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染料脱色过化物酶BsDyP及其在真菌毒素脱毒中的应用

阅读:169发布:2020-05-08

专利汇可以提供染料脱色过化物酶BsDyP及其在真菌毒素脱毒中的应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 属于农业 生物 技术领域,具体涉及染料脱色过 氧 化物酶BsDyP及其编码基因和应用;本发明所涉及的染料脱色过氧化物酶BsDyP,其 氨 基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示;本发明还公开了编码上述BsDyP的基因,其DNA序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4;本发明还公开了上述染料脱色过氧化物酶BsDyP的制备方法及其在 真菌 毒素脱毒上的应用,及其作为真菌毒素 生物降解 剂的制备方法和应用,本发明的染料脱色过氧化物酶BsDyP在真菌毒素脱毒领域具有巨大的应用前景。,下面是染料脱色过化物酶BsDyP及其在真菌毒素脱毒中的应用专利的具体信息内容。

1.具有降解真菌毒素功能的染料脱色过化物酶BsDyP,其特征在于,具有:
(Ⅰ)、如SEQ ID No.1或2所示的基酸序列;或
(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或两个氨基酸残基获得的氨基酸序列,且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列;或
(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列具有至少90%序列一致性,优选95%序列一致性,且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。
2.编码如权利要求1所述染料脱色过氧化物酶BsDyP的核苷酸,其特征在于,具有:
(Ⅰ)、如SEQ ID No.3或4所示的核苷酸序列;或
(Ⅱ)、如SEQ ID No.3或4所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列;或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质,但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列;或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列,且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列;或
(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列具有至少90%序列一致性的核苷酸序列,优选95%序列一致性的核苷酸序列。
3.一种包含如权利要求2所述的核苷酸的重组表达载体。
4.一种包含如权利要求2所述的核苷酸的重组菌株或细胞。
5.制备如权利要求1所述的染料脱色过氧化物酶BsDyP的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、用如权利要求3所述的重组表达载体转化宿主细胞,得到重组菌株;
步骤2、培养所述重组菌株,诱导染料脱色过氧化物酶BsDyP表达;
步骤3、纯化所述染料脱色过氧化物酶BsDyP。
6.如权利要求1所述的染料脱色过氧化物酶BsDyP在真菌毒素脱毒中的应用。
7.一种复合酶,其特征在于,包括权利要求1所述的染料脱色过氧化物酶BsDyP和葡萄糖氧化酶GOD复合配制而成。
8.一种真菌毒素生物降解剂,其特征在于,包括如权利要求1所述的染料脱色过氧化物酶BsDyP或权利要求7所述的复合酶,以及生理上可接受的配伍载体和/或介体。
9.根据权利要求8所述的真菌毒素生物降解剂,其特征在于,所述生理上可接受的配伍载体包括但不限于麦芽糖糊精、环糊精、小麦、麦麸、稻米、米糠、蔗糖淀粉、Na2SO4、滑石粉、蒙脱石、寡糖或酵母细胞壁中的一种或多种。
10.根据权利要求8所述的真菌毒素生物降解剂,其特征在于,所述介体用于辅助染料脱色过氧化物酶BsDyP催化降解真菌毒素的天然和合成介体,其包括但不限于丁香、乙酰丁香、乙酰香草酮、对香豆酸、丁香酸甲酯、香芹酚、百里香酚、肉桂醛、柠檬醛、柠檬烯、γ-萜品烯、紫苏醛、大蒜素、丁香酚、茴香脑、薄荷酮、沉香醇、异戊醛、芳樟醇、姜油酮、异硫氰酸酯、2,2-联氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)ABTS、紫脲酸VIO、1-羟基苯并三唑HBT、2,
2’,6,6’-四甲基呱啶氧化物TEMPO或多金属氧酸盐中的一种或多种。
11.根据权利要求8所述的真菌毒素生物降解剂,其特征在于,所述真菌毒素生物降解剂还包括微生态制剂,所述微生态制剂包括但不限于粪肠球菌、屎肠球菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、两歧双歧杆菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌或德氏乳杆菌保加利亚亚种中的一种或多种,优选的,所述真菌毒素生物降解剂在用于青贮饲料饲料时,还含有布氏乳杆菌、产丙酸杆菌和副干酪乳杆菌中的至少一种;或者所述真菌毒素生物降解剂在用于禽类、猪和产养殖动物的饲料时,还含有凝结芽孢杆菌和/或侧孢短芽孢杆菌。
12.根据权利要求8所述的真菌毒素生物降解剂,其特征在于,所述真菌毒素生物降解剂还包括另外的酶;所述另外的酶包括但不限于玉米赤霉烯酮内酯酶、伏毒素羧基酯酶、伏马毒素氨基转移酶、氨基多元醇胺氧化酶、黄曲霉毒素氧化酶、漆酶、羧肽酶、黑曲霉天冬氨酸蛋白酶,弹性蛋白酶、氨基肽酶、胃蛋白酶、胃蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、细菌蛋白酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、几丁质酶、凝乳酶质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶,葡糖醛酸酶、己糖氧化酶、超氧化物歧化酶、水解酶、转移酶、异构酶、脂解酶、裂解酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、谷胱甘肽过氧化物酶、氧化还原酶、醛酮还原酶、果胶乙酰酯酶、果胶去聚合酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、锰过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、乙醇脱氢酶、核糖核酸酶、转谷酰胺酶、环氧化物水解酶和酸性磷酸酶中的一种或多种。
13.一种降解真菌毒素的方法,其特征在于,包括如下步骤:
将如权利要求1所述的染料脱色过氧化物酶BsDyP或如权利要求7所述的复合酶或如权利要求8~12任一项所述的真菌毒素生物降解剂处理含有真菌毒素的材料。
14.根据权利要求13所述的方法,其特征在于,所述材料包括但不限于食品、饲料及其原料、粮食及其加工副产物、粮油、牛奶、陈化粮、茶叶、水果、果汁或中草药中的一种或多种。
15.如权利要求7所述的复合酶或权利要求8~12任一项所述的真菌毒素生物降解剂在真菌毒素脱毒中的应用。
16.如权利要求6或权利要求15所述的应用,其特征在于所述的真菌毒素包括但不限于玉米赤霉烯酮类毒素、黄曲霉毒素、单端孢霉烯族类毒素、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素、展青霉素、胶霉毒素和杂色曲霉素,优选为玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1或M2。

说明书全文

染料脱色过化物酶BsDyP及其在真菌毒素脱毒中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于农业生物技术领域,具体涉及染料脱色过氧化物酶BsDyP及其编码基因和应用,尤其是在真菌毒素脱毒中的应用。

背景技术

[0002] 真菌毒素是真菌的次级代谢产物,具有致癌作用、遗传毒性、生殖毒性、神经毒性和免疫抑制作用,对人和各种畜禽产生极大的危害。目前已经分离和鉴定的真菌毒素有300多种,其中污染最广泛、毒性最大,研究最多的是黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)、玉米赤霉烯(Zearalenone,ZEN)、单端孢霉烯族毒素(Trichothecene mycotoxins,包括呕吐毒素和T-2毒素等)、赭曲霉毒素(Ochratoxin)和烟曲霉毒素(Fumonisin)等。目前在食品和饲料工业用于真菌毒素脱毒的方法主要为两大类,其一是物理吸附脱毒,添加一些蒙脱石类的无机吸附剂和酯化甘露聚糖类的有机吸附剂;另一种是生物降解,通过微生物或其产生的酶对真菌毒素进行生物降解,破坏毒素的分子结构使其代谢生成无毒或低毒的代谢产物。生物降解方法安全、高效和环保,是当下真菌毒素脱毒的研究热点。
[0003] 目前报道的具有降解玉米赤霉烯酮活性的酶包括来源于红粉粘帚霉的内酯解酶ZHD101以及来源于葡萄顶枯病菌的玉米赤霉烯酮降解酶ZENdease-N2;报道的具有降解黄曲霉毒素的酶包括来源于假蜜环菌的黄曲霉毒素氧化酶ADTZ、来源于分枝杆菌的F420H2依赖还原酶FDR和来源于白腐真菌的真菌漆酶,但是这些酶对毒素的降解机理及降解产物的毒性不十分清楚,限制了真菌毒素降解酶的研究和应用。越来越多证据表明,其他性质未明的酶也可能参与玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素这两种具有苯环和内酯环结构的真菌毒素的生物降解。因此,寻找和挖掘新的真菌毒素降解酶具有重要的现实意义。

发明内容

[0004] 有鉴于此,本发明提供一种具有降解真菌毒素功能的染料脱色过氧化物酶BsDyP及其在真菌毒素脱毒中的应用。该染料脱色过氧化物酶BsDyP能够降解真菌毒素。
[0005] 本发明的目的在于提供一种具有降解真菌毒素功能的染料脱色过氧化物酶BsDyP。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述具有降解真菌毒素功能的染料脱色过氧化物酶BsDyP的编码基因。
[0007] 本发明的另一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。
[0008] 本发明的另一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株或细胞。
[0009] 本发明的另一目的在于提供上述染料脱色过氧化物酶BsDyP的制备方法。
[0010] 本发明的另一目的在于提供上述具有降解真菌毒素功能的染料脱色过氧化物酶BsDyP的应用。
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种含有上述染料脱色过氧化物酶BsDyP和葡萄糖氧化酶GOD的复合酶。
[0012] 本发明的另一目的在于提供一种含有上述染料脱色过氧化物酶BsDyP和葡萄糖氧化酶的复合酶的应用。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种含有上述染料脱色过氧化物酶BsDyP的真菌毒素生物降解剂。
[0014] 本发明的另一目的在于提供上述含有染料脱色过氧化物酶BsDyP的真菌毒素生物降解剂的制备方法。
[0015] 本发明的另一目的在于提供一种降解真菌毒素的方法。
[0016] 本发明的另一目的在于提供含有上述染料脱色过氧化物酶BsDyP、染料脱色过氧化物酶BsDyP和葡萄糖氧化酶GOD的复合酶,及真菌毒素生物降解剂在真菌毒素脱毒方面的应用。
[0017] 为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
[0018] 本发明所述的具有降解真菌毒素功能的染料脱色过氧化物酶BsDyP的基酸序列可以为:
[0019] SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列,其中SEQ ID NO.1含有信号肽,SEQ ID NO.2不含信号肽;
[0020] 或者SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列中的一个或两个氨基酸残基被取代和/或缺失和/或插入;
[0021] 或者与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少90%以上的序列一致性,优选95%序列一致性,并具有染料脱色过氧化物酶BsDyP的功能的序列。
[0022] 本发明还提供了编码所述染料脱色过氧化物酶BsDyP的核苷酸序列为:
[0023] SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示序列;
[0024] 或者SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示序列中的一个或两个核苷酸残基被取代和/或缺失和/或插入;
[0025] 或者与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有至少90%以上的序列一致性,优选95%序列一致性的核苷酸序列。
[0026] SEQ ID NO.1:
[0027] MSDEQKKPEQIHRRDILKWGAMAGAAVAIGASGLGGLAPLVQTAAKPSKKDEKEEEQIVPFYGKHQAGITTAHQTYVYFAALDVTAKDKSDIITLFRNWTSLTQMLTSGKKMSAEQRNQYLPPQDTGESADLSPSNLTVTFGFGPGFFEKDGKDRFGLKSKKPKHLAALPAMPNDNLDEKQGGGDICIQVCADDEQVAFHALRNLLNQAVGTCEVRFVNKGFLSGGKNGETPRNLFGFKDGTGNQSTKDDTLMNSIVWIQSGEPDWMTGGTYMAFRKIKMFLEVWDRSSLKDQEDTFGRRKSSGAPFGQKKETDPVKLNQIPSNSHVSLAKSTGKQILRRAFSYTEGLDPKTGYMDAGLLFISFQKNPDNQFIPMLKALSAKDALNEYTQTIGSALYACPGGCKKGEYIAQRLLES
[0028] SEQ ID NO.2:
[0029] IGASGLGGLAPLVQTAAKPSKKDEKEEEQIVPFYGKHQAGITTAHQTYVYFAALDVTAKDKSDIITLFRNWTSLTQMLTSGKKMSAEQRNQYLPPQDTGESADLSPSNLTVTFGFGPGFFEKDGKDRFGLKSKKPKHLAALPAMPNDNLDEKQGGGDICIQVCADDEQVAFHALRNLLNQAVGTCEVRFVNKGFLSGGKNGETPRNLFGFKDGTGNQSTKDDTLMNSIVWIQSGEPDWMTGGTYMAFRKIKMFLEVWDRSSLKDQEDTFGRRKSSGAPFGQKKETDPVKLNQIPSNSHVSLAKSTGKQILRRAFSYTEGLDPKTGYMDAGLLFISFQKNPDNQFIPMLKALSAKDALNEYTQTIGSALYACPGGCKKGEYIAQRLLES
[0030] SEQ ID NO.3:
[0031] ATGAGCGATGAACAGAAAAAGCCAGAACAAATTCACAGACGGGACATTTTAAAATGGGGAGCGATGGCGGGGGCAGCCGTTGCGATCGGTGCCAGCGGTCTCGGCGGTCTCGCTCCGCTTGTTCAGACTGCGGCTAAGCCATCGAAAAAGGATGAAAAAGAGGAGGAGCAGATTGTTCCGTTTTACGGAAAGCATCAGGCCGGAATCACAACTGCCCATCAGACGTATGTCTATTTTGCTGCACTGGATGTAACAGCAAAAGACAAAAGCGACATCATTACGTTATTTAGAAACTGGACAAGTCTCACACAGATGCTGACGTCTGGCAAGAAAATGTCAGCGGAGCAGAGAAATCAGTATCTGCCGCCGCAGGATACAGGTGAGTCTGCTGATTTATCCCCTTCCAACTTAACGGTCACATTCGGATTCGGGCCTGGCTTTTTTGAAAAAGACGGAAAGGACCGCTTCGGACTGAAAAGCAAAAAACCGAAGCACCTAGCCGCTCTTCCAGCGATGCCCAATGACAACCTGGATGAAAAGCAGGGAGGCGGGGACATCTGCATTCAAGTGTGTGCAGACGACGAGCAAGTGGCGTTTCACGCGCTGCGTAACCTGCTAAATCAAGCGGTCGGCACTTGTGAGGTCCGTTTTGTGAACAAAGGCTTTTTAAGCGGTGGAAAAAATGGTGAAACACCGCGCAACCTCTTCGGGTTTAAAGATGGAACAGGCAACCAGAGCACGAAGGATGACACGTTGATGAACTCGATCGTGTGGATTCAGTCTGGTGAGCCTGACTGGATGACGGGCGGCACCTATATGGCTTTTCGGAAAATCAAAATGTTCCTTGAGGTATGGGACCGCTCTTCCCTCAAGGACCAAGAGGATACCTTCGGCCGCAGAAAAAGCTCGGGGGCGCCTTTTGGGCAGAAAAAGGAAACAGATCCCGTGAAGCTGAATCAAATTCCGTCTAATTCACACGTCAGTCTAGCGAAATCTACTGGGAAACAAATTTTGCGAAGAGCTTTCTCTTACACAGAAGGACTTGATCCGAAAACCGGCTATATGGATGCAGGTCTCCTGTTTATCAGTTTTCAAAAAAATCCCGACAATCAGTTTATCCCGATGCTGAAGGCTCTTTCAGCAAAGGATGCGTTAAACGAATATACACAAACAATCGGTTCTGCTTTATACGCATGCCCAGGCGGCTGCAAAAAAGGAGAATATATTGCCCAGCGTTTGCTGGAATCATAA
[0032] SEQ ID NO.4:
[0033] ATCGGTGCCAGCGGTCTCGGCGGTCTCGCTCCGCTTGTTCAGACTGCGGCTAAGCCATCGAAAAAGGATGAAAAAGAGGAGGAGCAGATTGTTCCGTTTTACGGAAAGCATCAGGCCGGAATCACAACTGCCCATCAGACGTATGTCTATTTTGCTGCACTGGATGTAACAGCAAAAGACAAAAGCGACATCATTACGTTATTTAGAAACTGGACAAGTCTCACACAGATGCTGACGTCTGGCAAGAAAATGTCAGCGGAGCAGAGAAATCAGTATCTGCCGCCGCAGGATACAGGTGAGTCTGCTGATTTATCCCCTTCCAACTTAACGGTCACATTCGGATTCGGGCCTGGCTTTTTTGAAAAAGACGGAAAGGACCGCTTCGGACTGAAAAGCAAAAAACCGAAGCACCTAGCCGCTCTTCCAGCGATGCCCAATGACAACCTGGATGAAAAGCAGGGAGGCGGGGACATCTGCATTCAAGTGTGTGCAGACGACGAGCAAGTGGCGTTTCACGCGCTGCGTAACCTGCTAAATCAAGCGGTCGGCACTTGTGAGGTCCGTTTTGTGAACAAAGGCTTTTTAAGCGGTGGAAAAAATGGTGAAACACCGCGCAACCTCTTCGGGTTTAAAGATGGAACAGGCAACCAGAGCACGAAGGATGACACGTTGATGAACTCGATCGTGTGGATTCAGTCTGGTGAGCCTGACTGGATGACGGGCGGCACCTATATGGCTTTTCGGAAAATCAAAATGTTCCTTGAGGTATGGGACCGCTCTTCCCTCAAGGACCAAGAGGATACCTTCGGCCGCAGAAAAAGCTCGGGGGCGCCTTTTGGGCAGAAAAAGGAAACAGATCCCGTGAAGCTGAATCAAATTCCGTCTAATTCACACGTCAGTCTAGCGAAATCTACTGGGAAACAAATTTTGCGAAGAGCTTTCTCTTACACAGAAGGACTTGATCCGAAAACCGGCTATATGGATGCAGGTCTCCTGTTTATCAGTTTTCAAAAAAATCCCGACAATCAGTTTATCCCGATGCTGAAGGCTCTTTCAGCAAAGGATGCGTTAAACGAATATACACAAACAATCGGTTCTGCTTTATACGCATGCCCAGGCGGCTGCAAAAAAGGAGAATATATTGCCCAGCGTTTGCTGGAATCATAA
[0034] 本发明还提供了包含上述染料脱色过氧化物酶BsDyP的重组载体,优选为PET-31b-BsDyP。
[0035] 本发明还提供了包含上述染料脱色过氧化物酶BsDyP的重组菌株,优选为重组菌株Rosseta(DE3)/BsDyP。
[0036] 本发明还提供了一种制备染料脱色过氧化物酶BsDyP的方法,包括以下步骤:
[0037] (1)用包含编码染料脱色过氧化物酶BsDyP基因的重组表达载体转化宿主细胞,得到重组菌株;
[0038] (2)培养所述重组菌株,诱导染料脱色过氧化物酶BsDyP表达;
[0039] (3)利用镍离子亲和层析获得纯化后的染料脱色过氧化物酶BsDyP。
[0040] 本发明还提供了上述染料脱色过氧化物酶BsDyP的应用,尤其在真菌毒素脱毒方面的应用,所述的真菌毒素包括但不限于玉米赤霉烯酮类毒素、黄曲霉毒素、单端孢霉烯族类毒素(包括呕吐毒素、T-2毒素)、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素、展青霉素、胶霉毒素和杂色曲霉素,其能够直接降解或者依赖介体降解玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1或M2等真菌毒素。
[0041] 本发明还提供一种复合酶,包含染料脱色过氧化物酶BsDyP和葡萄糖氧化酶GOD。
[0042] 本发明还提供了上述含有染料脱色过氧化物酶BsDyP和葡萄糖氧化酶GOD的复合酶的应用,尤其在真菌毒素脱毒方面的应用,其能够直接降解或者依赖介体降解玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1或M2等真菌毒素。
[0043] 本发明还提供一种真菌毒素生物降解剂,包含染料脱色过氧化物酶BsDyP以及生理上可接受的配伍载体和/或介体,所述生理上可接受的配伍载体包括但不限于麦芽糖糊精、环糊精、小麦、麦麸、稻米、米糠、蔗糖淀粉、Na2SO4、滑石粉、蒙脱石、寡糖或酵母细胞壁中的一种或多种;所述介体选自丁香、乙酰丁香酮、乙酰香草酮、对香豆酸、丁香酸甲酯、香芹酚、百里香酚、肉桂醛、柠檬醛、柠檬烯、γ-萜品烯、紫苏醛、大蒜素、丁香酚、茴香脑、薄荷酮、沉香醇、异戊醛、芳樟醇、姜油酮、异硫氰酸酯、2,2-联氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)ABTS、紫脲酸VIO、1-羟基苯并三唑HBT、2,2’,6,6’-四甲基呱啶氧化物TEMPO或多金属氧酸盐中的一种或多种。
[0044] 上述真菌毒素生物降解剂中,还包括微生态制剂,所述微生态制剂包括但不限于粪肠球菌、屎肠球菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、两歧双歧杆菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌或德氏乳杆菌保加利亚亚种中的一种或多种,优选的,所述真菌毒素生物降解剂在用于青贮饲料饲料时,还含有布氏乳杆菌、产丙酸杆菌和副干酪乳杆菌中的至少一种;或者所述真菌毒素生物降解剂在用于禽类、猪和水产养殖动物的饲料时,还含有凝结芽孢杆菌和/或侧孢短芽孢杆菌。
[0045] 上述真菌毒素生物降解剂中,还包括另外的酶,所述另外的酶包括但不限于玉米赤霉烯酮内酯酶、伏毒素羧基酯酶、伏马毒素氨基转移酶、氨基多元醇胺氧化酶、黄曲霉毒素氧化酶、漆酶、羧肽酶、黑曲霉天冬氨酸蛋白酶,弹性蛋白酶、氨基肽酶、胃蛋白酶、胃蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、细菌蛋白酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、几丁质酶、凝乳酶质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶,葡糖醛酸酶、己糖氧化酶、超氧化物歧化酶、水解酶、转移酶、异构酶、脂解酶、裂解酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、谷胱甘肽过氧化物酶、氧化还原酶、醛酮还原酶、果胶乙酰酯酶、果胶去聚合酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、锰过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、乙醇脱氢酶、核糖核酸酶、转谷酰胺酶、环氧化物水解酶和酸性磷酸酶中的一种或多种。
[0046] 本发明还提供一种降解真菌毒素的方法,包括将上述染料脱色过氧化物酶BsDyP或上述复合酶或上述真菌毒素生物降解剂处理含有真菌毒素的材料。
[0047] 上述方法中,所述处理为将上述染料脱色过氧化物酶BsDyP或上述复合酶或上述真菌毒素生物降解剂和含有真菌毒素的材料混合。
[0048] 上述方法中,所述真菌毒素包括但不限于玉米赤霉烯酮类毒素、黄曲霉毒素、单端孢霉烯族类毒素(包括呕吐毒素、T-2毒素)、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素、展青霉素、胶霉毒素和杂色曲霉素,尤其涉及玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1或M2等真菌毒素。
[0049] 上述方法中,所述含有真菌毒素的材料包括但不限于食品、饲料及原料、粮食及加工副产物、粮油、牛奶、陈化粮、茶叶、水果及果汁和中草药等,包括各种含有真菌毒素的材料。
[0050] 本发明的优点和有益效果:
[0051] 本发明提供了一种具有降解真菌毒素功能的染料脱色过氧化物酶BsDyP及其编码基因和应用,尤其涉及其在降解真菌毒素方面的应用,试验证实染料脱色过氧化物酶BsDyP能够不依赖介体高效降解玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯醇和玉米赤霉醇等真菌毒素,如果在反应体系中加入介体其对各类真菌毒素的降解效率提高。本发明第一次报道染料脱色过氧化物酶BsDyP能够降解真菌毒素,且该酶催化效率高,转化效率快,来源于益生芽孢杆菌,在饲料和食品工业有非常广阔的应用前景。附图说明
[0052] 为了更清楚地说明本发明实施例现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0053] 图1是重组质粒PET31b-BsDyP的表达产物纯化后SDS-PAGE图;其中泳道1为纯化重组染料脱色过氧化物酶BsDyP,泳道M为蛋白分子量标准(116、66.2、45、35、25、18.4、14.4kDa);
[0054] 图2是重组染料脱色过氧化物酶rBsDyP在不同温度条件下对ZEN的降解情况;
[0055] 图3是重组染料脱色过氧化物酶rBsDyP在不同pH条件下对ZEN的降解情况;
[0056] 图4是重组染料脱色过氧化物酶rBsDyP在介体ABTS参与条件下对ZEN的降解情况;
[0057] 图5是重组染料脱色过氧化物酶rBsDyP在介体ABTS参与条件下对AFB1的降解情况;
[0058] 图6是重组染料脱色过氧化物酶rBsDyP与不同浓度葡萄糖氧化酶联用对ZEN的降解情况。

具体实施方式

[0059] 本发明公开了一种具有降解真菌毒素功能的染料脱色过氧化物酶BsDyP及其编码基因和其在真菌毒素脱毒中的应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
[0060] 在本发明实施例中使用的主要实验材料和试剂为:
[0061] 大肠杆菌表达载体PET-31b、克隆菌株大肠杆菌DH5α、表达菌株大肠杆菌Rosseta(DE3)均购自Invitrogen公司。限制性核酸内切酶和DNA连接酶购自NEB公司,玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素标准品购自sigma公司,其它试剂为国产分析纯。
[0062] 如未特别指明,实施例中所用的生化试剂均为市售试剂,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员用到的常规手段。
[0063] 下面结合实施例,进一步阐述本发明:
[0064] 实施例1染料脱色过氧化物酶BsDyP的获得及表达
[0065] 以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为扩增模板,扩增染料脱色过氧化物酶BsDyP的编码基因,然后构建含有BsDyP编码基因序列的重组表达载体及其工程菌,并表达染料脱色过氧化物酶BsDyP。具体步骤如下:
[0066] 1、编码染料脱色过氧化物酶BsDyP基因的克隆
[0067] 1.1按以下步骤提取枯草芽孢杆菌基因组DNA
[0068] (1)从甘油管中接种划线于LB固体平板上,37℃静置培养12h。
[0069] (2)从培养菌体的平板上挑取一单菌落接种于含5mL液体LB培养基中,180r/min,37℃条件下培养12h。
[0070] (3)将菌液分装到灭菌的1.5mL微量离心管中,12000r/min离心1min收集菌体,弃上清。
[0071] (4)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL细胞悬浮液,枪头吹旋使菌体悬浮,37℃温浴60min;12000r/min离心1min收集菌体,弃上清。
[0072] (5)向菌体沉淀中加入225μL缓冲液A,振荡至菌体彻底悬浮。
[0073] (6)向管子里加入10μL蛋白酶K溶液,颠倒混匀。
[0074] (7)加入25μL裂解液S,颠倒混匀;57℃水浴放置20min,其间颠倒混匀1-2次。
[0075] (8)加入250μL缓冲液B,振荡5s充分混匀。
[0076] (9)加入250μL无水乙醇,充分振荡混匀15s。
[0077] (10)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中,12000r/min离心30s,倒掉废液,将吸附柱放入收集管中。
[0078] (11)向吸附柱中加入500μL缓冲液C,12000r/min离心30s,倒掉废液,将吸附柱放入收集管中。
[0079] (12)向吸附柱中加入700μL缓冲液W2,离心30s,倒掉废液,将吸附柱放入收集管中。
[0080] (13)向吸附柱中加入500μL缓冲液W2,12000r/min离心3min,倒掉废液。
[0081] (14)将吸附柱放入一个干净的离心管中,室温放置数分钟,向吸附膜的中间部位悬空滴加150μL洗脱液TE,室温放置5min,12000r/min离心2min,将溶液收集到离心管中。
[0082] 1.2枯草芽孢杆菌染料脱色过氧化物酶BsDyP编码基因扩增,步骤如下:
[0083] 依照载体PET-31b多克隆位点,选择NdeI和XhoI为酶切位点,设计上游引物P1和下游引物P2,由上海生工生物工程技术有限公司合成。设计上游引物P1和下游引物P2序列如下:
[0084] 上游引物P1:5′-GCTTATTCATATGATCGGTGCCA-3′(如SEQ ID NO.5所示)
[0085] 下游引物P2:5′-GTTCTCGAGTGATTCCAGCA-3′(如SEQ ID NO.6所示)
[0086] 以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板进行扩增,其反应条件为:
[0087]DNA模板 1μL
上游引物P1 2μL
下游引物P2 2μL
2×Pfu PCR Mix 25μL
ddH2O2 20μL
总体积 50μL
[0088] 扩增条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s;50℃退火30s,72℃延伸1min 30s反应30个循环;72℃彻底延伸10min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。
[0089] 2、含有染料脱色过氧化物酶BsDyP编码基因序列的重组表达载体构建用NdeI和XhoI双酶切上一步回收的PCR产物以及PET-31b质粒,酶切体系如下:
[0090]PCR产物/PET-31b质粒 30μL
NdeI 1μL
XhoI 1μL
10×CutSmart Buffer 5μL
ddH2O2 13μL
总体积 50μL
[0091] 酶切条件为:37℃水浴30min。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物和质粒酶切片段
[0092] 上述酶切回收的PCR产物和质粒经T4DNA连接酶16℃连接过夜;连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经Amp抗性平板筛选,挑取阳性转化子,提取转化质粒,并进行单、双酶切验证和测序,确定构建获得正确的重组菌株DH5α/PET-31b-BsDyP。
[0093] 3、重组染料脱色过氧化物酶rBsDyP在大肠杆菌中的诱导表达和纯化
[0094] 3.1重组染料脱色过氧化物酶rBsDyP诱导表达
[0095] 将转化有PET-31b-BsDyP质粒的重组大肠杆菌Rosseta(DE3)接种于5mL液体LB培养基中活化过夜,按1:100比例转接到500mL装液量为300mL的三角瓶中,180r/min,37℃条件下培养至OD600为0.6,添加终浓度为0.2mM IPTG 28℃条件下诱导目的蛋白表达。
[0096] 3.2重组染料脱色过氧化物酶rBsDyP纯化
[0097] 收集发酵液,4℃,12000rpm离心30min,弃上清;用pH7.0的磷酸缓冲液重悬菌体,4℃,12000rpm离心30min,弃上清,重复洗涤菌体三次。然后将菌体细胞重悬在1mg/mL的binding buffer中,超声破碎,4℃,12000rpm离心10min,收集上清并过滤。由于表达的rBsDyP蛋白C端带有组氨酸标签(6×His),因此使用镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA)纯化重组蛋白,平衡、上样、洗脱等步骤参见Qiagen使用手册。纯化后的蛋白用截留管(3kDa)超滤去除其中含有的咪唑,采用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的纯化结果,结果如图1所示,泳道1为表达产物目的条带,蛋白质的分子量约为44kDa,与理论分子量大小一致。
[0098] 实施例2重组染料脱色过氧化物酶rBsDyP在不同温度条件下降解玉米赤霉烯酮情况
[0099] 将玉米赤霉烯酮(ZEN)溶解到甲醇中配成1000μg/mL储备液,在1mL磷酸钠缓冲液(0.1M,pH8.0)体系中进行降解反应,实施例1制得的rBsDyP蛋白浓度为100μg/mL,ZEN浓度为10μg/mL,反应体系中H2O2含量为100μM,以未加入rBsDyP蛋白的体系作为对照;分别在27、32、37、42、47、52和57℃下反应1h,加入1mL甲醇终止反应,采用高效液相色谱检测ZEN含量。
[0100] 高效液相色谱检测ZEN的色谱条件为:色谱柱:Agilent C18色谱柱,4.6mm×150mm×5μm;流动相:乙腈-水-甲醇(46:46:8);流速:1mL/min;压:45bar;进样量:20μL;荧光检测器检测波长:λex=274nm,λem=440nm;采集时间:18分钟。
[0101] 结果如图2所示,rBsDyP蛋白降解ZEN最适温度为42℃,在最适温度条件下实施例1制得的rBsDyP蛋白与ZEN(10μg/mL)反应1h降解率为83%。
[0102] 实施例3重组染料脱色过氧化物rBsDyP在不同pH条件下降解玉米赤霉烯酮情况[0103] 为测试在不同pH条件下实施例1制得的rBsDyP降解ZEN活性,在1mL不同pH值的缓冲液(pH4-6,0.1M柠檬酸钠缓冲液;pH7-8,0.1M磷酸钠缓冲液;pH9-10,0.1M甘氨酸-NaOH缓冲液)中进行降解反应,反应体系中H2O2含量为100μM,实施例1制得的rBsDyP蛋白浓度为100μg/mL,ZEN浓度为10μg/mL;以未加入rBsDyP蛋白的体系作为对照;在42℃下反应1h,加入1mL甲醇终止反应,采用高效液相色谱检测ZEN含量。
[0104] 结果如图3所示,rBsDyP蛋白降解ZEN最适pH为8,在最适pH条件下实施例1制得的rBsDyP与ZEN(10μg/mL)在42℃下反应1h降解率为83%。
[0105] 实施例4重组染料脱色过氧化物酶rBsDyP在介体ABTS参与条件下对ZEN的降解情况
[0106] 在1mL不同pH值的缓冲液(pH4-6,0.1M柠檬酸钠缓冲液;pH7-8,0.1M磷酸钠缓冲液;pH9-10,0.1M甘氨酸-NaOH缓冲液)中进行降解反应,反应体系中H2O2含量为100μM,实施例1制得的rBsDyP蛋白浓度为100μg/mL,ZEN浓度为10μg/mL,ABTS含量为1mM或者5mM;以未加入rBsDyP蛋白的体系作为对照;在42℃下反应1h后,加入1mL甲醇终止反应,采用高效液相色谱检测ZEN含量。
[0107] 结果如图4所示,添加ABTS能够加强rBsDyP对ZEN的降解作用,当体系中存在ABTS时,反应进行1h后,在pH5到10条件下ZEN降解率均超过95%。在pH4条件下,当体系中ABTS含量为1mM时,ZEN降解率为52%;当体系中ABTS含量为5mM时,ZEN降解率为85%。
[0108] 实施例5重组染料脱色过氧化物酶rBsDyP在介体ABTS参与条件下对AFB1的降解情况
[0109] 在1mL不同pH值的缓冲液(pH4-6,0.1M柠檬酸钠缓冲液;pH7-8,0.1M磷酸钠缓冲液;pH9-10,0.1M甘氨酸-NaOH缓冲液)中进行降解反应,反应体系中H2O2含量为100μM,实施例1制得的rBsDyP蛋白浓度为100μg/mL,AFB1浓度为2μg/mL,ABTS含量为1mM或者5mM;以未加入rBsDyP蛋白的体系作为对照;在42℃下反应1h后,加入1mL甲醇终止反应,采用高效液相色谱检测AFB1含量。
[0110] 结果如图5所示,在中性和性条件下(pH 7到10),当体系中ABTS含量为1mM时,AFB1降解率均超过74%;当体系中ABTS含量为5mM时,AFB1降解率均超过85%。
[0111] 实施例6重组染料脱色过氧化物酶rBsDyP与不同浓度葡萄糖氧化酶GOD联合应用对玉米赤霉烯酮的降解情况
[0112] 为测试实施例1制得的rBsDyP和不同浓度葡萄糖氧化酶GOD联合应用降解ZEN的作用效果,采用实施例2所用的1mL磷酸钠缓冲液(0.1M,pH8.0)反应体系,体系中葡萄糖氧化酶的含量分别为0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4和0.5U/mL,葡萄糖含量为100μM,rBsDyP蛋白浓度为100μg/mL,ZEN浓度为10μg/mL,以未加入rBsDyP蛋白的体系作为对照;在42℃下分别反应1h,加入1mL甲醇终止反应,采用高效液相色谱检测ZEN含量。
[0113] 结果如图6所示,随着葡萄糖氧化酶GOD浓度增加,实施例1制得的rBsDyP对ZEN的降解率增加,当GOD的浓度为0.5U/mL时,rBsDyP对ZEN的降解率为75%。
[0114] 实施例7重组染料脱色过氧化物酶rBsDyP催化降解玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、AFB2、AFM1、AFM2、AFG1和AFG2的效率
[0115] 将α-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、AFB2、AFM1、AFM2、AFG1和AFG2分别溶解到二甲基亚砜中,按如下反应体系进行试验:在1mL不同pH值的缓冲液(pH4和6,0.1M柠檬酸钠缓冲液;pH8,0.1M磷酸钠缓冲液)中进行降解反应,反应体系中H2O2含量为100μM,实施例1制得的rBsDyP蛋白浓度为100μg/mL,玉米赤霉烯醇或玉米赤霉醇浓度为10μg/mL,AFB2、AFM1、AFM2、AFG1或AFG2浓度为2μg/mL,ABTS含量为5mM;以未加入rBsDyP蛋白的体系作为对照;在42℃下反应12h后,加入1mL甲醇终止反应,采用高效液相色谱检测各毒素含量。rBsDyP催化降解玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、AFB2、AFM1、AFM2、AFG1和AFG2的效率见表1。
[0116] 表1 rBsDyP催化降解不同毒素的效率
[0117]
[0118] 实施例8一种真菌毒素生物降解剂及其制备方法
[0119] 称取添加剂总质量的90%的载体(麦芽糖糊精与淀粉按质量比2:1比例混合),然后再按添加剂总质量的10%的比例混入实施例1制得的染料脱色过氧化物酶BsDyP蛋白,得到真菌毒素生物降解剂。
[0120] 实施例9一种真菌毒素生物降解剂及其制备方法
[0121] 称取添加剂总质量的9%的载体(麦芽糖糊精与蔗糖按质量比1:1比例混合),然后再按添加剂总质量的1%的比例混入实施例1制得的染料脱色过氧化物酶BsDyP蛋白,最后按添加剂总量的90%混入枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合制剂粉(枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌质量比为1:1),得到真菌毒素生物降解剂。
[0122] 实施例10一种真菌毒素生物降解剂及其制备方法
[0123] 先将占添加剂总质量的70%的淀粉与占添加剂总质量的10%的枯草芽孢杆菌混合,然后再按添加剂总质量的10%的比例混入实施例1制得的染料脱色过氧化物酶BsDyP蛋白,最后按添加剂总量的10%混入葡萄糖氧化酶,得到真菌毒素生物降解剂。
[0124] 实施例11一种真菌毒素生物降解剂及其制备方法
[0125] 先将占添加剂总质量的70%麦芽糖糊精与占添加剂总质量的20%的嗜酸乳杆菌混合,然后再按添加剂总质量的5%的比例混入实施例1制得的染料脱色过氧化物酶BsDyP蛋白,再按添加剂总质量的5%的比例混入漆酶,最后按添加剂总量的1%混入丁香醛,得到真菌毒素生物降解剂。
[0126] 实施例12真菌毒素生物降解剂处理含有ZEN的饲料
[0127] 将实施例11所述真菌毒素生物降解剂处理含有ZEN的饲料(ZEN=4ppm)按0.1%比例混合,在体外模拟动物胃肠液中消化24h,用于降解饲料中的ZEN。
[0128] 模拟胃液:准确称取2g含有ZEN的饲料,再添加2mg降解剂,放入100mL锥形瓶中,加入25mLPBS(0.1MpH6.0),调pH到6.8,混匀。加入1mL配制好的淀粉酶溶液,39℃,150r/min消化2h。加10mL0.2MHCl,用1MHCl或1MNaOH溶液调pH至2.0,加1mL新鲜配制的酸性蛋白酶(50000U/g),混匀,用parafilm封口,于39℃恒温摇床培养6h(150r/min)。
[0129] 模拟小肠液:模拟胃液孵育6h以后,再加入5mL0.6MNaOH溶液,用1MHCl或1MNaOH将pH调到6.8后加入新鲜配制的肠道外源酶混悬液(蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶=3:1:1),用parafilm封口,于39℃恒温摇床分别培养18h(150r/min)。
[0130] 反应结束后测定ZEN的降解率为94.58%。
[0131] 实施例13真菌毒素生物降解剂处理含有AFB1的花生粕
[0132] 将实施例12所述真菌毒素生物降解剂处理含有AFB1的花生粕(AFB1=1ppm)按0.1%比例混合,在体外模拟动物胃肠液中消化24h,用于降解饲料中的AFB1。
[0133] 模拟胃液:准确称取2g含有AFB1的花生粕,再添加2mg降解剂,放入100mL锥形瓶中,加入25mLPBS(0.1MpH6.0),调pH到6.8,混匀。加入1mL配制好的淀粉酶溶液,39℃,150r/min消化2h。加10mL0.2MHCl,用1MHCl或1MNaOH溶液调pH至2.0,加1mL新鲜配制的酸性蛋白酶(50000U/g),混匀,用parafilm封口,于39℃恒温摇床培养6h(150r/min)。
[0134] 模拟小肠液:模拟胃液孵育6h以后,再加入5mL0.6MNaOH溶液,用1MHCl或1MNaOH将pH调到6.8后加入新鲜配制的肠道外源酶混悬液(蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶=3:1:1),用parafilm封口,于39℃恒温摇床分别培养18h(150r/min)。
[0135] 反应结束后测定AFB1的降解率为82.63%。
[0136] 以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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