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AXMI277 线虫毒素及其使用方法

阅读：120发布：2020-05-13

专利汇可以提供AXMI277 线虫毒素及其使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了用于赋予针对细菌、植物、植物细胞、组织以及种子的杀虫活性的组合物和方法。提供了包括一种针对毒素多肽的编码序列的组合物。这些编码序列可以用在DNA构建体或表达盒中用于在植物和细菌中进行转化和表达。组合物还包括经转化的细菌、植物、植物细胞、组织、以及种子。特别是提供了分离的毒素核酸分子。此外，包括相应于这些多核苷酸的氨基酸序列，以及特异性结合到这些氨基酸序列上的抗体。具体而言，本发明提供了分离的核酸分子，这些核酸分子包括对SEQ ID NO：2或3中所示的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列，或在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列，连同它们的变体以及片段。，下面是AXMI277 线虫毒素及其使用方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种重组核酸分子，由编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2或3的杀虫多肽的核苷酸序列组成。
2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列是已经被设计为用于在植物中表达的合成序列。
4.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列可操作地连接于能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中进行表达的启动子。
5.一种载体，包括如权利要求1所述的重组核酸分子。
6.一种细菌宿主细胞，该细菌宿主细胞包含如权利要求1所述的重组核酸分子。
7.一种具有杀虫活性的重组多肽，该重组多肽由SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列组成。
8.一种组合物，包括如权利要求7所述的多肽。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述组合物选自粉末、粉尘、颗粒、喷雾、乳液、胶体以及溶液。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述颗粒为小粒。
11.如权利要求8所述的组合物，其中所述组合物通过细菌细胞培养物的干燥、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩而制备。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述干燥为冷冻干燥。
13.如权利要求8所述的组合物，包括按重量计为1％至99％的所述多肽。
14.一种用于控制鳞翅目的、半翅目的、鞘翅目的、线虫目的或双翅目的害虫种群的方法，包括将所述种群与杀虫有效量的如权利要求7所述的多肽进行接触。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述害虫种群为秀丽隐杆线虫种群。
16.一种用于杀死鳞翅目的、半翅目的、鞘翅目的、线虫目的或双翅目的害虫的方法，包括用杀虫有效量的如权利要求7所述的多肽接触或喂食所述害虫。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述害虫为秀丽隐杆线虫。
18.一种用于生产具有杀虫活性的多肽的方法，包括在编码多肽的核酸分子得到表达的条件下培养如权利要求6所述的细菌宿主细胞。
19.一种用于保护植物免受害虫的方法，该方法包括在植物或其细胞中表达核苷酸序列，该核苷酸序列编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2或3的杀虫多肽。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述植物产生杀虫多肽，该杀虫多肽具有针对鳞翅目的、半翅目的、鞘翅目的、线虫目的或双翅目的害虫的杀虫活性。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述害虫为秀丽隐杆线虫。
23.一种用于在植物中增加产量的方法，该方法包括使植物或其种子在田地中生长，该植物或其种子具有稳定地并入其基因组中的DNA构建体，该DNA构建体包括编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2或3的杀虫多肽的核苷酸序列，
其中所述田地被害虫侵染，所述多肽具有针对该害虫的杀虫活性。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述害虫为秀丽隐杆线虫。

说明书全文

AXMI277线虫毒素及其使用方法

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2011年6月30日提交的美国临时申请序列号61/503,132的权益，其内容通过引用以其全文结合在此。

[0003] 电子提交的序列表的引用

[0004] 序列表的这个正式拷贝是通过EFS-Web以电子方式提交的一个ASCII格式序列表，文件命名为“2916693-094977-SEQLIST.txt”，创建于2012年6月28日，大小为21.4千字节，并且与本说明书同时提交。包含在这个ASCII格式文件中的该序列表是本说明书的一部分，并且通过引用以其全文结合在此。发明领域

[0005] 本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新颖的基因。这些蛋白质和编码它们的这些核酸序列在杀虫配制品的制备以及转基因抗害虫植物的生产中是有用的。

背景技术

[0006] 苏云金芽孢杆菌是一种形成革兰氏阳性孢子的土壤细菌，其特征在于它具有产生结晶内含物的能力，这些结晶内含物对某些目和物种的昆虫是具有特异毒性的，但是对植物以及其他非靶向的生物是无害的。由于这种原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀昆虫(insecticidal)蛋白的组合物可以用作环境可接受的杀虫剂来控制农业的虫害或针对多种的人或动物疾病的媒虫。

[0007] 来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目的、半翅目的、双翅目的、以及鞘翅目的幼虫的有效的杀昆虫活性。这些蛋白质还已经显示对抗膜翅目、同翅目、虱目、食毛目、以及螨害虫目、连同其他无脊椎动物目(如线虫动物门、扁形动物门、以及原生动物门肉鞭毛虫亚门)的活性(Feitelson(斐特尔森)(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree(苏云金芽孢杆菌家族树).在Advanced Engineered Pesticides(《高级工程化杀虫剂》)中,Marcel Dekker,Inc.(马塞尔·德克公司),纽约市,纽约州)这些蛋白质主要基于它们的杀昆虫活性最初被分类为CryI至CryV。这些主要的类别是鳞翅类特异的(I)、鳞翅类与双翅目特异的(II)、鞘翅目特异的(III)、双翅目特异的(IV)、以及线虫特异的(V)与(VI)。这些蛋白质进一步被分类为亚家族，每个家族之内更加高度相关的蛋白质被分配了分组字母，如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。在每个组之内的甚至更加紧密相关的蛋白质被给予名称，如Cry1C1，Cry1C2等。

[0008] 最近说明了对于这些Cry基因的一种基于氨基酸序列同源性而不是昆虫靶标特异性的新命名法(Crickmore(克里克莫尔)等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.(《微生物分子生物学综述》)62:807-813)。在这种新式分类中，每种毒素被分配了一个独特的名称，该名称结合了一个第一列(一个阿拉伯数字)，一个第二列(一个大写体字母)、一个第三列(一个小写字母)、以及一个第四列(另一个阿拉伯数字)。在这种新式分类中，在该第一列中罗马数字已经换成了阿拉伯数字。具有小于45％的序列一致性的蛋白质具有不同的第一列，并且对于第二和第三列的指标对应地是78％和95％。

[0009] 该晶体蛋白直到它已经被昆虫摄取并且在昆虫的肠中溶解时才显示出杀昆虫活性。被摄取的原毒素在昆虫的消化道中被蛋白酶水解为一种活性有毒分子( and Whiteley(1989)Microbiol.Rev.(《微生物综述》)53:242-255)。这种毒素在该目标幼虫的中肠中与顶端的刷状缘受体相结合，并且插到该顶膜中产生了离子通道或孔，导致幼虫的死亡。

[0010] δ-内毒素总体上具有五个保守序列结构域，以及三个保守结构域(参见例如，de Maagd等人(2001)Trends Genetics(《遗传学趋势》)17:193-199)。第一保守结构域由7个α螺旋组成，并且参与膜插入与孔形成。结构域II由排列成希腊钥匙构型的三个β折叠组成，并且结构域III由“果冻卷饼”形式下的两个反向平行β折叠组成(de Maagd等人,2001,同上)。结构域II和III参与了受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定簇。

[0011] 由于昆虫可以带来的灾害，以及通过控制虫害在产量方面的改进，存在着一种发现新形式的杀虫毒素的不断需求。

发明内容

[0012] 提供了用于赋予针对细菌、植物、植物细胞、组织以及种子的杀虫活性的组合物和方法。组合物包括针对杀虫(pesticidal)的和杀昆虫(insectidal)多肽的核酸分子编码序列、包括那些核酸分子的载体、以及包括这些载体的宿主细胞。组合物还包括这些杀虫多肽序列以及针对那些多肽的抗体。这些核苷酸序列可以用在DNA构建体或表达盒中以用于在多种生物(包括微生物和植物)中进行转化和表达。这些核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，这些合成序列已经被设计为用于在一种生物中表达，该生物体包括但不局限于：一种微生物或一种植物。组合物还包括含有本发明的核苷酸序列的细菌、植物、植物细胞、组织以及种子。

[0013] 具体而言，提供了分离的核酸分子，这些核酸分子编码一种杀虫蛋白。此外，涵盖了与这些杀虫蛋白相对应的氨基酸序列。具体而言，本发明提供了一种分离的或重组的核酸分子，该核酸分子包括对SEQ ID NO:2或3中所示的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列，或在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸序列，连同它们的生物活性的变体以及片段。还涵盖了与本发明的一个核苷酸序列互补的核苷酸序列、或与本发明的一个序列杂交的核苷酸序列或其互补物。进一步提供了载体、宿主细胞、植物以及种子，这些载体、宿主细胞、植物以及种子包括本发明的这些核苷酸序列，或对本发明的这些氨基酸序列进行编码的核苷酸序列，连同它们的生物活性的变体以及片段。

[0014] 提供了用于产生本发明的多肽的方法，以及用于使用这些多肽来控制或杀死一种鳞翅目的、半翅目的、鞘翅目的、线虫目的、或双翅目的害虫的方法。还包括了用于在一个样品中检测本发明的这些核酸和多肽的方法和试剂盒。

[0015] 本发明的这些组合物和方法对于产生具有增强的害虫抗性或耐受性的生物是有用的。这些生物以及包括这些生物的组合物对于农业目的是所希望的。本发明的这些组合物还对于产生改变的或改进的具有杀虫活性的蛋白质、或对于在产物或生物中检测杀虫蛋白或核酸的存在是有用的。

[0016] 本发明描绘了用于调节生物(特别是植物或植物细胞)中的害虫抗性或耐受性的组合物和方法。“抗性”一词是指该害虫(例如，昆虫)一旦摄取或以其他方式接触本发明的多肽类时就被杀死。“耐受性”一词是指该害虫的运动、摄食、繁殖、或其他功能的损害或降低。这些方法涉及用编码了本发明的一种杀虫蛋白的一个核苷酸序列来转化生物。特别是，本发明的核苷酸序列对于制备具有杀虫活性的植物和微生物是有用的。因此，提供了经转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织以及种子。组合物是杆菌或其他物种的杀虫的核酸以及蛋白质。发现这些序列在用于随后转化入感兴趣的生物体中的表达载体的构建方面用作探针用于其他同源(或部分同源的)基因的分离，以及用于通过本领域中已知的方法(如，结构域交换或DNA改组)来产生改变的杀虫蛋白，例如，采用内毒素的Cry1、Cry2以及Cry9家族中的成员。发现这些蛋白质用于控制或杀死鳞翅目的、半翅目的、鞘翅目的、双翅目的、以及线虫目的害虫种群，以及用于生产具有杀虫活性的组合物。

[0017] “杀虫毒素”或“杀虫蛋白”是指一种毒素，该毒素具有针对以下一种或多种害虫的毒性，包括但不局限于：鳞翅目的、双翅目的、以及鞘翅目的、或线虫门的成员，或具有与这种蛋白质的同源性的一种蛋白质。已经从生物中分离出杀虫蛋白，这些生物包括例如，芽孢杆菌、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、以及日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。杀虫蛋白包括从在此所披露的全长核苷酸序列中推导出的氨基酸序列，以及比这些全长序列更短的氨基酸序列(或者由于使用了一个可替代的下游起始位点，或者由于产生一个较短的具有杀虫活性的蛋白质的加工过程)。加工可以在表达该蛋白质的生物内发生，或在该害虫摄取该蛋白质之后发生。

[0018] 杀虫蛋白类涵盖δ-内毒素。δ-内毒素类包括被鉴定为cry1至cry43，cyt1和cyt2，以及Cyt样毒素的蛋白质。目前存在着超过250种己知的δ-内毒素物种，它们具有宽范围的特异性和毒性。对于全面的列表，参见Crickmore(克里克莫尔)等人(1998),Microbiol.Mol.Biol.Rev.(《微生物分子生物学综述》)62:807-813，而对于定期更新，参见www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index上的Crickmore(克里克莫尔)等人(2003)“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature(苏云金芽孢杆菌毒素命名法)”。

[0019] 因此，在此提供了新颖的分离的或重组的核苷酸序列，这些序列赋予了杀虫活性。这些核苷酸序列对具有与已知的δ-内毒素或二元毒素的同源性的多肽进行编码。还提供了这些杀虫蛋白的氨基酸序列。由这种基因的翻译而产生的蛋白质允许细胞控制或杀死摄取了该蛋白质的害虫。

[0020] 分离的核酸分子、以及它们的变体和片段

[0021] 本发明的一个方面涉及了分离的或重组的核酸分子，这些核酸分子包含编码了杀虫蛋白和多肽或它们的生物活性部分的核苷酸序列；连同足以用作杂交探针来鉴定编码了具有序列同源性的区域的蛋白质的核酸分子。在此还涵盖了能够在如在本文别处所限定的严格条件下与本发明的这些核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。如在此所使用的，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如，重组DNA、cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物而产生的DNA或RNA的类似物。这种核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。

[0022] “分离的”或“重组的”核酸序列(或DNA)被用在此处是指一种核酸序列(或DNA)，该核酸序列(或DNA)不再存在于它的自然环境中(例如，在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中)。在一些实施例中，一种分离的或重组的核酸是不含有在衍生出该核酸的生物的基因组DNA中天然地位于该核酸侧翼的序列(即，位于该核酸的5'和3'末端的序列)(优选编码蛋白质的序列)。出于本发明的目的，“分离的”当用于指核酸分子时不包括分离的染色体。例如，在不同的实施例中，编码了核酸分子的该分离的δ-内毒素能够包含小于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，这些核苷酸序列在衍生出该核酸的细胞的基因组DNA中天然地位于该核酸分子的侧翼。在不同的实施例中，基本上不含有细胞物质的一种δ-内毒素蛋白包括具有小于非δ-内毒素蛋白(在此也被称为“污染蛋白质”)的大约30％、
20％、10％或5％(按干重计)的蛋白质的制剂。

[0023] 编码了本发明的这些蛋白质的核苷酸序列包括在SEQ ID NO:1中列出的序列，以及其变体、片段和互补物。“互补物”一词是指一个核苷酸序列，该核苷酸序列与一种给定的核苷酸序列足够地互补，这样使得它可以与该给定的核苷酸序列杂交以便由此形成一个稳定的双链体。对于由这些核苷酸序列所编码的杀虫蛋白的相对应的氨基酸序列在SEQ ID NO:2、或3中列出。

[0024] 本发明还涵盖了以下核酸分子，这些核酸分子是这些编码了杀虫蛋白的核苷酸序列的片段。“片段”一词是指编码了一种杀虫蛋白的核苷酸序列的一个部分。一个核苷酸序列的一个片段可以编码一种杀虫蛋白的一个生物活性部分，或它可以是使用以下披露的方法而可以用作一种杂交探针或PCR引物的一个片段。作为编码了一种杀虫蛋白的一个核苷酸序列的片段的核酸分子包括至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400个相邻的核苷酸，或达到在此所披露的一种全长的编码杀虫蛋白的核苷酸序列中存在的核苷酸的数目，这取决于所预期的用途。“相邻的”核苷酸旨在指彼此紧邻的核苷酸残基。本发明的核苷酸序列的片段将编码保留该杀虫蛋白的生物活性、并且因此保留杀虫活性的蛋白质片段。因此，还涵盖了在此披露的这些多肽的生物活性片段。“保留活性”是指该片段将具有该杀虫蛋白的杀虫活性的至少大约30％，至少大约50％，至少大约70％、80％、90％、95％，或更高。在一个实施例中，该杀虫活性是杀鞘翅目的活性。
在另一个实施例中，该杀虫活性是杀鳞翅目的活性。在另一个实施例中，该杀虫活性是杀线虫的活性。在另一个实施例中，该杀虫活性是杀双翅目的活性。在另一个实施例中，该杀虫活性是杀半翅目的活性。用于测量杀虫活性的方法在本领域中是众所周知的。参见例如Czapla(恰普拉)和Lang(朗)(1990)J.Econ.Entomol.(《经济昆虫学杂志》)83:2480-2485；
Andrews(安德鲁斯)等人(1988)Biochem.J.(《生物化学杂志》)252:199-206；Marrone(马罗内)等人(1985)J.of Economic Entomology(《经济昆虫学杂志》)78:290-293；以及美国专利号5,743,477，它们全部通过引用以其全文结合于此。

[0025] 编码一种杀虫蛋白的一个核苷酸序列的一个片段(即编码本发明的一种蛋白质的一个生物活性部分)将编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450个相邻的氨基酸，或达到在本发明的全长杀虫蛋白中存在的氨基酸的总数目。在一些实施例中，该片段是一种蛋白酶切割片段。例如，该蛋白酶切割片段可以相对于SEQ ID NO:2或3具有一个至少大约100个氨基酸、大约120个、大约130个、大约140个、大约150个或大约160个氨基酸的N-末端或C-末端截短。在一些实施例中，在此涵盖的这些片段产生于对C-末端结晶结构域的去除，例如通过蛋白水解作用或通过在编码序列中插入一个终止密码子。

[0026] 本发明的优选杀虫蛋白是由与SEQ ID NO:1的核苷酸序列足够一致的一种核苷酸序列所编码的，或这些杀虫蛋白是与SEQ ID NO:2或3中列出的氨基酸序列足够一致的。“足够一致的”是指使用在此所说明的这些比对程序中的一个，使用标准参数，将一种氨基酸或核苷酸序列与一种参比序列相比较，该氨基酸或核苷酸序列具有至少大约60％或65％序列一致性，大约70％或75％序列一致性，大约80％或85％序列一致性，大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列一致性。本领域的普通技术人员将会认识到，可以对这些数值进行适当地调整以便通过考虑密码子简并、氨基酸相似性、阅读框定位等等来确定由两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应一致性。

[0027] 为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的一致性百分比，针对最佳比较目的而比对了这些序列。这两个序列之间的一致性百分比是由这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，一致性百分比＝相同位置的数目/位置(例如，重叠位置)的总数目×100)。在一个实施例中，这两个序列是相同长度的。在另一个实施例中，该一致性百分比是贯穿该参比序列的整体来计算的(即，在此所披露的如SEQ ID NO:1-3中任一项的序列)。在两个序列之间的一致性百分比可以使用与以下说明的那些相类似的技术来进行确定，其中允许或不允许缺口。在计算一致性百分比中，对典型地准确的匹配进行计数。一个缺口，即在一次比对中在一个序列中在该处存在残基而在另一个序列中在该处不存在该残基的一个位置，被视为一个具有非一致残基的位置。

[0028] 在两个序列之间的一致性百分比的确定可以使用一种数学算法来完成。用于两个序列的比较的数学算法的一个非限制性实例是Karlin(卡林)和Altschul(阿特休尔)(1990)Proc.Natl.Acad.Sci USA《( 美国国家科学院院刊》)87:2264的算法，它在Karlin(卡林)和Altschul(阿特休尔)(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA(《美国国家科学院院刊》)90:5873-5877中进行了修改。这样一种算法被结合到了Altschul(阿特休尔)等人(1990)J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)215:403的BLASTN和BLASTX程序中。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序(得分＝100、字长＝12)来进行，以获得与本发明的杀虫样核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序(得分＝50、字长＝3)来进行，以获得与本发明的杀虫样蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可以使用如Altschul(阿特休尔)等人(1997)Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)25:3389中所说明的Gapped BLAST(在BLAST2.0中)。可替代地，PSI-Blast可以用于进行一种迭代搜索，该搜索检测了分子间的远离关系。见Altschul(阿特休尔)等人(1997)，同上。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用对应的程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。还可通过目测检查而手工地进行比对。

[0029] 用于序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是ClustalW算法(Higgins(希金斯)等人(1994)Nucleic Acids Res.《( 核酸研究》)22:4673-4680)。ClustalW比较了序列并且比对了该氨基酸或DNA序列的整体，并且因此可以提供有关该整个氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法用于几个可商购的DNA/氨基酸分析软件包，如Vector NTI Program Suite的ALIGNX模块(Invitrogen Corporation(英杰公司)，Carlsbad(卡尔斯巴德)，CA)。在用ClustalW对多个氨基酸序列进行比对之后，可以评估氨基酸一致性百分比。对ClustalW比对分析有用的软件程序的另一个非限制性实例是GENEDOCTM。GENEDOCTM(Karl Nicholas)允许在多个蛋白质之间评估氨基酸(或DNA)相似性和一致性。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是Myers(迈尔斯)和Miller(米列尔)(1988)CABIOS4:11-17的算法。这样一种算法被结合到ALIGN程序(版本2.0)中，该程序是GCG Wisconsin Genetics Software Package(GCG威斯康辛遗传学软件包)版本10(可获得自Accelrys公司,9685Scranton Rd.(斯克兰顿路),San Diego(圣地亚哥市),加利福尼亚州,美国)的一部分。当利用ALIGN程序来比较多个氨基酸序列时，可以使用一个PAM120权重残基表、缺口长度罚分12、以及缺口罚分4。

[0030] 除非另有说明，GAP版本10(它采用了Needleman(内德勒曼)和Wunsch(翁施)(1970)J.MoI.Biol.(《分子生物学杂志》)48(3):443-453的算法)将使用以下参数用于测定序列一致性或相似性：对于一个核苷酸序列的一致性百分比以及相似性百分比，使用GAP权重50和长度权重3，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；对于一个氨基酸序列的一致性百分比以及相似性百分比，使用GAP权重8和长度权重2，以及BLOSUM62评分程序。还可以使用等效的程序。“等效的程序”一词是指以下任何序列比较程序，该程序针对所研究的任何两个序列、当与由GAP版本10所产生的相应的比对相比时产生了一个比对，该比对具有相同的核苷酸残基匹配以及一个相同的序列一致性百分比。

[0031] 本发明还涵盖了变体核酸分子。编码杀虫蛋白的核苷酸序列的“变体”包括编码了在此所披露的杀虫蛋白、但由于遗传密码的简并而保守性地不同的那些序列，连同如以上所讨论的足够一致的那些序列。自然发生的等位基因变体可以使用所熟知的分子生物学技术来鉴定，例如像以下所概括的聚合酶链式反应(PCR)以及杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成地衍生的核苷酸序列，这些核苷酸序列已经例如通过使用定点诱变而产生但它们仍编码了在本发明中所披露的杀虫蛋白，如以下所讨论。本发明所涵盖的变体蛋白质是有生物活性的，即它们继续具有所希望的天然蛋白质的生物活性，即杀虫活性。“保留活性”是指该变体将具有该天然蛋白质的杀虫活性的至少大约30％，至少大约50％，至少大约70％、或至少大约80％。用于测量杀虫活性的方法在本领域中是众所周知的。参见例如Czapla(恰普拉)和Lang(朗)(1990)J.Econ.Entomol.《( 经济昆虫学杂志》)83:2480-2485；Andrews(安德鲁斯)等人(1988)Biochem.J.(《生物化学杂志》)252:199-206；Marrone(马罗内)等人(1985)J.of Economic Entomology(《经济昆虫学杂志》)78:290-293；以及美国专利号5,743,477，它们全部通过引用以其全文结合于此。

[0032] 有经验的行家将会进一步意识到，可以通过突变本发明的核苷酸序列来引入变化，由此导致在这些经编码的杀虫蛋白的氨基酸序列中的变化，而不改变这些蛋白质的生物活性。因此，分离的核酸分子变体可以通过以下方式来创造：将一个或多个核苷酸置换、添加、或缺失引入到在此所披露的相应的核苷酸序列中，这样使得将一个或多个氨基酸置换、添加、或缺失引入到所编码的蛋白质中。可以通过标准的技术(如定点诱变和PCR-介导的诱变)来引入突变。此类变体核苷酸序列也由本发明所涵盖。

[0033] 例如，保守的氨基酸置换可以在一个或多个、预测的、非必需氨基酸残基上进行。一个“非必需”氨基酸残基是以下残基，该残基可以从一种杀虫蛋白的野生型序列中进行改变而不改变生物活性，而一个“必需”氨基酸残基是生物活性所要求的。一个“保守的氨基酸置换”是其中该氨基酸残基被一个具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。在本领域中，已经对具有相似侧链的氨基酸残基的家族进行了限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

[0034] δ-内毒素总体上具有五个保守序列结构域，以及三个保守结构域(例如，见de Maagd等人(2001)Trends Genetics(《遗传学趋势》)17:193-199)。第一保守结构域由7个α螺旋组成，并且参与膜插入与孔形成。结构域II由排列成希腊钥匙构型的三个β折叠组成，并且结构域III由“果冻卷饼”形式下的两个反向平行β折叠组成(de Maagd等人,2001,同上)。结构域II和III参与了受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定簇。

[0035] 氨基酸置换可以在保留功能的非保守性区域中进行。总体上，此类置换并非针对保守的氨基酸残基、或针对在一个保守基序内的氨基酸残基而进行，其中此类残基是蛋白质活性所必要的。保守的并且对于蛋白质活性可能是必需的残基的实例包括例如以下残基，这些残基在一个与本发明的序列相类似或相关的毒素的比对中所包含的全部蛋白质之间是一致的(例如，在一次同源蛋白质比对中一致的残基)。保守的但可能允许保守的氨基酸置换、并且仍保留活性的残基的实例包括例如以下残基，这些残基在一个与本发明的序列相类似或相关的毒素的比对中所包含的全部蛋白质之间仅具有保守性置换(例如，在同源蛋白质比对中所包含的全部蛋白质之间仅具有保守性置换的残基)。然而，本领域的普通技术人员应当理解，功能性变体在保守残基中可以具有少量的保守性或非保守性改变。

[0036] 可替代地，可以通过沿着该编码序列的全部或部分随机地引入突变(如通过饱和诱变)来制备变体核苷酸序列，并且可以针对赋予杀虫活性的能力来筛选得到的突变体以鉴定保留活性的突变体。在诱变之后，这种经编码的蛋白质可以进行重组地表达，并且这种蛋白质的活性可以使用标准的测定技术来测定。

[0037] 使用诸如PCR、杂交、以及类似的方法可以鉴定出相应的杀虫序列，此类序列具有与本发明的序列实质的一致性。参见例如Sambrook(萨姆布鲁克)和Russell(拉塞尔)(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.《( 分子克隆：实验指南》)(冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约州)和Innis(英尼斯)等人(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(《PCR方案：方法与应用指南》)(Academic Press(学术出版社),纽约州)。

[0038] 在一种杂交方法中，该杀虫核苷酸序列的全部或部分可以用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建此类cDNA和基因组文库的方法在本领域内是总体上已知的，并且披露于Sambrook(萨姆布鲁克)和Russell(拉塞尔)，2001，同上。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其他寡核苷酸，并且可以用一个可检测基团(如32P、或任何其他可检测的标记物，如其他放射性同位素、一种荧光化合物、一种酶、或一种酶辅因子)进行标记。可以基于在此所披露的已知的编码杀虫蛋白的核苷酸序列、通过对合成的寡核苷酸进行标记来制备用于杂交的探针。可以额外地使用简并引物，这些引物是基于在该核苷酸序列或经编码的氨基酸序列中的保守性核苷酸或氨基酸残基而设计的。这种探针典型地包括以下核苷酸序列的一个区域，这些核苷酸序列区域在严格条件下与本发明的编码一种杀虫蛋白的核苷酸序列或它的一个片段或变体的至少约12个，至少约25个，至少约50、75、100、125、150、175、或200个连续核苷酸进行杂交。用于制备用于杂交的探针的方法是本领域大体上已知的，并且披露于Sambrook(萨姆布鲁克)和Russell(拉塞尔)，2001(同上)中，将该文献通过引用结合在此。

[0039] 例如，在此所披露的一个完整的杀虫序列、或它的一个或多个部分可以用作一种探针，该探针能够与相对应的杀虫蛋白样序列以及信使RNA特异性地杂交。为了达到在不同的条件下的特异性杂交，此类探针包括以下序列，这些序列是独特的并且长度优选为至少约10个核苷酸、或长度为至少约20个核苷酸。此类探针可以用于由PCR从一种选择的生物中扩增出相对于应的杀虫序列。这种技术可以用于从一种所希望的生物中分离额外的编码序列，或用作一种诊断性测定来以便在一种生物中确定编码序列的存在。杂交技术包括铺板的(plated)DNA文库的杂交筛选(或是噬菌斑，或是菌落，参见例如Sambrook(萨姆布鲁克)等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验指南》)(第2版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约))。

[0040] 因此，本发明涵盖了用于杂交的探针，连同能够与本发明的一种核苷酸序列的全部或一部分(例如，在此所披露的一种核苷酸序列的至少大约300个核苷酸、至少大约400、至少大约500、1000、1200、1500、2000、2500、3000、3500、或高达全长)进行杂交的核苷酸序列。此类序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”是指以下条件，在这些条件下与其他序列相比一种探针将与它的目标序列杂交达到一个可检测地更大的程度(例如，超过背景至少2倍)。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与该探针100％互补的目标序列(同源探测)。可替代地，可以调整严格条件以便允许序列中的一些错误匹配，这样使得检测出较低程度的相似性(异源探测)。总体上，一个探针的长度为小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。

[0041] 典型地，严格条件将是以下条件，在这些条件下该盐浓度在pH7.0-8.3下是小于约1.5M Na离子，典型地大约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐类)，并且温度对于短探针(例如，10至50个核苷酸)为至少约30℃，而对于长探针(例如，超过50个核苷酸)为至少约60℃。
严格条件还可以用加入去稳定剂(如甲酰胺)来达到。示例性的低严格条件包括在37℃下利用一种30％至35％甲酰胺、1M NaCl，1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，并且在50℃至55℃下在1X至2XSSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中进行洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中进行杂交，并且在55℃至60℃下在0.5X至1X SSC中进行洗涤。示例性的高度严格条件包括在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中进行杂交，并且在60℃至65℃下在0.1X SSC中进行洗涤。可任选的是，洗涤缓冲液可以包括大约0.1％至大约1％SDS。杂交的持续时间大体上是小于约24小时，通常为大约4至大约12小时。

[0042] 特异性典型地是杂交后洗涤的函数，关键性因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交物，Tm可以从Meinkoth(门科斯)和Wahl(沃尔)(1984)Anal.Biochem.(《分析生物化学》)138:267-284的等式中进行估计：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是在DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是在杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是以碱基对计的杂交物的长度。Tm是以下温度，在该温度下一个互补的目标序列的50％与一个完全匹配的探针进行杂交(在限定的离子强度和pH下)。对于每1％的错配，Tm减少大约1℃；因此，可以调整Tm、杂交、和/或洗涤条件，以便与具有所希望的一致性的序列进行杂交。例如，如果查找具有≥90％一致性的序列，该Tm可以降低10℃。总体上，严格条件被选择为在一种限定的离子强度和pH下比针对该特定序列及其互补物的热解链点(Tm)低大约5℃。然而，极端严格条件可以利用在低于该热解链点(Tm)1℃、2℃、3℃或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用在低于该热解链点(Tm)6℃、7℃、8℃、9℃、或10℃下的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用在低于该热解链点(Tm)11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下的杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交和洗涤组合物、以及所希望的Tm，普通技术人员应当理解，内在地说明了在杂交和/或洗涤溶液的严格性方面的改变。如果所希望的错误匹配程度导致小于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，则优选增加SSC浓度，这样使得可以使用更高的温度。对核酸杂交的全面指导见于以下文献：Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology(《生物化学与分子生物学技术》)-第2章第I部分Hybridization with Nucleic Acid Probes(与核酸探针的杂交),(Elsevier(爱思唯尔),纽约)；以及Ausubel(奥苏伯尔)等人,编著(1995)Current Protocols in Molecular Biology(《分子生物学当前方案》),第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience(格林出版和韦利科学公司),纽约)。参见Sambrook(萨姆布鲁克)等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验指南》)(第2版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约)。

[0043] 分离的蛋白质及其变体和片段

[0044] 杀虫蛋白也涵盖于本发明之内。“杀虫蛋白”是指具有在SEQ ID NO:2或3中列出的氨基酸序列的一种蛋白质。其片段、生物活性部分以及变体也被提供，并且可以用于实践本发明的方法。“分离的蛋白质”或“重组蛋白质”被用来指一种蛋白质，该蛋白质不再存在于它的自然环境中(例如，在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中)。

[0045] “片段”或“生物活性部分”包括以下多肽片段，这些多肽片段包括与在SEQ ID NO:2或3中所列出的氨基酸序列足够地一致的氨基酸序列，并且展示出杀虫活性。一种杀虫蛋白的一个生物活性部分可以是这样一种多肽：该多肽在长度上是例如10、25、50、100、150、
200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、
1100、1150、1200、1250、1300、1350或更多个氨基酸。此类生物活性部分可以通过重组技术来制备，并且可以针对杀虫活性来评估。用于测量杀虫活性的方法在本领域中是众所周知的。参见例如Czapla(恰普拉)和Lang(朗)(1990)J.Econ.Entomol.(《经济昆虫学杂志》)83:
2480-2485；Andrews(安德鲁斯)等人(1988)Biochem.J.(《生物化学杂志》)252:199-206；
Marrone(马罗内)等人(1985)J.of Economic Entomology(《经济昆虫学杂志》)78:290-
293；以及美国专利号5,743,477，它们全部通过引用以其全文结合于此。如这里所使用的，一种片段包括SEQ ID NO:2或3的至少8个邻近的氨基酸。然而，本发明涵盖了其他片段，如在长度上大于大约10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、
700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350或更多个氨基酸的该蛋白质中的任何片段。

[0046] “变体”是指以下蛋白质或多肽，这些蛋白质或多肽所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2或3中任一者的氨基酸序列至少大约60％、65％，大约70％、75％，大约80％、85％，大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。变体还包括由在严格条件下与SEQ ID NO:1的核酸分子杂交的一种核酸分子或其互补物所编码的多肽。变体包括由于诱变而在氨基酸序列方面不同的多肽。由本发明所涵盖的变体蛋白质是生物活性的，即它们继续具有所希望的天然蛋白质的生物活性，即保留了杀虫活性。在一些实施例中，这些变体相对于天然蛋白质具有改进的活性。用于测量杀虫活性的方法在本领域中是众所周知的。参见例如Czapla(恰普拉)和Lang(朗)(1990)J.Econ.Entomol.(《经济昆虫学杂志》)83:
2480-2485；Andrews(安德鲁斯)等人(1988)Biochem.J.(《生物化学杂志》)252:199-206；
Marrone(马罗内)等人(1985)J.of Economic Entomology(《经济昆虫学杂志》)78:290-
293；以及美国专利号5,743,477，它们全部通过引用以其全文结合于此。

[0047] 细菌基因(如本发明的axmi基因)在开放阅读框的起始附近相当经常地具有多个甲硫氨酸起始密码子。经常，在这些起始密码子中的一个或多个上的翻译起始将导致一种功能蛋白质的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，细菌(如，芽孢杆菌)还将该密码子GTG识别为一个起始密码子，并且在GTG密码子上起始翻译的蛋白质在第一个氨基酸上包含一个甲硫氨酸。在少数情况下，细菌系统中的翻译可能在TTG密码子处启动，尽管在这种情况下TTG编码一个甲硫氨酸。此外，常常不首先确定这些密码子中的哪一些在细菌中自然地使用。因此，应当理解，使用这些可替代的甲硫氨酸密码子之一也可能导致杀虫蛋白的产生。这些杀虫蛋白涵盖于在本发明之中，并且可以在本发明的这些方法中使用。应当理解的是当在植物中表达时将有必要将替代起始密码子改变为ATG以用于正确的翻译。

[0048] 还涵盖了针对本发明的多肽、或它们的变体或片段的抗体。用于生产抗体的方法在本领域中是众所周知的(参见例如Harlow(哈洛)和Lane(莱恩)(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体：实验指南》),冷泉港实验室,冷泉港,纽约州；美国专利号4,196,265)。

[0049] 还涵盖了针对本发明的多肽、或它们的变体或片段的抗体。用于生产抗体的方法在本领域中是众所周知的(参见例如Harlow(哈洛)和Lane(莱恩)(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体：实验指南》),冷泉港实验室,冷泉港,纽约州；美国专利号4,196,265)。

[0050] 因此，本发明的一个方面涉及与本发明的这些蛋白质或肽分子中的一个或多个以及它们的同源物、融合物或片段特异性结合的抗体、单链抗原结合分子或其他蛋白质。在一个特别优选的实施例中，该抗体与具有在SEQ ID NO：2或3中列出的氨基酸序列的一种蛋白质或其片段特异性地结合。在另一个实施例中，该抗体与包括从SEQ ID NO：2或3中列出的氨基酸序列中所选择的一种氨基酸序列的一种融合蛋白或其片段特异性地结合。

[0051] 本发明的抗体可以用于定量地或定性地检测本发明的这些蛋白质或肽分子，或检测这些蛋白质的翻译后修饰。如在此所使用的，一种抗体或肽被认为与本发明的一种蛋白质或肽分子“特异性地结合”，如果这样的结合没有被非相关分子的存在所竞争性地抑制的话。

[0052] 改变或改进的变体

[0053] 应当认识到，可以通过不同的方法来改变一种杀虫蛋白的DNA序列，并且这些改变可以导致编码以下蛋白质的DNA序列，这些蛋白质具有不同于由本发明的一种杀虫蛋白所编码的氨基酸序列的那些。这种蛋白质可以按照不同的方式进行改变，包括SEQ ID NO:2或3的一个或多个氨基酸的氨基酸置换、缺失、截短、以及插入，包括达到大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约7、大约8、大约9、大约10、大约15、大约20、大约25、大约30、大约35、大约
40、大约45、大约50、大约55、大约60、大约65、大约70、大约75、大约80、大约85、大约90、大约
100、大约105、大约110、大约115、大约120、大约125、大约130、大约135、大约140、大约145、大约150、大约155个、或更多氨基酸置换、缺失或插入。用于此类操作的方法在本领域内是总体上己知的。例如，可以通过在DNA中的突变来制备一种杀虫蛋白的氨基酸序列变体。这还可以通过几种诱变形式之一和/或在定向进化中来完成。在某些方面，在该氨基酸序列中所编码的改变将基本上不影响该蛋白质的功能。此类变体将具有所希望的杀虫活性。然而，应当理解，一种杀虫蛋白赋予杀虫活性的能力可以通过对本发明的这些组合物使用此类技术来进行改进。例如，可以在以下宿主细胞中表达一种杀虫蛋白，这些宿主细胞在DNA复制过程中显示出高比率的的碱基错误结合，如XL-l Red(Stratagene,La Jolla(拉荷亚),加利福尼亚州)。在此类菌株中繁殖之后，可以分离出该DNA(例如通过制备质粒DNA，或通过由PCR进行扩增并且将得到的PCR片段克隆到一个载体中)，在一种非诱变菌株中培养这些杀虫蛋白突变体，并且鉴定具有杀虫活性的经突变的基因，例如通过进行一项对杀虫活性进行测试的测定。总体上，在摄食测定中混合并使用了这种蛋白质。参见例如Marrone(马罗内)等人(1985)J.of Economic Entomology(《经济昆虫学杂志》)78:290-293。此类测定可以包括使植物与一种或多种害虫接触，并且确定该植物存活和/或造成这些害虫死亡的能力。导致毒性提高的突变的实例见于Schnepf(施内普夫)等人(1998)
Microbiol.Mol.Biol.Rev.(《微生物分子生物学综述》)62:775-806中。

[0054] 可替代地，可以在氨基或羧基的末端上对多种蛋白质的蛋白质序列进行改变，而基本上不影响活性。这可以包括由现代分子方法所引入的插入、缺失、或改变，这些方法如PCR，包括PCR扩增，这些PCR扩增借助于将编码氨基酸的序列包含到在PCR扩增中所使用的寡核苷酸之中而改变或延长了这种编码蛋白质的序列。可替代地，所加入的蛋白质序列可以包括完整的编码蛋白质的序列，如在本领域内通常用于产生蛋白质融合物的那些序列。此类融合蛋白常常用于(1)增加一种感兴趣的蛋白质的表达；(2)引入一个结合结构域、酶活性、或表位以促进蛋白质纯化、蛋白检测、或本领域已知的其他实验用途；或(3)将一种蛋白质的分泌或翻译靶向一个亚细胞器，如革兰氏阴性菌的壁膜间隙，或真核细胞的内质网，后者常常导致蛋白质的糖基化。

[0055] 本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还涵盖了由诱变和引起重组的程序(如DNA改组)所衍生的序列。使用此类操作，可以将一个或多个不同的杀虫蛋白编码区用来创造出一种具有所希望的性质的新的杀虫蛋白。按照这种方式，从包含以下序列区域的相关序列多核苷酸的种群中产生重组多核苷酸的文库，这些序列区域具有充分的序列一致性并且可以在体外或体内进行同源重组。例如，使用这种方法，可以将编码一个感兴趣的结构域的序列基序在本发明的一个杀虫蛋白基因与其他已知的杀虫蛋白基因之间进行改组，以获得编码一种蛋白质的新基因，该蛋白质具有一种改进的感兴趣的性质，例如一种增加的杀昆虫活性。针对这样的DNA改组的策略在本领域中是已知的。参见例如Stemmer(施特默尔)(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)91:10747-10751；Stemmer(施特默尔)(1994)Nature(《自然》)370:389-391；Crameri(克莱默)等人(1997)Nature Biotech.(《自然生物技术》)15:436-438；Moore(穆尔)等人(1997)J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)272:336-347；Zhang(张)等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)94:
4504-4509；Crameri(克莱默)等人(1998)Nature(《自然》)391:288-291；以及美国专利号5,
605,793和5,837,458。

[0056] 结构域交换或改组是针对产生了经改变的杀虫蛋白的另一种机制。可在杀虫蛋白之间交换结构域，从而导致具有改进的杀虫活性或目标谱的杂合或嵌合毒素。用于产生重组蛋白以及对它们进行杀虫活性测试的方法在本领域中是众所周知的(参见例如Naimov等人(2001)Appl.Environ.Microbiol.(《应用环境微生物学》)67:5328-5330；de Maagd等人(1996)Appl.Environ.Microbiol.(《应用环境微生物学》)62:1537-1543；Ge等人(1991)J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)266:17954-17958；Schnepf(施内普夫)等人(1990)J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)265:20923-20930；Rang(朗)等人91999)Appl.Environ.Microbiol.(《应用环境微生物学》)65:2918-2925)。

[0057] 载体

[0058] 本发明的一个杀虫序列可以在用于在一种感兴趣的植物中表达的表达盒中得到提供。“植物表达盒”一词是指一个DNA构建体，该构建体能够导致一种蛋白质在一种植物细胞中从一个开放阅读框中的表达。典型地，这些构建体包含一个启动子以及一种编码序列。经常，此类构建体还将包含3'非翻译区。此类构建体可以包含一个“信号序列”或“前导序列”，以促进该肽的共翻译成或翻译后运输至某些细胞内结构，如叶绿体(或其他质体)、内质网、或高尔基体。

[0059] “信号序列”一词是指一个序列，该序列是已知或怀疑导致跨过该细胞膜的共翻译或翻译后肽运输的。在真核生物中，这典型地涉及分泌到高尔基体内，其中具有某些产生的糖基化。细菌的杀昆虫毒素经常被合成为原毒素，它们是在该目标害虫的肠中以蛋白水解的方式激活(Chang(1987)Methods Enzymol.(《酶学方法》)153:507-516)。在本发明的一些实施例中，该信号序列位于该天然的序列中，或可以衍生自本发明的一个序列。“前导序列”一词是指当被翻译时导致足以触发该肽链的共翻译运输至一个亚细胞器的氨基酸序列的任何序列。因此，这包括通过进入内质网内，进入液泡、质体(包括叶绿体、线粒体)等中来对运输和/或糖基化进行靶向的前导序列。

[0060] “植物转化载体”一词是指一种DNA分子，该分子对于有效转化一个植物细胞而言是所必需的。这种分子可以由一个或多个植物表达盒组成，或可以被组织进入超过一个的“载体”DNA分子中。例如，二元载体是植物转化载体，它们利用两个非邻近的DNA载体来编码用于植物细胞转化的所有需求的顺式和反式作用功能(Hellens and Mullineaux(2000)Trends in Plant Science5:446-451)。“载体”是指用于在不同的宿主细胞之间进行转移的核酸构建体。“表达载体”是指一种载体，该载体具有将异源的DNA序列或片段结合、整合到一种外源细胞中并且在其中表达该异源DNA序列或片段的能力。该盒将包括与本发明的一个序列可操作地连接的5'和/或3'的调节序列。“可操作地连接”一词是指在一个启动子与一个第二序列之间的功能性连接，其中该启动子序列引发并介导了对应于该第二序列的DNA序列的转录。总体上，可操作地连接意味着被连接的核酸序列是相邻的并且(在有必要时连结两个蛋白质编码区)是在相同的阅读框中相邻的。该盒可以额外地包含至少一种有待共转化到生物体中的额外的基因。可替代地，可以在多个表达盒上提供这种或这些额外的基因。

[0061] 在不同的实施例中，本发明的核苷酸序列与一种启动子(例如一种植物启动子)可操作地连接。“启动子”是指一个核酸序列，该核酸序列发挥作用以指导一种下游编码序列的转录。该启动子连同其他转录和翻译的调节性核酸序列(也被称为“控制序列”)是一个感兴趣的DNA序列的表达所必需的。

[0062] 这种表达盒配备有多个限制位点，这些限制位点用于插入该杀虫序列以便处于这些调节区的转录调节之下。

[0063] 该表达盒将以5'至3'的转录方向包括一个转录和翻译的起始区(即，一个启动子)、本发明的一种DNA序列、以及在植物中发挥作用的一个翻译和转录的终止区(即，终止区)。该启动子对于该植物宿主和/或本发明的DNA序列而言可以是天然的或类似的、或外源的或异源的。额外地，该启动子可以是天然序列或可替代地是一个合成序列。在该启动子对于该植物宿主而言是“天然的”或“同源的”时，它是指该启动子是在该启动子所引入的天然植物中被发现的。在启动子对于本发明的DNA序列而言是“外源的”或“异源的”时，它是指该启动子对于可操作地连接的本发明的DNA序列而言不是天然的或自然发生的启动子。

[0064] 该终止区对于转录起始区而言可以是天然的，对于可操作地连接的感兴趣的DNA序列而言可以是天然的，对于该植物宿主而言可以是天然的，或可以衍生自另一种来源(即，对于该启动子、该感兴趣的DNA序列、该植物宿主、或它们的任何组合而言是外源的或异源的)。方便的终止区可以获自根瘤土壤杆菌的Ti质粒，如章鱼碱合酶以及胭脂碱合酶的终止区。另见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)262:141-144；Proudfoot(普劳德富特)(1991)Cell(《细胞》)64:671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.(《基因与发育》)5:141-149；Mogen(摩根)等人(1990)Plant Cell(《植物细胞》)
2:1261-1272；Munroe(芒罗)等人(1990)Gene(《基因》)91:151-158；Ballas(巴拉斯)等人(1989)Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)17:7891-7903；以及Joshi(乔希)等人(1987)Nucleic Acid Res.(《核酸研究》)15:9627-9639。

[0065] 在适当时，可以针对在经转化的宿主细胞中的表达增加来优化这种或这些基因。即，可以使用宿主细胞偏爱的密码子来合成这些基因用于改进的表达，或可以通过以一个宿主偏爱的密码子使用频率来使用密码子来合成这些基因。总体上，该基因的GC含量将会增加。例如，对于对宿主偏爱的密码子使用的讨论，见Campbell(坎贝尔)和Gowri(格里)(1990)Plant Physiol.(《植物生理学》)92:1-11。用于合成植物偏爱的基因的方法在本领域内是可供使用的。参见例如美国专利号5,380,831,和5,436,391，美国专利申请号
20090137409，以及Murray(默里)等人(1989)Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)17:477-
498，将其通过引用结合于此。

[0066] 在一个实施例中，将该杀虫蛋白靶向叶绿体而用于表达。按照这种方式，当该杀虫蛋白不直接被插到该叶绿体中时，该表达盒将额外地包含一个编码转运肽的核酸以便将该杀虫蛋白指向该叶绿体。此类转运肽在本领域中是已知的。参见例如Von Heijne(范海涅)等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.(《植物分子生物导报》)9:104-126；Clark(克拉克)等人(1989)J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)264:17544-17550；Della-Cioppa(黛拉-乔帕)等人(1987)Plant Physiol.(《植物生理学》)84:965-968；Romer(罗默)等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.(《生物化学与生物物理研究通讯》)196:1414-1421；以及Shah(沙阿)等人(1986)Science(《科学》)233:478-481。

[0067] 可以针对在叶绿体中的表达来优化被靶向该叶绿体的杀虫蛋白基因，以便将在该植物细胞核与这种细胞器之间在密码子使用方面的差异考虑在内。按照这种方式，可以使用叶绿体偏爱的密码子来合成感兴趣的核酸。见，例如，美国专利号5,380,831，将其通过引用结合在此。

[0068] 植物转化

[0069] 本发明的方法涉及将一个核苷酸构建体引入植物中。“引入”一词是指按照以下方式将该核苷酸构建体给予该植物，使得该构建体获得了接近该植物的一个细胞的内部的途径。本发明的方法不要求用于将一个核苷酸构建体引入植物中的一种具体方法，只要求该核苷酸构建体获得了接近该植物的至少一个细胞的内部的途径。用于将核苷酸构建体引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于：稳定转化法、瞬时转化法、以及病毒-介导法。

[0070] “植物”一词是指整个植物、植物器官(例如，叶子、茎、根、等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚芽以及以上的子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

[0071] “转基因植物”或“经转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指已经将外源的核酸序列或DNA片段并入或整合到该植物细胞中的植物。这些核酸序列包括外源的、或不存在于该未经转化的植物细胞中的那些序列，连同可以是内源的、或存在于该未经转化的植物细胞中的那些序列。“异源的”大体上是指以下核酸序列，这些核酸序列对于它们所在的细胞或天然基因组的一部分而言不是内源的，并且已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔、微粒轰击、或类似方法加到该细胞中。

[0072] 本发明的这些转基因植物表达在此所披露的这些新颖的毒素序列中的一种或多种。在不同实施例中，该转基因植物进一步包括针对昆虫抗性的一种或多种额外基因(例如，Cry1，如Cry1A、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1E和Cry1F家族的成员；Cry2，如Cry2A家族的成员；Cry9，如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员；等等)。本领域的普通技术人员将会理解的是，该转基因植物可以包括赋予一种感兴趣的农艺性状的任何基因。

[0073] 可通过在本领域内已知的几种技术之一来实现植物细胞的转化。可以对本发明的杀虫基因进行修饰以便在植物细胞中获得或增强表达。典型地，表达这种蛋白质的一个构建体将包含一个驱动该基因的转录的启动子，连同一个允许转录终止和多腺苷酸化的3'非翻译区。此类构建体的组织在本领域内是熟知的。在一些情况下，它可有用于对该基因进行工程化处理，这样使得得到的肽被分泌、或者以其他方式靶向到在植物细胞中。例如，该基因可以经工程化处理以包含一个信号肽来促进该肽到内质网的转移。还可以优选工程化处理该植物表达盒以包含一个内含子，这样使得该内含子的mRNA加工是表达所要求的。

[0074] 典型地，这种“植物表达盒”将被插入一种“植物转化载体”中。这种植物转化载体可以包括对于实现植物转化所需要的一个或多个DNA载体。例如，利用包括超过一种相邻的DNA区段的植物转化载体在本领域内是一种常见的实践。在本领域内，这些载体经常被称为“二元载体”。二元载体连同具有辅助质粒的载体最常用于土壤杆菌-介导的转化，其中对于实现有效转化所需要的DNA区段的大小和复杂性是相当大的，并且将功能分散到分开的DNA分子上是有利的。二元载体典型地包含一种质粒载体，该质粒载体包含对于T-DNA转移所要求的顺式作用序列(如左边界和右边界)、经工程化处理以便能够在一个植物细胞中表达的一个选择标记物、以及一个“感兴趣的基因”(一个经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的基因，对于它而言转基因植物的产生是所希望的)。在这种质粒载体上还存在着细菌复制所要求的序列。这些顺式作用序列以一种方式进行排列使得允许有效转移到植物细胞中并在其中进行表达。例如，该选择标记物基因以及该杀虫蛋白基因位于该左边界与右边界之间。经常，一个第二质粒载体包含了介导T-DNA从土壤杆菌转移到植物细胞的反式作用因子。这种质粒经常包含这些毒性功能(Vir基因)，这些毒性功能允许由土壤杆菌感染植物细胞，并且通过在边界序列上的切割以及vir-介导的DNA转移来转移DNA，如在本领域中所理解(Hellens(海伦斯)和Mullineaux(马利诺)(2000)Trends in Plant Science(《植物科学趋势》)5:446-451)。几种类型的土壤杆菌属菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105、等)可以用于植物转化。该第二质粒载体是通过其他方法(如微粒轰击、显微注射、电穿孔、聚乙二醇、等)转化这些植物所不需要的。

[0075] 总体上，植物转化法类涉及将异源DNA转移到目标植物细胞(例如，未成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体、等)中，之后跟随应用了一个最大阈值水平的合适选择(取决于这种选择标记物基因)，以便从一群未经转化的细胞团中回收这些经转化的植物细胞。典型地将外植体转移到一种新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。随后，在被置于补充有一种最大阈值水平的选择试剂的再生培养基上之后，这种经转化的细胞被分化成芽。然后，将这些芽转移到一种选择性生根培养基中用于回收已生根的芽或小植株。然后，该转基因小植株生长为一株成熟植物并且产生可繁殖的种子(例如Hiei(日江井)等人(1994)The Plant Journal(《植物杂志》)6:271-282；Ishida(石田)等人(1996)Nature Biotechnology(《自然生物技术》)14:745-750)。典型地将外植体转移到一种新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。用于产生转基因植物的技术和方法的总体说明可见于Ayres(艾尔斯)和Park(帕克)(1994)Critical Reviews in Plant Science(《植物科学评论》)13:219-239以及Bommineni(博米尼尼)和Jauhar(裘哈尔)(1997)Maydica42:107-
120。因为这种经转化的材料包含多个细胞；经转化的和未转化的细胞存在于受试的目标愈伤组织或组织或细胞组群的任何部分中。杀死未经转化的细胞并允许经转化的细胞进行增殖的能力导致了经转化的植物培养物。经常，去除未经转化的细胞的能力是快速回收经转化的植物细胞以及成功产生转基因植物的一个限制。

[0076] 转化方案连同用于将核苷酸序列引入植物的方案可依据靶向用于转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶或双子叶)而变化。转基因植物的产生可以通过几种方法之一来进行，包括但不限于：显微注射、电穿孔、直接的基因转移、由土壤杆菌将异源DNA引入植物细胞中(土壤杆菌-介导的转化)、用粘附于粒子上的异源外源DNA来轰击植物细胞、射弹粒子加速(ballistic particle acceleration)、气溶胶束转化(aerosol beam transformation)(美国公开申请号20010026941；美国专利号4,945,050；国际公开号WO91/
00915；美国公开申请号2002015066)、Lec1转化、以及用于转移DNA的不同的其他非粒子直接-介导法。

[0077] 用于叶绿体转化的方法在本领域中是已知的。参见例如Svab(什瓦布)等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)87:8526-8530；Svab(什瓦布)和Maliga(马利加)(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)90:913-917；Svab(什瓦布)和Maliga(马利加)(1993)EMBO J.12:601-606。该方法依赖于对包含一种可选择标记物的DNA进行粒子枪输送并且通过同源重组将该DNA靶向质体基因组。额外地，质体转化可以通过一个核编码的以及质体指导的RNA聚合酶的组织偏爱的表达、通过一个沉默的携带质体的转基因的反式激活来完成。这样一种系统已经被报道于McBride(麦克布赖德)等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)91:7301-7305中。

[0078] 在将异源外源DNA整合到植物细胞中之后，然后在该培养基中应用了一种最大阈值水平的合适选择以杀死这些未经转化的细胞，并且通过定期转移到一种新鲜培养基中来分离和增殖这些从这种选择处理中存活的假定经转化的细胞。通过连续传代和使用合适的选择进行攻击，鉴定并增殖了这些用该质粒载体转化的细胞。然后，分子和生物化学的方法可以用于证实整合到该转基因植物的基因组中的感兴趣的异源基因的存在。

[0079] 已经转化的细胞可以根据常规方法长成植物。参见例如McCormick(麦考密克)等人(1986)Plant Cell Reports(《植物细胞报告》)5:81-84。然后，可以让这些植物进行生长，并且用相同的经转化的品系或不同的品系进行授粉，并且鉴定出这种得到的具有所希望的表型特征的组成型表达的杂种。可以生长两代或更多代以确保所希望的表型特征的表达被稳定地维持并遗传，并接着收获种子以确保已经获得了所希望的表型特征的表达。按照这种方式，本发明提供了经转化的种子(也被称为“转基因种子”)，该种子具有本发明的一个核苷酸构建体，例如被稳定地并入它们的基因组中的本发明的表达盒。

[0080] 植物转化的评估

[0081] 在将异源外源DNA引入植物细胞中之后，通过不同的方法来证实异源基因在植物类基因组中的转化或整合，这些方法例如对与该整合的基因相关联的核酸、蛋白质以及代谢产物的分析。

[0082] PCR分析是一种快速的筛选方法，用于针对在移植入土壤中之前的较早阶段的并入基因的存在而对经转化的细胞、组织或芽进行筛选(Sambrook(萨姆布鲁克)和Russell(拉塞尔)(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.(《分子克隆：实验指南》)冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约州)。PCR是使用对感兴趣的基因或土壤杆菌载体背景等特异的寡核苷酸引物类来进行。

[0083] 可以通过基因组DNA的DNA印迹分析来证实植物类转化(Sambrook(萨姆布鲁克)和Russell(拉塞尔)，2001，同上)。总体上，从该转化体中提取了总DNA，用合适的限制酶进行消化，在琼脂糖凝胶中进行分级，并且转移至硝酸纤维素或尼龙膜上。然后，根据标准的技术，用例如放射性标记32P的目标DNA片段来探测该膜或“印迹”以证实引入的基因整合到该植物基因组中(Sambrook(萨姆布鲁克)和Russell(拉塞尔)，2001，同上)。

[0084] 在RNA印迹分析中，从该转化体的特定组织中分离了RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中进行分级，并且根据在本领域内是常规的标准操作来印迹到尼龙滤膜上(Sambrook(萨姆布鲁克)和Russell(拉塞尔)，2001，同上)。然后，通过在本领域内已知的方法、通过将该滤膜与衍生自一种杀虫基因的放射性探针进行杂交来测试由该杀虫基因所编码的RNA的表达(Sambrook(萨姆布鲁克)和Russell(拉塞尔)，2001，同上)。

[0085] 可以对转基因植物进行蛋白质印迹、生物化学测定、以及类似测定，以便通过标准操作来证实由该杀虫基因所编码的蛋白质的存在(Sambrook(萨姆布鲁克)和Russell(拉塞尔)，2001，同上)，这是使用与在该杀虫蛋白上存在的一种或多种表位相结合的抗体而进行的。

[0086] 植物中的杀虫活性

[0087] 在本发明的另一个方面，可以产生表达了一种具有杀虫活性的杀虫蛋白的转基因植物。以上通过实例来说明的方法可用于产生转基因植物，但产生这些转基因植物细胞的方式对于本发明而言不是至关重要的。可以依据实验者的判断来使用在本领域内已知或说明的方法，如土壤杆菌-介导的转化、生物射弹转化、以及非-粒子-介导法。可以通过在本领域内所说明的普通方法来分离表达一种杀虫的植物，这些方法例如通过愈伤组织的转化，经转化的愈伤组织的选择，以及从此类转基因愈伤组织中再生出能育的植物类。在此类方法中，可以使用任何基因作为一个选择标记物，只要它在植物细胞中的表达赋予了鉴定或选择经转化的细胞的能力。

[0088] 已经开发了多种用植物细胞一起使用的标记物，如对于氯霉素、氨基糖甙G418、潮霉素、以及类似物的抗性。编码了参与叶绿体代谢的产物的其他基因也可以用作选择标记物。例如，提供对于植物除草剂(如草甘磷、溴苯腈、或咪唑琳酮)的抗性的基因可以是特别有用的。此类基因已经被报道(Stalker(斯托克)等人(1985)J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)263:6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；以及Sathasivan等人(1990)Nucl.Acids Res.(《核酸研究》)18:2188(AHAS咪唑并啉酮抗性基因))。额外地，在此所披露的这些基因用作标记物来评估细菌的或植物的细胞的转化。用于检测在一种植物、植物器官(例如，叶子、茎、根、等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或以上的子代中转基因的存在的方法是本领域内所熟知的。在一个实施例中，通过对杀虫活性进行测试来检测该转基因的存在。

[0089] 可以针对杀虫活性来对表达一种杀虫蛋白的能育的植物进行测试，并且对显示出最佳活性的植物进行选择用于进一步的育种。在本领域内对害虫活性进行测定的方法是可供使用的。总体上，在摄食测定中混合并使用了这种蛋白质。参见例如Marrone(马罗内)等人(1985)J.of Economic Entomology(《经济昆虫学杂志》)78:290-293。

[0090] 本发明可以用于转化任何植物类种类，包括但不限于：单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的实例包括但不限于：玉米(玉蜀黍)、高梁、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、以及油菜、芸苔属植物、苜蓿、黑麦、粟、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔属的树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏性植物、以及针叶树。

[0091] 蔬菜包括但不限于：番茄、莴苣、青豆、利马豆、豌豆，以及甜瓜属(genus Curcumis)的成员，如黄瓜、网纹甜瓜、以及甜瓜。观赏性植物包括但不限于：杜鹃花属、绣球属、木槿属、蔷薇属、郁金香、水仙属、碧冬茄属、康乃馨、一品红、以及菊花。优选地，本发明的植物是农作物植物(例如，玉蜀黍、高梁、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜、等)。

[0092] 在虫害控制方面的用途

[0093] 在虫害控制或工程化处理其他生物中用于采用多种菌株作为杀虫剂的总体方法在本领域内是已知的，这些菌株包括了本发明的一个核苷酸序列或它的一种变体。参见例如美国专利号5,039,523和EP0480762A2。

[0094] 包含本发明的一个核苷酸序列、或它的一个变体的芽孢杆菌菌株、或已经被遗传改变而包含本发明的一种杀虫基因和蛋白质的微生物可用于保护农业作物以及产品免受害虫的侵害。在本发明的一个方面，用以下试剂来处理一种产生毒素(杀虫剂)的生物的完整的(即，未裂解的)细胞，当这些细胞被施用到一种或多种目标害虫的环境时这些试剂延长了在该细胞中产生的毒素的活性。

[0095] 可替代地，通过将一种杀虫蛋白基引入到一个细胞宿主中来产生该杀虫剂。该杀虫基因的表达直接或间接地导致了该杀虫剂的细胞内产生和维持。在本发明的一个方面，然后在以下条件下对这些细胞进行处理，当该细胞被施用到这种或这些目标害虫的环境时这些条件延长了在该细胞中产生的毒素的活性。得到的产物保留该毒素的毒性。然后，可以按照常规技术来配制这些天然胶囊化的杀虫剂，用于施用到栖宿着一种目标害虫的环境(例如，土壤、水、以及植物的叶)。参见，例如EPA0192319，以及其中所引用的文献。可替代地，可配制表达本发明的一个基因的这些细胞，以便允许得到的材料作为一种杀虫剂的施用。

[0096] 本发明的活性成分通常以组合物的形式进行施用，并且可以同时或相继地与其他化合物一起施用到有待处理的作物区域或植物中。这些化合物可以是肥料、除草剂、冷冻保护剂(cryoprotectants)、表面活性剂、洗涤剂、杀虫肥皂(pesticidal soaps)、休眠喷洒油(dormant oils)、聚合物、和/或定时释放或生物可降解的载体配制品，这些配制品允许在单次施用该配制品之后对一个目标面积进行长期给药。它们还可以是选择性除草剂、化学杀昆虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些配制品中的几种的混合物，如果希望的话，与其他农业上可接受的载体、表面活性剂或在配制品领域内通常采用的促进施用的佐剂一起。合适的载体和佐剂可以是固体或液体，并且相应于在配制技术中常常采用的物质，例如天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。同样地，可将这些配制品制备成可食用的“诱饵”或塑造成害虫“陷阱”以允许由一种目标害虫来摄食或摄取该杀虫配制品。

[0097] 施用本发明的一种活性成分或本发明的一种农业化学组合物(该组合物包含由本发明的细菌菌株所产生的这些杀虫蛋白中的至少一种)的方法包括叶施用、种子涂覆和土壤施用。施用次数以及施用率取决于由相对应的害虫所侵染的强度。

[0098] 可以将该组合物配制成一种粉末、粉尘、小粒、颗粒、喷雾、乳液、胶体、溶液、或类似剂型，并且可以通过以下常规方法来制备该组合物，这些方法例如包括该多肽的多个细菌细胞的一种培养物的干燥、冷冻干燥、均化、提取、过滤、离心、沉降、或浓缩。在包含至少一种这种杀虫多肽的所有此类组合物中，该多肽可以按照按重量计从大约1％至大约99％的浓度而存在。

[0099] 可以在一个给定的区域内通过本发明的这些方法来杀死鳞翅目的、半翅目、双翅目的、或鞘翅目的害虫或减少其数目，或可以将它们预防性地施用到一个环境区域内以防止由一种易受影响的害虫的侵染。优选地，这种害虫摄取、或接触了一个杀虫有效量的该多肽。“杀虫有效量”一词是指该杀虫剂的一个量值，该量值能够引起至少一个害虫的死亡、或明显减少害虫的生长、摄食、或正常的生理发育。这个量值将取决于以下因素而变化：例如，有待控制的特定的目标害虫，由待处理的特定的环境、地点、植物、作物、或农业场所，环境条件，以及施用在杀虫上有效的多肽组合物的方法、速率、浓度、稳定性、以及数量。这些配制品还可以根据气候条件、环境考虑、和/或施用频率和/或害虫侵染的严重度而变化。

[0100] 可通过将该细菌细胞、该晶体、和/或该孢子悬浮物、或该分离的蛋白质组分与所希望的农业上可接受的载体配制在一起来制备所说明的杀害虫剂组合物。在施用之前，可以用一种合适的手段(如冻干、冷冻干燥、干燥的，或在一种水性载体、介质或合适的稀释剂，如盐水或其他缓冲液中)配制这些组合物。这些经配制的组合物可以处于以下形式：一种粉尘或颗粒材料、或一种在油(植物性或矿物性)中的悬浮体、或水或油/水乳液、或作为一种可湿性粉末、或与适合于农业施用的任何其他载体材料相组合。合适的农业载体可以是固体的或液体的，并且在本领域中是众所周知的。术语“农业上可接受的载体”覆盖了所有佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂、等等，它们在杀虫剂配制技术中是常用的；这些对于杀虫剂配制领域的普通技术人员而言是熟知的。这些配制品可以与一种或多种固体或液体佐剂相混合，并且通过不同的手段进行制备，例如通过使用常规的配制技术将这种杀虫组合物与合适的佐剂进行均匀地混合、掺合和/或研磨。合适的配制品和施用方法说明于美国专利号6,468,523中，将该文献通过引用结合在此。

[0101] “害虫”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱、以及类似物。虫害包括选自以下的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目、虱目(Anop1ura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)、等等，特别是鞘翅目、鳞翅目、以及双翅目。

[0102] 鞘翅目包括肉食亚目(suborder Adephaga)和多食亚目(suborder Polyphaga)。肉食亚目包括步甲总科(superfamily Caraboidea)和豉甲总科(superfamily
Gyrinoidea)，而多食亚目包括牙甲总科(superfamily Hydrophi1oidea)、隐翅甲总科(superfamily Staphylinoidea)、花萤总科(superfamily Cantharoidea)、郭公虫总科(superfamilyCleroidea)、叩头虫总科(superfamily Elateroidea)、花甲总科
(superfamily Dascilloidea)、泥甲总科(superfamily Dryopoidea)、九甲总科
(superfamily Byrrhoidea)、扁甲总科(superfamily Cucujoidea)、芜菁总科
(superfamily Meloidea)、花蚤总科(superfamily Mordelloidea)、拟步甲总科
(superfamily Tenebrionoidea)、长蝽总科(superfamily Bostrichoidea)、金龟总科(superfamily Scarabaeoidea)、天牛总科(superfamily Cerambycoidea)、叶甲总科(superfamily Chrysomeloidea)以及象甲总科(superfamily Curculionoidea)。步甲总科包括虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)、以及龙虱科(Dytiscidae)。豉甲总科包括豉甲科(family Gyrinidae)。牙甲总科包括牙甲科(family Hydrophilidae)。隐翅甲总科包括葬甲科(family Silphidae)和隐翅甲科(family Staphylinidae)。花萤总科包括花萤科(family Cantharidae)和萤科(family Lampyridae)。郭公虫总科包括郭公虫科(C1eridae)和皮蝽科(Dermestidae)。叩头虫总科包括叩头虫科(Elateridae)和吉丁虫科(Buprestidae)。扁甲总科包括瓢虫科(Coccinellidae)。芫菁总科包括芜菁科(Meloidae)。
拟步甲总科包括拟步甲科(Tenebrionidae)。金龟总科包括黑蜕科(Passalidae)和金龟科(Scarabaeidae)。天牛总科包括天牛科(Cerambycidae)。叶甲总科包括叶甲科
(Chrysomelidae)。象甲总科包括象甲科(Curculionidae)和小蝽科(Scolytidae)。

[0103] 双翅目包括长角亚目(Nematocera)、短角亚目(Brachycera)、以及环裂亚目(Cyclorrhapha)。长角亚目包括大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、摇蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)、以及瘿蚊科(Cecidomyiidae)。短角亚目包括水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、剑虻科(Therevidae)、食虫虻科(Asilidae)、拟食虫虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)、以及长足虻科(Dolichopodidae)。环裂亚目包括无缝组(Division Aschiza)和有缝组(Division Schizophora)。无缝组包括蚤蝇科(Phoridae)、蚜蝇科(Syrphidae)和眼蝇科(Conopidae)。有缝组包括无瓣类(Acalyptratae)和有瓣类(Calyptratae)。无瓣类包括斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科
(Agromyzidae)、以及果蝇科(Drosophilidae)。有瓣类包括虱蝇科(Hippoboscidae)、狂蝇科(Oestridae)、寄蝇科(Tachinidae)、花蝇科(Anthomyiidae)、蝇科(Muscidae)、丽蝇科(Calliphoridae)、以及麻蝇科(Sarcophagidae)。

[0104] 鳞翅目包括凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、天蚕蛾科(Saturniidae)、尺娥科(Ceometridae)、灯娥科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)、以及谷蛾科(Tineidae)。

[0105] 对于主要农作物的本发明的虫害包括：玉米：玉米螟(Ostrinia nubilalis)，欧洲玉米螟(European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon)，黑地老虎(black cutworm)；谷实夜娥(Helicoverpa zea)，棉铃虫(corn earworm)；草地夜娥(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾(fall armyworm)；西南玉米秆草螟(Diatraea grandiosella)，西南玉米螟(southwestern corn borer)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米秆螟(lesser cornstalk borer)；小蔗秆草螟(Diatraea saccharalis)，小蔗秆草螟(surgarcane borer)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)，西方玉米根螟(western corn rootworm)；长角叶甲巴氏亚种(Diabrotica longicornis barberi)，北方玉米根螟(northern corn rootworm)；黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi)，南方玉米根螟(southern corn rootworm)；梳爪叩头虫属(Melanotus spp.)，金针虫(wireworms)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis)，北方圆头犀金龟(蛴螬)；南方圆头犀金龟(Cyclocephala immaculata)，南方圆头犀金龟(蛴螬)；日本弧丽金龟(Popillia japonica)，日本金龟子；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria)，玉米跳甲；玉米隐啄象(Sphenophorus maidis)，玉米谷象；玉米缢管蚜(Rhopa1osiphum maidis)，玉米叶蚜虫；玉米根蚜(Anuraphis maidiradicis)，玉米根蚜虫；美洲谷长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)，高粱长蝽；赤胫黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，红胫蝗虫(redlegged grasshopper)；血黑蝗(Melanoplus sanguinipes)，迁徙蝗虫；玉米种蝇(Hylemya platura)，种蝇；玉米斑潜蝇(Agromyza parvicornis)，玉米斑潜蝇(Corn blot leafminer)；玉米黄蓟马(Anaphothrips obscrurus)，草蓟马；窃蚁(Solenopsis milesta)，窃蚁(thief ant)；二斑叶螨(Tetranychus urticae)，二斑叶螨(twospotted spider mite)；高粱：斑禾草螟(Chilo partellus)，高粱螟；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾；谷实夜娥(Helicoverpa zea)，棉铃虫；南美玉米苗斑螟
(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米秆螟；粒肽脏切夜娥(Feltia subterranea)，颗粒地老虎(granulate cutworm)；长毛食叶然金龟(Phyllophaga crinita)，蛴螬；伪金针虫属(Eleodes spp.)，叩头虫属(Conoderus spp.)，以及Aeolus属，蛴螬；黑角负泥虫(Oulema melanopus)，谷类叶甲；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria)，玉米跳甲；玉米隐啄象(Sphenophorus maidis)，玉米谷象；玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis)，玉米叶蚜；美甘蔗伪毛蚜(Sipha f1ava)，黄甘蔗蚜；美洲谷长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)，高粱长蝽；高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola)，粱痪蚊(sorghum midge)；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)，朱砂叶螨；二斑叶蹒(Tetranychus urticae)，二斑叶蹒；小麦：一点黏虫(Pseuda1etia unipunctata)，黏虫；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米秆螟；西方灰地老虎(Agrotis orthogonia)，西方地老虎；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米秆螟；黑角负泥虫(Oulema melanopus)，谷类叶甲；三叶草叶象(Hypera punctata)，三叶草叶象；黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi)，南方玉米根螟；俄罗斯小麦蚜虫；麦二叉蚜(Schizaphis graminum)，麦二叉蚜；麦长管蚜(Macrosiphum avenae)，麦长管蚜；赤胫黑蝗(Melanoplusfemurrubrum)，赤胫黑蝗；异黑蝗(Melanoplus differentia1is)，异黑蝗；血黑蝗(Melanoplus sanguinipes)，迁徙蝗虫；小麦瘿蚊(Mayetiola destructor)，小麦瘿蚊(Hessian fly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana)，麦蛆(wheat midge)；美洲杆蝇(Meromyza americana)，美洲麦秆黄潜蝇(wheat stem maggot)；麦疫种蝇(Hylemya coarctata)，麦种蝇(wheat bulb fly)；烟褐花蓟马(Frankliniella fusca)，烟草蓟马；麦茎蜂(Cephus ductus)，麦茎蜂；曲叶螨(Aceria tulipae)，小麦曲叶螨(wheat curl mite)；向日葵：向日葵芽卷叶娥(Suleima helianthana)，向日葵芽娥；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum)，向日葵娥；向日葵叶甲(zygogramma exclamationis)，向日葵甲虫；胡萝卜利犀金龟(Bothyrus gibbosus)，胡萝卜甲虫；向日葵籽瘿蚊(Neolasioptera murtfeldtiana)，向日葵籽蠓；棉花：烟芽夜娥(Heliothis virescens)，棉花蚜虫；谷实夜娥(Helicoverpa zea)，棉铃虫；甜菜夜娥(Spodoptera exigua)，甜菜夜娥；红铃麦娥(Pectinophora gossypiella)，粉色棉铃虫；棉铃象(Anthonomus grandis)，棉子象鼻虫；棉蚜(Aphis gossypii)，棉花蚜虫；棉序盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)，棉花跳盲蝽；温室粉虱(Trialeurodes abutilonea)，带状翅白粉虱(bandedwinged whitefly)；美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)，牧草盲蝽；赤胫黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，红胫蝗虫；异黑蝗(Melanoplus differentialis)，异黑蝗；烟蓟马(Thrips tabaci)，洋葱蓟马；烟褐花蓟马(Franklinkiella fusca)，烟蓟马；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)，朱砂叶螨；二斑叶螨(Tetranychus urticae)，二斑叶螨；稻：小蔗杆草螟(Diatraea saccharalis)，甘蔗螟；草地夜娥(Spodoptera frugiperda)，秋夜娥；谷实夜娥(Helicoverpa zea)，棉铃虫；葡萄鞘叶甲(Colaspis brunnea)，葡萄鞘叶甲；稻水象(Lissorhoptrus oryzophilus)，稻水象；米象(Sitophilus oryzae)，米象；二条黑尾叶蝉(Nephotettix nigropictus)，米叶蝉；美洲谷长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)，高粱长蝽；拟缘蝽(Acrosternum hilare)，绿蝽；大豆：大豆夜娥(Pseudoplusia includens)，大豆尺夜娥(soybean looper)；梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，夜蛾科；苜蓿绿夜娥(Plathypena scabra)，苜蓿绿夜娥；玉米螟(Ostrinia nubilalis)，欧洲玉米螟；小地老虎(Agrotis ipsilon)，黑地老虎；甜菜夜娥(Spodoptera exigua)，甜菜夜娥；烟芽夜娥(Heliothis virescens)，棉花蚜虫；谷实夜娥(Helicoverpa zea)，棉铃虫；墨西哥大豆瓢虫(Epilachna varivestis)，墨西哥大豆瓢虫；桃蚜(Myzus persicae)，桃蚜；蚕豆微叶蝉(Empoasca fabae)，马铃薯叶蝉；拟缘蝽(Acrosternum hilare)，绿蝽；赤胫黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，赤胫黑蝗；异黑蝗(Melanoplus differentialis)，异黑蝗；玉米种蝇(Hylemya platura)，玉米种蝇；大豆蓟马
(Sericothrips variabilis)，大豆蓟马；烟蓟马(Thrips tabaci)，洋葱蓟马；草莓叶螨(Tetranychus turkestani)，草莓叶螨；二斑叶螨(Tetranychus urticae)，二斑叶螨；大麦：玉米螟(Ostrinia nubilalis)，欧洲玉米螟；小地老虎(Agrotis ipsilon)，黑地老虎；
麦二叉蚜(Schizaphis graminum)，麦二叉蚜(greenbug)；美洲谷长蝽(leucopterus leucopterus)，高粱长蝽；拟缘蝽(Acrosternum hilare)，绿蝽；烟草蝽(Euschistus servus)，茶色蝽；灰地种蝇(Delia platura)，种蝇；小麦瘿蚊(Mayetiola destructor)，小麦瘿蚊；潜岩螨(Petrobia latens)，麦长腿蜘蛛；油料种子油菜：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)，卷心菜蚜；蔬菜黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae)，跳甲；蓓带夜娥(Mamestra configurata)，贝莎夜蛾(Bertha armyworm)；菜蛾(Plutella xylostella)，小菜蛾；地种蝇属(Delia ssp.)，根蛆。

[0106] 线虫包括寄生性线虫，例如根结线虫、胞囊线虫、以及根腐线虫，包括异皮线虫属、根结线虫属、以及球异皮线虫属；特别是胞囊线虫的成员，包括但不限于：大豆异皮线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫)；甜菜异皮线虫(甜菜胞囊线虫)；燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)(燕麦胞囊线虫)；以及马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)以及马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯胞囊线虫)。根腐线虫包括短体线虫属。

[0107] 用于增加植物产量的方法

[0108] 提供了用于增加植物产量的方法。这些方法包括提供表达对在此披露的杀虫多肽序列进行编码的一种多核苷酸的一种植物或植物细胞，并且在一块侵染有(或易受侵染)一种害虫的田地中使该植物或其种子生长，所述多肽具有针对该害虫的杀虫活性。在一些实施例中，该多肽具有针对一种鳞翅目的、鞘翅目的、双翅目的、半翅目的、或线虫目的害虫的杀虫活性，并且所述田地侵染有一种鳞翅目的、半翅目的、鞘翅目的、双翅目的、或线虫目的害虫。如在此所定义的，该植物的“产量”指由该植物所产生的生物质的品质和/或数量。“生物质”一词是指任何经测量的植物产物。生物质产生方面的增加是在所测量的植物产物的产量方面的任何改进。增加植物产量具有几种商业应用。例如，增加植物叶生物质可以增加用于人或动物消费的叶菜的产量。额外地，增加叶生物质可以用于增加植物衍生的药学或工业产物的生产。产量的增加可以包括与一种不表达该杀虫序列的植物相比任何统计学上显著的增加，包括但不限于：产量的至少1％的增加，至少3％的增加，至少5％的增加，至少10％的增加，至少20％的增加，至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大的增加。在特定的方法中，作为对在此所披露的一种杀虫蛋白进行表达的一种植物的改进的害虫抗性的结果，植物产量会增加。该杀虫蛋白的表达导致一种害虫侵染或摄食的能力降低。

[0109] 还可以用一种或多种化学成分来处理植物，这些化学成分包括一种或多种除草剂、杀虫剂、或杀真菌剂。示例性的化学成分包括：果实/蔬菜类除草剂：莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草丁膦、氯吡嘧磺隆(Gowan)、百草枯、戊炔草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、三嗪茚草胺(Indaziflam)；果实/蔬菜类杀虫剂：涕灭威、转苏云金芽孢杆菌、甲萘威、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、二嗪磷、马拉硫磷、阿维菌素、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯、顺式氰戊菊酯、λ-氯氟氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、双苯氟脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、螺螨酯、γ-氯氟氰菊酯、螨酯、多杀菌素、氯虫酰胺、氰虫酰胺、杀虫脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氟虫酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、腈吡螨酯(Cyanopyrafen)、噻虫胺、噻虫嗪、乙基多杀菌素(Spinotoram)、硫双威、氟啶虫酰胺、灭虫威、甲氨基阿维菌素-苯甲酸甲酯、茚虫威、苯线磷、蚊蝇醚、苯丁锡；果实/蔬菜类杀真菌剂：唑嘧菌胺(Ametoctradin)、嘧菌酯、苯噻菌胺(Benthiavalicarb)、啶酰菌胺、克菌丹、多菌灵、百菌清、铜、氰霜唑、环氟菌胺、霜脲氰、环唑醇、嘧菌环胺、恶醚唑、达灭芬(Dimetomorph)、二氰蒽醌、咪唑菌酮、环酰菌胺、氟啶胺、咯菌腈、氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、灭菌丹、三乙膦酸、异菌脲、丙森锌、异皮姆、醚菌酯、代森锰锌、双炔酰菌胺(Mandipropamid)、甲霜灵/精甲霜灵、代森联、苯菌酮、腈菌唑、戊菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、霜霉威、丙环唑、丙森锌、丙氧喹啉、丙硫菌唑、唑菌胺酯、嘧霉胺、喹氧灵、螺环菌胺、硫、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯；谷类除草剂：

[0110] 2.4-D、酰嘧磺隆(Amidosulfuron)、溴苯腈、氟酮唑草-E、绿麦隆、氯磺隆、炔草酯磷、二氯吡啶酸、麦草畏、禾草灵-M、吡氟草胺、精恶唑禾草灵、吡氟草胺、氟卡巴腙钠、氟噻草胺、氟啶嘧磺隆-M(Flupyrosulfuron-M)、氯氟吡氧乙酸、弗勒泰蒙、草甘膦、碘磺隆、碘苯腈、异丙隆、二甲四氯、甲磺胺磺隆、甲磺隆、二甲戊乐灵、唑啉草酯、丙苯、苄草丹、氟磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、肟草酮、醚苯磺隆、苯磺隆、氟乐灵、甲磺隆；谷类杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺(Bixafen)、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、环氟菌胺、环唑醇、嘧菌环胺、醚菌胺、氟环唑、苯锈、丁苯吗啉、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟喹唑、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、异皮姆、醚菌酯、叶菌唑、苯菌酮、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鲜胺、丙环唑、丙氧喹啉、丙硫菌唑、唑菌胺酯、喹氧灵、螺环菌胺、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯；谷类杀虫剂：乐果、λ-三氟氯氰菊酯(λ-cyhalthrin)、溴氰菊酯、顺式氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺(Dinetofuran)、毒死蜱(Clorphyriphos)、抗蚜威、灭虫威、氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)；玉米除草剂：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S-)甲酚噻草胺、草铵膦、草甘膦、异恶唑草酮、(S-)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、苯吡唑草酮(Topramezone)、环磺酮(Tembotrione)、嘧啶肟草醚、酮脲磺草吩酯、氟噻草胺、吡咯磺隆(Pyroxasulfon)；玉米杀虫剂：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、λ-氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、螨酯、氟虫酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、嘧丙磷(Tebupirimphos)、乙虫腈、氰虫酰胺(Cyazypyr)、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺(Dinetofuran)，阿维菌素；玉米杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺(Bixafen)、啶酰菌胺、环唑醇、醚菌胺、氟环唑、种衣酯(Fenitropan)、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、异皮姆、叶菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙环唑、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、肟菌酯；水稻除草剂：丁草胺、敌稗、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草酯、杀草隆、四唑酰草胺、咪唑磺隆、苯噻草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、禾草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、去稗安、苯并双环酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚、稻思达、乙氧嘧磺隆、丙草胺、硝草酮、特糠酯酮(Tefuryltrione)、恶草酮、精恶唑禾草灵、吡丙醚(Pyrimisulfan)；水稻杀虫剂：二嗪农、仲丁威、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼(Chromafenozide)、噻虫胺、乙虫腈、氟虫酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、氰虫酰胺(Cyazypyr)、多杀菌素、乙基多杀菌素(Spinotoram)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、高效氯氰菊酯、毒死蜱、醚菊酯、克百威、丙硫克百威、氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)；水稻杀真菌剂：嘧菌酯、多菌灵、氯环丙酰胺、双氯氰菌胺、恶醚唑、克瘟散、嘧菌腙、庆大霉素、己唑醇、恶霉灵、异稻瘟净(IBP)、稻瘟灵、异噻菌胺、春雷霉素、代森锰锌、苯氧菌胺、肟醚菌胺、戊菌隆、噻菌灵、丙环唑、丙森锌、咯喹酮、戊唑醇、硫甲基、噻酰菌胺、三环唑、肟菌酯、井冈霉素；棉花除草剂：敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、丁基吡氟禾草灵、草甘膦、哒草伏、二甲戊乐灵、嘧硫苯甲酸钠、三氟啶磺隆、得杀草、草铵膦、丙炔氟草胺、塞苯隆；棉花杀虫剂：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿维菌素、啶虫脒、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威、λ-氯氟氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-氯氟氰菊酯、螨酯、三氟甲吡醚(Pyridalyl)、氟啶虫酰胺氟虫酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺(Dinetofuran)、氟虫酰胺、氰虫酰胺(Cyazypyr)、多杀菌素、乙基多杀菌素(Spinotoram)、γ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、三氟甲吡醚(Pyridalyl)、螨酯、氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)；棉花杀真菌剂：嘧嘧菌酯、联苯吡菌胺(Bixafen)、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、铜、环唑醇、恶醚唑、醚菌胺、氟环唑、咪唑菌酮、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺
(Fluxapyroxad)、异菌脲、异皮姆、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰、苯氧菌胺、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙森锌、丙硫菌唑、唑菌胺酯、五氯硝基苯、戊唑醇、四氟醚、甲基硫菌灵、肟菌酯；大豆除草剂：甲草胺、灭草松、氟乐灵、氯嘧磺隆、氯酯磺草胺、精恶唑禾草灵、氟磺胺草醚、丁基吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊乐灵、得杀草、草铵膦；大豆杀虫剂：λ-氯氟氰菊酯、灭多威、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺(Dinetofuran)、氟虫酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺(Cyazypyr)、多杀菌素、乙基多杀菌素(Spinotoram)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ-和λ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、螺螨酯(Spinodiclofen)、杀虫脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺(Bixafen)、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、铜、环唑醇、恶醚唑、醚菌胺、氟环唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、粉唑醇、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、异皮姆、异菌脲、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰、叶菌唑、苯氧菌胺、腈菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙环唑、丙森锌、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、四氟醚、甲基硫菌灵、肟菌酯；甜菜除草剂：杀草敏、甜安宁、乙氧氟草黄、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、丁基吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、三氟啶磺隆、得杀草、精喹禾灵；甜菜杀虫剂：吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺(Dinetofuran)、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ-/λ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、Cyaxypyr、氟虫腈、克百威；低芥酸菜籽除草剂：二氯吡啶酸、禾草灵、丁基吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐灵、胺苯磺隆、喹草酸、精喹禾灵、烯草酮、得杀草；低芥酸菜籽杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺(Bixafen)、啶酰菌胺、多菌灵、环唑醇、恶醚唑、醚菌胺、氟环唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟硅唑、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、异菌脲、异皮姆、甲哌鎓、叶菌唑、苯氧菌胺、多效唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鲜胺、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯、乙烯菌核利；低芥酸菜籽杀虫剂：克百威、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺(Dinetofuran)、β-氟氯氰菊酯、γ-和λ-氯氟氰菊酯、τ-氟胺氰菊酯(Fluvaleriate)、乙虫腈、多杀菌素、乙基多杀菌素(Spinotoram)、氟虫酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺(Cyazypyr)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。

具体实施方式

[0111] 通过说明并且并非通过限制的方式提供了以下实施例。

[0112] 实施例1.来自苏云金芽孢杆菌的新颖的杀虫基因的发现

[0113] 一种新颖的杀虫基因从细菌菌株ATX47290中被鉴定出(表1)。

[0114] 表1.从菌株ATX47290中鉴定出的新颖的基因

[0115]

[0116]

[0117] 通过本领域中众所周知的方法，将Axmi277通过PCR从pAX980中扩增出，并且将该PCR产物克隆入杆菌表达载体pAX916，或另一种合适的载体。将所产生的包含带有axmi基因的载体的杆菌菌株在一种常规生长培养基(如CYS培养基(10g/l细菌培养用酪蛋白胨；3g/l 酵母提取物；6g/l KH2PO4；14g/l K2HPO4；0.5mM MgSO4；0.05mM MnCl2；0.05mM FeSO4))上进行培养，直到通过显微镜检验有明显的孢子形成。准备样品，并且在生物测定中针对活性对这些样品进行测试。

[0118] 实施例2.Axmi277针对秀丽隐杆线虫的活性

[0119] 在大肠杆菌BL21(DE3)明星菌株中，在编码麦芽糖结合蛋白的前导序列之后，这些全长的以及截短的基因被过表达(pMAL表达载体)。在LB培养基中，在37℃，250rpm使这些培养物生长，直到这些培养物的光密度(OD600)达到0.4至0.6，然后将培养物转到20℃，并且通过加入0.2至0.3mM IPTG诱导蛋白质产生。在16小时之后，收获这些细胞，并保存该细胞沉淀用于蛋白质纯化。使用一种AKTA FPLC系统，通过使用直链淀粉/琼脂糖珠的亲和层析，对这些异源过表达的蛋白质进行纯化。该树脂用于分离与麦芽糖结合蛋白相融合的蛋白质。用包含10mM麦芽糖的缓冲液，将这些蛋白质在最初的1至2个柱体积内从该柱中洗脱下来。这些蛋白质的纯度以及表征通过SDS-PAGE分析来进行。

[0120] Axmi277表现出非常强的针对秀丽隐杆线虫的活性(与对照相比较，平均死亡率80％)。这些蛋白质的两种形式，全长的以及截短的型式，在低浓度下都表现出强活性，并且这些活性是热不稳定的。在交予生物测定之前，为了去除MBP片段，用因子Xa对这些蛋白质进行处理。

[0121] 实施例3.杀虫活性的其他测定

[0122] 可以将本发明的核苷酸序列针对它们产生杀虫蛋白的能力来进行测试。经常通过多种方式来评定一种杀虫蛋白充当针对一种害虫的杀虫剂的能力。在本领域内熟知的一种方法是进行一项摄食测定。在这项摄食测定中，将这种害虫暴露于一种包含有待测试的化合物的样品或对照样品。经常，这是通过将有待测试的材料、或此类材料的一种合适的稀释物置于该害虫将摄取的材料(如，人工饵料)上来进行。这种有待测试的材料可以由一种液体、固体、或浆料组成。可将有待测试的材料置于表面上，并接着允许其干燥。可替代地，可将有待测试的材料与一种溶化的人工饵料进行混合，并且然后分配到该测定小室中。该测定小室可以是例如一个杯子、一个皿、或一个微量滴定板的一个孔。

[0123] 用于吸吮性害虫(sucking pest)(例如，蚜虫)的测定可以涉及通过一个分隔物将这种测试材料与这种昆虫分开，这种分隔物理想地是可以被这种吸吮性昆虫的吸吮式口器刺穿、以便允许摄取这种测试材料的部分。经常将这种测试材料与一种摄食刺激物(如蔗糖)相混合，以便促进该测试化合物的摄取。

[0124] 其他类型的测定可以包括将这种测试材料显微注射到这种害虫的口或肠内，连同形成转基因的植物类，之后随后这种害虫摄食该转基因植物的能力的测试。植物测试可涉及分离被正常地消耗的植物部分，例如放在叶上的小笼，或分离在包含昆虫的笼中的整个植物。

[0125] 其他测定害虫的方法和手段在本领域中是已知的，并且可以见于例如Robertson(罗伯逊)和Preisler(普赖斯勒),编著(1992)Pesticide bioassays with arthropods(《利用节肢动物类的害虫生物测定》),CRC,Boca Raton(波卡拉顿),FL(佛罗里达州)中。可替代地，在杂志“Arthropod Management Tests(节肢动物管理测试)”以及“Journal of Economic Entomology(《经济昆虫学杂志》)”中、或通过与美国昆虫学学会(Entomological Society of America，ESA)的成员的讨论而经常地说明了这些测定。

[0126] 在一些实施例中，对在此所披露的这些杀虫蛋白的毒素区进行编码的DNA区被克隆入大肠杆菌表达载体pMAL-C4x中，并位于编码麦芽糖结合蛋白(MBP)的malE基因之后。这些框内融合物导致在大肠杆菌中MBP-Axmi融合蛋白的表达。

[0127] 为了在大肠杆菌中的表达，用单独的质粒对BL21*DE3进行转化。单菌落被接种至添加有羧苄青霉素和葡萄糖的LB中，并且在37℃过夜生长。在接下来的一天，用1％的过夜培养物对新鲜培养基进行接种，并且在37℃生长至对数期。随后，用0.3mM IPTG在20℃对培养物进行过夜诱导。将每个细胞沉淀悬浮于20mM Tris-Cl缓冲液，pH7.4+200mM NaCl+1mM DTT+蛋白酶抑制剂中，并且进行超声处理。通过SDS-PAGE进行的分析可以用于确认融合蛋白的表达。

[0128] 然后，总无细胞提取物流过附接于快速蛋白质液相层析(FPLC)的直链淀粉柱，用来进行MBP-axmi融合蛋白的亲和纯化。用10mM麦芽糖溶液将结合的融合蛋白从树脂洗脱下来。然后，用因子Xa或者用胰蛋白酶对纯化的融合蛋白进行切割，以从Axmi蛋白去除氨基末端MBP标签。这些蛋白质的切割和溶解性可以通过SDS-PAGE而确定

[0129] 实施例4.用于植物表达的基因的运载

[0130] 本发明的编码区是与用于在植物中表达的适当的启动子和终止子序列相连的。此类序列在本领域内是所熟知的，并且可以包括用于在单子叶植物中表达的稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子，用于在双子叶植物中表达的拟南芥属UBQ3启动子或CaMV35S启动子、以及nos或PinII终止子。用于生产并证实启动子-基因-终止子构建体的技术在本领域内也是熟知的。

[0131] 在本发明的一个方面中，设计并产生了合成的DNA序列。相对于亲本序列，这些合成的序列具有改变的核苷酸序列，但是编码与该亲本序列本质上一致的蛋白质。

[0132] 在本发明的另一个方面，这些合成基因的改进变体被设计为使得将得到的肽靶向一种植物细胞器，如内质网或质外体。已知会导致使融合蛋白靶向植物细胞器的肽序列在本领域中是已知的。例如，来自白羽扇豆(Lupinus albus)( ID GI:14276838,Miller(米勒)等人(2001)Plant Physiology(《植物生理学》)127:594-606)的酸性磷酸酶基因的N-末端区在本领域中已知会导致异源蛋白的内质网靶向。如果得到的融合蛋白在C-末端还包含一个内质网保留序列，该序列包括肽N-末端-赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(即，“KDEL”基序，SEQ ID NO:4)，则该融合蛋白将被靶向内质网。如果这种融合蛋白在C末端缺少一个靶向内质网的序列，则该蛋白将被靶向该内质网，但最终将被隔离在质外体中。

[0133] 因此，这个基因编码一种融合蛋白，该融合蛋白包含了来自白羽扇豆的酸性磷酸酶基因的N-末端31个氨基酸( ID GI：14276838,Miller(米勒)等人,2001，同上文)，它们在C-末端上与本发明的氨基酸序列、连同KDEL序列的N-末端相融合。因此，预测得到的蛋白质一旦表达于一种植物细胞时就被靶向该植物的内质网。

[0134] 将以上说明的植物表达盒与一种合适的、辅助经转化的细胞和组织的选择的、植物选择标记物相组合，并且将其连接到植物转化载体中。这些可以包括来自土壤杆菌介导的转化的二元载体、或用于气溶胶或生物射弹转化的简单的质粒载体。

[0135] 实施例5.使用在此说明的杀虫蛋白基因的玉米细胞的转化

[0136] 在授粉后8至12天收集玉米穗。将胚与穗进行分离，并且那些大小为0.8-1.5mm的胚是优选用于转化的。将这些胚以盾片侧向上的方式放置在一种合适的孵育培养基上，如DN62A5S培养基(3.98g/L N6盐；1mL/L(的1000x母液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/L L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(的1mg/mL母液)
2,4-D)。然而，培养基和盐类(而不是DN62A5S)是适当的并且在本领域内是已知的。将这些胚在黑暗中在25℃下孵育过夜。然而，本质上不需要将这些胚孵育过夜。

[0137] 将所得到的外植体转移至网眼方阵(30-40个/平板)，转移至渗透培养基上并保持30-45分钟，随后转移至一个聚束平板(beaming plate)上(见，例如，PCT公开号WO/0138514和美国专利号5,240,842)。

[0138] 在植物细胞中将被设计为本发明基因的DNA构建体加速进入植物组织中，这是使用一种气溶胶束加速器、使用基本上如PCT公开号WO/0138514中所说明的条件进行的。在聚束之后，将胚在渗透培养基上孵育大约30分钟，并且将其置于孵育培养基上在25℃下在黑暗中过夜。为了避免不适当地破坏经聚束的外植体，它们在转移至恢复培养基之前被孵育至少24小时。然后，将胚在25℃下在黑暗中扩散到恢复培养基上，持续大约5天，随后转移至一种选择培养基中。将外植体在选择培养基中孵育达到8周，这取决于所利用的特定选择的性质和特征。在选择期之后，将得到的愈伤组织转移至胚成熟培养基中，直至观察到成熟的体细胞胚的形成。然后，将得到的成熟的体细胞胚置于低光照下，并且通过本领域已知的方法引发该再生过程。允许这些得到的芽在生根培养基上生根，并且将得到的植物转移至育苗盆(nursery pot)中并繁殖成转基因植物。

[0139] 材料

[0140] DN62A5S培养基

[0141]

[0142] 用1N KOH/1N KCl将该溶液的pH调整至pH5.8，加入高达3g/L的浓度的Gelrite(Sigma)，并将该培养基高压灭菌。在冷却至50℃之后，加入2ml/L的5mg/ml硝酸银母液(Phytotechnology Labs)。

[0143] 实施例6.通过土壤杆菌-介导的转化将本发明的基因转化到植物细胞中

[0144] 穗最好在授粉之后8至12天进行收集。将胚与穗进行分离，并且那些大小为0.8-1.5mm的胚是优选用于转化的。将胚以盾片侧向上的方式置于在一种适当的孵育介质中，并且在25℃下在黑暗中孵育过夜。然而，本质上不需要将这些胚孵育过夜。将这些胚与一种土壤杆菌属菌株进行接触，该菌株包含了这些适当的载体用于Ti质粒介导的转化，持续大约
5-10分钟，并接着将其置于共培养基上持续大约3天(25℃下、在黑暗中)。在共培养之后，将外植体转移到恢复期培养基中，持续大约5天(25℃下、在黑暗中)。将外植体在选择培养基中孵育达到8周，这取决于所利用的特定选择的性质和特征。在选择期之后，将得到的愈伤组织转移至胚成熟培养基中，直至观察到成熟的体细胞胚的形成。然后，将得到的成熟的体细胞胚置于低光照下，并且如本领域内所已知来引发再生过程。

[0145] 在本说明书中提到的所有公开文件和专利申请对于本发明所涉及的领域的普通技术人员的技术水平而言是指示性的。所有公开文件和专利申请是通过引用结合在此的，其程度就像每个单独公开文件或专利申请被专门地和单独地表明通过引用结合在此一样。

[0146] 尽管本发明在上文中出于理解清楚的目的、通过展示和实施例已经相当详细地进行了说明，应当明显的是可以在所附的权利要求书的范围内实行某些变化和修改。

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