALPK1来诱导的表达IL1β、IL-8和TNFα。还显示了肌动蛋白(actb)和GADPH(gadph)的表达。
[0114] 5F.通过shRNA敲低THP-1巨噬细胞中ALPK1导致TNFα和IL1β的分泌的抑制[0115] 当THP-1细胞被PMA(50ng/ml)诱导2至6天以分化为巨噬细胞时，通过shRNA敲低THP-1巨噬细胞中ALPK1导致在LPS(10ng/ml)诱导后的TNFα(图10A)和IL1β(图10B)的分泌的抑制。
[0116] 5G.MDA-MB-468细胞中的ALPK1敲低导致细胞因子表达降低
[0117] 通过siRNA敲低乳腺癌细胞系MDA-MB-468中的ALPK1导致IL1β、IL8和TNFα的表达降低(图11)。
[0118] 5H.RAW 264.7细胞中的ALPK1敲低导致细胞因子表达降低
[0119] 在LPS刺激(图12A)和无LPS刺激(图12B)的情况下，通过shRNA敲低小鼠巨噬细胞系RAW264.7中的ALPK1导致细胞因子表达降低。
[0120] 5I.来自携带失活性ALPK1突变的小鼠的原代小鼠巨噬细胞
[0121] 从野生型(WT)小鼠和以上实施例1中所述的纯合(HO)和杂合(HE)ALPK1小鼠获得小鼠骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)。用100ng/ml LPS处理成熟的BMDM，以诱导细胞因子表达。来自纯合(HO)和杂合(HE)ALPK1敲除小鼠的细胞中的细胞因子IL1β、TNFα、TGFβ1、IL6、IFNα、IL15、IL10和TNFβ的mRNA表达均是降低的(图13)。
[0122] 实施例6：小分子激酶抑制剂，MI6，可改善DSS结肠炎模型中的恢复
[0123] 通过筛选小分子文库对ALPK1的抑制活性来鉴定ALPK1抑制剂。多种测定用于筛选文库，该测定包括结合测定、激酶测定和针对细胞因子分泌的基于细胞的测定。根据MI6在结合和激酶测定以及至少两种基于细胞的测定中的表现，将其鉴定为ALPK1抑制剂。
[0124] 如下评估了MI6改善DSS诱导的结肠炎模型中的炎症的能力。从第0天到第5天，用3％DSS(钠盐，MW 40K-50K，来自Affymetrix)处理8周龄的雌性野生型FVC小鼠。然后小鼠被换成饮用水。小鼠每天被腹膜内(IP)注射溶于DMSO(n＝6)的MI6(1mg/kg)或仅DMSO(n＝5)。
每天对动物称重。与未治疗的动物相比，用MI6处理的三天之内，经处理的动物开始显示出改善的重量增加(图14)。
每天对动物称重。与未治疗的动物相比，用MI6处理的三天之内，经处理的动物开始显示出改善的重量增加(图14)。
[0125] 实施例7：ALPK1突变降低乳腺癌中的肿瘤生长和转移
[0126] 在MMTV-PyVT转基因肿瘤模型中，多瘤病毒中间T抗原(PyVT)在小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子下表达，该启动子驱动PyVT的乳腺组织特异性表达。PyVT是一种致癌基因，可激活多种致瘤途径，包括src和磷脂酰肌醇3-激酶，从而导致侵袭性肿瘤表型。携带转基因的处女雌性在10至12周龄时发展多病灶性、低分化、高侵袭性导管癌，且原发性乳腺肿瘤引起的肺转移发生率很高。在5周龄时，雌性发展非侵袭性病灶性病变，其被分为四类：单纯、实体、囊性和混合性(实体和囊性)。实体病变由其中结节片中有密集大量的非典型细胞的大病灶组成。囊性病变的大小和复杂性各不相同，并在大量清澈液体的情况下被多层上皮填满。
[0127] 在许多癌症类型中，原发肿瘤转移到远处仍然是重要的死亡原因，这突出了转移模型的重要性。自发性乳癌发生的MMTV-PyVT转基因肿瘤模型是用于研究与肿瘤进展和新型化学疗法发展相关联的机制的强大工具。
[0128] 我们检查了在MMTV-PyVT模型中ALPK1失活性突变的防护效果。如图15A-15D中所示的，与无ALPK1突变的模拟MMTV-PyVT转基因小鼠相比，乳腺组织中的肿瘤负荷(图15B)和转移性肺肿瘤负荷(图15D)在统计学上均显着下降，这表明此突变的防护效果。
[0129] 等同物
[0132] 本发明的范围不受本文所述的具体实施方案限制。实际上，除了本文描述的修改之外，根据前述的描述和附图，本发明的多种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求书的范围内。
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