水稻基因OsATL15在调节农药的吸收转运中的应用
阅读：756发布：2020-05-13
专利汇可以提供水稻基因OsATL15在调节农药的吸收转运中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了 水 稻基因OsATL15在调节 农药 的吸收转运中的应用。本发明从水稻品种中花11中分离克隆得到调控水稻对农药的吸收转运的基因OsATL15，其核苷酸序列、编码的蛋白以及含有基因OsATL15的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌可提高水稻对农药的吸收转运，使农药到达 害虫 为害部位，减少水稻田农药的使用量；也可以从遗传上改良水稻品种的对农药的输导性，选育农药高效利用的水稻品种。并且，OsATL15基因可以参与调节水稻株高，具有改良水稻种质资源的作用。，下面是水稻基因OsATL15在调节农药的吸收转运中的应用专利的具体信息内容。
1.水稻基因OsATL15在调节农药的吸收转运中的应用，其特征在于，所述的水稻基因OsATL15编码的蛋白，其氨基酸序列为下列A)或B)：
A.如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
B.以上A经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而获得的仍具有相同功能的衍生蛋白质的氨基酸序列；
所述的农药为内吸性农药。
2.根据权利要求1所述的水稻基因OsATL15在调节农药的吸收转运中的应用，其特征在于，所述的水稻基因OsATL15，其核苷酸序列为下列A)至E)中的任意一种：
A.如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
B.如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
C.严格条件下与A或B所限定的核苷酸杂交，且编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列；
D.与A所限定的核苷酸序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％或99％同源性，且编码由如SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列；
E.与B所限定的核苷酸序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％或99％同源性，且编码由如SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列；
所述的农药为内吸性杀虫剂。
3.根据权利要求1或2所述的水稻基因OsATL15在调节农药的吸收转运中的应用，其特征在于，所述的农药为新烟碱类杀虫剂、酰胺类杀虫剂、有机磷类杀虫剂、沙蚕毒素类杀虫剂或氨基甲酸酯类杀虫剂中的一种。
4.含有权利要求1或2所述的水稻基因OsATL15的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节农药的吸收转运中的应用。
5.一种水稻基因OsATL15的分子标记检测引物，其特征在于由如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的上游引物和下游引物组成：
F:5’-TACTCGCCGCCGCCGTCATA-3’；
R:5’-CGAGGTTGAGCGTGTTGCTGTTCC-3’。
6.权利要求5所述的水稻基因OsATL15的分子标记检测引物在鉴别高效利用农药的水稻品种中的应用，其特征在于包括如下步骤：利用所述的分子标记检测引物对待检测的水稻品种的种质基因组DNA或者RNA进行扩增，通过基因表达量的变化判断目标基因响应农药处理的敏感性；
所选农药为内吸性农药。
7.一种水稻基因OsATL15的分子标记检测试剂盒，其特征在于包括权利要求5所述的分子标记检测引物；
所述的水稻基因OsATL15的分子标记检测试剂盒还包括PCR用酶、PCR用水和PCR用缓冲液中的至少一种。
8.权利要求1或2所述的水稻基因OsATL15在培育高效利用农药的转基因水稻中的应用，其特征在于包括如下步骤：将所述的水稻基因OsATL15构建于植物表达载体上，将得到的重组表达载体转入水稻中进行表达，得到高效利用农药的水稻品种。
9.根据权利要求8所述的水稻基因OsATL15在培育高效利用农药的转基因水稻中的应用，其特征在于：
所述的农药为内吸性农药；
所述的植物表达载体为pCAMBIA2300-35S；
所述的将得到的重组表达载体转入水稻中进行表达是通过农杆菌介导、植物病毒载体、直接DNA转化、电导转化的生物学方法将得到的重组植物表达载体转化到植物细胞或组织中。
10.权利要求1或2所述的水稻基因OsATL15在调节水稻株高中的应用。
水稻基因OsATL15在调节农药的吸收转运中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 水稻是我国和全世界的主要粮食作物，全世界约有22亿人以水稻为食，中国有60％的人口以水稻为食。然而，水稻生产过程中杀虫剂的过度使用，给生态环境造成了巨大压力。据估算，在目前的农药使用中，只有施药量2％的农药会真正停留在植物表面，而真正到达作用靶标的更是只有0.1％(Wang等，2007)。这意味着99.9％以上的杀虫剂会进入环境中，化学肥料和农药利用效率低，大部分流失进入土壤和河流，造成土壤质量下降，水体污染和土壤生态多样性下降(Pimentel等，1992)。因此，增强农药靶向性，提高农药有效利用率是当前农药研究的主要目标，是实现农药减量增效的必经途径。
[0003] 农药转运基因可实现农药的靶向积累，提高农药的有效利用。因此，利用分离克隆水稻的农药转运基因和蛋白，有望实现内吸输导性农药的靶向积累调控，减少环境释放，同时有利于水稻育种，具有重要的经济价值。
发明内容
[0004] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供水稻基因OsATL15在调节农药的吸收转运中的应用。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种水稻基因OsATL15的分子标记检测引物。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：水稻基因OsATL15在调节农药的吸收转运中的应用，是基于本发明发明人发现OsATL15基因可以提高水稻对农药的吸收转运，增加水稻对农药的吸收和转运，到达害虫为害部位，减少水稻田农药的使用量；也可以从遗传上改良水稻品种的对农药的输导性，选育农药高效利用的水稻品种。
[0007] 所述的农药优选为内吸性农药；进一步优选为内吸性杀虫剂；更进一步优选为新烟碱类杀虫剂、酰胺类杀虫剂、有机磷类杀虫剂、沙蚕毒素类杀虫剂或氨基甲酸酯类杀虫剂中的一种；最优选为噻虫嗪、氯虫苯甲酰胺、氧乐果、杀虫双或灭多威中的一种。
[0008] 所述的水稻基因OsATL15编码的蛋白，其氨基酸序列为下列A)或B)：
[0009] A.如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
[0010] B.以上A经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而获得的仍具有相同功能的衍生蛋白质的氨基酸序列。
[0011] 所述的水稻基因OsATL15，其核苷酸序列为下列A)至E)中的任意一种：
[0012] A.如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
[0013] B.如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
[0014] C.严格条件下与A或B所限定的核苷酸杂交，且编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列；
[0015] D.与A所限定的核苷酸序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性，且编码由如SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列；
[0016] E.与B所限定的核苷酸序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性，且编码由如SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列。
[0017] 含有所述的水稻基因OsATL15的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌在调节农药的吸收转运中的应用也属于本发明的保护范围。
[0018] 一种水稻基因OsATL15的分子标记检测引物，由如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的上游引物和下游引物组成：
[0019] F:5’-TACTCGCCGCCGCCGTCATA-3’；
[0020] R:5’-CGAGGTTGAGCGTGTTGCTGTTCC-3’。
[0021] 所述的水稻基因OsATL15的分子标记检测引物在鉴别高效利用农药的水稻品种中的应用，包括如下步骤：利用所述的分子标记检测引物对待检测的水稻品种的种质基因组DNA或者RNA进行扩增，通过基因表达量的变化判断目标基因响应农药处理的敏感性。
[0022] 所述的农药优选为内吸性农药；进一步优选为内吸性杀虫剂；更进一步优选为新烟碱类杀虫剂、酰胺类杀虫剂、有机磷类杀虫剂、沙蚕毒素类杀虫剂或氨基甲酸酯类杀虫剂中的一种；最优选为噻虫嗪、氯虫苯甲酰胺、氧乐果、杀虫双或灭多威中的一种。
[0024] 所述的水稻基因OsATL15的分子标记检测试剂盒，还包括PCR用酶、PCR用水和PCR用缓冲液中的至少一种。
[0025] 水稻基因OsATL15在培育高效利用农药的转基因水稻中的应用，包括如下步骤：将所述的水稻基因OsATL15构建于植物表达载体上，将得到的重组表达载体转入水稻中进行表达，得到高效利用农药的水稻品种。
[0026] 所述的农药优选为内吸性农药；进一步优选为内吸性杀虫剂；更进一步优选为新烟碱类杀虫剂、酰胺类杀虫剂、有机磷类杀虫剂、沙蚕毒素类杀虫剂或氨基甲酸酯类杀虫剂中的一种；最优选为噻虫嗪、氯虫苯甲酰胺、氧乐果、杀虫双或灭多威中的一种。
[0027] 所述的植物表达载体优选为pCAMBIA2300-35S。
[0028] 所述的将得到的重组表达载体转入水稻中进行表达可以通过农杆菌介导、植物病毒载体、直接DNA转化、电导转化等常规生物学方法将得到的重组植物表达载体转化到植物细胞或组织中。
[0029] 上述水稻基因OsATL15在调节水稻株高中的应用。
[0030] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0031] 1.本发明利用聚合酶链式反应(PCR)从水稻品种中花11中分离克隆到一个水稻中控制农药吸收转运的基因OsATL15，应用该基因可以增加水稻对农药的吸收和转运，使农药到达害虫为害部位，减少水稻田农药的使用量。
[0032] 2.在水稻中提高基因OsATL15的表达可以从遗传上改良水稻品种的对农药的输导性，选育农药高效利用的品种，实现稻田农药减量增效。
[0033] 3.本发明证实了基因OsATL15在农药吸收转运中的作用，为研究水稻对农药的利用机制提供了新的线索。
[0035] 图1为OsATL15过表达水稻株系中OsATL15基因表达量的实时定量荧光PCR检测结果图。
[0036] 图2为CRISPR敲除OsATL15基因的突变体植株与野生型植株的OsATL15基因序列的比对结果图。
[0037] 图3为检测OsATL15基因的突变体水稻根部和根上部中噻虫嗪含量的结果图。
[0038] 图4为检测OsATL15基因的突变体水稻根部和根上部中氯虫苯甲酰胺含量的结果图。
[0039] 图5为检测OsATL15基因的突变体水稻根部和根上部中氧乐果含量的结果图。
[0040] 图6为检测OsATL15基因的突变体水稻根部和根上部中杀虫双含量的结果图。
[0041] 图7为检测OsATL15基因的突变体水稻根部和根上部中灭多威含量的结果图。
[0042] 图8为检测OsATL15基因的突变体水稻株系中噻虫嗪的转移系数的结果图。
[0043] 图9为检测OsATL15基因的突变体水稻株系中氯虫苯甲酰胺的转移系数的结果图。
[0044] 图10为检测OsATL15基因的突变体水稻株系中氧乐果的转移系数的结果图。
[0045] 图11为检测OsATL15基因的突变体水稻株系中杀虫双的转移系数的结果图。
[0046] 图12为检测OsATL15基因的突变体水稻株系中灭多威的转移系数的结果图。
[0047] 图13为OsATL15蛋白-GFP在水稻原生质体中的亚细胞定位结果图；其中，图A、B、C和D为蛋白GFP的亚细胞定位结果图；图E、F、G和H为融合蛋白OsATL15-GFP的亚细胞定位结果图；图A和E为明视场下的结果；图B和F为暗视场下的绿色荧光；图C和G为膜定位蛋白mCherry-1008红色荧光；图D和H为重叠视野；标尺＝10μm。
[0048] 图14为OsATL15基因在100μmol/L噻虫嗪(THX)处理24小时条件下的实时荧光定量PCR检测结果图。
[0049] 图15为OsATL15基因的突变体水稻株系表型(标尺＝10cm)；其中，A为野生型水稻中花11，B为突变体Crispr-10，C为突变体Crispr-9，D为突变体Crispr-17。
[0050] 图16为OsATL15基因的突变体水稻株高统计图。
[0051] 图17为OsATL15基因的突变体水稻根长统计图。
具体实施方式
[0052] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0053] 下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
[0054] 实施例中大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105为常用的菌株，多数分子生物学实验室均有保存；水稻品种为野生型中花11(公开使用的水稻品种，市售)。
[0055] 实施例中所使用的化学试剂均为进口或国产分析纯。
[0056] 实施例中所使用的引物由深圳华大基因公司合成，测序在深圳华大基因公司进行。
[0057] 实施例1OsATL15基因及其编码蛋白的克隆
[0058] 提取野生型粳稻品种中花11幼苗的RNA(OMEGA R6827-01)，反转录(Takara cat#6210A)得到去gDNA的cDNA(具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸)，将其作为模板，用正向引物F1和反向引物R1进行PCR扩增。得到1896bp的PCR产物。
[0059] 经过测序，1896bp的PCR产物具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸。利用(http://web.expasy.org/translate/)对编码序列CDS进行氨基酸翻译，获得OsATL15的氨基酸序列，编码631个氨基酸。编码的蛋白命名为OsATL15，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0060] F1：5’-ATGGCAGATCAGAAGGTG-3’；
[0061] R1：5’-TCATAGGTGACGAGACTGAGGTG-3’。
[0062] 实施例2过表达OsATL15植株的构建
[0063] 一、过表达OsATL15基因
[0064] 1、重组表达载体pCAMBIA1300-35S-OsATL15的构建
[0065] 提取野生型中花11幼苗的RNA，反转录得到cDNA作为模板(提取和反转录的方法同实施例1)，用引物1(ACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAATGGCAGATCAGAAGGTG)与引物2(ATGATACGAACGAAAGCTCTGCATCATAGGTGACGAGACTGAGGTG)进行PCR扩增(Takara cat#R045)，反应条件为：1个循环：98℃、3min；32个循环：98℃、30s，58℃、30s，72℃、1min；1个循环：72℃、5min；16℃，得到带15个碱基同源重组臂的OsATL15基因。
[0066] 将上述PCR产物进行胶回收，与经过Sal I和Pst I双酶切的pCAMBIA2300-35S载体骨架(武汉伯远公司提供)通过In-fusion试剂盒(Takara cat#639648)进行同源重组，得到重组质粒。将重组质粒送样测序，命名为pCAMBIA1300-35S-OsATL15，为重组表达载体。
[0067] 2、过表达OsATL15的转基因水稻的制备
[0068] 1)将重组表达载体pCAMBIA1300-35S-OsATL15电击转入农杆菌EHA105中(Olivia等,2019)，得到重组菌AGL1/pCAMBIA1300-35S-OsATL15(从阳性克隆中提取质粒，测序验证)。
[0069] 2)将重组菌AGL1/pCAMBIA1300-35S-OsATL15用农杆菌介导的方法转化中花11水稻愈伤组织，具体如下：
[0070] 挑取AGL1/pCAMBIA1300-35S-OsATL15单菌落，接种于10mL的农杆菌培养基中(含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L)，28℃，180rpm摇床培养2-3天。取4mL菌液，4000rpm离心3min，倒去上清液，加入少量AAM培养基重新悬浮细胞，然后加入20mL的AAM培养基(含0.1mM乙酰丁香酮As)，28℃、150rpm摇床避光培养1-2h，培养至OD600＝0.4左右。挑选生长状态良好、颗粒状中花11(以下也称为野生型水稻)水稻愈伤组织浸入农杆菌培养液中，28℃、150-
200rpm摇20min，将愈伤组织倒出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织平铺在含多层滤纸的无菌平皿中，超净台上吹干(愈伤分散不结块)，然后将愈伤组织转移到共培养培养基上，黑暗条件下培养2-3天。将愈伤转至含有100mg/L的潮霉素和400mg/L头孢霉素的NB基本培养基上筛选3-4周(一筛)。将成活的愈伤组织转入二筛培养基(含100mg/L潮霉素及
200mg/L头孢霉素的NB基本培养基)上筛选3周。将抗性愈伤组织转入分化培养基(含100mg/L潮霉素)上进行分化，再生植株在含100mg/L潮霉素的壮苗培养基上生根后(约3-4周)转移至温室中，得到T0代转OsATL15水稻。
200rpm摇20min，将愈伤组织倒出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织平铺在含多层滤纸的无菌平皿中，超净台上吹干(愈伤分散不结块)，然后将愈伤组织转移到共培养培养基上，黑暗条件下培养2-3天。将愈伤转至含有100mg/L的潮霉素和400mg/L头孢霉素的NB基本培养基上筛选3-4周(一筛)。将成活的愈伤组织转入二筛培养基(含100mg/L潮霉素及
200mg/L头孢霉素的NB基本培养基)上筛选3周。将抗性愈伤组织转入分化培养基(含100mg/L潮霉素)上进行分化，再生植株在含100mg/L潮霉素的壮苗培养基上生根后(约3-4周)转移至温室中，得到T0代转OsATL15水稻。
[0071] 上述转化中所用的培养基如下：
[0072] 共培养培养基：诱导愈伤及继代培养基+As(0.1mM/L)+葡萄糖(10g/L)，pH5.2。
[0073] 农杆菌侵染水稻愈伤组织AAM培养基：AA大量元素+AA微量元素+AA氨基酸+MS维生素+水解酪蛋白(500mg/L)+蔗糖(68.5g/L)+葡萄糖(36g/L)+As(0.1mM)，pH 5.2。
[0075] 诱导愈伤及继代培养基：NB基本培养基+2，4-D(2mg/L)。
[0076] 分化培养基：NB基本培养基+6-BA(3mg/L)+NAA(1mg/L)。
[0077] 壮苗培养基：1/2MS无机盐+NAA(0.5mg/L)+MET(0.25mg/L)。
[0079] 3、转OsATL15水稻的分子鉴定
[0080] 1)PCR初步鉴定
[0081] 提取T0代转OsATL15水稻的基因组DNA(OMEGA cat#D2485-02)，用引物F2和R2(引物序列如下)进行PCR鉴定，反应条件为：1个循环：98℃、3min；32个循环：98℃、30s，60℃、30s，72℃、30s；1个循环：72℃、5min；16℃。筛选出PCR阳性(340bp)T0代转OsATL15水稻植株#1、#2和#3。
[0082] F2：5’-ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC-3’；
[0083] R2：5’-TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGA-3’。
[0084] 2)转录水平分析
[0085] 提取PCR阳性T0代转OsATL15水稻株系#1、#2和#3的总RNA，反转录，得到的cDNA作为模板，用如下引物进行实时定量荧光PCR，检测各材料中OsATL15基因在转录水平上的表达量。实验重复3次，结果取平均值。以野生型水稻为对照。
[0086] 实时定量荧光PCR使用Bio-Rad CFX96进行。PCR反应体系(20μL)按照产品使用说明书SYBR Green Real-Time PCR Master Mix reagent(Takara)进行，具体体系如下：10μL SYBR Green Real-Time PCR Master Mix、2μL上下游引物混合物(上下游引物浓度均为10μM)、7μL RNase-free water、1μL cDNA模板。具体反应程序如下：酶热激活95℃、30s，1个循环；变性95℃、5s，延伸60℃、30s，共40个循环。
[0087] 其中，扩增OsATL15基因的引物序列为：
[0088] OsATL15上游引物F：5’-TACTCGCCGCCGCCGTCATA-3’；
[0089] OsATL15下游引物R：5’-CGAGGTTGAGCGTGTTGCTGTTCC-3’。
[0090] 以UBQ2作为内参基因，扩增内参UBQ2的引物序列为：
[0091] UBQ2上游引物：5’-GCATCTCTCAGCACATTCCA-3’；
[0092] UBQ2下游引物：5’-ACCACAGGTAGCAATAGGTA-3’。
[0093] 数据的处理采用Comparative Ct的方法，即Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的－△△Ct域值时所经历的循环数，ΔCt＝Ct(OsATL15)-Ct(ACTIN1)，以2 的值衡量基因转录水平，对各材料中OsATL15基因的表达进行分析比较。
[0094] 各实验材料中OsATL15基因表达量的实时定量荧光PCR检测结果如图1所示，OsATL15基因的表达均为相对值，可以看出：相比未转基因的野生型水稻粳稻中花11(WT)，PCR阳性T0代转OsATL15水稻株系#1、#2和#3中OsATL15基因的表达量在转录水平上显著提高。PCR阳性T0代转OsATL15水稻株系#1、#2和#3为阳性T0代转OsATL15水稻，命名为OsATL15-OX1、OsATL15-OX2和OsATL15-OX3。
[0095] 实施例3：CRISPR敲除构建OsATL15突变体植株
[0096] 1、利用CRISPR/Cas9系统，根据OsATL15的外显子序列选择靶标序列
[0097] 利用简单、高效的CRISPR/Cas9系统，根据OsATL15外显子序列选择特异的靶标序列，靶标序列：GAGGCACGTCCTGGAGAAGGAGG。靶标序列针对OsATL15基因，特异的使OsATL15蛋白失活。
[0098] 2、构建含上述靶标序列片段的pCRISPR/Cas9重组载体
[0099] 1)根据靶标序列，设计带粘性末端的接头引物
[0100] 将设计的靶序列添加pCRISPR/Cas9系统的特异粘性末端接头(F：GGCA；R：AAAC)，并合成完整的接头引物。
[0101] F3：5’-GGCA-GAGGCACGTCCTGGAGAAGG-3’；
[0102] R3：5’-AAAC-CCTTCTCCAGGACGTGCCTC-3’。
[0103] 2)将带粘性末端的接头引物退火互补形成带粘性末端的双链小片段
[0104] 将F3引物和R3引物稀释成浓度为10μM的溶液，各取10μL混匀，在PCR仪中进行退火反应，从98℃降至22℃，使F3引物和R3引物互补形成带粘性末端的双链小片段。
[0105] 3)酶切包含sg-RNA的原始载体pOs-sgRNA(TAKARA Cat#632640)
[0106] 用限制性内切酶BsaⅠ酶切包含sg-RNA的原始载体pOs-sgRNA，产生可以和靶标序列粘性末端互补的粘性末端。用BsaⅠ酶切pOs-sgRNA原始载体的体系为：10×buffer BsaⅠ2μL、BsaⅠ酶1μL、pOs-sgRNA载体4μg、ddH2O补足至20μL，37℃酶切12h。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳核查条带大小后，试剂盒(OMEGA Cat#D2500-02)过柱回收纯化酶切产物，得到酶切过的pOs-sgRNA载体，加入灭菌的ddH2O溶解，测定浓度后待用。
[0107] 4)将带粘性末端的双链小片段连接到酶切过的pOs-sgRNA载体上，形成包含靶标序列和sg-RNA的重组载体
[0108] 用T4连接酶将步骤2)中的双链小片段和步骤3)中酶切过的pOs-sgRNA载体连接，形成完整的包含针对OsATL15蛋白的靶序列和sg-RNA的重组载体。15μL连接体系为：10×T4 ligation buffer 1.5μL、双链小片段4μL、酶切过的pOs-sgRNA载体3μL、T4 DNA ligase 1μL、ddH2O补足至15μL，16℃连接12小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α，卡那抗性LB平板过夜培养，挑选阳性菌株进行测序，得到测序正确的包含靶标序列和sg-RNA的重组载体。
[0109] 5)用LRmix将包含靶标序列和sg-RNA的重组载体和包含Cas9的载体pH-Ubicas9-7进行LR反应重组，形成包含靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整重组载体
[0110] 用LR mix将步骤4)得到的重组载体和包含Cas9的载体pH-Ubi-cas9-7(武汉伯远公司提供)进行LR反应重组，LR反应体系：包含靶标序列和sg-RNA的重组载体25-50ng、pH-Ubi-cas9-7载体75ng、5×LR Clonase TM buffer 1μL、TE Buffer(pH8.0)补充到4.5μL、LR ClonaseTM 0.5uL。将体系于25℃下温育2h，反应后加2μL 2μg/μL的Proteinase K，在37℃下处理10min，再将2μL反应产物转入大肠杆菌DH5α，庆大霉素抗性LB平板37℃过夜培养，挑选阳性菌株进行测序，得到测序正确的包含OsATL15蛋白靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整pCRISPR/Cas9重组载体。
[0111] 3、将所获得的pCRISPR/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因植株[0112] 按照实施例2重组载体转OsATL15水稻的方法将步骤5)所获得的包含OsATL15蛋白靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整重组载体导入水稻愈伤组织中制备转基因水稻，在T0代植株中就可以得到OsATL15蛋白完全失活的转基因植株。
[0113] 4、筛选转基因植株中的转基因阳性植株
[0114] 将移栽的转基因植株(T0代)提取DNA，进行靶序列位点检测，共检测到32株阳性植株。
[0115] 5、利用转基因阳性植株获得突变体植株
[0116] 1)突变位点的鉴定
[0117] 将移栽的阳性植株提取DNA，针对含靶标位点的500bp以内的DNA片段，设计特异性引物F4和R4，扩增含靶标位点的DNA片段，扩增得到的360bp PCR产物经纯化后送公司测序，测序结果与野生型植株序列比对，筛选出突变体植株。部分突变分析结果如图2所示。
[0118] F4:5’-ATGGCAGATCAGAAGGTGATT-3’；
[0119] R4:5’-TGGAGCTGGTAGCCAAGAATCT-3’。
[0120] 2)将突变体植株进行繁种，于T1代转基因分离群体中检测不含潮霉素、Cas9等转基因元件的植株单株收种子，得到不带转基因成分的功能缺失突变体，分别命名为Crispr-10、Crispr-9和Crispr-17。
[0121] 实施例4：OsATL15突变体植株对农药的吸收转运的影响
[0122] 选用以下农药进行实验：新烟碱类杀虫剂噻虫嗪、酰胺类杀虫剂氯虫苯甲酰胺、有机磷类杀虫剂氧乐果、沙蚕毒素类杀虫剂杀虫双、氨基甲酸酯类杀虫剂灭多威。检测实施例3获得的Crispr-10、Crispr-9和Crispr-17水稻株系和野生型水稻中花11的水稻根茎叶中农药的含量。
[0123] (1)将噻虫嗪原药用DMSO溶解配制成40mM的母液，储存于4℃备用。将在水稻培养箱生长14天的水稻幼苗挑出，小心冲洗干净根部营养液，10株水稻幼苗为一组。之后将水稻幼苗根放置于0.5mM氯化钙缓冲溶液中预培养2h；用0.5mM氯化钙缓冲溶液将药物母液稀释至100μΜ，调节pH＝5.8后，加入50mL离心管中，每管40mL，将水稻幼苗转入其中，并用定值杯固定，保证水稻茎部部接触液面，静置于人工气候培养箱培养24h。24h后将水稻取出，用0.5mM(pH＝5.8)氯化钙缓冲液清洗根部4遍，确保完全清除根部表面附着的药物。用滤纸擦干表面水分，然后用刀片切断根茎交界处下方1cm及上方1cm，将水稻分为根、茎和叶三部分。分别称重记录后，在研钵中加液氮磨碎，加入10mL色谱级乙腈萃取，超声30min，14000g离心10min，吸取上清液1mL，过0.22μm得针头微孔滤膜除去杂质，装入液相瓶中，样品置于-
80℃低温保存待检测。每个处理3组重复。采用氯虫苯甲酰胺、氧乐果、杀虫双以及灭多威对水稻幼苗做相同处理，每个处理3组重复。
80℃低温保存待检测。每个处理3组重复。采用氯虫苯甲酰胺、氧乐果、杀虫双以及灭多威对水稻幼苗做相同处理，每个处理3组重复。
[0124] 结果表明，Crispr-10、Crispr-9和Crispr-17水稻株系根上部中噻虫嗪(THX)、氯虫苯甲酰胺、氧乐果、杀虫双以及灭多威的含量比野生型高，而根部中的含量与野生型相比无明显差异(图3、图4、图5、图6、图7)；Crispr-10、Crispr-9和Crispr-17水稻株系中转移系数(RCF)与野生型相比明显降低(图8、图9、图10、图11、图12)。
[0125] 实施例5：OsATL15蛋白的亚细胞定位
[0126] 提取15天大小中花11水稻幼苗的总RNA，反转录得到cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增OsATL15的全长ORF(去除终止密码子)，所用引物为：
[0127] F5：5’-TCAGATCTCGAGCTCAAGCTTC ATGGCAGATCAGAAGGTG-3’；
[0128] R5：5’-CCTTGCTCACCATCAGGATCCCTAGGTGACGAGACTGAGGTG-3’。
[0129] 将扩增得到的目的片段酶切回收，与空载体322-d1-eGFPn(北京华越洋)进行连接，使OsATL15与GFP融合，测序鉴定正确后分别将融合载体322-d1-eGFPn-OsATL15和空载体转入水稻原生质体中，室温下正常培养16h，在激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白OsATL15-GFP和蛋白GFP的在水稻原生质体中的亚细胞定位。结果如图13所示，证明了OsATL15蛋白特异的定位在水稻细胞膜中。
[0130] 实施例6：OsATL15分子探针的开发
[0131] 以新烟碱类杀虫剂噻虫嗪为例。
[0132] 用100umol/L的噻虫嗪对生长14天的野生型品种中花11幼苗进行处理，以溶剂水处理作为对照(Control)。处理后提取其RNA，反转录后利用定量PCR技术进行检测OsATL15基因的表达，方法同实施例2，实验设三次重复。
[0133] 结果如图14所示，在噻虫嗪处理条件下，水稻根、茎和叶中OsATL15基因的特异性表达受到强烈诱导。由此，利用该引物作为分子探针，对水稻种质中的OsATL15基因进行表达分析，可以快速判定目标基因响应噻虫嗪处理能力，可用于选育对噻虫嗪吸收高的新品种。
[0134] 实施例7OsATL15基因突变后对株高的影响
[0135] 将实施例3获得的OsATL15水稻Crispr-10、Crispr-9和Crispr-17突变体与野生型水稻中花11种植于水稻培养箱中，两周后观察表型。每个株系15株，实验重复3次，结果取平均值。
[0136] 观察表型，与野生型水稻中花11相比，Crispr-10、Crispr-9和Crispr-17水稻株系的株高减少，而根长无明显变化(图15)。测量水稻各个株高和根长，与野生型水稻中花11相比，Crispr-10、Crispr-9和Crispr-17水稻株系株高均降低(图16)，而根长无变化(图17)。
[0137] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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