[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求(2017年6月16日提交的)美国临时申请号62/521,084的权益，该临时申请通过引用以其整体并入本文。

[0003] 以电子方式提交的序列表的引用

[0004] 该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为5296WOPCT_SequenceListing，创建于2018年3月13日，且具有186千字节大小，并且与
本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通
过引用以其整体并入本文。

[0005] 本公开涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖基因。这些杀有害生物蛋白和编码它们的核酸序列可用于制备杀有害生物制剂和生产有害生物抗性转基
因植物。

[0006] 使用微生物剂(如真菌、细菌或其他昆虫物种)对具有农业意义的昆虫有害生物进行生物防治，为合成型化学杀有害生物剂提供了环境友好且有商业吸引力的替代方案。使
用生物杀有害生物剂造成污染和环境危害的风险较低，并且生物杀有害生物剂提供比传统
广谱化学杀昆虫剂所特有的靶特异性更强的靶特异性。另外，生物杀有害生物剂往往生产
成本较低，并且因此能提高各种作物的经济产量。

[0007] 已知芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的某些物种对一系列昆虫有害生物具有杀有害生物活性，所述昆虫有害生物包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目
(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)和
日本金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)是迄今为止发现的最成功的生物防治剂。昆虫
致病性还归因于幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌
(B.sphaericus)和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)的菌株。微生物杀昆虫剂，特别是从芽孢杆菌
属菌株获得的那些微生物杀昆虫剂，作为有害生物化学防治的替代品在农业上起着重要作
用。

[0008] 通过将作物植物进行遗传工程改造以从芽孢杆菌属产生杀有害生物蛋白，已经开发出抗昆虫增强的作物植物。例如，已经对玉米和棉花植物进行遗传工程改造以产生从苏
云金芽孢杆菌菌株分离的杀有害生物蛋白。现在，这些经遗传工程改造的作物广泛应用于
农业中，并且为农民提供了取代传统昆虫防治方法的环境友好型替代方案。虽然它们已被
证明在商业上非常成功，但是这些经遗传工程改造的昆虫抗性作物植物仅针对窄范围的经
济上重要的昆虫有害生物提供抗性。在一些情况下，昆虫可以对不同杀昆虫化合物产生抗
性，这就导致需要鉴定用于有害生物防治的替代性生物防治剂。

[0009] 因此，仍然需要对昆虫有害生物具有不同范围的杀昆虫活性的新杀有害生物蛋白，例如针对鳞翅目和鞘翅目中的各种昆虫具有活性的杀昆虫蛋白，所述昆虫包括但不限
于已对现存杀昆虫剂产生抗性的昆虫有害生物。
发明内容

[0010] 在一个方面，提供了用于对细菌、植物、植物细胞、组织以及种子赋予杀有害生物活性的组合物和方法。组合物包括杀有害生物和杀昆虫多肽的核酸分子编码序列、包含那
些核酸分子的载体、以及包含所述载体的宿主细胞。组合物还包括所述杀有害生物多肽序
列以及针对那些多肽的抗体。组合物还包含经转化的细菌、植物、植物细胞、组织以及种子。

[0011] 在另一方面，提供了编码IPD059多肽的分离或重组的核酸分子，所述多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段。提供了分离或重组的核酸分子，所述分离或重组的核酸分子能够编码SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：
49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、和SEQ ID NO：78的IPD059多肽，以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段，及其组合。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的
核酸序列。所述核酸序列可以在DNA构建体或表达盒中使用，以用于在多种生物体(包括微
生物和植物)中进行转化和表达。所述核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，所述合成序列
已经被设计用于在生物体中表达，所述生物体包括但不限于：微生物或植物。

[0012] 在另一方面，涵盖了IPD059多肽。还提供了分离或重组的SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、和SEQ ID NO：78的IPD059多肽，以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段，及其组合。

[0013] 在另一方面，提供了编码IPD098多肽的分离或重组的核酸分子，所述多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段。提供了分离或重组的核酸分子，所述分离或重组的核酸分子能够编码SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：
106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、和SEQ ID NO：117的IPD098多肽，以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段，及其组合。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。所述核酸序列可以在DNA构建体或表
达盒中使用，以用于在多种生物体(包括微生物和植物)中进行转化和表达。所述核苷酸或
氨基酸序列可以是合成序列，所述合成序列已经被设计用于在生物体中表达，所述生物体
包括但不限于：微生物或植物。

[0014] 在另一方面，涵盖了IPD098多肽。还提供了分离或重组的SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、和SEQ ID NO：117的IPD098多肽，以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段，及其组合。

[0015] 在另一方面，提供了编码IPD108多肽的分离或重组的核酸分子，所述多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段。提供了分离或重组的核酸分子，所述分离或重组的核酸分子能够编码SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：
136的IPD108多肽，以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段，及其组合。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。所述核酸序列可以在DNA构建体或表达盒
中使用，以用于在多种生物体(包括微生物和植物)中进行转化和表达。所述核苷酸或氨基
酸序列可以是合成序列，所述合成序列已经被设计用于在生物体中表达，所述生物体包括
但不限于：微生物或植物。

[0016] 在另一方面，涵盖了IPD108多肽。还提供了分离或重组的SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、和SEQ ID NO：136的IPD108多肽，以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段，及其组合。

[0017] 在另一方面，提供了编码IPD109多肽的分离或重组的核酸分子，所述多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段。提供了分离或重组的核酸分子，所述分离或重组的核酸分子能够编码SEQ ID NO：138的IPD109多肽，以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段，及其组合。
还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。所述核酸序列可以
在DNA构建体或表达盒中使用，以用于在多种生物体(包括微生物和植物)中进行转化和表
达。所述核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，所述合成序列已经被设计用于在生物体中
表达，所述生物体包括但不限于：微生物或植物。

[0018] 在另一方面，涵盖了IPD109多肽。还提供了分离或重组的SEQ ID NO：138的IPD109多肽，以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段，及其组合。

[0019] 在另一方面，提供了用于产生多肽和使用那些多肽来控制或杀灭鳞翅目、鞘翅目、线虫、真菌、和/或双翅目有害生物的方法。实施例的转基因植物表达本文公开的杀有害生
物序列中的一种或多种。在不同实施例中，所述转基因植物进一步包含一种或多种另外的
抗昆虫基因，例如，用于控制鞘翅目、鳞翅目、半翅目或线虫有害生物的一种或多种另外的
基因。本领域技术人员将理解，所述转基因植物可以包含赋予目的农艺性状的任何基因。

[0020] 在另一方面，还包括用于在样品中检测实施例的核酸和多肽的方法。提供了用于在样品中检测本公开的多肽的存在或检测编码本公开的多肽的多核苷酸的存在的试剂盒。
所述试剂盒可以与实施预期试剂检测的方法所需的所有试剂和对照样品，以及使用说明书
一起提供。

[0021] 在另一方面，实施例的组合物和方法可用于产生具有增强的有害生物抗性或耐受性的生物体。这些生物体以及包含所述生物体的组合物对于农业目的是所希望的。实施例
的组合物还可用于产生改变或改善的具有杀有害生物活性的蛋白质，或可用于检测
IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的存在。
附图说明

[0022] 图1显示使用Vector 套件的 模块中的邻接法产生的以下IPD059同源物的系统发育树：IPD059Aa(SEQ ID NO：39)、IPD059Ab(SEQ ID NO：40)、IPD059Ac(SEQ ID NO：41)、IPD059Ad(SEQ ID NO：42)、IPD059Ae(SEQ ID NO：43)、IPD059Af(SEQ ID NO：
44)、IPD059Ag(SEQ ID NO：45)、IPD059Ah(SEQ ID NO：46)、IPD059Ca(SEQ ID NO：47)、
IPD059Cb(SEQ ID NO：48)、IPD059Cc(SEQ ID NO：49)、IPD059Da(SEQ ID NO：50)、IPD059Db(SEQ ID NO：51)、IPD059Ea(SEQ ID NO：52)、IPD059Eb(SEQ ID NO：53)、IPD059Ec(SEQ ID NO：54)、IPD059Ed(SEQ ID NO：55)、IPD059Ee(SEQ ID NO：56)、IPD059Ef(SEQ ID NO：57)、IPD059Eg(SEQ ID NO：58)、IPD059Eh(SEQ ID NO：59)、IPD059Ei(SEQ ID NO：60)、IPD059Ej(SEQ ID NO：61)、IPD059Ek(SEQ ID NO：62)、IPD059El(SEQ ID NO：63)、IPD059Em(SEQ ID NO：64)、IPD059En(SEQ ID NO：65)、IPD059Eo(SEQ ID NO：66)、IPD059Ep(SEQ ID NO：67)、IPD059Eq(SEQ ID NO：68)、IPD059Er(SEQ ID NO：69)、IPD059Es(SEQ ID NO：70)、IPD059Et(SEQ ID NO：71)、IPD059Eu(SEQ ID NO：72)、IPD059Ev(SEQ ID NO：73)、IPD059Ew(SEQ ID NO：74)、和IPD059Ex(SEQ ID NO：75)。

[0023] 图2A-2B显示使用Vector 套件的 模块，以下IPD059同源物的氨基酸序列比对：IPD059Aa(SEQ ID NO：39)、IPD059Ab(SEQ ID NO：40)、IPD059Ac(SEQ ID 
NO：41)、IPD059Ad(SEQ ID NO：42)、IPD059Ae(SEQ ID NO：43)、IPD059Af(SEQ ID NO：44)、IPD059Ag(SEQ ID NO：45)、IPD059Ah(SEQ ID NO：46)、IPD059Ca(SEQ ID NO：47)、IPD059Cb(SEQ ID NO：48)、和IPD059Cc(SEQ ID NO：49)。所述序列之间的氨基酸序列多样性被突出
显示。在比对上方，保守的半胱氨酸残基用 符号表示。缺失变体IPD059AaTR1(SEQ ID 
NO：78)的起点由IPD059Aa(SEQ ID NO：39)的残基29(天冬氨酸)上方的“·”符号表示。

[0024] 图3显示使用Vector 套件的 模块，以下IPD059同源物的氨基酸序列比对：IPD059Da(SEQ ID NO：50)、IPD059Db(SEQ ID NO：51)、IPD059Ea(SEQ ID NO：
52)、IPD059Eb(SEQ ID NO：53)、IPD059Ec(SEQ ID NO：54)、IPD059Ed(SEQ ID NO：55)、
IPD059Ee(SEQ ID NO：56)、IPD059Ef(SEQ ID NO：57)、和IPD059Eg(SEQ ID NO：58)。所述序列之间的氨基酸序列多样性被突出显示。在比对上方，保守的半胱氨酸残基用 符号表
示。

[0025] 图4显示使用Vector 套件的 模块，以下IPD059同源物的氨基酸序列比对：IPD059Em(SEQ ID NO：64)、IPD059En(SEQ ID NO：65)、IPD059Eo(SEQ ID NO：
66)、IPD059Ep(SEQ ID NO：67)、IPD059Eq(SEQ ID NO：68)、IPD059Er(SEQ ID NO：69)、
IPD059Es(SEQ ID NO：70)、和IPD059Et(SEQ ID NO：71)。所述序列之间的氨基酸序列多样
性被突出显示。在比对上方，保守的半胱氨酸残基用 符号表示。

[0026] 图5显示使用Vector 套件的 模块，以下IPD098同源物的氨基酸序列比对：IPD098Aa(SEQ ID NO：102)、IPD098Ab(SEQ ID NO：103)、IPD098Ac(SEQ ID NO：
104)、IPD098Ba(SEQ ID NO：105)、IPD098Bb(SEQ ID NO：106)、IPD098Bc(SEQ ID NO：107)、IPD098Bd(SEQ ID NO：108)、IPD098Be(SEQ ID NO：109)、IPD098Bf(SEQ ID NO：110)、
IPD098Bg(SEQ ID NO：111)、IPD098Bh(SEQ ID NO：112)、和IPD098Bi(SEQ ID NO：113)。所述序列之间的氨基酸序列多样性被突出显示。在比对上方，保守的半胱氨酸残基用 符
号表示。

[0027] 图6显示使用Vector 套件的 模块，以下IPD098同源物的氨基酸序列比对：IPD098Fa(SEQ ID NO：118)、IPD098Ga(SEQ ID NO：119)、IPD098Gb(SEQ ID NO：
120)、IPD098Gc(SEQ ID NO：121)、IPD098Gd(SEQ ID NO：122)、IPD098Ge(SEQ ID NO：123)。
所述序列之间的氨基酸序列多样性被突出显示。在比对上方，保守的半胱氨酸残基用
符号表示。

[0028] 图7A-7B显示使用Vector 套件的 模块，以下IPD108同源物的氨基酸序列比对：IPD108Aa(SEQ ID NO：131)、IPD108Da(SEQ ID NO：132)、IPD108Dd(SEQ ID NO：133)、IPD108Df(SEQ ID NO：134)、IPD108Dj(SEQ ID NO：135)、和IPD108Eb(SEQ ID NO：
136)。所述序列之间的氨基酸序列多样性被突出显示。在比对上方，保守的半胱氨酸残基用
符号表示。

[0029] 图8显示了反映来自实例12的SDS-PAGE凝胶的凝胶内荧光的密度测定值的曲线，针对40nM Alexa标记的IPD098Aa多肽(SEQ ID NO：102)与未标记的IPD098Aa多肽(SEQ ID 
NO：102)的同源竞争，作为与WCRW BBMV的总结合百分比(在没有竞争者的情况下)相对于未
标记的IPD098Aa多肽(SEQ ID NO：102)的浓度。

[0030] 应理解，本公开不局限于所描述的特定方法、方案、细胞系、属、以及试剂，因此可以变化。还应理解，本文所用的术语是仅为了描述特定实施例，并且不旨在限制本公开的范围。

[0031] 如本文所用的，单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另有明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白质”包括本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质及其等效物，等等。本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确
说明。

[0032] 本公开涉及用于控制有害生物的组合物和方法。所述方法涉及用编码本公开的多肽的核酸序列转化生物体。实施例的核酸序列可用于制备具有杀有害生物活性的植物和微
生物。因此，提供了经转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织以及种子。所述组合物包括细菌物种的杀有害生物核酸和蛋白。所述核酸序列可用于构建随后转化到目的生物体中的表
达载体，作为用于分离其他同源(或部分同源)基因的探针，并且用于通过本领域已知的方
法(如定向诱变、结构域交换或DNA改组)产生改变的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽。
所述IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽可用于控制或杀灭鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真
菌、半翅目和线虫有害生物群体，并且可用于生产具有杀有害生物活性的组合物。目的昆虫
有害生物包括但不限于：鳞翅目物种，所述鳞翅目物种包括但不限于：玉米穗蛾(Corn 
Earworm，CEW)(玉米穗虫(Helicoverpa zea))；欧洲玉米螟(European Corn Borer，ECB)
(玉米螟(Ostrinia nubialis))，小菜蛾(diamond-back moth)，例如玉米穗虫；大豆夜蛾
(soybean looper)，例如大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)；以及黎豆夜蛾
(velvet bean caterpillar)，例如梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner)和鞘翅目
物种，所述鞘翅目物种包括但不限于：西方玉米根虫(Western corn rootworm)(玉米根萤
叶甲(Diabrotica virgifera))-WCRW、南方玉米根虫(Southern corn rootworm)(斑点黄
瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctata howardi))-SCRW、和北方玉米根虫(Northern corn 
rootworm)(北方玉米根虫(Diabrotica barberi))-NCRW。

[0033] 本文所用的“杀有害生物毒素”或“杀有害生物蛋白”是指毒素或与这种蛋白质具有同源性的蛋白质，所述毒素具有针对以下一种或多种有害生物的毒性活性，所述有害生
物包括但不限于：鳞翅目、双翅目、半翅目以及鞘翅目或线虫门的成员。已经从生物体中分
离出杀有害生物蛋白，所述生物体包括例如，芽孢杆菌属物种、假单胞菌属(Pseudomonas)
物种、发光杆菌属(Photorhabdus)物种、致病杆菌属(Xenorhabdus)物种、双酶梭菌
(Clostridium bifermentans)、和鲍比氏类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。杀有害
生物蛋白包括但不限于：来自假单胞菌属物种的杀昆虫蛋白，如PSEEN3174(Monalysin；
(2011)PLoS Pathogens[PLoS病原体]，7：1-13)；来自假单胞菌蛋白菌(Pseudomonas 
protegens)菌株CHA0和Pf-5(之前为荧光假单胞菌(fluorescens))(Pechy-Tarr，(2008)
Environmental Microbiology[环境微生物学]10：2368-2386；基因库登录号EU400157)的
杀昆虫蛋白；来自台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)(Liu等人，(2010)
J.Agric.Food Chem.[农业与食品化学杂志]，58：12343-12349)和来自假产碱假单胞菌
(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(Zhang等人，(2009)Annals of Microbiology[微生物
学杂志]59：45-50和Li等人，(2007)Plant Cell Tiss.Organ Cult.[植物细胞，组织和器官
培养杂志]89：159-168)的杀昆虫蛋白；来自发光杆菌属物种和致病杆菌属物种
(Hinchliffe等人，(2010)The Open Toxicology Journal[开放毒理学杂志]，3：101-118和
Morgan等人，(2001)Applied and Envir.Micro.[应用与环境微生物学]67：2062-2069)的
杀昆虫蛋白；来自美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946的杀昆虫蛋白；US 9,688,
730的PIP-1多肽；US 9,475,847的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽；美国公开号US 20160186204
的PIP-47多肽；PCT公开号WO 2016/114973的IPD045多肽、IPD064多肽、IPD074多肽、IPD075多肽、和IPD077多肽；PCT序列号PCT/US17/56517的IPD080多肽；序列号PCT/US17/54160的
IPD078多肽、IPD084多肽、IPD085多肽、IPD086多肽、IPD087多肽、IPD088多肽、和IPD089多肽；美国专利公开号US 20160366891的PIP-72多肽；美国公开号US 20170166921的PtIP-50
多肽和PtIP-65多肽；美国序列号62/521084的IPD098多肽、IPD059多肽、IPD108多肽、
IPD109多肽；美国公开号US 20160347799的PtIP-83多肽；美国公开号US 20170233440的
PtIP-96多肽；PCT公开号WO 2017/23486的IPD079多肽；PCT公开号WO 2017/105987的
IPD082多肽、序列号PCT/US17/30602的IPD090多肽、美国序列号62/434020的IPD093多肽；
序列号PCT/US17/39376的IPD103多肽；美国序列号62/438179的IPD101多肽；美国序列号US 
62/508,514的IPD121多肽；和δ-内毒素，包括但不限于Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35，Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry50、Cry51、Cry52、Cry53、Cry54、Cry55、Cry56、Cry57、Cry58、Cry59、Cry60、Cry61、Cry62、Cry63、Cry64、Cry65、Cry66、Cry67、Cry68、Cry69、Cry70、Cry71、和Cry72类的δ-内毒素多肽以及苏云金芽孢杆菌细胞溶解性cyt1和
cyt2基因。这些类别的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的成员是本领域技术人员熟知的(参见，
Crickmore等人，“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命
名法]”(2011)，网址为lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/，其可以使用
“www”前缀在万维网上访问)。

[0034] δ-内毒素的实例还包括但不限于：美国专利号5,880,275、7,858,849和8,878,007的Cry1A蛋白；US 9,512,187的Cry1Ac突变体；美国专利号8,304,604、8,304,605和8,476,
226的DIG-3或DIG-11毒素(cry蛋白(如Cry1A、Cry3A)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的N-末端
缺失)；美国专利申请序列号10/525,318、美国专利申请公开号US 20160194364和美国专利
号9,404,121和8,772,577的Cry1B；PCT公开号WO 2016/61197和序列号PCT/US17/27160的
Cry1B变体；美国专利号6,033,874的Cry1C；US 20170233759的Cry1D蛋白；PCT序列号PCT/
US17/53178的Cry1E蛋白；美国专利号5,188,960和6,218,188的Cry1F蛋白；美国专利号7,
070,982、6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体；PCT公开号WO 2017/0233759的Cry1I蛋
白；美国公开US 20170240603的Cry1J变体；美国专利号7,064,249的Cry2蛋白如Cry2Ab蛋
白和US 7208474的Cry2A.127蛋白；Cry3A蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同Cry蛋
白的可变区和保守区的独特组合产生的经工程改造的杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申
请公开号2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,
552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,339,092、7,378,499、7,462,760和9,593,345的Cry8蛋白；Cry9蛋白，例如像Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员，包括美国专利9,000,261和8,802,933以及美国序列号WO 2017/132188的Cry9蛋白；Cry15蛋白，描
述于以下丈献中：Naimov等人，(2008)Applied and Environmental Microbiology[应用与
环境微生物学]，74：7145-7151；美国专利号US 8,933,299的Cry14蛋白；美国专利号6,127,
180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利号US 8,816,157的截短的
Cry34蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,
229的CryET33和cryET34蛋白；美国专利公开号2006/0191034、2012/0278954，和PCT公开号
WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物；美国专利号6,083,499、6,548,291和6,340,
593的Cry35Ab1蛋白；美国专利号9,403,881的Cry46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素；
TIC901或相关毒素；美国专利申请公开号2008/0295207的TIC807；美国专利US 8,513,493
的TIC853；PCT US 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利申请公开号US 20160150795的经工程改造的半翅目毒素蛋白，美国专利号8,236,
757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；美国专利号7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-
040、AXMI-049：WO 2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO 2005/038032的
AXMI-010；WO 2005/021585的AXMI-003；美国专利申请公开号2004/0250311的AXMI-008；美
国专利申请公开号2004/0216186的AXMI-006；美国专利申请公开号2004/0210965的AXMI-
007；美国专利申请号2004/0210964的AXMI-009；美国专利申请公开号2004/0197917的
AXMI-014；美国专利申请公开号2004/0197916的AXMI-004；WO 2006/119457的AXMI-028和
AXMI-029；WO 2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和
AXMI-004；美国专利号8,084,416的AXMI-150；美国专利申请公开号2011/0023184的AXMI-
205；美国专利申请公开号2011/0263488的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-
019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063和AXMI-064；美国专利US 8461421和US 8,461,422的AXMI046、AXMI048、AXMI050、AXMI051、AXMI052、AXMI053、AXMI054、AXMI055、AXMI056、AXMI057、AXMI058、AXMI059、AXMI060、AXMI061、AXMI067、AXMI069、AXMI071、AXMI072、AXMI073、AXMI074、AXMI075、AXMI087、AXMI088、AXMI093、AXMI070、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI125、AXMI126、AXMI127、AXMI129、AXMI151、AXMI161、AXMI164、AXMI183、AXMI132、AXMI137、AXMI138；美国专利申请公开号2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白；WO 2011/103248的AXMI221Z、
AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z：WO 2011/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231；美国专利号8,334,431的AXMI-
115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；美国专利申请公开号2010/0298211的
AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045；美国专利申请公开号2009/0144852
的AXMI-066和AXMI-076；美国专利号8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、
AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；美国专利US 8461421的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、dsAXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137；美国专利US  8,461,415的AXMI192；美国专利申请公开号US 
20160177332的AXMI281；美国专利号US 8,252,872的AXMI422；美国专利号8,319,019的具
有修饰的蛋白水解位点的Cry蛋白如Cry1A和Cry3A；美国专利申请公开号2011/0064710的
来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。美国序列号62/
607372的Cry蛋白MP032、MP049、MP051、MP066、MP068、MP070、MP091S、MP109S、MP114、MP121、MP134S、MP183S、MP185S、MP186S、MP195S、MP197S、MP208S、MP209S、MP212S、MP214S、MP217S、MP222S、MP234S、MP235S、MP237S、MP242S、MP243、MP248、MP249S、MP251M、MP252S、MP253、MP259S、MP287S、MP288S、MP295S、MP296S、MP297S、MP300S、MP304S、MP306S、MP310S、MP312S、MP314S、MP319S、MP325S、MP326S、MP327S、MP328S、MP334S、MP337S、MP342S、MP349S、MP356S、MP359S、MP360S、MP437S、MP451S、MP452S、MP466S、MP468S、MP476S、MP482S、MP522S、MP529S、MP548S、MP552S、MP562S、MP564S、MP566S、MP567S、MP569S、MP573S、MP574S、MP575S、MP581S、MP590、MP594S、MP596S、MP597、MP599S、MP600S、MP601S、MP602S、MP604S、MP626S、MP629S、MP630S、MP631S、MP632S、MP633S、MP634S、MP635S、MP639S、MP640S、MP644S、MP649S、MP651S、MP652S、MP653S、MP661S、MP666S、MP672S、MP696S、MP704S、MP724S、MP729S、MP739S、MP755S、MP773S、MP799S、MP800S、MP801S、MP802S、MP803S、MP805S、MP809S、MP815S、MP828S、MP831S、MP844S、MP852、MP865S、MP879S、MP887S、MP891S、MP896S、MP898S、MP935S、MP968、MP989、MP993、MP997、MP1049、MP1066、MP1067、MP1080、MP1081、MP1200、MP1206、MP1233、和MP1311。
Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员所熟知的(综述参见van Frannkenhuyzen，(2009)
J.Invert.Path.[无脊椎动物病理学杂志]101：1-16)。使用Cry蛋白作为转基因植物性状是
本领域技术人员熟知的，并且Cry-转基因植物(包括但不限于表达以下的植物：Cry1Ac、
Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、
mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt)已获得法规性审批(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal[植物生物技术杂志]9：283-300和CERA
(2010)环境风险评估的转基因作物数据库中心(CERA)(GM Crop Database Center for 
Environmental Risk Assessment(CERA))，ILSI研究基金会(ILSI  Research 
Foundation)，华盛顿特区，网址为cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。本领域技术人员熟知的不只一种杀有害生物蛋白
也可以在植物中表达，如Vip3Ab和Cry1Fa(US 2012/0317682)；Cry1BE和Cry1F(US 2012/
0311746)；Cry1CA和Cry1AB(US 2012/0311745)；Cry1F和CryCa(US 2012/0317681)；Cry1DA
和Cry1BE(US 2012/0331590)；Cry1DA和Cry1Fa(US 2012/0331589)；Cry1AB和Cry1BE(US 
2012/0324606)；Cry1Fa和Cry2Aa以及Cry1I和Cry1E(US 2012/0324605)；Cry34Ab/35Ab&
Cry6Aa(US 20130167269)；Cry34Ab/VCry35Ab&Cry3Aa(US 20130167268)；Cry1Da&Cry1Ca
(US 9796982)；Cry3Aa&Cry6Aa(US 9798963)；以及Cry3A&Cry1Ab或Vip3Aa(US 9,045,
766)。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，所述杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7,491,869
的脂质酰基水解酶，和胆固醇氧化酶，如来自链霉菌属(Purcell等人，(1993)Biochem 
Biophys Res Commun[生物化学与生物物理学研究通讯]15：1406-1413)。杀有害生物蛋白
还包括美国专利号5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020
中的VIP(营养期杀昆虫蛋白)毒素等。其他VIP蛋白质是本领域技术人员熟知的(参见，
lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html，其可以使用“www”前缀在万
维网上访问)。杀有害生物蛋白还包括PCT序列号PCT/US2017/000510的Cyt蛋白(包括Cyt1A
变体)；杀有害生物蛋白还包括毒素复合物(TC)蛋白，所述毒素复合物(TC)蛋白可从生物体
如致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属获得(参见，美国专利号7,491,698和8,084,
418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独
立毒素(stand-alone toxin)的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC
蛋白“增效剂”来增强“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的TC蛋白。如本文所提及的，A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)增强了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的实例包括但不限于莱
科毒素-1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。产生的组合还可以包括目的多核苷酸中
的任何一个的多个拷贝。

[0035] 在一些实施例中，所述IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽包括从本文公开的全长核酸序列推导出的氨基酸序列，以及由于使用替代性下游起始位点或由于产生具有杀有
害生物活性的较短蛋白的加工而比全长序列更短的氨基酸序列。加工可以在表达所述蛋白
质的生物体内或在摄取所述蛋白质后的有害生物中发生。

[0036] 因此，本文提供了赋予杀有害生物活性的新颖的分离或重组的核酸序列。还提供了IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的氨基酸序列。由这些IPD059、IPD098、IPD108或
IPD109基因翻译产生的蛋白质允许细胞控制或杀灭摄取所述蛋白质的某些有害生物。

[0037] IPD059蛋白及其变体和片段

[0038] 本公开涵盖了IPD059多肽。如本文中可互换地使用的“IPD059多肽”和“IPD059蛋白”是指具有杀昆虫活性(包括但不限于对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物
的杀昆虫活性)的多肽，并且与SEQ ID NO：39的IPD059Aa多肽充分同源。考虑了多种IPD059
多肽。IPD059多肽或相关蛋白的来源包括选自但不限于水龙骨属(Polypodium)物种、线蕨
属(Colysis)物种、铁角蕨属(Asplenium)物种、耳蕨属(Polystichium)物种、或对开蕨属
(Phyllitis)物种的蕨类植物或其他原始植物物种。

[0039] 在一些实施例中，所述IPD059多肽源自水龙骨目、水龙骨科和水龙骨属中的蕨类物种。在一些实施例中，所述IPD059多肽源自水龙骨属中的蕨类物种，所述蕨类物种选自但
不限于：Polypodium absidatum、尖叶水龙骨(Polypodium acutifolium)、Polypodium 
adiantiforme、Polypodium aequale、仿射水龙骨(Polypodium affine)、Polypodium 
albidopaleatum、角状水龙骨(Polypodium alcicorne)、艾氏水龙骨(Polypodium 
alfarii)、阿氏水龙骨(Polypodium alfredii)、阿氏水龙骨科特变种(Polypodium 
alfredii var.curtii)、Polypodium allosuroides、Polypodium alsophilicola、奄美水
龙骨(Polypodium amamianum)、友水龙骨(Polypodium amoenum)、无定形水龙骨
(Polypodium amorphum)、Polypodium anetioides、扭曲水龙骨(Polypodium 
anfractuosum)、蛇形水龙骨(Polypodium anguinum)、狭叶水龙骨疏叶变型(Polypodium 
angustifolium f.remotifolia)、Polypodium angustifolium var.amphostenon、狭叶水
龙骨异苞变种(Polypodium angustifolium var.heterolepis)、狭叶水龙骨怪异变种
(Polypodium angustifolium var.monstrosa)、Polypodium angustipaleatum、线叶水龙
骨(Polypodium angustissimum)、非异构水龙骨篦齿变种(Polypodium anisomeron 
var.pectinatum)、Polypodium antioquianum、Polypodium aoristisorum、Polypodium 
apagolepis、顶端水龙骨(Polypodium apicidens)、尖顶水龙骨(Polypodium 
apiculatum)、Polypodium apoense、阿帕拉契水龙骨(Polypodium appalachianum)、紧贴
水龙骨(Polypodium appressum)、砂质水龙骨(Polypodium arenarium)、阿根延水龙骨
(Polypodium argentinum)、尖齿拟水龙骨(Polypodium argutum)、复伞水龙骨
(Polypodium armatum)、芳香水龙骨(Polypodium aromaticum)、糙点水龙骨(Polypodium 
aspersum)、上升水龙骨(Polypodium assurgens)、Polypodium atrum、耳状水龙骨
(Polypodium auriculatum)、Polypodium balaonense、Polypodium balliviani、巴姆勒水
龙骨(Polypodium  bamleri)、Polypodium bangii、巴勒塔水龙骨(Polypodium 
bartlettii)、基础水龙骨(Polypodium  basale)、伯努利水龙骨(Polypodium 
bernoullii)、Polypodium biauritum、两面水龙骨(Polypodium bifrons)、Polypodium 
blepharodes、波氏水龙骨(Polypodium bolivari)、玻利维亚水龙骨(Polypodium 
bolivianum)、Polypodium bolobense、丝质水龙骨(Polypodium bombycinum)、丝质水龙骨
岛海变种(Polypodium bombycinum var.insularum)、Polypodium bradeorum、藓上生水龙
骨(Polypodium bryophilum)、Polypodium bryopodum、Polypodium buchtienii、
Polypodium  buesii、Polypodium bulbotrichum、卡塞雷斯水龙骨(Polypodium 
caceresii)、Polypodium californicum f.brauscombii、Polypodium californicum 
f.parsonsiae、加利福尼亚水龙骨(Polypodium  californicum)、Polypodium 
calophlebium、Polypodium calvum、Polypodium camptophyllarium var.abbreviatum、
Polypodium capitellatum、Polypodium carpinterae、Polypodium chachapoyense、
Polypodium chartaceum、Polypodium chimantense、Polypodium chiricanum、Polypodium choquetangense、Polypodium christensenii、克里斯蒂水龙骨(Polypodium christii)、
黄毛水龙骨(Polypodium chrysotrichum)、Polypodium ciliolepis、灰毛水龙骨
(Polypodium cinerascens)、高氏水龙骨(Polypodium collinsii)、Polypodium 
colysoides、融合水龙骨(Polypodium confluens)、相容水龙骨(Polypodium conforme)、
散生水龙骨(Polypodium Confusum)、Polypodium congregatifolium、康奈尔水龙骨
(Polypodium connellii)、Polypodium consimile var.bourgaeanum、相似水龙骨小变种
(Polypodium consimile var.minor)、连接水龙骨(Polypodium conterminans)、连合水龙
骨(Polypodium contiguum)、库氏水龙骨(Polypodium cookii)、革叶水龙骨(Polypodium 
coriaceum)、崖姜水龙骨(Polypodium coronans)、哥斯达黎加水龙骨(Polypodium 
costaricense)、心叶水龙骨(Polypodium costatum)、厚叶水龙骨线叶变型(Polypodium 
crassifolium f.angustissimum)、厚叶水龙骨长梗变种(Polypodium crassifolium 
var.longipes)、粗鲁水龙骨(Polypodium crassulum)、漏斗水龙骨(Polypodium 
craterisorum)、隐藏水龙骨(Polypodium  cryptum)、结晶水龙骨(Polypodium 
crystalloneuron)、兜叶水龙骨平面变种(Polypodium cucullatum var.planum)、昆卡水
龙骨(Polypodium cuencanum)、兰屿水龙骨(Polypodium cumingianum)、Polypodium 
cupreolepis、Polypodium curranii、弯曲水龙骨(Polypodium curvans)、Polypodium 
cyathicola、杯状水龙骨(Polypodium cyathisorum)、环状水龙骨(Polypodium 
cyclocolpon)、Polypodium daguense、Polypodium damunense、乌柄水龙骨(Polypodium 
dareiformioides)、Polypodium dasypleura、Polypodium decipiens、端正水龙骨
(Polypodium decorum)、薄叶水龙骨(Polypodium delicatulum)、三角水龙骨(Polypodium 
deltoideum)、Polypodium demeraranum、齿状水龙骨(Polypodium denticulatum)、透明水
龙骨(Polypodium diaphanum)、柔叶水龙骨(Polypodium dilatatum)、分散水龙骨
(Polypodium dispersum)、多裂水龙骨(Polypodium dissectum)、掩饰水龙骨(Polypodium 
dissimulans)、Polypodium dolichosorum、多洛莉丝水龙骨(Polypodium dolorense)、唐
奈史密斯水龙骨(Polypodium donnell-smithii)、Polypodium drymoglossoides、
Polypodium ebeninum、艾格斯水龙骨(Polypodium eggersii)、埃尔默水龙骨(Polypodium 
elmeri)、长叶水龙骨(Polypodium elongatum)、Polypodium enterosoroides、红色水龙骨
(Polypodium erubescens)、溶血水龙骨(Polypodium erythrolepis)、Polypodium 
erythrotrichum、Polypodium eurybasis、Polypodium eurybasis var.villosum、
Polypodium exornans、镰齿水龙骨(Polypodium falcoideum)、Polypodium 
fallacissimum、钝头水龙骨(Polypodium farinosum)、猴斑水龙骨(Polypodium 
faucium)、费氏水龙骨(Polypodium feei)、铁锈水龙骨(Polypodium ferrugineum)、树叶
水龙骨(Polypodium feuillei)、坚定水龙骨(Polypodium firmulum)、Polypodium 
firmum、软弱水龙骨(Polypodium flaccidum)、鞭毛水龙骨(Polypodium flagellare)、波
状水龙骨(Polypodium flexuosum)、Polypodium flexuosum var.ekmanii、福布斯水龙骨
(Polypodium  forbesii)、台湾水龙骨(非)、Polypodium fraxinifolium 
subsp.articulatum、Polypodium fraxinifolium subsp.luridum、多果水龙骨
(Polypodium fructuosum)、海草水龙骨(Polypodium fucoides)、黄褐水龙骨(Polypodium 
fulvescens)、Polypodium galeottii、蓝绿水龙骨(Polypodium glaucum)、甘草水龙骨
(Polypodium glycyrrhiza)、纤细水龙骨(Polypodium gracillimum)、细叶水龙骨
(Polypodium gramineum)、大叶水龙骨(Polypodium grandifolium)、Polypodium gratum、
天竺葵水龙骨(Polypodium graveolens)、Polypodium griseo-nigrum、灰色水龙骨
(Polypodium griseum)、斑点水龙骨(Polypodium guttatum)、Polypodium haalilioanum、
Polypodium hammatisorum、韩氏水龙骨(Polypodium hancockii)、Polypodium 
haplophlebicum、哈里斯水龙骨(Polypodium harrisii)、矛状水龙骨简单变种
(Polypodium hastatum var.simplex)、夏威夷水龙骨(Polypodium hawaiiense)、
Polypodium  heanophyllum、海氏水龙骨(Polypodium  helleri)、Polypodium 
hemionitidium、亨利水龙骨(Polypodium henryi)、南树水龙骨(Polypodium herzogii)、
西方水龙骨(Polypodium hesperium)、Polypodium hessii、Polypodium hombersleyi、霍
斯特曼水龙骨(Polypodium hostmannii)、矮水龙骨(Polypodium humile)、无色水龙骨
(Polypodium hyalinum)、Polypodium iboense、Polypodium induens var.subdentatum、
狡猾水龙骨(Polypodium insidiosum)、箭叶水龙骨(Polypodium insigne)、Polypodium 
intermedium subsp.masafueranum var.obtuseserratum、缘内水龙骨(Polypodium 
intramarginale)、卷叶水龙骨(Polypodium involutum)、Polypodium itatiayense、爪哇
水龙骨(Polypodium javanicum)、胡桃水龙骨(Polypodium juglandifolium)、Polypodium 
kaniense、诺尔顿水龙骨(Polypodium knowltoniorum)、Polypodium kyimbilense、水龙骨
哥斯达黎加变种(Polypodium l′herminieri var.costaricense)、Polypodium 
lachniferum f.incurvata、Polypodium lachniferum var.glabrescens、毛柄水龙骨
(Polypodium  lachnopus)、披针水龙骨扁枝变种(Polypodium  lanceolatum 
var.complanatum)、披针水龙骨针蔺变种(Polypodium lanceolatum var.trichophorum)、
Polypodium latevagans、异裂水龙骨(Polypodium laxifrons)、异裂水龙骨铅色变种
(Polypodium laxifrons var.lividum)、球序水龙骨(Polypodium lehmannianum)、
Polypodium leiorhizum、Polypodium leptopodon、水龙骨狭叶变种(Polypodium 
leuconeuron  var.angustifolia)、水龙骨宽叶变种(Polypodium leuconeuron 
var.latifolium)、白绒水龙骨(Polypodium leucosticta)、Polypodium limulum、
Polypodium lindigii、线细水龙骨(Polypodium lineatum)、Polypodium lomarioides、长
额水龙骨(Polypodium longifrons)、Polypodium loretense、Polypodium loriceum 
var.umbraticum、带叶水龙骨(Polypodium loriforme)、剑蕨水龙骨巨大变型(Polypodium 
loxogramme f.gigas)、戟叶水龙骨(Polypodium ludens)、吕宋水龙骨(Polypodium 
luzonicum)、褶叶水龙骨抛光变型(Polypodium lycopodioides f.obtusum)、褶叶水龙骨
(Polypodium lycopodioides L.)、大鳞水龙骨(Polypodium macrolepis)、大叶水龙骨
(Polypodium macrophyllum)、巨大水龙骨(Polypodium macrosorum)、巨球水龙骨
(Polypodium macrosphaerum)、斑点水龙骨(Polypodium maculosum)、Polypodium 
madrense、镰叶水龙骨(Polypodium manmeiense)、Polypodium margaritiferum、沿海水龙
骨(Polypodium maritimum)、马氏水龙骨(Polypodium martensii)、Polypodium mayoris、
稠密水龙骨(Polypodium megalolepis)、黑毛水龙骨(Polypodium melanotrichum)、新月
叶水龙骨柔毛变种(Polypodium menisciifolium var.pubescens)、Polypodium 
meniscioides、麦氏水龙骨(Polypodium merrillii)、Polypodium mettenii、梅滕水龙骨
(Polypodium mexiae)、星蕨水龙骨(Polypodium microsorum)、军绿水龙骨(Polypodium 
militare)、最小水龙骨(Polypodium minimum)、基芽水龙骨(Polypodium minusculum)、混
杂水龙骨(Polypodium mixtum)、Polypodium mollendense、毛叶水龙骨(Polypodium 
mollissimum)、串珠水龙骨小变种(Polypodium moniliforme var.minus)、Polypodium 
monoides、高山水龙骨(Polypodium monticola)、山地水龙骨(Polypodium montigenum)、
Polypodium morizianum、Polypodium  moultonii、多尾水龙骨(Polypodium 
multicaudatum)、多纹水龙骨(Polypodium multilineatum)、Polypodium multisorum、蒙
克水龙骨(Polypodium munchii)、藓状水龙骨(Polypodium muscoides)、Polypodium 
myriolepis、狐尾水龙骨(Polypodium myriophyllum)、Polypodium myriotrichum、
Polypodium nematorhizon、林荫水龙骨(Polypodium nemorale)、Polypodium 
nesioticum、变黑水龙骨(Polypodium nigrescentium)、黑柄水龙骨(Polypodium 
nigripes)、Polypodium  nigrocinctum、Polypodium nimbatum、Polypodium 
nitidissimum、Polypodium nitidissimum var.latior、Polypodium nubrigenum、少鳞水
龙骨(Polypodium oligolepis)、Polypodium oligosorum、Polypodium oligosorum、橄榄
水龙骨(Polypodium olivaceum)、橄榄水龙骨波浪变种(Polypodium olivaceum 
var.elatum)、Polypodium oodes、卵球水龙骨(Polypodium oosphaerum)、高地水龙骨
(Polypodium oreophilum)、Polypodium ornatissimum、华丽水龙骨(Polypodium 
ornatum)、卵形水龙骨(Polypodium ovatum)、Polypodium oxylobum、嗜酸水龙骨
(Polypodium oxypholis)、Polypodium pakkaense、苍白水龙骨(Polypodium pallidum)、
Polypodium palmatopedatum、帕氏水龙骨(Polypodium palmeri)、巴拿马水龙骨
(Polypodium panamense)、微小水龙骨(Polypodium parvum)、巴塔哥尼亚水龙骨
(Polypodium patagonicum)、Polypodium paucisorum、绚烂水龙骨(Polypodium 
pavonianum)、篦穗水龙骨热身变种(Polypodium pectinatum var.caliense)、篦穗水龙骨
硬毛变种(Polypodium  pectinatum var.hispidum)、透明水龙骨(Polypodium 
pellucidum)、钟摆水龙骨玻利维亚变种(Polypodium pendulum var.boliviense)、
Polypodium percrassum、Polypodium perpusillum、Polypodium peruvianum 
var.subgibbosum、鳞片水龙骨长叶变种(Polypodium phyllitidis var.elongatum)、毕赤
水龙骨(Polypodium pichinchense)、Polypodium pilosissimum、Polypodium 
pilosissimum var.glabriusculum、Polypodiumpilossimum var.tunguraquensis、
Polypodiumpityrolepis、宽叶水龙骨(Polypodium platyphyllum)、布烈氏水龙骨
(Polypodium playfairii)、习见水龙骨库珀变种(Polypodium plebeium var.cooperi)、
Polypodium plectolepidioides、Polypodium pleolepis、Polypodium plesiosorum 
var.i、Polypodium podobasis、柄果水龙骨(Polypodium podocarpum)、波洛水龙骨
(Polypodium poloense)、Polypodium polydatylon、复苏蕨针形变种(Polypodium 
polypodioides var.aciculare)、复苏蕨米修变种(Polypodium polypodioides 
var.michauxianum)、疏忽水龙骨(Polypodium praetermissum)、Polypodium preslianum 
var.immersum、棕毛水龙骨(Polypodium procerum)、棕毛水龙骨(Polypodium procerum)、
产物水龙骨(Polypodium productum)、产物水龙骨(Polypodium productum)、延长水龙骨
(Polypodium prolongilobum)、支持水龙骨(Polypodium propinguum)、变形水龙骨
(Polypodium  proteus)、Polypodium  pruinatum、假毛水龙骨(Polypodium 
pseudocapillare)、假缘水龙骨(Polypodium pseudofraternum)、假垂穗水龙骨
(Polypodium pseudonutans)、假齿水龙骨(Polypodium pseudoserratum)、美丽水龙骨
(Polypodium pulcherrimum)、Polypodium pulogense、尖刺水龙骨(Polypodium 
pungens)、紫色水龙骨(Polypodium purpusii)、激进水龙骨(Polypodium radicale)、兰德
尔水龙骨(Polypodium randallii)、Polypodium ratiborii、下垂水龙骨(Polypodium 
reclinatum)、Polypodium recreense、匍匐水龙骨唐突变种(Polypodium repens 
var.abruptum)、旋转水龙骨(Polypodium revolvens)、Polypodium rhachipterygium、菱
羽水龙骨(Polypodium rhomboideum)、阔鳞水龙骨(Polypodium rigens)、强壮水龙骨
(Polypodium robustum)、罗氏水龙骨(Polypodium roraimense)、罗氏水龙骨(Polypodium 
roraimense)、桃色水龙骨(Polypodium rosei)、罗森水龙骨(Polypodium rosenstockii)、
Polypodium rubidum、原始水龙骨(Polypodium rudimentum)、鲁斯伯水龙骨(Polypodium 
rusbyi)、Polypodium sablanianum、匐茎水龙骨(Polypodium sarmentosum)、石生水龙骨
(Polypodium saxicola)、申克水龙骨(Polypodium schenckii)、狭叶水龙骨(Polypodium 
schlechteri)、蜈蚣水龙骨(Polypodium scolopendria)、蜈蚣水龙骨(Polypodium 
scolopendria)、棕鳞水龙骨(Polypodium scolopendrium)、Polypodium scouleri、
Polypodium scutulatum、分离水龙骨(Polypodium segregatum)、半多毛水龙骨
(Polypodium semihirsutum)、Polypodium semihirsutum var.fuscosetosum、老年水龙骨
小变种(Polypodium senile var.minor)、Polypodium sericeolanatum、锯齿水龙骨
(Polypodium serraeforme)、兰屿水龙骨(Polypodium serricula)、冗长水龙骨
(Polypodium sesquipedala)、Polypodium sessilifolium、线鳞水龙骨秃子变种
(Polypodium setosum var.calvum)、刚毛水龙骨(Polypodium setulosum)、Polypodium 
shaferi、Polypodium sibomense、干性水龙骨(Polypodium siccum)、Polypodium 
simacense、模仿水龙骨(Polypodium simulans)、歌手水龙骨(Polypodium singeri)、中华
水龙骨(Polypodium sinicum)、Polypodium sintenisii、Polypodiumskutchii、斯隆水龙
骨(Polypodium sloanei)、Polypodium sodiroi、龌龊水龙骨(Polypodium sordidulum)、
卑鄙水龙骨(Polypodium sordidum)、球状水龙骨(Polypodium sphaeropteroides)、楔形
水龙骨(Polypodium sphenodes)、整洁水龙骨(Polypodium sprucei)、Polypodium 
sprucei var.furcativenosa、Polypodium steirolepis、Polypodium stenobasis、细苞水
龙骨(Polypodium stenolepis)、狭翅水龙骨(Polypodium stenopterum)、Polypodium 
subcapillare、Polypodium subflabelliforme、Polypodium subhemionitidium、
Polypodium subinaequale、Polypodium subintegrum、匙苞水龙骨(Polypodium 
subspathulatum)、微妙水龙骨(Polypodium subtile)、Polypodium subvestitum、
Polypodium  subviride、表面水龙骨剑叶变种(Polypodium  superficiale 
var.attenuatum)、表面水龙骨中华变种(Polypodium superficiale vair.chinensis)、
Polypodium sursumcurrens、Polypodium tablazianum、Polypodium taenifolium、
Polypodium tamandarei、费岛水龙骨(Polypodium tatei)、Polypodium tenuiculum 
var.acrosora、Polypodium tenuiculum var.brasiliense、Polypodium tenuilore、
Polypodium tenuinerve、Polypodium tepuiense、特里萨水龙骨(Polypodium teresae)、
四角水龙骨不完全变种(Polypodium tetragonum var.incompletum)、毛鳞水龙骨二回羽
状分裂变种(Polypodium thysanolepis var.bipinnatifidum)、毛鳞水龙骨毛鳞变种
(Polypodium  thyssanolepis，var.thyssanolepis)、毛鳞水龙骨(Polypodium 
thyssanolepsi)、多巴哥水龙骨(Polypodium tobagense)、毛柄水龙骨(Polypodium 
trichophyllum)、三趾水龙骨(Polypodium tridactylum)、三齿水龙骨(Polypodium 
tridentatum)、三叉水龙骨短柄变种(Polypodium trifurcatum var.brevipes)、三叶水龙
骨(Polypodium triglossum)、截裂水龙骨(Polypodium truncatulum)、附生水龙骨大变种
(Polypodium truncicola var.major)、附生水龙骨小变种(Polypodium truncicola 
var.minor)、结节水龙骨(Polypodium tuberosum)、Polypodium tunguraguae、塔奎因水龙
骨(Polypodium turquinum)、图里亚尔瓦水龙骨(Polypodium turrialbae)、硬毛水龙骨
(Polypodium ursipes)、蔓生水龙骨(Polypodium vagans)、Polypodium valdealatum、维
斯提格水龙骨(Polypodium versteegii)、维拉格兰水龙骨(Polypodium villagranii)、东
北水龙骨冻疮变型(Polypodium virginianum f.cambroideum)、东北水龙骨梨变型
(Polypodium virginianum f.peraferens)、书带水龙骨(Polypodium vittarioides)、欧
亚水龙骨(Polypodium vulgare)、欧亚水龙骨(Polypodium vulgare L.)、欧亚水龙骨嗜矿
亚种(Polypodium vulgare subsp.oreophilum)、欧亚水龙骨尖锐变种(Polypodium 
vulgare var.acuminatum)、诡计水龙骨(Polypodium vulpinum)、威廉水龙骨(Polypodium 
williamsii)、摇摆水龙骨(Polypodium wobbense)、Polypodiumx fallacissimum-
guttatum、Polypodium xantholepis、梳叶水龙骨(Polypodium xiphopteris)、Polypodiun yarumalense、Polypodium yungense、和Polypodium zosteriforme。

[0040] 在一些实施例中，所述IPD059多肽源自水龙骨目、水龙骨科或线蕨属中的蕨类物种。在一些实施例中，所述IPD059多肽源自线蕨属中的蕨类物种，所述蕨类物种选自但不限
于：Colysis ampla、掌叶线蕨(Colysis digitata)、Colysis elegans、椭圆线蕨(Colysis elliptica)、曲边线蕨(Colysis flexiloba)、断线蕨(Colysis hemionitidea)、胄叶线蕨
(Colysis hemitoma)、矩圆线蕨(Colysis henryi)、Colysis insignis、矛叶线蕨(Colysis intermedia)、绿叶线蕨(Colysis leveillei)、长柄线蕨(Colysis longipes)、滇线蕨
(Colysis  pentaphylla)、宽羽线蕨(Colysis pothifolia)、有翅线蕨(Colysis 
pteropus)、新店线蕨(Colysis shintenensis)、Colysis simplicifrons、三裂线蕨
(Colysis triphylla)、和褐叶线蕨(Colysis wrightii)。

[0041] 在一些实施例中，所述IPD059多肽源自水龙骨目、铁角蕨科和铁角蕨属中的蕨类物种。在一些实施例中，所述IPD059多肽源自铁角蕨属中的蕨类物种，所述蕨类物种选自但
不限于：横线铁角蕨(Asplenium abscissum)、Asplenium actinopteroides、细裂黑色铁角
蕨(Asplenium adiantum-nigrum)、Asplenium aegaeum、埃塞俄比亚铁角蕨(Asplenium 
aethiopicum)、Asplenium aff.hallbergii、Asplenium aff.heterochroum、仿射铁角蕨
(Asplenium affine)、波翅铁角蕨(Asplenium alatum)、Asplenium amboinense、
Asplenium anceps、狭叶铁角蕨(Asplenium angustum)、Asplenium anisophyllum、广布铁
角蕨(Asplenium anogrammoides)、Asplenium anogrammoides x Asplenium、鸟巢蕨
(Asplenium antiquum)、Asplenium antrophyoides、Asplenium apogamum、Asplenium 
appendiculatum、金色铁角蕨(Asplenium  aureum)、耳状铁角蕨(Asplenium 
auriculatum)、长耳铁角蕨(Asplenium  auritum)、南洋山苏花(Asplenium 
australasicum)、亚速尔铁角蕨(Asplenium azoricum)、Asplenium barclayanum、
Asplenium billotii、两用铁角蕨(Asplenium bipartitum)、Asplenium blepharodes、
Asplenium boltonii、北方铁角蕨(Asplenium boreale)、Asplenium bourgaei、珠芽铁角
蕨(Asplenium bulbiferum)、珠芽铁角蕨x珠芽铁角蕨纤细亚种(Asplenium bulbiferum x 
Asplenium bulbiferum subsp.gracillimum)、大盖铁角蕨(Asplenium bullatum)、线柄铁
角蕨(Asplenium capillipes)、栗铁角蕨(Asplenium castaneum)、鞭叶铁角蕨(Asplenium 
caudatum)、康定铁角蕨(Asplenium ceterach)、查塔姆铁角蕨(Asplenium chathamense)、
克里斯蒂铁角蕨(Asplenium christii)、Asplenium cimmeriorum、线裂铁角蕨(Asplenium 
coenobiale)、扁果铁角蕨(Asplenium compressum)、连合铁角蕨(Asplenium contiguum)、
Asplenium cordatum、毛轴铁角蕨(Asplenium crinicaule)、鸡冠铁角蕨(Asplenium 
cristatum)、大蓬莱铁角蕨(Asplenium cuneatiforme)、楔叶铁角蕨(Asplenium 
cuneifolium)、Asplenium currorii、Asplenium cuspidatum、大羽铁角蕨(Asplenium 
cymbifolium)、塞浦路斯铁角蕨(Asplenium cyprium)、长药铁角蕨(Asplenium 
dalhousiae)、Asplenium dareoides、薄叶铁角蕨(Asplenium daucifolium)、分解铁角蕨
(Asplenium decompositum)、细叶铁角蕨(Asplenium delicatulum)、Asplenium 
dielerectum、异型铁角蕨(Asplenium difforme)、二态铁角蕨(Asplenium dimorphum)、多
裂铁角蕨(Asplenium dissectum)、Asplenium dregeanum、湿地松铁角蕨(Asplenium 
elliottii)、Asplenium emarginatum、剑叶铁角蕨(Asplenium ensiforme)、垂直铁角蕨
(Asplenium erectum)、低头铁角蕨(Asplenium exiguum)、Asplenium feei、纤维状铁角蕨
(Asplenium fibrillosum)、细柄铁角蕨(Asplenium filipes)、网脉铁角蕨(Asplenium 
finlaysonianum)、裂隙铁角蕨(Asplenium fissum)、扇叶铁角蕨(Asplenium 
flabellifolium)、软叶铁角蕨(Asplenium flaccidum)、西藏铁角蕨(Asplenium 
fontanum)、Asplenium foresiense、台湾铁角蕨(Asplenium formosum)、脆弱铁角蕨
(Asplenium fragile)、Asplenium friesiorum、大芽铁角蕨(Asplenium gemmiferum)、丛
叶铁角蕨(Asplenium griffithianum)、庐山铁角蕨(Asplenium gulingense)、Asplenium 
hallbergii、Asplenium harpeodes、戟唇铁角蕨(Asplenium hastatum)、Asplenium 
haughtonii、豪拉基铁角蕨(Asplenium haurakiense)、泽泻铁角蕨(Asplenium 
hemionitis)、Asplenium hemitomum、杂色铁角蕨(Asplenium heterochpoum)、异弹性体铁
角蕨(Asplenium heteroresiliens)、Asplenium hispanicum、霍比迪铁角蕨(Asplenium 
hobdyi)、虎克铁角蕨(Asplenium hookerianum)、Asplenium hostmannii、杂种铁角蕨
(Asplenium hybridum)、虎尾铁角蕨(Asplenium incisum)、中间铁角蕨(Asplenium 
interjectum)、Asplenium jahandiezii、Asplenium juglandifolium、Asplenium 
kukkonenii、鳞柄铁角蕨(Asplenium laciniatum)、光泽铁角蕨(Asplenium laetum)、亮叶
铁角蕨(Asplenium lamprophyllum)、Asplenium laserpitiifolium、铅色铁角蕨
(Asplenium lividum)、Asplenium lolegnamense、南海铁角蕨(Asplenium loriceum)、
Asplenium loxoscaphoides、透明铁角蕨(Asplenium lucidum)、新月铁角蕨(Asplenium 
lunulatum)、泸山铁角蕨(Asplenium lushanense)、高山铁角蕨(Asplenium lyallii)、
Asplenium majoricum、大型铁角蕨(Asplenium majus)、小花鸢尾兰铁角蕨(Asplenium 
mannii)、海洋铁角蕨(Asplenium marinum)、Asplenium mauritiensis、Asplenium 
micantifrons、赤尾铁角蕨(Asplenium milnei)、单囊铁角蕨(Asplenium monanthes)、山
地铁角蕨(Asplenium montanum)、多叶铁角蕨(Asplenium myriophyllum)、皱叶鸟巢蕨
(Asplenium nidus)、山蜡梅铁角蕨(Asplenium nitens)、倒挂铁角蕨(Asplenium 
normale)、Asplenium northlandicum、Asplenium obliquissimum、歪叶铁角蕨(Asplenium obliquum)、长圆叶铁角蕨(Asplenium oblongifolium)、倒卵形铁角蕨(Asplenium 
obovatum)、钝叶铁角蕨(Asplenium obtusatum)、八倍铁角蕨(Asplenium octoploideum)、
贫脉铁角蕨(Asplenium oligophlebium)、Asplenium onopteris、帕尔梅里铁角蕨
(Asplenium  palmeri)、Asplenium papaverifolium、小叶铁角蕨(Asplenium 
parvifolium)、Asplenium paucivenosum、Asplenium pauperequitum、北京铁角蕨
(Asplenium  pekinense)、Asplenium  pellucidum、有柄铁角蕨(Asplenium 
petiolulatum)、彼得拉克铁角蕨(Asplenium petrarchae)、Asplenium phillipsianum、狭
叶铁角蕨(Asplenium phyllitidis)、斜叶铁角蕨(Asplenium planicaule)、板神经元铁角
蕨(Asplenium platyneuron)、多齿铁角蕨(Asplenium polyodon)、多叶铁角蕨(Asplenium 
polyphyllum)、Asplenium praegracile、西南铁角蕨(Asplenium praemorsum)、凹果铁角
蕨(Asplenium preussii)、长生铁角蕨(Asplenium prolongatum)、Asplenium protensum、
大羽铁角蕨(Asplenium pseudolaserpitiifolium)、Asplenium pseudowilfordii、粗梗铁
角蕨(Asplenium pteridoides)、狐蝠铁角蕨(Asplenium pteropus)、Asplenium 
punjabense、沼地铁角蕨(Asplenium radicans)、黑杆铁角蕨(Asplenium resiliens)、根
珊瑚铁角蕨(Asplenium rhizophyllum)、理查德铁角蕨(Asplenium richardii)、
Asplenium riparium、尖叶铁角蕨(Asplenium ritoense)、华北铁角蕨(Asplenium 
ruprechtii)、卵叶铁角蕨(Asplenium ruta-muraria)、芸香叶铁角蕨(Asplenium 
rutifolium)、箭叶铁角蕨(Asplenium sagittatum)、柳叶铁角蕨(Asplenium 
salicifolium)、桑德森铁角蕨(Asplenium sandersonii)、华中铁角蕨(Asplenium 
sarelii)、Asplenium scalare、Asplenium scleropium、棕鳞铁角蕨(Asplenium 
scolopendrium)、Asplenium seelosii、线叶铁角蕨(Asplenium septentrionale)、细齿铁
角蕨(Asplenium serratum)、瀬戸井铁角蕨(Asplenium setoi)、Asplenium shimurae、
Asplenium shuttleworthianum、Asplenium simplicifrons、Asplenium smedsii、
Asplenium soleirolioides、Asplenium sphenotomum、非洲铁角蕨(Asplenium 
squamulatum)、匍枝铁角蕨(Asplenium stoloniferum)、Asplenium subglandulosus、具槽
石斛铁角蕨(Asplenium sulcatum)、Asplenium surrogatum、膜连铁角蕨(Asplenium 
tenerum)、细茎铁角蕨(Asplenium tenuicaule)、Asplenium theciferum、金桂铁角蕨
(Asplenium thunbergii)、针苞菊铁角蕨(Asplenium tricholepis)、瓶蕨铁角蕨
(Asplenium trichomanes)、台南铁角蕨(Asplenium trigonopterum)、三翅铁角蕨
(Asplenium tripteropus)、可变铁角蕨(Asplenium variabile)、变异铁角蕨(Asplenium 
varians)、Asplenium viellardii、绿柄铁角蕨(Asplenium viride)、福尔肯铁角蕨
(Asplenium volkensii)、兰屿铁角蕨(Asplenium vulcanicum)、闽浙铁角蕨(Asplenium 
wilfordii)、狭翅铁角蕨(Asplenium wrightii)、疏齿铁角蕨(Asplenium wrightioides)、
通奸铁角蕨(Asplenium x adulterinum)、Asplenium x chasmophilum、Asplenium x 
lessinense、Asplenium x mantoniae、Asplenium x protomajoricum、Asplenium x 
tenuivarians、华南铁角蕨(Asplenium yoshinagae)、和云南铁角蕨(Asplenium 
yunnanense)。

[0042] 在一些实施例中，所述IPD059多肽源自水龙骨目、鳞毛蕨科和耳蕨属中的蕨类物种。在一些实施例中，所述IPD059多肽源自耳蕨属中的蕨类物种，所述蕨类物种选自但不限
于：刺叶耳蕨(Polystichum acanthophyllum)、欧洲耳蕨(Polystichum aculeatum)、尖齿
耳蕨(Polystichum acutidens)、尖头耳蕨(Polystichum acutipinnulum)、阿当耳蕨
(Polystichum adungense)、角状耳蕨(Polystichum alcicorne)、高大耳蕨(Polystichum 
altum)、灰绿耳蕨(Polystichum  anomalum)、节毛耳蕨(Polystichum 
ariticulatipilosum)、上斜刀羽耳蕨(Polystichum assurgentipinnum)、小羽芽胞耳蕨
(Polystichum atkinsonii)、长叶芽胞耳蕨(Polystichum attenuatum)、滇东南耳蕨
(Polystichum auriculum)、薄叶耳蕨(Polystichum bakerianum)、宝兴耳蕨(Polystichum 
baoxingense)、二尖耳蕨(Polystichum biaristatum)、钳形耳蕨(Polystichum bifidum)、
双胞耳蕨(Polystichum bifidum)、川渝耳蕨(Polystichum bissectum)、波密耳蕨
(Polystichumbomiense)、喜马拉雅耳蕨(Polystichum brachypterum)、布朗耳蕨
(Polystichum braunii)、基芽耳蕨(Polystichum capillipes)、栗鳞耳蕨(Polystichum 
castaneum)、滇耳蕨(Polystichum chingiae)、拟角状耳蕨(Polystichum christii)、陈氏
耳蕨(Polystichum chunii)、涪陵耳蕨(Polystichum consimile)、轴果耳蕨(Polystichum 
costularisorum)、鞭叶耳蕨(Polystichum craspedosorum)、粗脉耳蕨(Polystichum 
crassinervium)、毛发耳蕨(Polystichum cringerum)、楔基耳蕨(Polystichum 
cuneatiforme)、圆片耳蕨(Polystichum cyclolobum)、大关耳蕨(Polystichum 
daguanense)、成忠耳蕨(Polystichum dangii)、洱源耳蕨(Polystichum delavayi)、对生
耳蕨(Polystichum deltodon)、圆顶耳蕨(Polystichum dielsii)、铺散耳蕨(Polystichum 
diffundens)、分离耳蕨(Polystichum discretum)、疏羽耳蕨(Polystichum disjunctum)、
杜氏耳蕨(Polystichum duthiei)、凸脉耳蕨(Polystichum elevatovenusum)、蚀盖耳蕨
(Polystichum erosum)、缺耳耳蕨(Polystichum exauriforme)、尖顶耳蕨(Polystichum 
excellens)、杰出耳蕨(Polystichum excelsius)、流苏耳蕨(Polystichum fimbriatum)、
台湾耳蕨(Polystichum formosanum)、寒生耳蕨(Polystichum frigidicola)、福贡耳蕨
(Polystichum fugongense)、工布耳蕨(Polystichum gongboense)、大叶耳蕨
(Polystichum grandifrons)、广西耳蕨(Polystichum guangxiense)、闽浙耳蕨
(Polystichum gymnocarpium)、哈巴耳蕨(Polystichum habaense)、小戟叶耳蕨
(Polystichum hancockii)、芒齿耳蕨(Polystichum hecatopteron)、草叶耳蕨
(Polystichum herbaceum)、猴场耳蕨(Polystichum houchangense)、川西耳蕨
(Polystichum huae)、宜昌耳蕨(Polystichum ichangense)、小耳蕨(Polystichum 
inaense)、深裂耳蕨(Polystichum incisopinnulum)、贡山耳蕨(Polystichum 
integrilimbum)、革叶耳蕨(Polystichum integrilobum)、金佛山耳蕨(Polystichum 
jinfoshaense)、九老洞耳蕨(Polystichum jiulaodongense)、鸡足山耳蕨(Polystichum 
jizhushanense)、康定耳蕨(Polystichum kangdingense)、宪需耳蕨(Polystichum 
kungianum)、广东耳蕨(Polystichum kwangtungense)、高山耳蕨(Polystichum 
lachenense)、亮叶耳蕨(Polystichum lanceolatum)、浪穹耳蕨(Polystichum 
langchungense)、宽鳞耳蕨(Polystichum latilepis)、柔软耳蕨(Polystichum lentum)、
莱氏耳蕨(Polystichum  leveillei)、正宇耳蕨(Polystichum liui)、矛状耳蕨
(Polystichum lonchitis)、长芒耳蕨(Polystichum longiaristatum)、长齿耳蕨
(Polystichum longidens)、长鳞耳蕨(Polystichum longipaleatum)、长柄耳蕨
(Polystichum longipes)、长羽耳蕨(Polystichum longipinnulum)、长刺耳蕨
(Polystichum longispinosum)、长叶耳蕨(Polystichum longissimum)、大盖耳蕨
(Polystichum macrochlaenum)、黑鳞耳蕨(Polystichum makinoi)、镰叶耳蕨
(Polystichum manmeiense)、黔中耳蕨(Polystichum martinii)、前原耳蕨(Polystichum 
mayebarae)、墨脱耳蕨(Polystichum medogense)、印西耳蕨(Polystichum mehrae)、美姑
耳蕨(Polystichum meiguense)、乌柄耳蕨(Polystichum melanostipes)、毛叶耳蕨
(Polystichum mollissimum)、玉山耳蕨(Polystichum morii)、穆坪耳蕨(Polystichum 
moupinense)、伴藓耳蕨(Polystichum muscicola)、岩生耳蕨(Polystichum nayongense)、
新正宇耳蕨(Polystichum neoliuii)、革叶耳蕨(Polystichum neolobatum)、软骨耳蕨
(Polystichum nepalense)、黛鳞耳蕨(Polystichum nigrum)、宁陕耳蕨(Polystichum 
ningshenense)、裸果耳蕨(Polystichum nudisorudm)、知本耳蕨(Polystichum 
obliquum)、镇康耳蕨(Polystichum oblongum)、疏果耳蕨(Polystichum oligocarpum)、峨
眉耳蕨(Polystichum omeiense)、假半育耳蕨(Polystichum oreodoxa)、藏东耳蕨
(Polystichum orientalitibeticum)、高山耳蕨(Polystichum otophorum)、卵鳞耳蕨
(Polystichum ovato-paleaceum)、短柄耳蕨(Polystichum paramoupinense)、小羽耳蕨
(Polystichum parvifoliolatum)、尖叶耳蕨(Polystichum parvipinnulum)、片马耳蕨
(Polystichum pianmaense)、乌鳞耳蕨(Polystichum piceo-paleaceum)、棕鳞耳蕨
(Polystichum polyblepharum)、芒刺耳蕨(Polystichum prescottianum)、锯叶耳蕨
(Polystichum prionolepis)、拟栗鳞耳蕨(Polystichum pseudocastaneum)、假亮叶耳蕨
(Polystichum pseudolanceolatum)、假黑鳞耳蕨(Polystichum pseudomakinoi)、菱羽耳
蕨(Polystichum pseudorhomboideum)、假线鳞耳蕨(Polystichum pseudosetosum)、洪雅
耳蕨(Polystichum pseudoxiphophyllum)、中缅耳蕨(Polystichum punctiferum)、吞天井
耳蕨(Polystichum puteicola)、密果耳蕨(Polystichum pycnopterum)、昌都耳蕨
(Polystichum qamdoense)、倒鳞耳蕨(Polystichum retrosopaleaceum)、外卷耳蕨
(Polystichum revolutum)、斜方耳蕨(Polystichum rhombiforme)、阔鳞耳蕨
(Polystichum rigens)、粗壮耳蕨(Polystichum robustum)、红鳞耳蕨(Polystichum 
rufopaleaceum)、石生耳蕨(Polystichum saxicola)、半育耳蕨(Polystichum 
semifertile)、刚毛耳蕨(Polystichum setillosum)、山东耳蕨(Polystichum 
shandongense)、陕西耳蕨(Polystichum shensiense)、边果耳蕨(Polystichum 
shimurae)、单羽耳蕨(Polystichum simplicipinnum)、中华耳蕨(Polystichum sinense)、
中华对马耳蕨(Polystichum sinotsus-simense)、草山耳蕨(Polystichum sozanense)、岩
穴耳蕨(Polystichum speluncicola)、密鳞耳蕨(Polystichum squarrosum)、芽胞耳蕨
(Polystichum stenophyllum)、猫儿刺耳蕨(Polystichum stimulans)、多羽耳蕨
(Polystichum subacutidens)、粗齿耳蕨(Polystichum subdeltodon)、拟流苏耳蕨
(Polystichum subfimbriatum)、近边耳蕨(Polystichum submarginale)、秦岭耳蕨
(Polystichum submite)、钻鳞耳蕨(Polystichum subulatum)、南亚耳蕨(Polystichum 
tacticopterum)、台中耳蕨(Polystichum taizhongense)、通麦耳蕨(Polystichum 
tangmaiense)、尾叶耳蕨(Polystichum thomsonii)、西藏耳蕨(Polystichum tibeticum)、
中越耳蕨(Polystichum tonkinense)、戟叶耳蕨(Polystichum tripteron)、井冈山耳蕨
(Polystichum tsingkanshanense)、对马耳蕨(Polystichum tsus-simense)、细裂耳蕨
(Polystichum wattii)、关山耳蕨(Polystichum xiphophyllum)、亚东耳蕨(Polystichum 
yadongense)、倒叶耳蕨(Polystichum yuanum)、云南耳蕨(Polystichum yunnanense)、和
察隅耳蕨(Polystichum zayuense)。

[0043] 本文所用的“充分同源”是指，使用标准参数、使用本文所述的比对程序之一，与参比序列相比，具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述序列同源性针对IPD059多肽的全长序列。

[0044] 在一些实施例中，所述IPD059多肽与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、或SEQ ID NO：78相比具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、
63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。在本文中与序列同一性百分比一起使用时，术语“约”意指/-0.5％。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定蛋白质的相应同源性。

[0045] 在一些实施例中，相对于SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、或SEQ ID NO：78的IPD059多肽，所述IPD059多肽具有来自N-末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、
44、45、46、47、48或更多个氨基酸的N-末端截短。

[0046] 在一些实施例中，相对于SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、或SEQ ID NO：78的IPD059多肽，所述IPD059多肽具有来自N-末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个的N-末端截短。

[0047] IPD098蛋白及其变体和片段

[0048] 本公开涵盖了IPD098多肽。如本文中可互换地使用的“IPD098多肽”和“IPD098蛋白”是指具有杀昆虫活性(包括但不限于对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物
的杀昆虫活性)的多肽，并且与SEQ ID NO：102的IPD098Aa多肽充分同源。考虑了多种
IPD098多肽。IPD098多肽或相关蛋白的来源包括选自但不限于铁角蕨属物种、鹿角蕨属
(Platycerium)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、或卷柏属(Selaginella)物种的蕨类植物
或其他原始植物物种。

[0049] 在一些实施例中，所述IPD098多肽源自水龙骨目、铁角蕨科和铁角蕨属中的蕨类物种。在一些实施例中，所述IPD098多肽源自铁角蕨属中的蕨类物种，所述蕨类物种选自但
不限于：横线铁角蕨(Asplenium abscissum)、Asplenium actinopteroides、细裂黑色铁角
蕨(Asplenium adiantum-nigrum)、Asplenium aegaeum、埃塞俄比亚铁角蕨(Asplenium 
aethiopicum)、Asplenium aff.hallbergii、Asplenium aff.heterochroum、仿射铁角蕨
(Asplenium affine)、波翅铁角蕨(Asplenium alatum)、Asplenium amboinense、
Asplenium anceps、狭叶铁角蕨(Asplenium angustum)、Asplenium anisophyllum、广布铁
角蕨(Asplenium anogrammoides)、Asplenium anogrammoides x Asplenium、鸟巢蕨
(Asplenium antiquum)、Asplenium antrophyoides、Asplenium apogamum、Asplenium 
appendiculatum、金色铁角蕨(Asplenium  aureum)、耳状铁角蕨(Asplenium 
auriculatum)、长耳铁角蕨(Asplenium  auritum)、南洋山苏花(Asplenium 
australasicum)、亚速尔铁角蕨(Asplenium azoricum)、Asplenium barclayanum、
Asplenium billotii、两用铁角蕨(Asplenium bipartitum)、Asplenium blepharodes、
Asplenium boltonii、北方铁角蕨(Asplenium boreale)、Asplenium bourgaei、珠芽铁角
蕨(Asplenium bulbiferum)、珠芽铁角蕨x珠芽铁角蕨纤细亚种(Asplenium bulbiferum x 
Asplenium bulbiferum subsp.gracillimum)、大盖铁角蕨(Asplenium bullatum)、线柄铁
角蕨(Asplenium capillipes)、栗铁角蕨(Asplenium castaneum)、鞭叶铁角蕨(Asplenium 
caudatum)、康定铁角蕨(Asplenium ceterach)、查塔姆铁角蕨(Asplenium chathamense)、
克里斯蒂铁角蕨(Asplenium christii)、Asplenium cimmeriorum、线裂铁角蕨(Asplenium 
coenobiale)、扁果铁角蕨(Asplenium compressum)、连合铁角蕨(Asplenium contiguum)、
Asplenium cordatum、毛轴铁角蕨(Asplenium crinicaule)、鸡冠铁角蕨(Asplenium 
cristatum)、大蓬莱铁角蕨(Asplenium cuneatiforme)、楔叶铁角蕨(Asplenium 
cuneifolium)、Asplenium currorii、Asplenium cuspidatum、大羽铁角蕨(Asplenium 
cymbifolium)、塞浦路斯铁角蕨(Asplenium cyprium)、长药铁角蕨(Asplenium 
dalhousiae)、Asplenium dareoides、薄叶铁角蕨(Asplenium daucifolium)、分解铁角蕨
(Asplenium decompositum)、细叶铁角蕨(Asplenium delicatulum)、Asplenium 
dielerectum、异型铁角蕨(Asplenium difforme)、二态铁角蕨(Asplenium dimorphum)、多
裂铁角蕨(Asplenlum dissectum)、Asplenium dregeanum、湿地松铁角蕨(Asplenium 
elliottii)、Asplenium emarginatum、剑叶铁角蕨(Asplenium ensiforme)、垂直铁角蕨
(Asplenium erectum)、低头铁角蕨(Asplenium exiguum)、Asplenium feei、纤维状铁角蕨
(Asplenium fibrillosum)、细柄铁角蕨(Asplenium filipes)、网脉铁角蕨(Asplenium 
finlaysonianum)、裂隙铁角蕨(Asplenium fissum)、扇叶铁角蕨(Asplenium 
flabcllifolium)、软叶铁角蕨(Asplenium flaccidum)、西藏铁角蕨(Asplenium 
fontanum)、Asplenium foresiense、台湾铁角蕨(Asplenium formosum)、脆弱铁角蕨
(Asplenium fragile)、Asplenium friesiorum、大芽铁角蕨(Asplenium gemmiferum)、丛
叶铁角蕨(Asplenium griffithianum)、庐山铁角蕨(Asplenium gulingense)、Asplenium 
hallbergii、Asplenium harpeodes、戟唇铁角蕨(Asplenium hastatum)、Asplenium 
haughtonii、豪拉基铁角蕨(Asplenium haurakiense)、泽泻铁角蕨(Asplenium 
hemionitis)、Asplenium hemitomum、杂色铁角蕨(Asolenium heterochroum)、异弹性体铁
角蕨(Asplenium heteroresiliens)、Asplenium hispanicum、霍比迪铁角蕨(Asplenium 
hobdyi)、虎克铁角蕨(Asplenium hookerianum)、Asplenium hostmannii、杂种铁角蕨
(Asplenium hybridum)、虎尾铁角蕨(Asplenium incisum)、中间铁角蕨(Asplenium 
interjectum)、Asplenium jahandiezii、Asplenium juglandifolium、Asplenium 
kukkonenii、鳞柄铁角蕨(Asplenium laciniatum)、光泽铁角蕨(Asplenium laetum)、亮叶
铁角蕨(Asplenium lamprophyllum)、Asplenium laserpitiifolium、铅色铁角蕨
(Asplenium lividum)、Asplenium lolegnamense、南海铁角蕨(Asplenium loriceum)、
Asplenium loxoscaphoides、透明铁角蕨(Asplenium lucidum)、新月铁角蕨(Asplenium 
lunulatum)、泸山铁角蕨(Asplenium lushanense)、高山铁角蕨(Asplenium lyallii)、
Asplenium majoricum、大型铁角蕨(Asplenium majus)、小花鸢尾兰铁角蕨(Asplenium 
mannii)、海洋铁角蕨(Asplenium marinum)、Asplenium mauritiensts、Asplenium 
micantifrons、赤尾铁角蕨(Asplenium milnei)、单囊铁角蕨(Asplenium monanthes)、山
地铁角蕨(Asplenium montanum)、多叶铁角蕨(Asplenium myriophyllum)、皱叶鸟巢蕨
(Asplenium nidus)、山蜡梅铁角蕨(Asplenium nitens)、倒挂铁角蕨(Asplenium 
normale)、Asplenium northlandicum、Asplenium obliquisslmum、歪叶铁角蕨(Asplenium obliquum)、长圆叶铁角蕨(Asplenium oblongifolium)、倒卵形铁角蕨(Asplenium 
obovatum)、钝叶铁角蕨(Asplenium obtusatum)、八倍铁角蕨(Asplenium octoploideum)、
贫脉铁角蕨(Asplenium oligophlebium)、Asplenium onopteris、帕尔梅里铁角蕨
(Asplenium  palmeri)、Asplenium papaverifolium、小叶铁角蕨(Asplenium 
parvifolium)、Asplenium paucivenosum、Asplenium pauperequitum、北京铁角蕨
(Asplenium  pekinense)、Asplenium  pellucidum、有柄铁角蕨(Asplenium 
petiolulatum)、彼得拉克铁角蕨(Asplenium petrarchae)、Asplenium phillipsianum、狭
叶铁角蕨(Asplenium phyllitidis)、斜叶铁角蕨(Asplenium planicaule)、板神经元铁角
蕨(Asplenium platyneuron)、多齿铁角蕨(Asplenium polyodon)、多叶铁角蕨(Asplenium 
polyphyllum)、Asplenium praegracile、西南铁角蕨(Asplenium praemorsum)、凹果铁角
蕨(Asplenium preussii)、长生铁角蕨(Asplenium prolongatum)、Asplenium protensum、
大羽铁角蕨(Asplenium pseudolaserpitiifolium)、Asplenium pseudowilfordii、粗梗铁
角蕨(Asplenium pteridoides)、狐蝠铁角蕨(Asplenium pteropus)、Asplenium 
punjabense、沼地铁角蕨(Asplenium radicans)、黑杆铁角蕨(Asplenium resiliens)、根
珊瑚铁角蕨(Asplenium rhizophyllum)、理查德铁角蕨(Asplenium richardii)、
Asplenium riparium、尖叶铁角蕨(Asplenium ritoense)、华北铁角蕨(Asplenium 
ruprechtii)、卵叶铁角蕨(Asplenium ruta-muraria)、芸香叶铁角蕨(Asplenium 
rutifolium)、箭叶铁角蕨(Asplenium sagittatum)、柳叶铁角蕨(Asplenium 
salicifolium)、桑德森铁角蕨(Asplenium sandersonii)、华中铁角蕨(Asplenium 
sarelii)、Asplenium scalare、Asplenium scleropium、棕鳞铁角蕨(Asplenium 
scolopendrium)、Asplenium seelosii、线叶铁角蕨(Asplenium septentrionale)、细齿铁
角蕨(Asplenium serratum)、瀬戸井铁角蕨(Asplenium setoi)、Asplenium shimurae、
Asplenium shuttleworthianum、Asplenium simplicifrons、Asplenium smedsii、
Asplenium soleirolioides、Asplenium sphenotomum、非洲铁角蕨(Asplenium 
squamulatum)、匍枝铁角蕨(Asplenium stoloniferum)、Asplenium subglandulosus、具槽
石斛铁角蕨(Asplenium sulcatum)、Asplenium surrogatum、膜连铁角蕨(Asplenium 
tenerum)、细茎铁角蕨(Asplenium tenuicaule)、Asplenium theciferum、金桂铁角蕨
(Asplenium thunbergii)、针苞菊铁角蕨(Asplenium tricholepis)、瓶蕨铁角蕨
(Asplenium trichomanes)、台南铁角蕨(Asplenium trigonopterum)、三翅铁角蕨
(Asplenium tripteropus)、可变铁角蕨(Asplenium variabile)、变异铁角蕨(Asplenium 
varians)、Asplenium viellardii、绿柄铁角蕨(Asplenium viride)、福尔肯铁角蕨
(Asplenium volkensii)、兰屿铁角蕨(Asplenium vulcanicum)、闽浙铁角蕨(Asplenium 
wilfordii)、狭翅铁角蕨(Asplenium wrightii)、疏齿铁角蕨(Asplenium wrightioides)、
通奸铁角蕨(Asplenium x adulterinum)、Asplenium x chasmophilum、Asplenium x 
lessinense、Asplenium x mantoniae、Asplenium x protomajoricum、Asplenium x 
tenuivarians、华南铁角蕨(Asplenium yoshinagae)、和云南铁角蕨(Asplenium 
yunnanense)。

[0050] 在一些实施例中，所述IPD098多肽源自水韭纲(Class Isoetopsida)，卷柏目中的物种。在一些实施例中，所述IPD098多肽源自水韭纲，卷柏目，卷柏科中的蕨类物种。在一些实施例中，所述IPD098多肽源自卷柏属中的物种。在一些实施例中，所述IPD098多肽源自卷
柏属物种，所述卷柏属物种选自但不限于：Selaginella acanthonota、细叶卷柏
(Selaginella apoda)、树形卷柏(Selaginella arbuscula)、沙丘卷柏(Selaginella 
arenicola)、亚利桑那卷柏(Selaginella arizonica)、具刺卷柏(Selaginella armata)、
岗梅卷柏(Selaginella asprella)、二形卷柏(Selaginella biformis)、比氏卷柏
(Selaginella bigelovii)、布朗卷柏(Selaginella braunii)、西亚卷柏(Selaginella 
cinerascens)、心叶卷柏(Selaginella cordifolia)、棘豆卷柏(Selaginella deflexa)、
薄叶卷柏(Selaginella delicatula)、致密卷柏(Selaginella densa)、道格拉斯卷柏
(Selaginella douglasii)、Selaginella eatonii、Selaginella eclipes、角百灵卷柏
(Selaginella eremophila)、红卷柏(Selaginella erythropus)、扇形卷柏(Selaginella 
flabellata)、汉逊氏卷柏(Selaginella  hansenii)、异齿卷柏(Selaginella 
heterodonta)、小翠云卷柏(Selaginella kraussiana)、Selaginella krugii、疏叶卷柏
(Selaginella laxifolia)、鳞叶卷柏(Selaginella lepidophylla)、Selaginella 
leucobryoides、海湾卷柏(Selaginella ludoviciana)、Selaginella mutica、俄勒冈卷柏
(Selaginella oregana)、卵叶卷柏(Selaginella ovifolia)、浅色腐殖卷柏(Selaginella 
pallescens)、秘鲁卷柏(Selaginella peruviana)、毛卷柏(Selaginella pilifera)、平卷
柏(Selaginella plana)、普卢莫萨卷柏(Selaginella plumosa)、Selaginella 
pulcherrima、岩生卷柏(Selaginella rupestris)、多毛卷柏(Selaginella rupincola)、
崖樱卷柏(Selaginella scopulorum)、欧洲卷柏(Selaginella selaginoides)、西伯利亚
卷柏(Selaginella  sibirica)、斯坦卷柏(Selaginella standleyi)、花型卷柏
(Selaginella stellata)、Selaginella subcaulescens、Selaginella substipitata、霉
草卷柏(Selaginella tenella)、Selaginella tortipila、雀舌草卷柏(Selaginella 
uliginosa)、荫生卷柏(Selaginella umbrosa)、翠云草卷柏(Selaginella uncinata)、盘
尾卷柏(Selaginella underwoodii)、犹他卷柏(Selaginella utahensis)、维多利亚卷柏
(Selaginella victoriae)、Selaginella viridissima、华氏卷柏(Selaginella 
wallacei)、Selaginella watsonii、Selaginella weatherbiana、藤卷柏(Selaginella 
willdenowii)、Selaginella wrightii、和Selaginella X neomexicana。

[0051] 在一些实施例中，所述IPD098多肽源自水龙骨目、水龙骨科和鹿角蕨属中的蕨类物种。在一些实施例中，所述IPD098多肽源自鹿角蕨属中的物种。在一些实施例中，所述
IPD098多肽源自鹿角蕨属物种，所述鹿角蕨属物种选自但不限于：圆盾鹿角蕨
(Platycerium alcicorne)、美洲鹿角蕨(Platycerium andinum)、安哥拉鹿角蕨
(Platycerium angolense)、二歧鹿角蕨(Platycerium bifurcatum)、皇冠鹿角蕨
(Platycerium coronarium)、象耳鹿角蕨(Platycerium elephantotis)、爱丽丝鹿角蕨
(Platycerium ellisii)、壮丽鹿角蕨(Platycerium grande)、深绿鹿角蕨(Platycerium 
hillii)、何其美鹿角蕨(Platycerium holttumii)、马达加斯加鹿角蕨(Platycerium 
madagascariense)、四叉鹿角蕨(Platycerium quadridichotomum)、亚洲猴脑鹿角蕨
(Platycerium ridleyi)、鹿角蕨属物种ES-2011、三角鹿角蕨(Platycerium stemaria)、巨
大鹿角蕨(Platycerium superbum)、立叶鹿角蕨(Platycerium veitchii)、瓦氏鹿角蕨
(Platycerium wallichii)、女王鹿角蕨(Platycerium wandae)、和Platycerium 
willinckii(Platycerium willinckii)。

[0052] 在一些实施例中，所述IPD098多肽源自散囊菌目(Order Eurotiales)、发菌科(Family Trichocomaceae)和曲霉属中的霉菌物种。在一些实施例中，所述IPD098多肽源自
曲霉属中的物种。在一些实施例中，所述IPD098多肽源自曲霉属物种，所述曲霉属物种选自
但不限于：酸曲霉(Aspergillus acidus)、Aspergillus aculeatinus、棘孢曲霉
(Aspergillus aculeatus)、Aspergillus aeneus、亲近曲霉(Aspergillus affinis)、阿拉
巴马曲霉(Aspergillus alabamensis)、洋葱曲霉(Aspergillus alliaceus)、亚马逊曲霉
(Aspergillus amazonicus)、不明曲霉(Aspergillus ambiguus)、Aspergillus amoenus、
灰绿曲霉(Aspergillus amstelodami)、解淀粉曲霉(Aspergillus amyloliquefaciens)、
淀粉曲霉(Aspergillus amylovorus)、异常曲霉(Aspergillus anomalus)、花束曲霉
(Aspergillus anthodesmis)、尖叶曲霉(Aspergillus apicalis)、疣顶曲霉(Aspergillus 
appendiculatus)、花生曲霉(Aspergillus arachidicola)、沙地曲霉(Aspergillus 
arenarius)、Aspergillus arvii、糙孢曲霉(Aspergillus asperescens)、Aspergillus 
assulatus、巢状曲霉(Aspergillus astellatus)、橙褐曲霉(Aspergillus 
aurantiobrunneus)、黄亮曲霉(Aspergillus aureofulgens)、具黄曲霉(Aspergillus 
aureolatus)、黄土曲霉(Aspergillus aureoterreus)、金黄曲霉(Aspergillus aureus)、
金头曲霉(Aspergillus auricomus)、澳洲曲霉(Aspergillus australensis)、澳洲非洲曲
霉(Aspergillus austroafricanus)、燕麦曲霉(Aspergillus avenaceus)、泡盛曲霉
(Aspergillus awamori)、西班牙曲霉(Aspergillus baeticus)、巴哈马曲霉(Aspergillus 
bahamensis)、两型曲霉(Aspergillus biplanus)、双孢曲霉(Aspergillus bisporus)、蚕
曲霉(Aspergillus bombycis)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、短柄曲霉
(Aspergillus  brevipes)、短梗曲霉(Aspergillus  brevistipitatus)、桥曲霉
(Aspergillus bridgeri)、褐单梗曲霉(Aspergillus brunneo-uniseriatus)、褐紫曲霉
(Aspergillus brunneoviolaceu)、隆起曲霉(Aspergillus caelatus)、浅蓝灰曲霉
(Aspergillus caesiellus)、丛簇曲霉(Aspergillus caespitosus)、焦曲霉(Aspergillus 
calidoustus)、野油菜曲霉(Aspergillus campestris)、亮白曲霉(Aspergillus 
candidus)、草鸮曲霉(Aspergillus capensis)、炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)、肉
色曲霉(Aspergillus carneus)、姬蛛曲霉(Aspergillus cavernicola)、姬蛛曲霉、鹿曲霉
(Aspergillus  cervinus)、谢瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri)、仲氏曲霉
(Aspergillus chungii)、鸡油菌曲霉(Aspergillus cibarius)、棒黄曲霉(Aspergillus 
clavatoflavus)、矮棒曲霉(Aspergillus clavatonanicus)、棒曲霉(Aspergillus 
clavatus)、圆锥曲霉(Aspergillus conicus)、锥接曲霉(Aspergillus conjunctus)、转换
曲霉(Aspergillus  conversis)、朝鲜曲霉(Aspergillus coreanus)、核心曲霉
(Aspergillus coremiiformis)、哥斯达黎加曲霉(Aspergillus costaricensis)、肋状曲
霉(Aspergillus costiformis)、克里伯曲霉(Aspergillus creber)、克里特曲霉
(Aspergillus cretensis)、冠突曲霉(Aspergillus cristatus)、皮落曲霉(Aspergillus 
crustosus)、黄晶曲霉(Aspergillus crystallinus)、Aspergillus cvjetkovicii、弯头曲
霉(Aspergillus deflectus)、Aspergillus delacroixii、纤弱曲霉(Aspergillus 
delicatus)、密曲霉(Aspergillus densus)、齿状曲霉(Aspergillus dentatulus)、萎缩曲
霉(Aspergillus depauperatus)、Aspergillus dessyi、指形曲霉(Aspergillus 
digitatus)、双形曲霉(Aspergillus dimorphicus)、Aspergillus diplocystis、
Aspergillus discophorus、长齿曲霉(Aspergillus disjunctus)、潜流曲霉(Aspergillus 
diversus)、Aspergillus dorothicus、金眶鸻曲霉(Aspergillus dubius)、金眶鸻曲霉、硬曲霉(Aspergillus duricaulis)、草原檬曲霉(Aspergillus dybowskii)、象牙淡黄曲霉
(Aspergillus eburneocremeus)、象牙曲霉(Aspergillus eburneus)、刺孢曲霉
(Aspergillus echinosporus)、刺金曲霉(Aspergillus echinulatus)、厄瓜多尔曲霉
(Aspergillus ecuadorensis)、平展曲霉(Aspergillus effusus)、埃及曲霉(Aspergillus 
egyptiacus)、矮曲霉(Aspergillus elatior)、雅致曲霉(Aspergillus elegans)、椭圆曲
霉(Aspergillus ellipsoideus)、椭孢曲霉(Aspergillus ellipticus)、长曲霉
(Aspergillus elongatus)、雪佛利耶氏曲霉(Aspergillus equitis)、红冠曲霉
(Aspergillus erythrocephalus)、翘孢曲霉(Aspergillus falconensis)、束生曲霉
(Aspergillus fasciculatus)、芬尼曲霉(Aspergillus fennelliae)、铁锈曲霉
(Aspergillus ferrugineus)、铁锈曲霉、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、Aspergillus fiemonthi、丝状曲霉(Aspergillus filifera)、粪生曲霉(Aspergillus fimetarius)、粪
闭曲霉(Aspergillus fimeti)、费希氏曲霉(Aspergillus fischeri)、费希尔曲霉
(Aspergillus fischerianus)、弗莱曲霉(Aspergillus  .flaschentraegeri)、淡黄曲霉
(Aspergillus flavescens)、浅黄曲霉(Aspergillus flavidus)、黄柄曲霉(Aspergillus 
flavipes)、黄叉曲霉(Aspergillus flavofurcatus)、黄绿曲霉(Aspergillus 
flavoviridescens)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、绒球曲霉(Aspergillus 
flocculosus)、花形曲霉(Aspergillus floriformis)、茴香曲霉(Aspergillus 
foeniculicola)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、赛卡曲霉(Aspergillus fonsecaeus)、
Aspergillus foutoynontii、蜂窝曲霉(Aspergillus foveolatus)、弗氏曲霉
(Aspergillus fresenii)、果曲霉(Aspergillus fructus)、水椰曲霉(Aspergillus 
fruticans)、Aspergillus fruticulosus、Aspergillusfujiokensis、烟色红曲霉
(Aspergillus fuliginosus)、暗黄曲霉(Aspergillus fulvus)、反丁烯二酸曲霉
(Aspergillus fumaricus)、烟熏亲近曲霉(Aspergillus fumigatiaffinis)、烟熏样曲霉
(Aspergillus fumigatoides)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、烟束曲霉(Aspergillus 
fumisynnematus)、蕈样曲霉(Aspergillus fungoides)、绳状曲霉(Aspergillus 
funiculosus)、弗拉克斯曲霉(Aspergillus fuscus)、冠毛曲霉(Aspergillus 
galeritus)、巨大曲霉(Aspergillus giganteus)、巨大硫色曲霉(Aspergillus 
gigantosulphureus)、枞大曲霉(Aspergillus gigas)、平滑曲霉(Aspergillus glaber)、
近灰曲霉(Aspergillus glaucoaffinis)、灰白曲霉(Aspergillus glauconiveus)、灰绿曲
霉(Aspergillus glaucus)、球形曲霉(Aspergillus globosus)、Aspergillus godfrini、
调制曲霉(Aspergillus gorakhpurensis)、薄曲霉(Aspergillus gracilis)、粒形曲霉
(Aspergillus granulatus)、颗粒曲霉(Aspergillus granulosus)、Aspergillus 
gratioti、绿曲霉(Aspergillus greconis)、灰曲霉(Aspergillus griseus)、小青曲霉
(Aspergillus guttifer)、裸狐鲣曲霉(Aspergillus gymnosardae)、寄生曲霉
(Aspergillus halophilicus)、嗜盐曲霉(Aspergillus halophilus)、Aspergillus 
helicothrix、亨氏曲霉(Aspergillus hennebergii)、蜡叶曲霉(Aspergillus 
herbariorum)、异核曲霉(Aspergillus heterocaryoticus)、异态曲霉(Aspergillus 
heteromorphus)、异宗配合曲霉(Aspergillus heterothallicus)、合阳曲霉(Aspergillus 
heyangensis)、新萨托曲霉(Asppergillus hiratsukae)、荷兰曲霉(Aspergillus 
hollandicus)、同态曲霉(Aspergillus homomorphus)、奥塔曲霉(Aspergillus hortae)、
腐质曲霉(Aspergillus humicola)、腐殖质曲霉(Aspergillus humus)、Aspergillus 
ibericus、红色曲霉(Aspergillus igneus)、伊苏卡曲霉(Aspergillus iizukae)、缠绕曲
霉(Aspergillus implicatus)、文雅曲霉(Aspergillus incrassatus)、印度曲霉
(Aspergillus indicus)、Aspergillus indohii、Aspergillus ingratus、昆虫曲霉
(Aspergillus insecticola)、奇突曲霉(Aspergillus insuetus)、胰岛曲霉(Aspergillus 
insulicola)、中间曲霉(Aspergillus intermedius)、印氏曲霉Aspergillus inuii)、衣康
酸曲霉(Aspergillus itaconicus)、象牙曲霉(Aspergillus ivoriensis)、贾纳斯曲霉
(Aspergillus janus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、甄氏曲霉(Aspergillus 
jeanselmei)、詹氏曲霉(Aspergillus jensenii)、Aspergillus kambarensis、神奈川曲霉
(Aspergillus kanagawaensis)、卡森曲霉(Aspergillus kassunensis)、柴鱼曲霉
(Aspergillus katsuobushi)、开费曲霉(Aspergillus keveii)、康氏曲霉(Aspergillus 
koningii)、垂缘曲霉(Aspergillus laciniosus)、乳酸曲霉(Aspergillus 
lacticoffeatus)、条纹曲霉(Aspergillus laneus)、Aspergillus lanosus、Aspergillus 
laokiashanensis、侧条曲霉(Aspergillus lateralis)、图鲁斯曲霉(Aspergillus 
lentulus)、鳞癣曲霉(Aspergillus lepidophyton)、兔曲霉(Aspergillus leporis)、
Aspergillus leucocarpus、林氏曲霉(Aspergillus lignieresii)、长曲霉(Aspergillus 
longivesica)、长担曲霉(Aspergillus longobasidia)、Aspergillus luchensi、琉球曲霉
(Aspergillus luchuensis)、勒克瑙曲霉(Aspergillus lucknowensis)、淡黑曲霉
(Aspergillus luteoniger)、淡绿曲霉(Aspergillus luteovirescens)、淡黄曲霉
(Aspergillus lutescens)、藤黄曲霉(Aspergillus luteus)、Aspergillus macfiei、大孢
曲霉(Aspergillus macrosporus)、恶性曲霉(Aspergillus malignus)、病臭曲霉
(Aspergillus malodoratus)、Aspergillus malvaceus、东北曲霉(Aspergillus 
mandshuricus)、芒让曲霉(Aspergillus manginii)、Aspergillus mannitosus、海事曲霉
(Aspergillus maritimus)、Aspergillus mattletii、大曲霉(Aspergillus maximus)、中
型曲霉(Aspergillus medius)、羊布氏曲霉(Aspergillus melitensis)、蜂蜜曲霉
(Aspergillus melleus)、Aspergillus mellinus、Aspergillus mencieri、米歇尔曲霉
(Aspergillus michelii)、小头曲霉(Aspergillus microcephalus)、微囊曲霉
(Aspergillus microcysticus)、微孢曲霉(Aspergillus microsporus)、微型曲霉
(Aspergillus microthecius)、Aspergillus microviridicitrinus、小曲霉(Aspergillus 
minimus)、微硬曲霉(Aspergillus minisclerotigenes)、小型曲霉(Aspergillus minor)、
微小曲霉(Aspergillus minutus)、Aspergillus miyajii、琉球曲霉(Aspergillus 
miyakoensis)、莫尔曲霉(Aspergillus mollis)、黑山曲霉(Aspergillus montenegroi)、
蒙特登曲霉(Aspergillus montevidensis)、粘液曲霉(Aspergillus mucoroides)、粘液曲
霉(Aspergillus mucoroideus)、穆勒曲霉(Aspergillus muelleri)、多色曲霉
(Aspergillus multicolor)、增殖曲霉(Aspergillus multiplicatus)、刺果曲霉
(Aspergillus muricatus)、Aspergillus muscivora、突变曲霉(Aspergillus 
mutabilis)、霉菌维拉布鲁兹曲霉(Aspergillus mycetomi-villabruzzii)、霉菌曲霉
(Aspergillus mycobanche)、Aspergillus nakazawae、Aspergillus nantae、矮小曲霉
(Aspergillus  nanus)、Aspergillus  navahoensis、新桥曲霉(Aspergillus 
neobridgeri)、新卡诺伊曲霉(Aspergillus neocarnoyi)、新椭圆曲霉(Aspergillus 
neoellipticus)、新平滑曲霉(Aspergillus neoglaber)、构巢曲霉(Aspergillus 
nidulans)、筑巢似曲霉(Aspergillus nidulellus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、变黑曲
霉(Aspergillus nigrescens)、微黑曲霉(Aspergillus nigricans)、Aspergillus 
nishimurae、雪灰曲霉(Aspergillus niveoglaucus)、霉白曲霉(Aspergillus niveus)、
Aspergillus noelting、模式曲霉(Aspergillus nominus)、红绶曲霉(Aspergillus 
nomius)、新烟曲霉(Aspergillus novofumigatus)、新曲霉(Aspergillus novus)、赭色花
瓣状曲霉(Aspergillus ochraceopetaliformis)、赭色玫瑰曲霉(Aspergillus 
ochraceoroseus)、赭红曲霉(Aspergillus ochraceoruber)、赭曲霉(Aspergillus 
ochraceus)、冈崎曲霉(Aspergillus okazakii)、橄榄棕丝曲霉(Aspergillus 
olivaceofuscus)、橄榄曲霉(Aspergillus olivaceus)、橄榄色曲霉(Aspergillus 
olivascens)、Aspergillus olivicola、阿曼曲霉(Aspergillus omanensis)、Aspergillus onikii、孢子曲霉(Aspergillus oosporus)、Aspergillus ornatulus、角曲霉
(Aspergillus ornatus)、米曲霉(Aspergillus  oryzae)、孔曲霉(Aspergillus 
ostianus)、Aspergillus otanii、卵精曲霉(Aspergillus ovalispermus)、稃状曲霉
(Aspergillus paleaceus)、苍白曲霉(Aspergillus pallidus)、巴拿马曲霉(Aspergillus 
panamensis)、奇异曲霉(Aspergillus paradoxus)、寄生曲霉(Aspergillus 
parasiticus)、Aspergillus parrulus、Aspergillus parvathecius、Aspergillus 
parvisclerotigenus、丛生曲霉(Aspergillus parviverruculosus)、微小曲霉
(Aspergillus  parvulu)、Aspergillus paulistensi、长毛曲霉(Aspergillus 
penicillatus)、青霉状曲霉(Aspergillus penicilliformis)、帚状曲霉(Aspergillus 
penicillioides)、帚形曲霉(Aspergillus penicillioideum)、Aspergillus 
penicillopsis、圆锥曲霉(Aspergillus periconioides)、恶性曲霉(Aspergillus 
perniciosus)、波斯曲霉(Aspergillus persii)、佩特曲霉(Aspergillus petrakii)、佩罗
尼曲霉(Aspergillus peyronelii)、褐冠曲霉(Aspergillus phaeocephalus)、海率曲霉
(Aspergillus phialiseptatus)、凤凰曲霉(Aspergillus phoenicis)、Aspergillus 
pidoplichknovii、胡椒曲霉(Aspergillus  piperis)、多色曲霉(Aspergillus 
polychromus)、褐囊曲霉(Aspergillus pouchetii)、樱草素曲霉(Aspergillus 
primulinus)、Aspergillus profusus、增生曲霉(Aspergillus proliferans)、疣梗曲霉
(Aspergillus protuberus)、假丝曲霉(Aspergillus pseudocaelatus)、假碳黑曲霉
(Aspergillus pseudocarbonarius)、假柠檬曲霉(Aspergillus pseudocitricus)、假棒曲
霉(Aspergillus pseudoclavatus)、假弯头曲霉(Aspergillus pseudodeflectus)、假矮曲
霉(Aspergillus pseudoelatior)、假雅致曲霉(Aspergillus pseudoelegans)、假黄曲霉
(Aspergillus pseudoflavus)、假灰绿曲霉(Aspergillus pseudoglaucus)、假异形曲霉
(Aspergillus pseudoheteromorphus)、假黑曲霉(Aspergillus pseudoniger)、假黑曲霉、
假红绶曲霉(Aspergillus pseudonomius)、假溜曲霉(Aspergillus pseudotamarii)、
Aspergillus pulchellus、人肺曲霉(Aspergillus pulmonum-hominis)、粉状曲霉
(Aspergillus pulverulentus)、叶枕曲霉(Aspergillus  pulvinus)、紫赤曲霉
(Aspergillus puniceus)、紫棕Aspergillus purpureofuscus)、紫曲霉(Aspergillus 
purpureus)、灰黑曲霉(Aspergillus pusillus)、Aspergillus puulaauensis、金字塔形曲
霉(Aspergillus pyramidus)、Aspergillus pyri、Aspergillus qinqixianii、
Aapergillus qizutongii、四边形曲霉(Aspergillus quadricinctus)、四环曲霉
(Aspergillus quadricingens)、四线曲霉(Aspergillus quadrifidus)、四线曲霉
(Aspergillus quadrilineatus)、栎曲霉(Aspergillus quercinus)、奎尼曲霉
(Aspergillus quininae)、Aspergillus quitensis、总状曲霉(Aspergillus racemosus)、
Aspergillus raianus、兰贝曲霉(Aspergillus rambellii)、分枝节曲霉(Aspergillus 
ramosus)、油菜曲霉(Aspergillus raperi)、反弯曲霉(Aspergillus recurvatus)、热迷曲
霉(Aspergillus rehmii)、Aspergillus repandus、小叶曲霉(Aspergillus repens)、匍生
曲霉(Aspergillus  reptans)、局限曲霉(Aspergillus restrictus)、根霉曲霉
(Aspergillus rhizopodus)、强健曲霉(Aspergillus robustus)、玫瑰球菌曲霉
(Aspergillus roseoglobosus)、玫瑰球菌曲霉(Aspergillus roseoglobulosus)、玫瑰绒
曲霉(Aspergillus roseovelutinus)、玫瑰曲霉(Aspergillus roseus)、玫瑰曲霉、赤曲霉
(Aspergillus ruber)、赤褐曲霉(Aspergillus rubrobrunneus)、红色曲霉(Aspergillus 
rubrum)、带红曲霉(Aspergillus rufescens)、皱曲霉(Aspergillus rugulosus)、皱瓣曲
霉(Aspergillus  rugulovalvus)、红褐曲霉(Aspergillus rutilans)、糖曲霉
(Aspergillus sacchari)、齐藤曲霉(Aspergillus saitoi)、鼠尾草曲霉(Aspergillus 
salviicola)、Aspergillus sartoryi、Aspergillus scheelei、希曼曲霉(Aspergillus 
schiemanniae)、硬化曲霉(Aspergillus sclerogenus)、碳核菌曲霉(Aspergillus 
scleroliicarbonarius)、硬黑曲霉(Aspergillus sclerotioniger)、核盘曲霉
(Aspergillus sclerotiorum)、Aspergillus sejunctus、分隔曲霉(Aspergillus 
septatus)、埋藏曲霉(Aspergillus sepultus)、林木曲霉(Aspergillus silvaticus)、单
纯曲霉(Aspergillus simplex)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、裂片曲霉(Aspergillus 
sparsus)、铲状曲霉(Aspergillus spathulatus)、丝衣曲霉(Aspergillus spectabilis)、
斯氏曲霉(Aspergillus spelunceus)、针刺曲霉(Aspergillus spiculosus)、棘突曲霉
(Aspergillus spinosus)、小棘曲霉(Aspergillus spinulosus)、螺旋曲霉(Aspergillus 
spiralis)、星状曲霉(Aspergillus stella-maris)、星形曲霉(Aspergillus stellatus)、
星芒曲霉(Aspergillus stellifer)、Aspergillus stercoreus、杂色曲霉(Aspergillus 
sterigmatophorus)、Aspergillus steynii、Aspergillus stramenius、纹曲霉
(Aspergillus striatulus)、条纹曲霉(Aspergillus striatus)、Aspergillus 
stromatoides、马钱子曲霉(Aspergillus strychni)、亚曲霉(Aspergillus subfuscus)、
亚灰曲霉(Aspergillus subgriseus)、钻形曲霉(Aspergillus sublatus)、细孢曲霉
(Aspergillus sublevisporus)、近绿曲霉(Aspergillus subolivaceus)、无柄曲霉
(Aspergillus subsessilis)、爪内曲霉(Aspergillus  subunguis)、变色曲霉
(Aspergillus subversicolor)、硫色曲霉(Aspergillus sulphureus)、Aspergillus 
sunderbanii、萨氏曲霉(Aspergillus sydowii)、三叉曲霉(Aspergillus sylvaticus)、集
珠曲霉(Aspergillus syncephalis)、烟草曲霉(Aspergillus tabacinus)、台中曲霉
(Aspergillus taichungensis)、Aspergillus takakii、塔克拉玛干曲霉(Aspergillus 
taklimakanensis)、塔玛瑞曲霉(Aspergillus tamari)、Aspergillus tapirirae、细迟曲
霉(Aspergillus  tardus)、Aspergillus  tatenoi、田纳西曲霉(Aspergillus 
tennesseensis)、陆生曲霉(Aspergillus terrestris)、土曲霉(Aspergillus terreus)、
地生Aspergillus terricola)、Aspergillus testaceocolorans、土壤曲霉(Aspergillus 
tetrazonus)、热突变曲霉(Aspergillus thermomutatus)、Aspergillus thomi、
Aspergillus tiraboschii、多哥曲霉(Aspergillus togoensis)、Aspergillus tokelau、
Aspergillus tonophilus、毒曲霉(Aspergillus toxicarius)、小麦曲霉(Aspergillus 
tritici)、Aspergillus tsurutae、瘤突曲霉(Aspergillus tuberculatus)、塔宾曲霉
(Aspergillus tubingensis)、Aspergillus tunetanus、Aspergillus udagawae、暗色曲霉
(Aspergillus umbrinus)、适阴曲霉(Aspergillus umbrosus)、波状曲霉(Aspergillus 
undulatus)、爪甲曲霉(Aspergillus unguis)、单侧曲霉(Aspergillus unilateralis)、宇
佐美曲霉(Aspergillus usamii)、黑粉曲霉(Aspergillus ustilago)、焦曲霉
(Aspergillus ustus)、葡萄汁曲霉(Aspergillus uvarum)、Aspergillus vadensis、
Aspergillus vancampenhoutii、瓦拉纳西曲霉(Aspergillus varanasensis)、多变曲霉
(Aspergillus variabilis)、变异曲霉(Aspergillus varians)、变色曲霉(Aspergillus 
variecolor)、杂色曲霉(Aspergillus variegatus)、绒毛曲霉(Aspergillus velutinus)、
毒性曲霉(Aspergillus venenatus)、委内瑞拉曲霉(Aspergillus venezuelensis)、采色
曲霉(Aspergillus versicolor)、Aspergillus vinosobubalinus、紫褐色曲霉
(Aspergillus violaceobrunneus)、紫沙色曲霉(Aspergillus violaceofuscus)、紫色曲
霉(Aspergillus violaceus)、绿色曲霉(Aspergillus virens)、绿灰色曲霉(Aspergillus 
viridigriseus)、绿垂曲霉(Aspergillus viridinutans)、卵黄曲霉(Aspergillus 
vitellinus)、葡萄曲霉(Aspergillus vitis)、玻璃曲霉(Aspergillus vitricola)、
Aspergillus wangduanlii、Aspergillus warcupii、布赫内氏曲霉(Aspergillus 
wehmeri)、百岁兰曲霉(Aspergillus welwitschiae)、温特曲霉(Aspergillus wentii)、
Aspergillus westendorpii、韦斯特迪克氏曲霉(Aspergillus westerdijkiae)、旱生曲霉
(Aspergillus xerophilus)、条斑曲霉(Aspergillus yezoensis)、肇庆曲霉(Aspergillus 
zhaoqingensis)、和带斑曲霉(Aspergillus zonatus)。

[0053] 本文所用的“充分同源”是指，使用标准参数、使用本文所述的比对程序之一，与参比序列相比，具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述序列同源性针对IPD098多肽的全长序列。

[0054] 在一些实施例中，所述IPD098多肽与SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：
115、SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：117相比具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。在本文中与序列同一性百分比一起使用时，术语“约”意指/-0.5％。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定蛋白质的相应同源
性。

[0055] IPD108蛋白及其变体和片段

[0056] 本公开涵盖了IPD108多肽。如本文中可互换地使用的“IPD108多肽”和“IPD108蛋白”是指具有杀昆虫活性(包括但不限于对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物
的杀昆虫活性)的多肽，并且与SEQ ID NO：131的IPD108Aa多肽充分同源。考虑了多种
IPD108多肽。IPD108多肽或相关蛋白的来源包括选自但不限于卷柏属物种、蹄盖蕨属
(Athyrium)物种或球子蕨属(Onoclea)物种的蕨类植物或其他原始植物物种。

[0057] 在一些实施例中，所述IPD108多肽源自水韭纲，卷柏目中的物种。在一些实施例中，所述IPD108多肽源自水韭纲，卷柏目和卷柏科中的蕨类物种。在一些实施例中，所述
IPD108多肽源自卷柏属中的物种。在一些实施例中，所述IPDl08多肽源自卷柏属物种，所述
卷柏属物种选自但不限于：Selaginella acanthonota、细叶卷柏、树形卷柏、沙丘卷柏、亚利桑那卷柏、具刺卷柏、岗梅卷柏、二形卷柏、比氏卷柏、布朗卷柏、西亚卷柏、心叶卷柏、棘豆卷柏、薄叶卷柏、致密卷柏、道格拉斯卷柏、Selaginella eatonii、Selaginella 
eclipes、角百灵卷柏、红卷柏、扇形卷柏、汉逊氏卷柏、异齿卷柏、小翠云卷柏、Selaginella krugii、疏叶卷柏、鳞叶卷柏、Selaginella leucobryoides、海湾卷柏、Selaginella 
mutica、俄勒冈卷柏、卵叶卷柏、浅色腐殖卷柏、秘鲁卷柏、毛卷柏、平卷柏、普卢莫萨卷柏、Selaginella pulcherrima、岩生卷柏、多毛卷柏、崖樱卷柏、欧洲卷柏、西伯利亚卷柏、斯坦卷柏、花型卷柏、Selaginella subcaulescens、Selaginella substipitata、霉草卷柏、
Selaginella tortipila、雀舌草卷柏、荫生卷柏、翠云草卷柏、盘尾卷柏、犹他卷柏、维多利亚卷柏、Selaginella viridissima、华氏卷柏、Selaginella watsonii、Selaginella 
weatherbiana、藤卷柏、Selaginella wrightii、如Selaginella X neomexicana。

[0058] 在一些实施例中，所述IPD108多肽源自水龙骨纲，水龙骨目中的物种。在一些实施例中，所述IPD108多肽源自水龙骨纲，水龙骨目和蹄盖蕨科中的蕨类物种。在一些实施例
中，所述IPD108多肽源自蹄盖蕨属中的物种。在一些实施例中，所述IPD108多肽源自蹄盖蕨
属物种，所述蹄盖蕨属物种选自但不限于：阿里山蹄盖蕨(Athyrium arisanense)、亚德氏
蹄盖蕨(Athyrium atkinsonii)、苍山蹄盖蕨(Athyrium biserrulatum)、东北蹄盖蕨
(Athyrium brevifrons)、秦氏蹄盖蕨(Athyrium chingianum)、芽胞蹄盖蕨(Athyrium 
clarkei)、坡生蹄盖蕨(Athyrium  clivicola)、合欢山蹄盖蕨(Athyrium 
cryptogrammoides)、肯氏蹄盖蕨(Athyrium cumingianum)、拟鳞毛蕨(Athyrium 
cuspidatum)、溪边蹄盖蕨(Athyrium deltoidofrons)、高山蹄盖蕨(Athyrium 
distentifolium)、Athyrium dolosa、轴果蹄盖蕨(Athyrium epirachis)、轴果蹄盖蕨
(Athyrium eremicola)、方氏蹄盖蕨(Athyrium fangii)、喜马拉雅蹄盖蕨(Athyrium 
filix-femina)、密羽蹄盖蕨(Athyrium frangulum)、陕西蹄盖蕨(Athyrium giraldii)、长
江蹄盖蕨(Athyrium iseanum)、宽鳞蹄盖蕨(Athyrium kirisimaense)、仓田蹄盖蕨
(Athyrium kuratae)、黑鳞蹄盖蕨(Athyrium masamunei)、蹄盖蕨(Athyrium 
melanolepis)、Athyrium monomachi、猴腿蹄盖蕨(Athyrium multidentatum)、红苞蹄盖蕨
(Athyrium nakanoi)、疏忽蹄盖蕨(Athyrium neglectum)、黑足蹄盖蕨(Athyrium 
nigripes)、Athyrium nikkoense、日本蹄盖蕨(Athyrium niponicum)、聂拉木蹄盖蕨
(Athyrium nyalamense)、Athyrium oblitescens、光蹄盖蕨(Athyrium otophorum)、沼生
蹄盖蕨(Athyrium palustre)、松林蹄盖蕨(Athyrium pinetorum)、贵州蹄盖蕨(Athyrium 
pubicostatum)、逆叶蹄盖蕨(Athyrium reflexipinnum)、轴生蹄盖蕨(Athyrium 
rhachidosorum)、高寒蹄盖蕨(Athyrium rupestre)、Athyrium scandicinum、Athyrium 
setullgerum、庐山蹄盖蕨(Athyrium sheareri)、林下蹄盖蕨(Athyrium silvicola)、中华
蹄盖蕨(Athyrium sinense)、Athyrium skinneri、蹄盖蕨属物种、蹄盖蕨属物种YCL-2009、尖齿蹄盖蕨(Athyrium spinulosum)、软刺蹄盖蕨(Athyrium strigillosum)、复羽蹄盖蕨
(Athyrium subrigescens)、三角叶假冷蕨(Athyrium subtriangulare)、腺叶蹄盖蕨
(Athyrium supraspinescens)、琉球蹄盖蕨(Athyrium tashiroi)、矮脚蹄盖蕨(Athyrium 
tozanense)、尖头蹄盖蕨(Athyrium vidalii)、Athyrium viridescentipes、华中蹄盖蕨
(Athyrium wardii)、Athyrium x akiense、Athyrium x hisatsuanum、Athyrium x 
tokashikii、禾秆蹄盖蕨(Athyrium yokoscense)、和俞氏蹄盖蕨(Athyrium yui)。

[0059] 在一些实施例中，所述IPD108多肽源自水龙骨纲，水龙骨目和球子蕨科中的蕨类物种。在一些实施例中，所述IPD108多肽源自球子蕨属中的物种。在一些实施例中，所述
IPD108多肽源自敏感球子蕨(Onoclea sensibilis)、东方球子蕨(Onoclea orientalis)、
间断球子蕨(Onoclea interrupta)、间断球子蕨或Onoclea hintonii。

[0060] 本文所用的“充分同源”是指，使用标准参数、使用本文所述的比对程序之一，与参比序列相比，具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述序列同源性针对IPD108多肽的全长序列。

[0061] 在一些实施例中，所述IPD108多肽与SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、或SEQ ID NO：135相比具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、
56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。在本文中与序列同一性百分比一起使用时，术语“约”意指/-0.5％。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定蛋白质的相应同源
性。

[0062] IPD109蛋白及其变体和片段

[0063] 本公开涵盖了IPD109多肽。如本文中可互换地使用的“IPD109多肽”和“IPD109蛋白”是指具有杀昆虫活性(包括但不限于对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物
的杀昆虫活性)的多肽，并且与SEQ ID NO：138的IPD109Aa多肽充分同源。考虑了多种
IPD109多肽。IPD109多肽或相关蛋白的来源包括选自但不限于卷柏属物种的蕨类植物或其
他原始植物物种。

[0064] 在一些实施例中，所述IPD109多肽源自水韭纲，卷柏目中的物种。在一些实施例中，所述IPD109多肽源自水韭纲，卷柏目，卷柏科中的蕨类物种。在一些实施例中，所述
IPD109多肽源自卷柏属中的物种。在一些实施例中，所述IPD109多肽源自卷柏属物种，所述
卷柏属物种选自但不限于：Selaginella acanthonota、细叶卷柏、树形卷柏、沙丘卷柏、亚利桑那卷柏、具刺卷柏、岗梅卷柏、二形卷柏、比氏卷柏、布朗卷柏、西亚卷柏、心叶卷柏、棘豆卷柏、薄叶卷柏、致密卷柏、道格拉斯卷柏、Selaginella eatonii、Selaginella 
eclipes、角百灵卷柏、红卷柏、扇形卷柏、汉逊氏卷柏、异齿卷柏、小翠云卷柏、Selaginella krugii、疏叶卷柏、鳞叶卷柏、Selaginella leucobryoides、海湾卷柏、Selaginella 
mutica、俄勒冈卷柏、卵叶卷柏、浅色腐殖卷柏、秘鲁卷柏、毛卷柏、平卷柏、普卢莫萨卷柏、Selaginella pulcherrima、岩生卷柏、多毛卷柏、崖樱卷柏、欧洲卷柏、西伯利亚卷柏、斯坦卷柏、花型卷柏、Selaginella subcaulescens、Selaginella substipitata、霉草卷柏、
Selaginella tortipila、雀舌草卷柏、荫生卷柏、翠云草卷柏、盘尾卷柏、犹他卷柏、维多利亚卷柏、Selaginella viridissima、华氏卷柏、Selaginella watsonii、Selaginella 
weatherbiana、藤卷柏、Selaginella wrightii、和Selaginella X neomexicana。

[0065] 本文所用的“充分同源”是指，使用标准参数、使用本文所述的比对程序之一，与参比序列相比，具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述序列同源性针对IPD109多肽的全长序列。

[0066] 在一些实施例中，所述IPD109多肽与SEQ ID NO：138相比具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更大序列同一性。在本文中与序列同一性百分比一起使用时，术语“约”意指/-0.5％。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值
以确定蛋白质的相应同源性。

[0067] 在一些实施例中，使用ClustalW算法在Vector 程序套件(英杰公司(Invitrogen Corporation)，卡尔斯巴德市(Carlsbad)，加利福尼亚州(Calif.))的
模块中在所有默认参数下计算所述序列同一性。在一些实施例中，使用ClustalW
算法在Vector 程序套件(英杰公司，卡尔斯巴德市，加利福尼亚州)的 模
块中在所有默认参数下计算跨全长多肽的序列同一性。

[0068] 如本文所用的，术语“蛋白质”、“肽分子”或“多肽”包括包含五个或更多个氨基酸的任何分子。本领域熟知蛋白质、肽或多肽分子可以进行修饰，所述修饰包括翻译后修饰，如但不限于二硫键形成、糖基化、磷酸化或寡聚化。因此，如本文所用的，术语“蛋白质”、“肽分子”或“多肽”包括通过任何生物或非生物过程修饰的任何蛋白质。术语“氨基酸”和“多种氨基酸”是指所有天然存在的L-氨基酸。

[0069] 本文所用的“重组蛋白”是指不再处于其天然环境中(例如处于体外或重组细菌或植物宿主细胞中)的蛋白质。基本上不含细胞材料的多肽包括具有小于约30％、20％、10％
或5％(以干重计)的非杀有害生物蛋白(在本文中也称为“污染蛋白”)的蛋白质的制剂。

[0070] 如本文所用的“变体”是指具有与亲本氨基酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的氨基酸序列的蛋白质或多肽。

[0071] 在一些实施例中，使用ClustalW算法在Vector 程序套件(英杰公司，卡尔斯巴德市，加利福尼亚州)的 模块中在所有默认参数下计算跨全长多肽的序列同
一性。

[0072] 用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，通过在DNA中的突变可以制备蛋白质的氨基酸序列变体。这还可以通过若干种诱变形式之一和/或在定向进化中来完成。

[0073] 在一些方面，在所述氨基酸序列中所编码的改变将基本上不影响所述蛋白质的功能。此类变体将具有所需杀有害生物活性。然而，应当理解，可以在本公开的组合物上使用
这些技术来改善蛋白质赋予杀有害生物活性的能力。例如，可以在一个或多个、预测的、非
必需氨基酸残基处做出保守氨基酸取代。“非必需”氨基酸残基是可以从蛋白质的野生型序
列改变而来的并且不改变生物活性的残基。蛋白质同源物的氨基酸序列的比对(例如-图2-
6)允许鉴定此家族中的天然同源物之间高度保守的残基以及耐受氨基酸多样性的残基或
区域。“保守氨基酸取代”是其中用具有相似侧链的氨基酸残基替换所述氨基酸残基的取
代。在本领域中已经限定了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括：具有碱性侧
链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；具有极性的、带负电荷的残基及其酰胺的氨基酸(例如，天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺)；具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)；具有小脂肪族、非极性或微小极性的残基的氨基酸(例如，丙氨
酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；具有大脂肪族、非极性残基的氨基酸(例如，甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸)；具有β-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)；具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)；具有大芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。

[0074] 氨基酸取代可以在保留功能的非保守区域中进行。通常，此类取代并非针对保守氨基酸残基、或针对在保守基序内的氨基酸残基而进行，其中此类残基是蛋白质活性所必
要的。保守的并且对于蛋白质活性可能是必需的残基的实例包括例如，在与实施例的序列
相似或相关的毒素的比对中所包含的全部蛋白之间是相同的残基(例如，在同源蛋白比对
中是相同的残基)。保守的但可以允许保守氨基酸取代、并且仍保留活性的残基的实例包括
例如，在与实施例的序列相似或相关的毒素的比对中所包含的全部蛋白质之间仅具有保守
取代的残基(例如，在同源蛋白比对中所包含的全部蛋白质之间仅具有保守取代的残基)。
然而，本领域的技术人员应当理解，功能性变体在保守的残基中可以具有少量保守或非保
守的改变。关于不影响目的蛋白质的生物活性的适当的氨基酸取代的指导可以发现于
Dayhoff等人，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure[蛋白序列和结构图谱]
(Natl.Biomed.Res.Found.[国家生物医学研究基金会]，Washington，D.C.[华盛顿特区])
的模型中，其通过引用并入本文。

[0075] 在进行这种变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质以交互性生物功能中的重要性在本领域中通常是被理解的(Kyte和Doolittle，(1982)J Mol 
Biol.[分子生物学杂志]，157(1)：105-32)。接受的是所述氨基酸的相对亲水特征有助于所
得蛋白质的次级结构，所述次级结构进而定义蛋白质与其他分子(例如酶、基质、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。

[0076] 本领域已知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸取代，并且仍然产生具有相似生物活性的蛋白质，即仍然获得生物功能等效的蛋白质。每个氨基酸基
于其疏水性和电荷特征被指定亲水指数(Kyte和Doolittle，同上)。它们是：异亮氨酸(+
4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-
3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在进行这种变化时，优选亲水指数
在2以内的氨基酸取代，特别优选在1以内的氨基酸取代，并且甚至更特别优选0.5以内的氨
基酸取代。

[0077] 在本领域中也可以理解，可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取代。美国专利号4,554,101说明蛋白质的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性支配的)与
所述蛋白的生物特性相关。

[0078] 如美国专利号4,554,101中所详述的，已为氨基酸残基分配以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+0.1)；谷氨酸(+3.0.+0.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+0.1)；丙氨酸(-
0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

[0079] 可替代地，可以对氨基或羧基末端处的多种蛋白质的蛋白序列进行改变，而基本上不影响活性。这可以包括由现代分子方法所引入的插入、缺失或改变，所述方法如PCR，包括PCR扩增，所述PCR扩增借助于将氨基酸编码序列包括到在PCR扩增中所使用的寡核苷酸
之中而改变或延长了这种蛋白质编码序列。可替代地，所添加的蛋白序列可以包括完整的
蛋白质编码序列，如在本领域内通常用于产生蛋白质融合物的那些序列。此类融合蛋白常
常用于(1)增加目的蛋白质的表达；(2)引入结合结构域、酶活性或表位以促进蛋白质纯化、
蛋白质检测或本领域已知的其他实验用途：(3)将蛋白质的分泌或翻译靶向亚细胞器，如革
兰氏阴性菌的周质空间、植物的线粒体或叶绿体或真核细胞的内质网，其中后者常常导致
蛋白质的糖基化。

[0080] 本公开的变体核苷酸和氨基酸序列还涵盖了源自诱变和引起重组的程序(如DNA改组)的序列。通过这种程序，可以使用一个或多个不同的同源多肽编码区来创建具有所需
特性的新多肽。以此方式，由相关序列多核苷酸的群体产生重组多核苷酸文库，所述相关序
列多核苷酸包含具有基本序列同一性并且能够在体外或体内同源重组的序列区域。例如，
使用这种方法，可以将编码目的结构域的序列基序在杀有害生物基因与其他已知的杀有害
生物基因之间进行改组，以获得编码具有改善的目的特性(如增加的杀昆虫活性)的蛋白的
新基因。这种DNA改组的策略在本领域中是已知的。参见，例如，Stemmer，(1994)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91：10747-10751；Stemmer，(1994)Nature[自
然]370：389-391；Ctameri等人，(1997)Nature Biotech.[自然生物技术]15：436-438；
Moore等人，(1997)J Mol Biol[分子生物学杂志]272：336-347；Zhang等人，(1997)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]94：4504-4509；Crameri等人，(1998)Nature
[自然]391：288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

[0081] 结构域交换或改组是用于产生改变的多肽的另一种机制。可以在多肽同源物之间交换结构域，导致具有改善的杀昆虫活性或靶谱的杂交或嵌合毒素。用于产生重组蛋白并
测试其杀有害生物活性的方法是本领域熟知的(参见，例如Naimov等人，(2001)
Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]67：5328-5330；de Maagd等人，(1996)
Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]62：1537-1543；Ge等人，(1991)
J.Biol.Chem.[生物化学杂志]266：17954-17958；Schnepf等人，(1990)J.Biol.Chem.[生物
化学杂志]265：20923-20930；Rang等人，91999)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微
生物学]65：2918-2925)。

[0082] 杀昆虫蛋白家族的系统发育、序列基序、和结构分析。可以使用序列和结构分析方法，所述方法由四个部分组成：系统发育树构建、蛋白序列基序发现、二级结构预测以及蛋
白序列和二级结构比对。关于每个部分的详细信息描述如下。

[0083] 系统发育树构建

[0084] 可以使用软件MEGA5进行系统发育分析。可以对蛋白序列进行ClustalW版本2分析(Larkin M.A等人(2007)Bioinformatics[生物信息学]23(21)：2947-2948)，用于多重序列
比对。然后通过在基于JTT矩阵的模型基础上的最大似然法推断进化历史。获得具有最高对
数似然值的树，以Newick格式导出，并进一步处理，以与在树中出现的相同顺序提取序列
ID。可以为每个杀昆虫蛋白家族手动鉴定代表亚科的几个进化枝。

[0085] 蛋白序列基序发现

[0086] 根据先前构建的系统发育树对蛋白序列进行重新排序，并输入基序分析工具MEME(用于基序引出的多重EM)(Bailey T.L.和Elkan C.，Proceedings of the Second 
International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology[第二届
国际分子生物学智能系统会议论文集]，第28-36页，AAAI Press[AAAI出版社]，Menlo Park
[门洛帕克]，加利福尼亚州，1994)，用于鉴定关键序列基序。MEME设置如下：最小位点数2，最小基序宽度5，和最大基序数30。通过视觉观察鉴定了每个亚家族独有的序列基序。基序
在整个基因家族中的分布可以在HTML网页中看到。相对于每个基序的E-值的排名对基序进
行编号。

[0087] 二级结构预测

[0088] PSIPRED，排名最高的二级结构预测方法(Jones DT.(1999)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]292：195-202)，可用于蛋白质二级结构预测。所述工具使用基于PSI-BLAST输出
的两个前馈神经网络提供准确的结构预测。通过去除Uniref100中的低复杂度、跨膜和卷曲
螺旋区域来创建PSI-BLAST数据库。PSIPRED结果包含预测的二级结构(α螺旋：H，β链：E和螺旋：C)和给定蛋白序列中每个氨基酸的对应置信度得分。

[0089] 蛋白序列与二级结构的比对

[0090] 可以开发脚本，以对所有蛋白质根据来自步骤1的多重蛋白序列比对来产生空位二级结构比对。将所有比对的蛋白序列和结构连接成单个FASTA文件，并然后导入到MEGA中
用于可视化和鉴定保守结构。

[0091] 在一些实施例中，所述IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽具有修饰的物理特性。如本文所用的，术语“物理特性”是指适于描述蛋白质的物理化学特征的任何参数。如本文所用的，“目的物理特性”和“目的特性”可互换使用，以指正在研究和/或修饰的蛋白质的物理特性。物理特性的实例包括但不限于：蛋白质表面上的净表面电荷和电荷分布、蛋白质
表面上的净疏水性和疏水残基分布、表面电荷密度、表面疏水密度、表面电离基团的总计
数、表面张力、蛋白质大小及其在溶液中的分布、熔融温度、热容量、和第二位力系数。物理特性的实例还包括，IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽具有增加的表达、增加的溶解度、降低的植物毒性、和蛋白水解片段在昆虫肠道中的可消化性。模拟胃液消化的模型是本领
域技术人员已知的(Fuchs，R.L.和J.D.Astwood.Food Technology[食品技术]50：83-88，
1996；Astwood，J.D.等人，Nature Biotechnology[生物技术]14：1269-1273，1996；Fu TJ等人，J.Agric Food Chem.[农业与食品化学杂志]50：7154-7160，2002)。

[0092] 在一些实施例中，变体包括由于诱变而在氨基酸序列方面不同的多肽。本公开所涵盖的变体蛋白质具有生物活性，即它们仍然具有天然蛋白质所需的生物活性(即杀有害
生物活性)。在一些实施例中，所述变体将具有至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、至少约80％或更多的天然蛋白质的杀昆虫活性。在一些实施例中，所述变体可以具
有比天然蛋白质改善的活性。

[0093] 细菌基因通常在可读框的起始附近具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在这些起始密码子中的一个或多个处的翻译起始将导致功能性蛋白质的产生。这些起始密码子可
以包括ATG密码子。然而，细菌(如，芽孢杆菌属物种)还将密码子GTG识别为起始密码子，并
且在GTG密码子处起始翻译的蛋白质在第一个氨基酸处包含甲硫氨酸。在少数情况下，细菌
系统中的翻译可以在TTG密码子处起始，尽管在此事件中TTG编码甲硫氨酸。此外，通常不先
验地确定细菌中天然使用了这些密码子中的哪一些。因此，应当理解，使用可替代的甲硫氨
酸密码子之一也可能导致杀有害生物蛋白的产生。这些杀有害生物蛋白涵盖于本公开之
中，并且可以在本公开的方法中使用。应当理解，当在植物中表达时，有必要将可替代的起
始密码子改变为ATG以用于正确翻译。

[0094] 本领域技术人员理解，可以修饰多核苷酸编码序列以在甲硫氨酸起始密码子之后的位置处添加密码子以产生用于重组克隆目的和/或用于表达目的的限制性酶切位点。在
一些实施例中，本公开的多肽在翻译起始因子甲硫氨酸之后的位置处进一步包含丙氨酸残
基。

[0095] 在一些实施例中，本公开的多肽的翻译起始因子甲硫氨酸在翻译后被切除。本领域技术人员理解，在许多细胞表达系统中，N-末端翻译起始因子甲硫氨酸可以被甲硫氨酸
氨基肽酶去除。

[0096] 在一些实施例中，提供了嵌合多肽，其包含本公开的至少两种不同IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的区域。在一些实施例中，提供了嵌合多肽，其包含本公开的
至少两种不同IPD098多肽的区域。在一些实施例中，提供了嵌合多肽，其包含本公开的至少
两种不同IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的区域。在一些实施例中，提供了嵌合多肽，其包含本公开的至少两种不同IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的区域。

[0097] 在其他实施例中，本公开的多肽可以表达为具有催化多步翻译后蛋白质剪接的间插序列的前体蛋白。蛋白质剪接涉及从多肽切除间插序列，并伴随连接侧翼序列以产生新
的多肽(Chong等人，(1996)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，271：22159-22168)。这种被称为内含肽的间插序列或蛋白质剪接元件，通过在N-末端和C-末端剪接点处的以下三个协调反
应催化其自身的切除：N-末端半胱氨酸或丝氨酸的酰基重排；两个末端之间形成支链酯或
硫酯中间体的酯交换反应，和与内含肽C-末端天冬酰胺的环化相偶联释放内含肽的肽键切
割(Evans等人，(2000)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，275：9091-9094)。阐明蛋白质剪接的机制导致了许多基于内含肽的应用(Comb等人，美国专利号5,496,714；Comb等人，美国专利
号5,834,247；Camarero和Muir，(1999)J.Amer.Chem.Soc.[美国化学会志]121：5597-5598；
Chong等人，(1997)Gene[基因]192：271-281，Chong等人，(1998)Nucleic Acids Res.[核酸研究]26：5109-5115；Chong等人，(1998)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]273：10567-10577；
Cotton等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]121：1100-1101；Evans等人，(1999)
J.Biol.Chem.[生物化学杂志]274：18359-18363；Evans等人，(1999)J.Biol.Chem.[生物化
学杂志]274：3923-3926；Evans等人，(1998)Protein Sci.[蛋白质科学]7：2256-2264；
Evans等人，(2000)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]275：9091-9094；Iwai和Pluckthun，
(1999)FEBS Lett.[欧洲生化学会联盟通讯]459：166-172；Mathys等人，(1999)Gene[基因]
231：1-13；Mills等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]95：3543-3548；
Muir等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]95：6705-6710；Otomo等人，
(1999)Biochemistry[生物化学]38：16040-16044；Otomo等人，(1999)J.Biolmol.NMR[生物
分子NMR杂志]14：105-114；Scott等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]
96：13638-13643；Severinov和Muir，(1998)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]273：16205-
16209；Shingledecker等人，(1998)Gene[基因]，207：187-195；Southworth等人，(1998)
EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]17：918-926；Southworth等人，(1999)Biotechniques
[生物技术]27：110-120；Wood等人，(1999)Nat Biotechnol.[自然生物技术]17：889-892；
Wu等人，(1998a)Proc.Natl.Acad.Scci.USA[美国科学院院报]95：9226-9231；Wu等人，
(1998b)Biochim Biophys Acta[生物化学与生物物理学学报]1387：422-432；Xu等人，
(1999)Proc.Natl.Acad.Scci.USA[美国科学院院报]96：388-393；Yamazaki等人，(1998)
J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]120：5591-5592)。针对在植物转基因中应用内含肽，参见，Yang等人(Transgene Res[转基因研究]15：583-593(2006))和Evans等人(Annu.Rev.Plant 
Biol.[植物生物学年评]56：375-392(2005))。

[0098] 在另一个实施例中，本公开的多肽可以由两个单独的基因编码，其中前体蛋白的内含肽来自两个称为分裂内含肽的基因，并且前体的两部分通过肽键形成连接。此肽键的
形成通过内含肽介导的反式剪接实现。为此目的，包含两个单独基因的第一和第二表达盒
进一步编码能够介导蛋白质反式剪接的内含肽。通过反式剪接，由第一和第二片段编码的
蛋白质和多肽可以通过肽键形成连接。反式剪接内含肤可以选自包括真核生物、古细菌和
真细菌在内的不同生物体的核仁和细胞器基因组。可以使用的内含肽列在neb.com/neb/
inteins.html上，其可以使用“www”前缀在万维网上访问。编码内含肽的核苷酸序列可以分裂成5′和3′部分，所述5′和3′部分分别编码内含肽的5′和3′部分。可能使内含肽剪接不需要的序列部分(例如归巢内切核酸酶结构域)缺失。将内含肽编码序列分裂，使得5′和3′部
分能够进行反式剪接。为了选择内含肽编码序列的合适的分裂位点，可以遵循由
Southworth等人，(1998)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]17：918-926公开的注意事项。
在构建第一和第二表达盒中，5′内含肽编码序列连接到编码本公开的IPD059、IPD098、
IPD108或IPD109多肽的N-末端部分的第一片段的3′末端，并且3′内含肽编码序列连接到编
码IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的C-末端部分的第二片段的5′末端。

[0099] 通常，可以使用任何断裂内含肽来设计反式剪接配偶体，包括任何天然存在或人工分裂的断裂内含肽。已知若干种天然存在的断裂内含肽，例如：集胞藻属
(Synechocystis)物种PCC6803的DnaE基因的断裂内含肽(参见，Wu等人，(1998)Proc Natl 
Acad Sci USA.[美国科学院院报]95(16)：9226-31和Evans等人，(2000)J Biol Chem.[生
物化学杂志]275(13)：9091-4)和来自点状念珠藻(Nostoc punctiforme)的DnaE基因的断
裂内含肽(参见，Iwai等人，(2006)FEBS Lett.[欧洲生化学会联盟通讯]580(7)：1853-8)。
非断裂内含肽在实验室中人工分裂以产生新的断裂内含肽，例如：人工分裂Ssp DnaB内含
肽(参见，Wu等人，(1998)Biochim Biophys Acta.[生物化学与生物物理学学报]1387：422-
32)和分裂Sce VMA内含肽(参见，Brenzel等人，(2006)Biochemistry.[生物化学]45(6)：
1571-8)和人工分裂真菌微型内含肽(参见，Elleuche等人，(2007)Biochem Biophys Res 
Commun.[生物化学与生物物理学研究通讯]355(3)：830-4)。还有把已知的内含肽编入目录
的内含肽数据库(参见，例如，可以在bioinformatics.weizmann.ac.il/～pietro/
inteins/Inteinstable.html处获得的在线数据库，其可以使用“www”前缀在万维网上访
问)。

[0100] 天然存在的非断裂内含肽可能具有内切核酸酶活性或其他酶活性，这些活性典型地可以在设计人工分裂的断裂内含肽时被去除。这样的迷你内含肽或最小化的断裂内含肽
是本领域熟知的，并且典型地小于200个氨基酸残基长(参见，Wu等人，(1998)Biochim 
Biophys Acta.[生物化学与生物物理学学报]1387：422-32)。合适的断裂内含肽可以向其
结构添加使其他纯化可行的多肽元件，条件是这些元件不会抑制断裂内含肽的剪接，或以
允许它们在拼接之前被去除的方式添加。已经使用以下蛋白质报道了蛋白质剪接，这些蛋
白质包含：细菌内含肽样(BIL)结构域(参见，Amitai等人，(2003)Mol Microbiol.[分子微
生物学]47：61-73)和刺猬(Hog)自体加工结构域(当称为Hog/内含肽超家族或HINT家族时，
后者与内含肽组合；参见，Dassa等人，(2004)J Biol Chem.[生物化学杂志]279：32001-7))以及如还可用于制备人工分裂的内含肽的结构域。特别地，可以通过分子生物学方法来修
饰这些家族的非剪接成员，以引入或恢复在这些相关物种中的剪接活性。最近的研究表明，
当允许N-末端断裂内含肽组分与自然界中未发现的作为其“配偶体”的C-末端断裂内含肽
组分反应时，可以观察到剪接；例如，已经观察到使用与“自然”剪接配偶体具有少至30％至
50％同源性的配偶体进行的剪接(参见，Dassa等人，(2007)Biochemistry.[生物化学]，46
(1)：322-30)。不同断裂内含肽的其他这种混合物已被证明是与另一个不反应的混合物(参
见，Brenzel等人，(2006)Biochemistry.[生物化学]45(6)：1571-8)。然而，使用常规方法并且无需运用创造性技能来确定一对特定多肽是否能够彼此结合以提供功能性内含肽是在
相关领域的技术人员的能力范围内。

[0101] 在一些实施例中，本公开的多肽是环形排列的变体。重组DNA方法的发展使得有可能研究序列转座对蛋白质折叠、结构和功能的影响。创建新序列中使用的方法类似于通过
其氨基酸序列的线性改组对天然存在的蛋白质对进行关联的方法(Cunningham等人，
(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院报]76：3218-3222；Teather和Erfle，
(1990)J.Bacteriol.[细菌学杂志]172：3837-3841；Schimming等人，(1992)
Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]204：13-19；Yamiuchi和Minamikawa，(1991)FEBS 
Lett.[欧洲生化学会联盟通讯]260：127-130；MacGregor等人，(1996)FEBS Lett.[欧洲生
化学会联盟通讯]378：263-266)。Goldenberg和Creighton描述了这种类型的蛋白质重排的
第一次体外应用(J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]165：407-413，1983)。在创建环形排列的
变体中，在原始序列的内部位点(断点)处选择新的N-末端，新序列从断点与原始序列具有
氨基酸相同的次序，直到其达到原始C-末端或其附近的氨基酸。在这一点上，新序列直接或
通过序列(接头)的另外部分连接到原始N-末端或其附近的氨基酸，并且新序列以与原始序
列相同的序列继续，直到其达到原始序列的断点位点的N-末端的氨基酸处或附近的点，此
残基形成链的新C-末端。接头的氨基酸序列的长度可以凭经验或以结构信息的指导或通过
使用两种方法的组合来选择。当没有结构信息可用时，可以使用设计和采取必要的确认，而
不会破坏杀有害生物多肽的构型的能力(构象灵活；Karplus和Schulz，(1985)
Naturwissenschaften[自然科学]72：212-213)制备小系列接头用于测试，该设计的长度为
了跨越从0至 的范围而变化并且选择该设计的序列以与表面暴露一致(亲水性，Hopp
和Woods，(1983)Mol.Immunol.[分子免疫学]20：483-489；Kyte和Doolittle，(1982)
J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]157：105-132；溶剂暴露表面积，Lee和Richards，(1971)
J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]55：379-400)。假设每个残基平均翻译为2.0至 这意
味着要测试的长度在0至30个残基之间，其中0至15个残基为优选范围。这种经验性系列的
实例将是使用重复n次的盒序列如Gly-Gly-Gly-Ser构建接头，其中n为1、2、3或4。本领域技术人员将认识到，存在许多长度或组成不同的这样的序列，其可以用作接头，其中主要注意
事项是它们是既不过长也不过短的(参见Sandhu，(1992)Critical Rev.Biotech.[生物技
术评论]12：437-462)；如果它们太长，熵效应可能会使三维折叠不稳定，并且也可能使得折叠在动力学上是不切实际的，并且如果它们太短，则它们可能由于扭转或空间应变使分子
不稳定。蛋白质结构信息分析的技术人员将认识到，使用定义为c-α碳之间距离的链末端之
间的距离可用于定义待使用的序列的长度，或至少限制在接头的经验选择中必须测试的可
能性的数量。因此，他们还将认识到，在有时多肽链末端的位置在源自X射线衍射或核磁共
振光谱数据的结构模型中是不明确的情况下，并且当确实如此的情况下，需要考虑这种情
况，以便正确估计所需接头的长度。从其位置定义明确的那些残基选择两个与链末端顺序
接近的残基，并且使用它们的c-α碳之间的距离来计算它们之间的接头的近似长度。使用计
算出的长度作为指导，然后选择具有一定范围数量的残基(每个残基使用2至 计算)
的接头。这些接头可以由原始序列组成，必要时缩短或延长，并且当延长时，可以如上所述
选择灵活的和亲水性的另外的残基；或任选地，原始序列可以用一系列接头取代，一个实例
是以上提及的Gly-Gly-Gly-Ser盒方法；或任选地，可以使用具有适当总长度的原始序列和
新序列的组合。能够折叠为生物活性状态的杀有害生物多肽的序列可以通过从原始多肽链
中开始(氨基末端)和末端(羧基末端)位置的适当选择，同时使用如上所述的接头序列来制
备。氨基和羧基末端使用下面所述的指南从称为断点区的序列的常见延伸中选出。因此，通
过从同一断点区内选择氨基和羧基末端来产生新颖的氨基酸序列。在许多情况下，新末端
的选择将使得羧基末端的原始位置紧邻氨基末端的位置。然而，本领域技术人员将认识到，
区域内任何地方的末端的选择可能起作用，并且这些将有效地导致新序列的氨基或羧基部
分的缺失或添加。蛋白质的主要氨基酸序列指令折叠为表达其生物功能所必需的三维结构
是分子生物学的核心原则。本领域技术人员已知使用单一蛋白晶体的x射线衍射或蛋白质
溶液的核磁共振光谱来获得和解释三维结构信息的方法。与断点区的鉴定相关的结构信息
的实例包括蛋白质二级结构的位置和类型(α和3-10个螺旋，平行和反向平行β折叠，链逆转(chain reversal)和转角，以及环；Kabsch和Sander，(1983)Biopolymers[生物聚合物]22：
2577-2637)；氨基酸残基的溶剂暴露程度、残基彼此之间相互作用的程度和类型(Chothia，
(1984)Ann.Rev.Biochem.[生物化学年鉴]53：537-572)以及沿多肽链的构象的静态和动态
分布(Alber和Mathews，(1987)Methods Enzymol.[酶学方法]154：511-533)。在一些情况
下，关于残基的溶剂暴露的其他信息是已知的；一个实例是必然位于所述蛋白质表面的碳
水化合物的翻译后附着位点。当实验结构信息不可获得或不可能获得时，也可以使用方法
来分析初级氨基酸序列，以便预测蛋白质三级和二级结构、溶剂可及性以及转角和环的发
生。当直接结构方法不可行时，生物化学方法有时也适用于经验性地确定表面暴露；例如，
在有限的蛋白水解之后使用断链位点的鉴定来推断表面暴露(Gentile和Salvatore，
(1993)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]218：603-621)。使用实验衍生的结构信息或预
测方法(例如，Srinivisan和Rose，(1995)Proteins：Struct.，Funct.&Genetics[蛋白质：结构，功能和遗传学]22：81-99)，检查亲本氨基酸序列以根据它们是否对维持二级和三级结
构是必不可少的来对区域进行分类。已知涉及周期性二级结构(α和3-10个螺旋，平行和反
平行β折叠)的区域内的序列发生是应该避免的区域。相似地，观察或预测具有低溶剂暴露
程度的氨基酸序列的区域更可能是蛋白的所谓疏水核心的一部分，并且也应避免选择氨基
和羧基末端。相比之下，已知或预测为表面内转角或环的那些区域，并且尤其是已知生物活
性所不需要的那些区域，是用于定位多肽链末端的优选位点。基于上述标准优选的氨基酸
序列的连续延伸被称为断点区。可以基本上遵循Mullins等人，(1994)J.Am.Chem.Soc.[美
国化学会志]116：5529-5533中所描述的方法制备编码环形排列的IPD059、IPD098、IPD108
或IPD109多肽的、具有新N-末端/C-末端的多核苷酸，所述多核苷酸包含将原C-末端与N-末
端分隔开的连接区。聚合酶链式反应(PCR)扩增的多个步骤用于重排编码蛋白质的一级氨
基酸序列的DNA序列。可以基于Horlick等人，(1992)Protein Eng.[蛋白工程]5：427-431中
所描述的串联重复方法制备编码环形排列的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的、具有
新N-末端/C-末端的多核苷酸，所述多核苷酸包含将原C-末端与N-末端分隔开的连接区。使
用串联重复的模板DNA进行新的N-末端/C-末端基因的聚合酶链式反应(PCR)扩增。

[0102] 在另一个实施例中，提供了融合蛋白，在所述融合蛋白的氨基酸序列中包含含有本公开的多肽的氨基酸序列。用于设计和构建融合蛋白(以及编码它们的多核苷酸)的方法
是本领域技术人员已知的。编码实施例的多肽的多核苷酸可以融合到信号序列，所述信号
序列将指导实施例的多肽定位于原核或真核细胞的特定区室和/或指导来自原核或真核细
胞的实施例的多肽的分泌。例如，在大肠杆菌(E.coli)中，人们可能希望指导蛋白质表达至
周质空间。可以与本公开的多肽融合以便指导所述多肽表达至细菌周质空间的信号序列或
蛋白质(或其片段)的实例包括但不限于：pelB信号序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列、
MBP、ompA信号序列、周质性大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基的信号序列和碱性磷酸酶的信号
序列。用于构建将指导蛋白质定位的融合蛋白的若干种载体是可商购的，如可从新英格兰
生物实验室(New England Biolabs)获得的pMAL系列的载体(特别是pMAL-p系列)。在具体
实施例中，所述IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽可以与pelB果胶酸裂合酶信号序列融
合，以增加革兰氏阴性菌中此类多肽的表达和纯化的效率(参见，美国专利号5,576,195和
5,846,818)。植物质体转运肽/多肽融合是本领域熟知的。质外体转运肽如水稻或大麦α-淀
粉酶分泌信号也是本领域熟知的。质体转运肽通常与待靶向的多肽(例如，融合配偶体)进
行N-末端融合。在一个实施例中，融合蛋白基本上由质体转运肽和待靶向的本公开的多肽
组成。在另一个实施例中，融合蛋白包含质体转运肽和待靶向的多肽。在这类实施例中，质
体转运肽优选位于融合蛋白的N-末端。然而，另外的氨基酸残基可以在质体转运肽的N-末
端，条件是所述融合蛋白至少部分地靶向质体。在具体实施例中，质体转运肽在融合蛋白的
N-末端一半处、N-末端三分之一处或N-末端四分之一处。当插入质体时，大部分或全部质体
转运肽通常从融合蛋白上切割。由于具体的细胞间条件或所使用的转运肽/融合配偶体的
特定组合，因此在不同植物发育阶段，切割位置可能在植物物种之间略有变化。在一个实施
例中，质体转运肽切割是均匀的，使得切割位点在融合蛋白群体中是相同的。在另一个实施
例中，质体转运肽不是均匀的，使得切割位点在融合蛋白群体中相差1-10个氨基酸。质体转
运肽能以若干种方式之一重组融合到第二蛋白质。例如，可以将限制性内切核酸酶识别位
点引入到对应于其C-末端的位置处的转运肽的核苷酸序列中，并且可以将相同或相容的位
点工程改造为在其N-末端待靶向的蛋白质的核苷酸序列。必须注意设计这些位点，以确保
转运肽和第二蛋白质的编码序列保持“框内”，以允许合成所需的融合蛋白。在一些情况下，当引入新的限制性位点时，优选去除第二蛋白质的起始因子甲硫氨酸。在两个亲本分子上
引入限制性内切核酸酶识别位点，以及它们随后通过重组DNA技术连接可导致在转运肽和
第二蛋白质之间添加一个或多个额外的氨基酸。这通常不影响靶向活性，只要转运肽切割
位点保持可及，并且在其N-末端添加这些额外的氨基酸不改变第二蛋白质的功能。可替代
地，本领域技术人员可以使用基因合成(Stemmer等人，(1995)Gene[基因]164：49-53)或相
似的方法在转运肽和第二蛋白质(有或没有其起始子甲硫氨酸)之间产生精确的切割位点。
另外，转运肽融合可以有意地包括切割位点下游的氨基酸。成熟蛋白质N-末端的氨基酸可
影响转运肽将蛋白质靶向质体的能力和/或蛋白质输入后的切割效率。这可能取决于待靶
向的蛋白质。参见，例如，Comai等人，(1988)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]263(29)：15104-
9。

[0103] 在一些实施例中，本公开的多肽与异源信号肽或异源转运肽融合。

[0104] 在一些实施例中，提供了包含本公开的多肽的融合蛋白，所述融合蛋白由选自由以下组成的组的式表示：

[0105] R1L-R2、R2-L-R1、R1-R2或R2-R1

[0106] 其中R1是本公开的多肽，并且R2是目的蛋白质。在一些实施例中，R1和R2是本公开1 2
的多肽。所述R多肽直接或通过接头(L)区段融合至R多肽。术语“直接”定义在没有肽接头
的情况下连接多肽的融合。因此，“L”表示与R1和R2框内融合的化学结合或多肽区段，最常见的是，L是R1和R2通过酰胺键将R1的羧基末端连接到L的氨基末端并且将L的羧基末端连接到
R2的氨基末端的线性肽。“框内融合”意指R1和R2的阅读框之间没有翻译终止或中断。连接基团(L)通常是长度在1至500个氨基酸之间的多肽。连接两个分子的接头优选设计成(1)允许
两个分子彼此独立地折叠并且起作用，(2)不具有发展可能干扰两种蛋白质的功能性结构
域的有序二级结构的倾向，(3)具有可与功能性蛋白质结构域相互作用的最小的疏水或带
电特征，并且(4)提供R1和R2的空间分离，使得R1和R2可以与单个细胞上的相应受体同时相
互作用。典型地，在柔性蛋白质区域中的表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser。期望包含Gly、Asn和Ser的氨基酸序列的几乎任何排列满足上述接头序列的标准。其他中性氨基酸如Thr和
Ala也可以用于接头序列。由于在接头序列中添加了独特的限制性位点以便于构建融合体，
因此另外的氨基酸也可以包括在接头中。

[0107] 在一些实施例中，所述接头包含选自以下式的组的序列：(Gly3Ser)n，(Gly4Ser)n，(Gly5Ser)n，(GlynSer)n或(AlaGlySer)n，其中n是整数。高度柔性接头的一个实例是存
在于丝状噬菌体(例如，噬菌体M13或fd)的pIII蛋白质内的富含(GlySer)的间隔子区域
(Schaller等人，1975)。此区域在pIII表面蛋白质的两个结构域之间提供长、柔性的间隔子
区域。还包括接头，在接头中包括内肽酶识别序列。这种切割位点对于分离融合物的各个组
分以确定它们在体外是否适当折叠和是否具有活性可能是有价值的。各种内肽酶的实例包
括但不限于：纤溶酶、肠激酶、激肽释放酶、尿激酶、组织纤溶酶原激活剂、梭菌蛋白酶、凝乳酶、胶原酶、鲁塞尔氏蝰蛇毒蛋白酶、后脯氨酸切割酶、V8蛋白酶、凝血酶和因子Xa。在一些实施例中，所述接头包含来自多基因表达载体(MGEV)的氨基酸EEKKN(SEQ ID NO：156)，其
如美国专利申请公开号US 2007/0277263中所公开的被液泡蛋白酶切割。在其他实施例中，
来自重链免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的铰链区域的肽接头区段提供所附着的多肽
之间的角度关系。尤其有用的是那些半胱氨酸被丝氨酸替换的铰链区域。本公开的接头包
括源自鼠IgG γ 2b铰链区域的序列，其中半胱氨酸已变为丝氨酸。融合蛋白不受所使用的
接头序列的形式、大小或数目的限制，并且接头的唯一要求是功能上不会不利地干扰融合
的各个分子的折叠和功能。

[0108] 核酸分子及其变体和片段

[0109] 提供了包含编码多肽或其生物活性部分的核酸序列的分离或重组的核酸分子，以及足以用作杂交探针以鉴定编码具有序列同源性区域的蛋白质的核酸分子的核酸分子。如
本文所用的，术语“核酸分子”是指DNA分子(例如，重组DNA、cDNA、基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物而产生的DNA或RNA的类似物。核酸分
子可以是单链的或双链的，但优选地是双链的DNA。

[0110] 本文所用的“分离的”核酸分子(或DNA)是指不再处于其天然环境中(例如处于体外)的核酸序列(或DNA)。本文所用的“重组的”核酸分子(或DNA)是指在重组细菌或植物宿
主细胞中的核酸序列(或DNA)。在一些实施例中，“分离的”或“重组的”核酸不含有在源自核酸的生物体的基因组DNA中天然地位于所述核酸侧翼的序列(即，位于所述核酸的5′和3′端
的序列)(优选编码蛋白质的序列)。出于本公开的目的，“分离的”或“重组的”当用于指核酸分子时排除分离的染色体。例如，在不同实施例中，编码本公开的多肽的重组核酸分子可以
包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核酸序列，所述核酸序列在源自核酸的细胞的基因组DNA中天然地位于所述核酸分子的侧翼。

[0111] 在一些实施例中，编码本公开的多肽的分离核酸分子与天然或基因组核酸序列相比具有核酸序列的一个或多个变化。在一些实施例中，天然或基因组核酸序列的改变包括
但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列改变；与天然或基因组序列相比，由于氨
基酸取代、插入、缺失和/或添加造成的核酸序列的改变；一个或多个内含子的去除；一个或多个上游或下游调节区的缺失；和与基因组核酸序列相关的5′和/或3′非翻译区域的缺失。
在一些实施例中，编码本公开的多肽的核酸分子是非基因组序列。

[0112] 考虑了编码本公开的多肽或相关蛋白的多种多核苷酸。当可操作地连接到合适的启动子、转录终止和/或聚腺苷酸化序列上时，这类多核苷酸可用于在宿主细胞中生产本公
开的多肽。这类多核苷酸还可用作用于分离编码本公开的多肽或相关蛋白的同源或基本上
同源的多核苷酸的探针。

[0113] 编码IPD059多肽的多核苷酸

[0114] 编码IPD059多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源是蕨类植物或其他原始植物物种，所述蕨类植物或其他原始植物物种选自但不限于水龙骨属物种、线蕨属物种、铁角蕨
属物种、耳蕨属物种、或对开蕨属物种，这些物种含有分别编码SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：
41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、或SEQ ID NO：75的IPD059多肽的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、或SEQ ID NO：37的IPD059多核苷酸。可以使用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：
10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、或SEQ ID NO：37的多核苷酸以在重组细菌宿主(包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)、芽孢杆菌、埃希氏杆菌(Escherichia)、沙门氏菌
(Salmonella)、假单胞菌(Pseudomonas)和根瘤菌(Rhizobium)细菌宿主细胞)中表达
IPD059多肽。所述多核苷酸还可用作用于分离编码IPD059多肽或相关蛋白的同源或基本上
同源的多核苷酸的探针。此类探针可用于鉴定源自蕨类植物或其他原始植物物种，选自但
不限于水龙骨属物种、线蕨属物种、铁角蕨属物种、耳蕨属物种、或对开蕨属物种的同源或
基本上同源的多核苷酸。

[0115] 编码IPD059多肽的多核苷酸也可以从IPD059多肽序列从头合成。多核苷酸基因的序列可以通过使用遗传密码从IPD059多肽序列中推导出来。计算机程序如
“BackTranslate”(GCGTM包，阿克莱瑞公司(Acclerys，Inc.)，圣迭戈市，加利福尼亚州)可用于将肽序列转换成编码所述肽的相应核苷酸序列。可用于获得相应核苷酸编码序列的
IPD059多肽序列的实例包括但不限于SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、和SEQ ID NO：78的IPD059多肽。此外，可以对本公开的合成的IPD059多核苷酸序列进行设计，使其在植物中表达。

[0116] 在一些实施例中，编码IPD059多肽的核酸分子是具有在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、或SEQ ID NO：37中所示序列的多核苷酸、及其变体、片段和互补序列。本文所用的“互补序列”是指与给定核酸序列充分互补的核酸序列，使得其可以与所述给定核酸序列杂交从而形成稳定的双链体。本文所用的“多
核苷酸序列变体”是指除遗传密码的简并性之外编码相同多肽的核酸序列。

[0117] 在一些实施例中，编码IPD059多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。如本文所用的，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”或“非基因组多核苷酸”是指与天然或基因组核酸序列相比，具有核酸序列的一个或多个变化的核酸分子。在一些实施例中，天然或基
因组核酸分子的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列改变；用于在
植物中表达的核酸序列的优化；与天然或基因组序列相比，引入至少一个氨基酸取代、插
入、缺失和/或添加的核酸序列的改变；去除与所述基因组核酸序列相关的一个或多个内含
子；插入一个或多个异源内含子；缺失与所述基因组核酸序列相关的一个或多个上游或下
游调节区；插入一个或多个异源上游或下游调节区；缺失与所述基因组核酸序列相关的5′
和/或3′非翻译区；插入异源5′和/或3′非翻译区；和聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施例中，所述非基因组核酸分子是合成的核酸序列。在一些实施例中，所述非基因组核酸分子是
cDNA。

[0118] 在一些实施例中，编码IPD059多肽的核酸分子是具有如下核苷酸序列的非基因组多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、或SEQ ID NO：37的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、
55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性，其中IPD059多肽具有杀昆虫活性。

[0119] 在一些实施例中，所述核酸分子编码包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、或SEQ ID NO：78的氨基酸序列的IPD059多肽，相比于在SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、或SEQ ID NO：78的相应位置处的天然氨基酸，所述氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、
46、47、48或更多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

[0120] 还提供了编码转录和/或翻译产物的核酸分子，所述转录和/或翻译产物随后被剪接以最终产生功能性IPD059多肽。剪接可以在体外或体内完成，并且可以涉及顺式或反式
剪接。用于剪接的底物可以是多核苷酸(例如，RNA转录物)或多肽。多核苷酸的顺式剪接的
实例是去除插入到编码序列中的内含子并剪接两个侧翼外显子区域以产生IPD059多肽编
码序列。反式剪接的实例是通过将所述编码序列分离成两个或更多个片段来对多核苷酸进
行加密，所述片段可以单独转录并且然后被剪接以形成全长的杀有害生物编码序列。使用
可以引入到构建体中的剪接增强子序列可以促进多肽的顺式或反式剪接(美国专利号6,
365,377和6,531,316)。因此，在一些实施例中，所述多核苷酸不直接编码全长IPD059多肽，而是编码IPD059多肽的一个或多个片段。这些多核苷酸可用于通过涉及剪接的机制来表达
功能性IPD059多肽，其中剪接可以在多核苷酸(例如内含子/外显子)和/或多肽(例如内含
肽/外显肽)的水平上发生。这可以用于，例如，控制杀有害生物活性的表达，因为如果在允
许剪接过程以产生功能性产物的环境中表达所有必需的片段，则仅表达功能性杀有害生物
多肽。在另一个实例中，将一个或多个插入序列引入多核苷酸中可促进与低同源性多核苷
酸的重组；使用针对所述插入序列的内含子或内含肽便于去除所述间插序列，从而恢复经
编码的变体的功能。

[0121] 作为编码IPD059多肽的这些核酸序列的片段的核酸分子也涵盖在实施例中。如本文所用的“片段”是指编码IPD059多肽的核酸序列的一部分。核酸序列的片段可以编码
IPD059多肽的生物活性部分，或者它可以是可以使用下文公开的方法用作杂交探针或PCR
引物的片段。作为编码IPD059多肽的核酸序列的片段的核酸分子包含至少约150、180、210、
240、270、300、330或360个连续核苷酸或高至存在于编码本文公开的IPD059多肽的全长核
酸序列中的核苷酸数目，这取决于预期用途。本文所用的“连续核苷酸”是指彼此紧邻的核
苷酸残基。实施例的核酸序列的片段将编码保留IPD059多肽的生物活性并因此保留杀昆虫
活性的蛋白质片段。本文所用的“保留杀昆虫活性”是指具有全长IPD059Aa多肽(SEQ ID 
NO：39)的至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀昆虫活性的多肽。在一些实施例中，所述杀昆虫活性针对鳞翅目物种。在一个实施例中，所
述杀昆虫活性针对鞘翅目物种。

[0122] 在一些实施例中，所述IPD059多肽由与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37的核酸序列充分同源的核酸序列编码。本文所用的“充分同源”是指，使用标准参数、使用本文所述的比对程序之一，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸或核酸序列。本领域技术人员将认识到，可以通过考虑简并性、氨基酸相
似性、阅读框定位等来适当地调整这些值以确定由两个核酸序列编码的蛋白质的相应同源
性。在一些实施例中，所述序列同源性针对编码IPD059多肽的多核苷酸的全长序列或针对
IPD059多肽的全长序列。

[0123] 在一些实施例中，所述核酸编码如下IPD059多肽：所述IPD059多肽与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ IDNO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、或SEQ ID NO：78相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0124] 在一些实施例中，使用ClustalW算法在Vector 程序套件(英杰公司，卡尔斯巴德市，加利福尼亚州)的 模块中在所有默认参数下计算所述序列同一性。在一
些实施例中，使用ClustalW算法在Vector NTI程序套件(英杰公司，卡尔斯巴德市，加利福
尼亚州)的ALIGNX模块中在所有默认参数下计算跨全长多肽的序列同一性。

[0125] 为了确定两种或更多种氨基酸序列或者两种或更多种核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的，将序列进行比对。两个序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同
位置的数量的函数(即，同一性百分比＝相同位置数/位置总数(例如，重叠位置×100)。

[0126] 在一个实施例中，两个序列具有相同的长度。在另一个实施例中，比较是在整个参比序列中进行(例如，在整个SEQ ID NO：39中)。可使用类似于下面所述的那些技术的技术，在容许或不容许缺口的情况下确定两个序列之间的百分比同一性。在计算百分比同一性
中，典型地计数确切的匹配。

[0127] 用于比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是如下文献中所述算法：Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48(3)：443-453，使用GAP版本
10软件来确定序列同一性或相似性，使用以下默认参数：对于核酸序列的同一性％和相似
性％，使用GAP权重为50和长度权重为3，以及nwsgapdna.cmpii评分矩阵；对于氨基酸序列
的同一性％或相似性％，使用GAP权重为8和长度权重为2，以及BLOSUM62评分程序。也可采
用等效的程序。本文所用的“等效的程序”是指任何序列比较程序，所述程序对于任何两个
所讨论的序列产生一个比对，当与GAP版本10所产生的对应的比对相比较时，所述比对具有
相同的核苷酸残基配对以及相同的序列同一性百分比。

[0128] 在一些实施例中，所述IPD059多核苷酸编码包含与贯穿SEQ ID NO：39的氨基酸序列的整个长度具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的氨基酸序列的IPD059多肽。

[0129] 在一些实施例中，提供了编码嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多肽包含本公开的至少两种不同IPD059多肽的区域。

[0130] 在一些实施例中，提供了编码嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多肽包含选自如下的至少两种不同IPD059多肽的区域：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、或SEQ ID NO：78。

[0131] 在一些实施例中，IPD059多核苷酸编码包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、或SEQ ID NO：78的氨基酸序列的IPD059多肽。

[0132] 编码IPD098多肽的多核苷酸

[0133] 编码IPD098多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源是蕨类植物或其他原始植物物种，所述蕨类植物或其他原始植物物种选自但不限于铁角蕨属物种、鹿角蕨属物种、曲霉
属物种、或卷柏属物种，这些物种含有分别编码SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：117的IPD098多肽的SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：
86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、或SEQ ID NO：94的IPD098多核苷酸。可以使用SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、或SEQ ID NO：94的多核苷酸以在重组细菌宿主(包括但不限于农杆菌、芽孢杆菌、埃希氏杆菌、沙门氏菌、假单胞菌和根瘤菌细菌宿主细胞)中表达IPD098多
肽。所述多核苷酸还可用作用于分离编码IPD098多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多
核苷酸的探针。此类探针可用于鉴定源自蕨类植物或其他原始植物物种，选自但不限于水
龙骨属物种、线蕨属物种、铁角蕨属物种、耳蕨属物种、或对开蕨属物种的同源或基本上同
源的多核苷酸。

[0134] 编码IPD098多肽的多核苷酸也可以从IPD098多肽序列从头合成。多核苷酸基因的序列可以通过使用遗传密码从IPD098多肽序列中推导出来。计算机程序如
“BackTranslate”(GCGTM包，阿克莱瑞公司，圣迭戈市，加利福尼亚州)可用于将肽序列转换成编码所述肽的相应核苷酸序列。可用于获得相应核苷酸编码序列的IPD098多肽序列的实
例包括但不限于SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、和SEQ ID NO：117的IPD098多肽。此外，可以对本公开的合成的IPD098多核苷酸序列进行设计，使
其在植物中表达。

[0135] 在一些实施例中，编码IPD098多肽的核酸分子是具有在SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、或SEQ ID NO：94中所示序列的多核苷酸、及其变体、片段和互补序列。本文所用的“互补序列”是指与给定核酸序列充分互补的核酸序列，使得其可以与所述
给定核酸序列杂交从而形成稳定的双链体。本文所用的“多核苷酸序列变体”是指除遗传密
码的简并性之外编码相同多肽的核酸序列。

[0136] 在一些实施例中，编码IPD098多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。如本文所用的，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”或“非基因组多核苷酸”是指与天然或基因组核酸序列相比，具有核酸序列的一个或多个变化的核酸分子。在一些实施例中，天然或基
因组核酸分子的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列改变；用于在
植物中表达的核酸序列的优化；与天然或基因组序列相比，引入至少一个氨基酸取代、插
入、缺失和/或添加的核酸序列的改变；去除与所述基因组核酸序列相关的一个或多个内含
子；插入一个或多个异源内含子；缺失与所述基因组核酸序列相关的一个或多个上游或下
游调节区；插入一个或多个异源上游或下游调节区；缺失与所述基因组核酸序列相关的5′
和/或3′非翻译区；插入异源5′和/或3′非翻译区；和聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施例中，所述非基因组核酸分子是合成的核酸序列。在一些实施例中，所述非基因组核酸分子是
cDNA。

[0137] 在一些实施例中，编码IPD098多肽的核酸分子是具有如下核苷酸序列的非基因组多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：
88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、或SEQ ID NO：94的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、
60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性，其中IPD098多肽具有杀昆虫活性。

[0138] 在一些实施例中，所述核酸分子编码包含SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：117的氨基酸序列的IPD098多肽，相比于在SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：117的相应位置处的天然氨基酸，所述氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、
44、45、46、47、48或更多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

[0139] 还提供了编码转录和/或翻译产物的核酸分子，所述转录和/或翻译产物随后被剪接以最终产生功能性IPD098多肽。剪接可以在体外或体内完成，并且可以涉及顺式或反式
剪接。用于剪接的底物可以是多核苷酸(例如，RNA转录物)或多肽。多核苷酸的顺式剪接的
实例是去除插入到编码序列中的内含子并剪接两个侧翼外显子区域以产生IPD098多肽编
码序列。反式剪接的实例是通过将所述编码序列分离成两个或更多个片段来对多核苷酸进
行加密，所述片段可以单独转录并且然后被剪接以形成全长的杀有害生物编码序列。使用
可以引入到构建体中的剪接增强子序列可以促进多肽的顺式或反式剪接(美国专利号6,
365,377和6,531,316)。因此，在一些实施例中，所述多核苷酸不直接编码全长IPD098多肽，而是编码IPD098多肽的一个或多个片段。这些多核苷酸可用于通过涉及剪接的机制来表达
功能性IPD098多肽，其中剪接可以在多核苷酸(例如内含子/外显子)和/或多肽(例如内含
肽/外显肽)的水平上发生。这可以用于，例如，控制杀有害生物活性的表达，因为如果在允
许剪接过程以产生功能性产物的环境中表达所有必需的片段，则仅表达功能性杀有害生物
多肽。在另一个实例中，将一个或多个插入序列引入多核苷酸中可促进与低同源性多核苷
酸的重组；使用针对所述插入序列的内含子或内含肽便于去除所述间插序列，从而恢复经
编码的变体的功能。

[0140] 作为编码IPD098多肽的这些核酸序列的片段的核酸分子也涵盖在实施例中。如本文所用的“片段”是指编码IPD098多肽的核酸序列的一部分。核酸序列的片段可以编码
IPD098多肽的生物活性部分，或者它可以是可以使用下文公开的方法用作杂交探针或PCR
引物的片段。作为编码IPD098多肽的核酸序列的片段的核酸分子包含至少约150、180、210、
240、270、300、330或360个连续核苷酸或高至存在于编码本文公开的IPD098多肽的全长核
酸序列中的核苷酸数目，这取决于预期用途。本文所用的“连续核苷酸”是指彼此紧邻的核
苷酸残基。实施例的核酸序列的片段将编码保留IPD098多肽的生物活性并因此保留杀昆虫
活性的蛋白质片段。本文所用的“保留杀昆虫活性”是指具有全长IPD098Aa多肽(SEQ ID 
NO：102)的至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀昆虫活性的多肽。在一些实施例中，所述杀昆虫活性针对鳞翅目物种。在一个实施例中，所
述杀昆虫活性针对鞘翅目物种。

[0141] 在一些实施例中，所述IPD098多肽由与SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、或SEQ ID NO：94的核酸序列充分同源的核酸序列编码。本文所用的“充分同源”是指，使用标准参数、使用本文所述的比对程序之一，与参比序列相比，具有至少约50％、
55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸或核酸序列。本领域技术人员将认识到，可以通过考虑简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等来
适当地调整这些值以确定由两个核酸序列编码的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，
所述序列同源性针对编码IPD098多肽的多核苷酸的全长序列或针对IPD098多肽的全长序
列。

[0142] 在一些实施例中，所述核酸编码如下IPD098多肽：所述IPD098多肽与SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：
113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：117相比具有至少约
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0143] 在一些实施例中，使用ClustalW算法在Vector 程序套件(英杰公司，卡尔斯巴德市，加利福尼亚州)的 模块中在所有默认参数下计算所述序列同一性。在一
些实施例中，使用ClustalW算法在Vector NTI程序套件(英杰公司，卡尔斯巴德市，加利福
尼亚州)的ALIGNX模块中在所有默认参数下计算跨全长多肽的序列同一性。

[0144] 为了确定两种或更多种氨基酸序列或者两种或更多种核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的，将序列进行比对。两个序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同
位置的数量的函数(即，同一性百分比＝相同位置数/位置总数(例如，重叠位置×100)。

[0145] 在一个实施例中，两个序列具有相同的长度。在另一个实施例中，比较是在整个参比序列中进行(例如，在整个SEQ ID NO：102中)。可使用类似于下面所述的那些技术的技
术，在容许或不容许缺口的情况下确定两个序列之间的百分比同一性。在计算百分比同一
性中，典型地计数确切的匹配。

[0146] 用于比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是如下文献中所述算法：Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48(3)：443-453，使用GAP版本
10软件来确定序列同一性或相似性，使用以下默认参数：对于核酸序列的同一性％和相似
性％，使用GAP权重为50和长度权重为3，以及nwsgapdna.cmpii评分矩阵；对于氨基酸序列
的同一性％或相似性％，使用GAP权重为8和长度权重为2，以及BLOSUM62评分程序。也可采
用等效的程序。本文所用的“等效的程序”是指任何序列比较程序，所述程序对于任何两个
所讨论的序列产生一个比对，当与GAP版本10所产生的对应的比对相比较时，所述比对具有
相同的核苷酸残基配对以及相同的序列同一性百分比。

[0147] 在一些实施例中，所述IPD098多核苷酸编码包含与贯穿SEQ ID NO：102的氨基酸序列的整个长度具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的氨基酸序列的IPD098多肽。

[0148] 在一些实施例中，提供了编码嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多肽包含本公开的至少两种不同IPD098多肽的区域。

[0149] 在一些实施例中，提供了编码嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多肽包含选自如下的至少两种不同IPD098多肽的区域：SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：
110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、和SEQ ID NO：117。

[0150] 在一些实施例中，IPD098多核苷酸编码包含SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、和SEQ ID NO：117的氨基酸序列的IPD098多肽。

[0151] 编码IPD108多肽的多核苷酸

[0152] 编码IPD108多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源是蕨类植物或其他原始植物物种，所述蕨类植物或其他原始植物物种选自但不限于卷柏属物种、蹄盖蕨属物种、或球子
蕨属物种，这些物种含有分别编码SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、或SEQ ID NO：135的IPD108多肽的SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：
127、SEQ ID NO：128、或SEQ ID NO：129的IPD108多核苷酸。可以使用SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、或SEQ ID NO：129的多核苷酸以在重组细菌宿主(包括但不限于农杆菌、芽孢杆菌、埃希氏杆菌、沙门氏菌、假单胞菌和根瘤菌细菌宿主细胞)中表达IPD108多肽。所述多核苷酸还可用作用于分离编码IPD108多肽或相关蛋白的同
源或基本上同源的多核苷酸的探针。此类探针可用于鉴定源自蕨类植物或其他原始植物物
种，选自但不限于卷柏属物种、蹄盖蕨属物种、或球子蕨属物种的同源或基本上同源的多核
苷酸。

[0153] 编码IPD108多肽的多核苷酸也可以从IPD108多肽序列从头合成。多核苷酸基因的序列可以通过使用遗传密码从IPD108多肽序列中推导出来。计算机程序如
“BackTranslate”(GCGTM包，阿克莱瑞公司，圣迭戈市，加利福尼亚州)可用于将肽序列转换成编码所述肽的相应核苷酸序列。可用于获得相应核苷酸编码序列的IPD108多肽序列的实
例包括但不限于SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、和SEQ ID NO：135的IPD108多肽。此外，可以对本公开的合成的IPD108多核苷酸序列进行设计，使
其在植物中表达。

[0154] 在一些实施例中，编码IPD108多肽的核酸分子是具有在SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、或SEQ ID NO：129中所示序列的多核苷酸、及其变体、片段和互补序列。本文所用的“互补序列”是指与给定核酸序列充分互补的核酸序列，使得其可以与所述给定核酸序列杂交从而形成稳定的双链体。本文所用的“多核苷酸序列变
体”是指除遗传密码的简并性之外编码相同多肽的核酸序列。

[0155] 在一些实施例中，编码IPD108多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。如本文所用的，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”或“非基因组多核苷酸”是指与天然或基因组核酸序列相比，具有核酸序列的一个或多个变化的核酸分子。在一些实施例中，天然或基
因组核酸分子的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列改变；用于在
植物中表达的核酸序列的优化；与天然或基因组序列相比，引入至少一个氨基酸取代、插
入、缺失和/或添加的核酸序列的改变；去除与所述基因组核酸序列相关的一个或多个内含
子；插入一个或多个异源内含子；缺失与所述基因组核酸序列相关的一个或多个上游或下
游调节区；插入一个或多个异源上游或下游调节区；缺失与所述基因组核酸序列相关的5′
和/或3′非翻译区；插入异源5′和/或3′非翻译区；和聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施例中，所述非基因组核酸分子是合成的核酸序列。在一些实施例中，所述非基因组核酸分子是
cDNA。

[0156] 在一些实施例中，编码IPD108多肽的核酸分子是具有如下核苷酸序列的非基因组多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：
128、或SEQ ID NO：129的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、
58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性，其中IPD108多肽具有杀昆虫活性。

[0157] 在一些实施例中，所述核酸分子编码包含SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、和SEQ ID NO：135的氨基酸序列的IPD108多肽，相比于在SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、和SEQ ID NO：135的相应位置处的天然氨基酸，所述氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、
44、45、46、47、48或更多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

[0158] 还提供了编码转录和/或翻译产物的核酸分子，所述转录和/或翻译产物随后被剪接以最终产生功能性IPD108多肽。剪接可以在体外或体内完成，并且可以涉及顺式或反式
剪接。用于剪接的底物可以是多核苷酸(例如，RNA转录物)或多肽。多核苷酸的顺式剪接的
实例是去除插入到编码序列中的内含子并剪接两个侧翼外显子区域以产生IPD108多肽编
码序列。反式剪接的实例是通过将所述编码序列分离成两个或更多个片段来对多核苷酸进
行加密，所述片段可以单独转录并且然后被剪接以形成全长的杀有害生物编码序列。使用
可以引入到构建体中的剪接增强子序列可以促进多肽的顺式或反式剪接(美国专利号6,
365,377和6,531,316)。因此，在一些实施例中，所述多核苷酸不直接编码全长IPD108多肽，而是编码IPD108多肽的一个或多个片段。这些多核苷酸可用于通过涉及剪接的机制来表达
功能性IPD108多肽，其中剪接可以在多核苷酸(例如内含子/外显子)和/或多肽(例如内含
肽/外显肽)的水平上发生。这可以用于，例如，控制杀有害生物活性的表达，因为如果在允
许剪接过程以产生功能性产物的环境中表达所有必需的片段，则仅表达功能性杀有害生物
多肽。在另一个实例中，将一个或多个插入序列引入多核苷酸中可促进与低同源性多核苷
酸的重组；使用针对所述插入序列的内含子或内含肽便于去除所述间插序列，从而恢复经
编码的变体的功能。

[0159] 作为编码IPD108多肽的这些核酸序列的片段的核酸分子也涵盖在实施例中。如本文所用的“片段”是指编码IPD108多肽的核酸序列的一部分。核酸序列的片段可以编码
IPD108多肽的生物活性部分，或者它可以是可以使用下文公开的方法用作杂交探针或PCR
引物的片段。作为编码IPD108多肽的核酸序列的片段的核酸分子包含至少约150、180、210、
240、270、300、330或360个连续核苷酸或高至存在于编码本文公开的IPD108多肽的全长核
酸序列中的核苷酸数目，这取决于预期用途。本文所用的“连续核苷酸”是指彼此紧邻的核
苷酸残基。实施例的核酸序列的片段将编码保留IPD108多肽的生物活性并因此保留杀昆虫
活性的蛋白质片段。本文所用的“保留杀昆虫活性”是指具有全长IPD1 08Aa多肽(SEQ ID 
NO：131)的至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀昆虫活性的多肽。在一些实施例中，所述杀昆虫活性针对鳞翅目物种。在一个实施例中，所
述杀昆虫活性针对鞘翅目物种。

[0160] 在一些实施例中，所述IPD108多肽由与SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、或SEQ ID NO：129的核酸序列充分同源的核酸序列编码。本文所用的“充分同源”是指，使用标准参数、使用本文所述的比对程序之一，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸或核酸序列。本领域技术人员将认识到，可以通过考虑简并性、氨基酸相似性、阅读
框定位等来适当地调整这些值以确定由两个核酸序列编码的蛋白质的相应同源性。在一些
实施例中，所述序列同源性针对编码IPD108多肽的多核苷酸的全长序列或针对IPD108多肽
的全长序列。

[0161] 在一些实施例中，所述核酸编码如下IPD108多肽：所述IPD108多肽与SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、或SEQ ID NO：135相比具有至少约
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0162] 在一些实施例中，使用ClustaIW算法在Vector 程序套件(英杰公司，卡尔斯巴德市，加利福尼亚州)的 模块中在所有默认参数下计算所述序列同一性。在
一些实施例中，使用ClustalW算法在Vector NTI程序套件(英杰公司，卡尔斯巴德市，加利
福尼亚州)的ALIGNX模块中在所有默认参数下计算跨全长多肽的序列同一性。

[0163] 为了确定两种或更多种氨基酸序列或者两种或更多种核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的，将序列进行比对。两个序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同
位置的数量的函数(即，同一性百分比＝相同位置数/位置总数(例如，重叠位置×100)。

[0164] 在一个实施例中，两个序列具有相同的长度。在另一个实施例中，比较是在整个参比序列中进行(例如，在整个SEQ ID NO：131中)。可使用类似于下面所述的那些技术的技
术，在容许或不容许缺口的情况下确定两个序列之间的百分比同一性。在计算百分比同一
性中，典型地计数确切的匹配。

[0165] 用于比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是如下文献中所述算法：Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48(3)：443-453，使用GAP版本
10软件来确定序列同一性或相似性，使用以下默认参数：对于核酸序列的同一性％和相似
性％，使用GAP权重为50和长度权重为3，以及nwsgapdna.cmpii评分矩阵；对于氨基酸序列
的同一性％或相似性％，使用GAP权重为8和长度权重为2，以及BLOSUM62评分程序。也可采
用等效的程序。本文所用的“等效的程序”是指任何序列比较程序，所述程序对于任何两个
所讨论的序列产生一个比对，当与GAP版本10所产生的对应的比对相比较时，所述比对具有
相同的核苷酸残基配对以及相同的序列同一性百分比。

[0166] 在一些实施例中，所述IPD108多核苷酸编码包含与贯穿SEQ ID NO：131的氨基酸序列的整个长度具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的氨基酸序列的IPD108多肽。

[0167] 在一些实施例中，提供了编码嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多肽包含本公开的至少两种不同IPD108多肽的区域。

[0168] 在一些实施例中，提供了编码嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多肽包含选自如下的至少两种不同IPD108多肽的区域：SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、和SEQ ID NO：135。

[0169] 在一些实施例中，IPD108多核苷酸编码包含SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、或SEQ ID NO：135的氨基酸序列的IPD108多肽。

[0170] 编码IPD109多肽的多核苷酸

[0171] 编码IPD109多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源是蕨类植物或其他原始植物物种，所述蕨类植物或其他原始植物物种选自但不限于卷柏属物种，所述物种含有编码SEQ 
ID NO：138的IPD109多肽的SEQ ID NO：137的IPD109多核苷酸。可以使用SEQ ID NO：137的
多核苷酸以在重组细菌宿主(包括但不限于农杆菌、芽孢杆菌、埃希氏杆菌、沙门氏菌、假单胞菌和根瘤菌细菌宿主细胞)中表达IPD109多肽。所述多核苷酸还可用作用于分离编码
IPD109多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多核苷酸的探针。此类探针可用于鉴定源自
蕨类植物或其他原始植物物种，选自但不限于卷柏属物种的同源或基本上同源的多核苷
酸。

[0172] 编码IPD109多肽的多核苷酸也可以从IPD109多肽序列从头合成。多核苷酸基因的序列可以通过使用遗传密码从IPD109多肽序列中推导出来。计算机程序如
“BackTranslate”(GCGTM包，阿克莱瑞公司，圣迭戈市，加利福尼亚州)可用于将肽序列转换成编码所述肽的相应核苷酸序列。可用于获得相应核苷酸编码序列的IPD109多肽序列的实
例包括但不限于SEQ ID NO：137的IPD109多肽。此外，可以对本公开的合成的IPD109多核苷
酸序列进行设计，使其在植物中表达。

[0173] 在一些实施例中，编码IPD109多肽的核酸分子是具有在SEQ ID NO：137中所示序列的多核苷酸、及其变体、片段和互补序列。本文所用的“互补序列”是指与给定核酸序列充分互补的核酸序列，使得其可以与所述给定核酸序列杂交从而形成稳定的双链体。本文所
用的“多核苷酸序列变体”是指除遗传密码的简并性之外编码相同多肽的核酸序列。

[0174] 在一些实施例中，编码IPD109多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。如本文所用的，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”或“非基因组多核苷酸”是指与天然或基因组核酸序列相比，具有核酸序列的一个或多个变化的核酸分子。在一些实施例中，天然或基
因组核酸分子的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列改变；用于在
植物中表达的核酸序列的优化；与天然或基因组序列相比，引入至少一个氨基酸取代、插
入、缺失和/或添加的核酸序列的改变；去除与所述基因组核酸序列相关的一个或多个内含
子；插入一个或多个异源内含子；缺失与所述基因组核酸序列相关的一个或多个上游或下
游调节区；插入一个或多个异源上游或下游调节区；缺失与所述基因组核酸序列相关的5′
和/或3′非翻译区；插入异源5′和/或3′非翻译区；和聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施例中，所述非基因组核酸分子是合成的核酸序列。在一些实施例中，所述非基因组核酸分子是
cDNA。

[0175] 在一些实施例中，编码IPD109多肽的核酸分子是具有如下核苷酸序列的非基因组多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：137的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、
54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、
69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更大同一性，其中IPD109多肽具有杀昆虫活性。

[0176] 在一些实施例中，所述核酸分子编码包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的IPD109多肽，相比于在SEQ ID NO：138的相应位置处的天然氨基酸，所述氨基酸序列具有1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、
32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或更多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

[0177] 还提供了编码转录和/或翻译产物的核酸分子，所述转录和/或翻译产物随后被剪接以最终产生功能性IPD109多肽。剪接可以在体外或体内完成，并且可以涉及顺式或反式
剪接。用于剪接的底物可以是多核苷酸(例如，RNA转录物)或多肽。多核苷酸的顺式剪接的
实例是去除插入到编码序列中的内含子并剪接两个侧翼外显子区域以产生IPD109多肽编
码序列。反式剪接的实例是通过将所述编码序列分离成两个或更多个片段来对多核苷酸进
行加密，所述片段可以单独转录并且然后被剪接以形成全长的杀有害生物编码序列。使用
可以引入到构建体中的剪接增强子序列可以促进多肽的顺式或反式剪接(美国专利号6,
365,377和6,531,316)。因此，在一些实施例中，所述多核苷酸不直接编码全长IPD109多肽，而是编码IPD109多肽的一个或多个片段。这些多核苷酸可用于通过涉及剪接的机制来表达
功能性IPD109多肽，其中剪接可以在多核苷酸(例如内含子/外显子)和/或多肽(例如内含
肽/外显肽)的水平上发生。这可以用于，例如，控制杀有害生物活性的表达，因为如果在允
许剪接过程以产生功能性产物的环境中表达所有必需的片段，则仅表达功能性杀有害生物
多肽。在另一个实例中，将一个或多个插入序列引入多核苷酸中可促进与低同源性多核苷
酸的重组；使用针对所述插入序列的内含子或内含肽便于去除所述间插序列，从而恢复经
编码的变体的功能。

[0178] 作为编码IPD109多肽的这些核酸序列的片段的核酸分子也涵盖在实施例中。如本文所用的“片段”是指编码IPD109多肽的核酸序列的一部分。核酸序列的片段可以编码
IPD109多肽的生物活性部分，或者它可以是可以使用下文公开的方法用作杂交探针或PCR
引物的片段。作为编码IPD109多肽的核酸序列的片段的核酸分子包含至少约150、180、210、
240、270、300、330或360个连续核苷酸或高至存在于编码本文公开的IPD109多肽的全长核
酸序列中的核苷酸数目，这取决于预期用途。本文所用的“连续核苷酸”是指彼此紧邻的核
苷酸残基。实施例的核酸序列的片段将编码保留IPD109多肽的生物活性并因此保留杀昆虫
活性的蛋白质片段。本文所用的“保留杀昆虫活性”是指具有全长IPD109Aa多肽(SEQ ID 
NO：138)的至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀昆虫活性的多肽。在一些实施例中，所述杀昆虫活性针对鳞翅目物种。在一个实施例中，所
述杀昆虫活性针对鞘翅目物种。

[0179] 在一些实施例中，所述IPD109多肽由与SEQ ID NO：137的核酸序列充分同源的核酸序列编码。本文所用的“充分同源”是指，使用标准参数、使用本文所述的比对程序之一，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更大序列同源性的氨基酸或核酸序列。本领域技术人员将认识到，可以通过考虑简
并性、氨基酸相似性、阅读框定位等来适当地调整这些值以确定由两个核酸序列编码的蛋
白质的相应同源性。在一些实施例中，所述序列同源性针对编码IPD109多肽的多核苷酸的
全长序列或针对IPD109多肽的全长序列。

[0180] 在一些实施例中，所述核酸编码如下IPD109多肽：所述IPD109多肽与SEQ ID NO：138相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0181] 在一些实施例中，使用ClustalW算法在Vector 程序套件(英杰公司，卡尔斯巴德市，加利福尼亚州)的 模块中在所有默认参数下计算所述序列同一性。在一
些实施例中，使用ClustalW算法在Vector NTI程序套件(英杰公司，卡尔斯巴德市，加利福
尼亚州)的ALIGNX模块中在所有默认参数下计算跨全长多肽的序列同一性。

[0182] 为了确定两种或更多种氨基酸序列或者两种或更多种核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的，将序列进行比对。两个序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同
位置的数量的函数(即，同一性百分比＝相同位置数/位置总数(例如，重叠位置×100)。

[0183] 在另一个实施例中，比较是在整个参比序列中进行(例如，在整个SEQ ID NO：138中)。可使用类似于下面所述的那些技术的技术，在容许或不容许缺口的情况下确定两个序
列之间的百分比同一性。在计算百分比同一性中，典型地计数确切的匹配。

[0184] 用于比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是如下文献中所述算法：Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48(3)：443-453，使用GAP版本
10软件来确定序列同一性或相似性，使用以下默认参数：对于核酸序列的同一性％和相似
性％，使用GAP权重为50和长度权重为3，以及nwsgapdna.cmpii评分矩阵；对于氨基酸序列
的同一性％或相似性％，使用GAP权重为8和长度权重为2，以及BLOSUM62评分程序。也可采
用等效的程序。本文所用的“等效的程序”是指任何序列比较程序，所述程序对于任何两个
所讨论的序列产生一个比对，当与GAP版本10所产生的对应的比对相比较时，所述比对具有
相同的核苷酸残基配对以及相同的序列同一性百分比。

[0185] 在一些实施例中，所述IPD109多核苷酸编码包含与贯穿SEQ ID NO：138的氨基酸序列的整个长度具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的氨基酸序列的IPD109多肽。

[0186] 在一些实施例中，提供了编码嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多肽包含本公开的至少两种不同IPD109多肽的区域。

[0187] 在一些实施例中，IPD109多核苷酸编码包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的IPD109多肽。

[0188] 所述实施例还涵盖编码本公开的多肽的变体的核酸分子。编码核酸序列的本公开的多肽的“变体”包括编码本文公开的多肽但是由于遗传密码的简并性而存在保守差异的
那些序列以及如上所讨论的充分同一的那些序列。可以通过使用熟知的分子生物学技术鉴
定天然存在的等位基因变体，如聚合酶链式反应(PCR)和如下文概述的杂交技术。变体核酸
序列还包括合成来源的核酸序列，所述核酸序列例如通过使用定向诱变而产生，但是仍然
编码如下所讨论的所公开的多肽。

[0189] 技术人员将进一步理解，可以通过核苷酸序列的突变来引入变化，由此导致在所编码的本公开的多肽的氨基酸序列中的变化，而不改变所述蛋白质的生物活性。因此，变体
核酸分子可以通过以下方式产生：将一个或多个核苷酸取代、添加和/或缺失引入本文公开
的相应的核酸序列中，这样使得将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入所编码的蛋白
质中。通过标准技术可以引入突变，如定向诱变和PCR介导的诱变。此类变体核酸序列也被
本公开所涵盖。

[0190] 可替代地，可以通过沿编码序列的全部或部分随机引入突变(如通过饱和诱变)来制备变体核酸序列，并且可以筛选所得突变体赋予杀有害生物活性以鉴定保留活性的突变
体的能力。在诱变之后，所编码的蛋白质可以进行重组表达，并且所述蛋白质的活性可以使
用标准的测定技术来确定。

[0191] 本公开的多核苷酸及其片段任选用作各种重组和递归(recursive)重组反应的底物，除了例如Ausubel、Berger和Sambrook所述的标准克隆方法之外，即，以产生具有所需特性的另外的杀有害生物多肽同源物及其片段。各种这样的反应是已知的，包括由诸位发明
人及其同事开发的那些反应。用于生产本文列出的任何核酸的变体的方法(这些方法包括
将此类多核苷酸与第二(或更多)多核苷酸递归重组，从而形成变体多核苷酸文库)也是本
公开的实施例，所产生的文库、包含所述文库的细胞和通过此类方法产生的任何重组多核
苷酸也是如此。另外，此类方法任选地包括基于杀有害生物活性从此类文库中选择变体多
核苷酸，正如其中此类递归重组在体外或体内进行。

[0192] 各种多样性产生方案(包括核酸递归重组方案)是可获得的并且在本领域中被充分描述。所述程序可以单独和/或组合使用以产生核酸或核酸集合的一种或多种变体，以及
所编码蛋白质的变体。单独地或整体地，这些程序提供了产生多样化核酸和核酸集合(包括
例如核酸文库)的稳健且广泛适用的方式，所述方式可用于，例如，具有新的和/或改善的特
征的核酸、蛋白质、途径、细胞和/或生物体的工程化或快速进化。

[0193] 虽然为清除起见，在随后的讨论过程中作出了区分和分类，但是应当理解，所述技术通常不是相互排斥的。实际上，各种方法可以单独使用或组合、平行或串联使用，以便取
得不同的序列变体。

[0194] 本文所述的任何多样性产生程序的结果可以是一种或多种核酸的产生，其可以选择或筛选具有或赋予所需特性的核酸或编码具有或者赋予所需特性的蛋白质的核酸。通过
本文的或技术人员以其他方式可用的一种或多种方法进行多样化之后，可以针对所需的活
性或特性(例如，杀有害生物活性)或在所需的pH下的这种活性等选择所产生的任何核酸。
这可以包括通过本领域任何测定来鉴定可以例如以自动化或可自动化形式检测的任何活
性，参见例如以下的杀昆虫活性筛选的讨论。各种相关(或甚至不相关)的特性可以由执业
者酌情串联或平行评估。

[0195] 用于产生经修饰的核酸序列(例如编码具有杀有害生物活性的多肽或其片段的那些)的各种多样性产生程序的描述可以在以下出版物和其中引用的参考文献中找到：Soong
等人，(2000)Nat Genet[自然遗传学]25(4)：436-439；Stemmer等人，(1999)Tumor 
Targeting[肿瘤靶向]4：1-4；Ness等人，(1999)Nat Biotechnol[自然生物技术]17：893-
896；Chang等人，(1999)Nat Biotechnol[自然生物技术]17：793-797；Minshull和Stemmer，(1999)Curr Opin Chem Biol[生物化学当代观点]3：284-290；Christians等人，(1999)Nat Biotechnol[自然生物技术]17：259-264；Crameri等人，(1998)Nature[自然]391：288-291；
Crameri等人，(1997)Nat Biotechnol[自然生物技术]15：436-438；Zhang等人，(1997)PNAS USA[美国科学院院报]94：4504-4509；Patten等人，(1997)Curr Opin Biotechnol[生物技
术当代观点]8：724-733；Crameri等人，(1996)Nat Med[自然医学]2：100-103；Crameri等
人，(1996)Nat Biotechnol[自然生物技术]14：315-319；Gates等人，(1996)J Mol Biol[分子生物学杂志]255：373-386；Stemmer，(1996)“Sexual PCR and Assembly PCR[有性PCR和组装PCR]”在：The Encyclopedia of Molecular Biology.[分子生物学百科全书]VCH出版
商，纽约，第447-457页；Crameri和Stemmer，(1995)BioTechniques[生物技术]18：194-195；
Stemmer等人，(1995)Gene[基因]，164：49-53；Stemmer，(1995)Science[科学]270：1510；
Stemmer，(1995)Bio/Technology[生物/技术]13：549-553；Stemmer，(1994)Nature[自然]
370：389-391和Stemmer，(1994)PNAS USA[美国科学院院报]91：10747-10751。

[0196] 产生多样性的突变方法包括例如定向诱变(Ling等人，(1997)Anal Biochem[分析生物化学]254(2)：157-178；Dale等人，(1996)Methods Mol Biol[分子生物学方法]57：
369-374；Smith，(1985)Ann Rev Genet[遗传学年评]19：423-462；Botstein和Shortle，
(1985)Science[科学]229：1193-1201；Carter，(1986)Biochem J[生物化学杂志]237：1-7
和Kunkel，(1987)“The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis[寡核苷
酸定向诱变的效率]”，在：Nucleic Acids&Molecular Biology[核酸与分子生物学]
(Eckstein和Lilley编辑，Springer Verlag[施普林格出版公司]，柏林))；使用含尿嘧啶的
模板的诱变(Kunkel，(1985)PNAS USA[美国科学院院报]82：488-492；Kunkel等人，(1987)
Methods Enzymol[酶学方法]154：367-382以及Bass等人，(1988)Science[科学]242：240-
245)；寡核苷酸定向诱变(Zoller和Smith，(1983)Methods Enzymol[酶学方法]100：468-
500；Zoller和Smith，(1987)Methods Enzymol[酶学方法]154：329-350(1987)；Zoller和
Smith，(1982)Nucleic Acids Res[核酸研究]10：6487-6500)；经硫代磷酸修饰的DNA诱变
(Taylor等人，(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13：8749-8764；Taylor等人，(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13：8765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein，(1986)Nucl Acids Res
[核酸研究]14：9679-9698；Sayers等人，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16：791-802以
及Sayers等人，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16：803-814)；使用有缺口的双链体DNA
的诱变(Kramer等人，(1984)Nucl Acids Res[核酸研究]12：9441-9456；Kramer和Fritz，
(1987)Methods Enzymol[酶学方法]154：350-367；Kramer等人，(1988)Nucl Acids Res[核
酸研究]16：7207以及Fritz等人，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16：6987-6999)。其他
合适的方法包括点错配修复(Kramer等人，(1984)Cell[细胞]38：879-887)、使用有修复缺
陷的宿主菌株的诱变(Carter等人，(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13：4431-4443以及
Carter，(1987)Methods in Enzymol[酶学方法]154：382-403)、缺失诱变(Eghtedarzadeh
和Henikoff，(1986)Nucl Acids Res[核酸研究]14：5115)、限制性-选择和限制性-纯化
(Wells等人，(1986)Phil Trans R Soc Lond A[伦敦皇家学会哲学会刊系列A]317：415-
423)、通过全基因合成的诱变(Nambiar等人，(1984)Science[科学]223：1299-1301；
Sakamar和Khorana，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]14：6361-6372；Wells等人，(1985)
Gene[基因]34：315-323以及 等人，(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13：
3305-3316)、双链断裂修复(Mandecki，(1986)PNAS USA[美国科学院院报]，83：7177-7181
以及Arnold，(1993)Curr Opin Biotech[生物技术当代观点]4：450-455)。许多上述方法的
另外的细节可以在Methods Enzymol[酶学方法]第154卷中找到，其还描述了用各种诱变方
法进行故障问题解决的有用对照。

[0197] 关于各种多样性产生方法的另外的细节可以在以下美国专利、PCT公开物和申请和EPO公开物中找到：美国专利号5,723,323、美国专利号5,763,192、美国专利号5,814,
476、美国专利号5,817,483、美国专利号5,824,514、美国专利号5,976,862、美国专利号5,
605,793、美国专利号5,811,238、美国专利号5,830,721、美国专利号5,834,252、美国专利
号5,837,458、WO 1995/22625、WO 1996/33207、WO 1997/20078、WO 1997/35966、WO 1999/
41402、WO 1999/41383、WO 1999/41369、WO 1999/41368、EP 752008、EP 0932670、WO 1999/
23107、WO 1999/21979、WO 1998/31837、WO 1998/27230、WO 1998/27230、WO 2000/00632、WO 2000/09679、WO 1998/42832、WO 1999/29902、WO 1998/41653、WO 1998/41622、WO 
1998/42727、WO 2000/18906、WO 2000/04190、WO 2000/42561、WO 2000/42559、WO 2000/
42560、WO 2001/23401、和PCT/US01/06775。

[0198] 实施例的核苷酸序列也可用于从蕨类植物或其他原始植物分离相应的序列。以这种方式，可以使用如PCR、杂交等方法来鉴定此类序列(基于其与本文所示序列的序列同源
性)。实施例涵盖基于与本文所示全部序列或其片段的序列同一性选择的序列。此类序列包
括作为公开序列的直向同源物的序列。术语“直向同源物”是指源自共同祖先基因并且由于
物种形成而在不同物种中发现的基因。当其核苷酸序列和/或其编码的蛋白序列共有如本
文其他地方所定义的基本同一性时，在不同物种中发现的基因被认为是直向同源物。直向
同源物的功能通常在物种间是高度保守的。

[0199] 在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以从由任何目的生物体提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物以及PCR克隆的方法是本领域通
常已知的并且公开于Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分
子克隆：实验室手册](第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版
社]，Plainview[普莱恩维尤]，纽约)，以下为“Sambrook”中。还参见，Innis等人编辑，
(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications[PCR方案：方法和应用指
南](Academic Press[学术出版社]，纽约)；Innis和Gelfand编辑，(1995)PCR Strategies
[PCR策略](Academic Press[学术出版社]，纽约)；和Innis和Gelfand编辑，(1999)PCR 
Methods Manual[PCR方法手册](Academic Press[学术出版社]，纽约)。已知的PCR方法包
括但不限于：使用成对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

[0200] 为了从蕨类植物或其他原始植物中鉴定潜在的杀昆虫多肽，可以使用蛋白质印迹法和/或ELISA方法，用针对本公开的多肽产生的抗体筛选所述蕨类植物或其他原始植物细
胞裂解物。这种类型的测定能以高通量方式进行。可以通过各种技术(如基于抗体的蛋白质
纯化和鉴定)进一步分析阳性样品。产生抗体的方法是本领域熟知的，如下文所讨论。

[0201] 可替代地，基于质谱的蛋白质鉴定方法可以使用文献中的方案用于鉴定本公开的多肽的同源物(Scott Patterson，(1998)，10.22，1-24，由约翰威利父子出版公司(John 
Wiley&Son Inc)出版的Current Protocol in Molecular Biology[当前分子生物学方
案])。具体来说，使用基于LC-MS/MS的蛋白质鉴定方法将给定细胞裂解物或所需分子量富
集样品(从相关分子量带的SDS-PAGE凝胶切除的)的MS数据与本公开的多肽及其同源物的
序列信息结合。肽序列中的任何匹配表明在样品中具有同源蛋白的可能性。可以使用另外
技术(蛋白质纯化和分子生物学)来分离蛋白质并鉴定同源物的序列。

[0202] 在杂交方法中，全部或部分杀有害生物核酸序列可用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建此类cDNA和基因组文库的方法是本领域通常已知的，并且公开于Sambrook和
Russell，(2001)，同上。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用一个可检测基团(如32P或任何其他可检测的标记，如其他放射性同
位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)进行标记。用于杂交的探针可以通过标记基于本文公开
的编码多肽的核酸序列的合成的寡核苷酸来制备。可以另外使用简并引物，所述简并引物
是基于在所述核酸序列或所编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基而设计的。所
述探针典型地包含以下核酸序列的区域，所述核酸序列区域在严格条件下与编码本公开的
IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的核酸序列或其片段或变体的至少约12个、至少约25
个、至少约50、75、100、125、150、175或200个连续核苷酸进行杂交。用于制备用于杂交的探针的方法是本领域通常已知的，并且公开于Sambrook和Russell，(2001)，同上，其通过引用并入本文。

[0203] 例如，编码本文公开的多肽的完整核酸序列或其一个或多个部分可以用作能够与编码本公开的多肽序列和信使RNA的相应核酸序列特异性杂交的探针。为了实现在不同的
条件下的特异性杂交，此类探针包括以下序列，所述序列是独特的并且长度优选为至少约
10个核苷酸、或长度为至少约20个核苷酸。此类探针可以用于通过PCR对来自所选生物体的
相应杀有害生物序列进行扩增。可以使用这种技术从所需的生物体中分离另外的编码序
列，或作为用于确定生物体中存在编码序列的诊断测定。杂交技术包括铺板的DNA文库的杂
交筛选(斑块或集落；参见，例如，Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港
实验室出版社])，Cold Spring Harbor[冷泉港]，N.Y.[纽约])。

[0204] 此类序列的杂交可以在严格条件下进行。本文所用的“严格条件”或“严格杂交条件”是指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，比
背景高至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将有所不同。通过控
制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探测)。可
替代地，可以调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源
探测)。通常，探针的长度为小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。

[0205] 组合物

[0206] 还包括包含至少一种本公开的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽或者IPD059、IPD098、IPD108或IPD109嵌合多肽的组合物。在一些实施例中，所述组合物包含含有至少一
种本公开的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽和农业运载体。

[0207] 抗体

[0208] 还涵盖了针对实施例的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽或其变体或片段的抗体。本公开的抗体包括保留其结合昆虫肠道中发现的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多
肽的能力的多克隆和单克隆抗体及其片段。据信抗体、单克隆抗体或其片段能够与分子结
合，前提是所述抗体、单克隆抗体或其片段能够与所述分子特异性反应，从而将所述分子与
抗体、单克隆抗体或其片段结合。术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)意在包括能够结合半抗原的完整分子及其片段或结合区域或结构域(例如，像Fab和F(ab).sub.2片段)。此类
片段典型地通过蛋白水解切割(如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)产生。可替代地，可以通过应用
重组DNA技术或通过合成化学来产生半抗原结合片段。制备本公开的抗体的方法是本领域
通常已知的。例如，参见Antibodies，A Laboratory Manual[抗体，实验室手册]，Ed Harlow和David Lane(编辑)Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室]，N.Y.[纽约]
(1988)，以及其中引用的参考文献。阐述免疫学的一般原则的标准参考文献包括：Klein，
J.Immunology：The Science of Cell-Noncell Discrimination[免疫学杂志：细胞-非细
胞鉴别科学]，约翰威利父子公司，纽约(1982)；Dennett等人，Monoclonal Antibodies，
Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses[单克隆抗体，杂交瘤：生物分析的
新维度]，Plenum Press[普莱纽姆出版社]，纽约(1980)以及Campbell，″Monoclonal 
Antibody Technology[单克隆抗体技术]，″在Laboratory Techniques in Biochemistry 
and Molecular Biology[生物化学与分子生物学实验室技术]，第13卷，Burdon等人，(编
辑)，Elsevier[爱思唯尔出版社]，Amsterdam[阿姆斯特丹](1984)。还参见，美国专利号4,
196,265；4,609,893；4,713,325；4,714,681；4,716,111；4,716,117和4,720,459。针对
IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽或其抗原结合部分的抗体可以通过多种技术产生，所
述技术包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，(1975)Nature[自然]256：495
中所述的标准体细胞杂交技术。还可以使用产生单克隆抗体的其他技术，如B淋巴细胞的病
毒或致癌性转化。用于制备杂交瘤的动物系统是小鼠系统。分离用于融合的免疫的脾细胞
的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，小鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是
已知的。本公开的抗体和单克隆抗体可以通过利用IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽作
为抗原来制备。

[0209] 提供了用于检测样品中IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的存在或检测编码IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的核苷酸序列的存在的试剂盒。在一个实施例中，所
述试剂盒提供了用于检测组织样品中IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的存在的基于
抗体的试剂。在另一个实施例中，所述试剂盒提供了用于检测编码IPD059、IPD098、IPD108
或IPD109多肽的一种或多种多核苷酸的存在的标记的核酸探针。将所述试剂盒与用于进行
检测方法的适当的试剂和对照物，以及试剂盒的使用说明书一起提供。

[0210] 受体鉴定和分离

[0211] 还涵盖了针对实施例的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽或其变体或片段的受体。用于鉴定受体的方法是本领域熟知的(参见，Hofmann等人，(1988)Eur.J.Biochem.
[欧洲生物化学杂志]173：85-91；Gill等人，(1995)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]27277-
27282)可以使用来自易感昆虫的刷状缘膜囊泡来鉴定和分离识别IPD059、IPD098、IPD108
或IPD109多肽的受体。除了引用文献中列出的放射性标记方法之外，可以将IPD059、
IPD098、IPD108或IPD109多肽用荧光染料和其他常见标记如链霉亲和素进行标记。可以根
据参考丈献中列出的方案制备易感昆虫(如大豆夜蛾和椿象)的刷状缘膜囊泡(BBMV)，并在
SDS-PAGE凝胶上分离，并在合适的膜上印迹。标记的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽
可以与BBMV的印迹膜一起孵育，并且标记的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽可以用标
记的报告基因鉴定。与IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽相互作用的一个或多个蛋白质
条带的鉴定可以通过基于N-末端氨基酸气相测序或基于质谱的蛋白质鉴定方法进行检测
(Patterson，(1998)10.22，1-24，由约翰威利父子出版公司出版的Current Protocol in 
Molecular Biology[当前分子生物学方案])。一旦鉴定出蛋白质，可以从易感昆虫的基因
组DNA或cDNA文库中克隆相应的基因，并且可以直接用IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多
肽测量结合亲和力。通过IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的杀昆虫活性的受体功能可
以通过RNAi型的基因敲除法完成验证(Rajagopal等人，(2002)J.Biol.Chem.[生物化学杂
志]，277：46849-46851)。

[0212] 核苷酸构建体、表达盒和载体

[0213] 本文使用术语“核苷酸构建体”并不旨在将实施例限制为包含DNA的核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到，核苷酸构建体，特别是由核糖核苷酸构成的多核苷酸和
寡核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合也可用于本文公开的方法中。实施例的
核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外涵盖这种构建体、分子和序列的所有互补形式。此
外，实施例的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列涵盖能用于实施例的转化植物方法
的所有核苷酸构建体、分子和序列，包括但不限于由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其组合
所构成的那些。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类
似物。实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还涵盖核苷酸构建体的所有形式，所述形
式包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。

[0214] 另外的实施例涉及经转化的生物体，如选自以下的生物体：植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻的生物体。经转化的生物体包含：实施例的DNA分子、含有DNA分子的表达盒或含有表达盒的载体，它可以稳定地并入经转化的生物体的基因
组。

[0215] 在DNA构建体中提供实施例的序列，用于在目的生物体中表达。所述构建体将包括可操作地连接到实施例的序列的5′和3′的调节序列。如本文所用的，术语“可操作地连接”是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动并介导相应于第二序列的
DNA序列的转录。通常，可操作地连接意味着所连接的核酸序列是连续的，并且在必要时在
相同阅读框中连接两个蛋白质编码区域。所述构建体可以另外含有待共转化进生物体的至
少一个另外的基因。可替代地，可以在多个DNA构建体上提供一个或多个另外的基因。

[0216] 提供的这种DNA构建体具有用于插入本公开的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽基因序列以使其处于调节区的转录调节下的多个限制性位点。DNA构建体可以另外包含
选择性标记基因。

[0217] 按5′到3′的转录方向，DNA构建体将通常包括：转录和翻译起始区域(即，启动子)、实施例的DNA序列以及在用作宿主的生物体内具有功能的转录和翻译终止区域(即，终止区)。针对实施例的宿主生物体和/或序列，转录起始区(即，启动子)可以是天然的、类似的、外源的或异源的。此外，所述启动子可以是天然序列，或可替代地，是合成序列。如本文所用的，术语“外源”表示在引入启动子的天然生物体中没有发现启动子。在启动子对于实施例
的序列而言是“外源的”或“异源的”情况下，它是指所述启动子对于实施例的可操作地连接的序列而言不是天然的或天然存在的启动子。如本文所用的，嵌合基因包含与转录起始区
可操作地连接的编码序列，所述转录起始区对于所述编码序列是异源的。当所述启动子是
天然(native或natural)序列时，可操作地连接的序列的表达从野生型表达变化，这导致表
型的改变。

[0218] 在一些实施例中，所述DNA构建体包含编码实施例的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的多核苷酸。

[0219] 在一些实施例中，所述DNA构建体包含：多核苷酸，其编码与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、或SEQ ID NO：78具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的IPD059多肽；和异源调节元件。

[0220] 在一些实施例中，所述DNA构建体包含：多核苷酸，其编码与SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：
108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：
119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：12l、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO 123、或SEQ ID NO：124具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、
64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、
79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的IPD098多肽；和异源调节元件。

[0221] 在一些实施例中，所述DNA构建体包含：多核苷酸，其编码与SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：
108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：117具有至少50％、51％、52％、
53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更大序列同一性的IPD098多肽；和异源调节元件。

[0222] 在一些实施例中，所述DNA构建体包含：多核苷酸，其编码与SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、或SEQ ID NO：136具有至少
50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的IPD108多肽；和异源调节元件。

[0223] 在一些实施例中，所述DNA构建体包含：多核苷酸，其编码与SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、或SEQ ID NO：135具有至少50％、51％、52％、
53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更大序列同一性的IPD108多肽；和异源调节元件。

[0224] 在一些实施例中，所述DNA构建体包含：多核苷酸，其编码与SEQ ID NO：138具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的IPD109多肽；和异源调节元件。

[0225] 在一些实施例中，所述DNA构建体包含编码实施例的嵌合IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的多核苷酸。

[0226] 在一些实施例中，所述DNA构建体包含编码含有实施例的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的融合蛋白的多核苷酸。

[0227] 在一些实施例中，所述DNA构建体包含：多核苷酸，其编码与SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、或SEQ ID NO：124具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、
62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的多肽；和异源调节元件。

[0228] 在一些实施例中，所述DNA构建体包含：多核苷酸，其编码与SEQ ID NO：136具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的多肽；和异源调节元件。

[0229] 在一些实施例中，所述DNA构建体包含：多核苷酸，其编码与SEQ ID NO：136具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的多肽；和异源调节元件。

[0230] 在一些实施例中，所述DNA构建体还可以包括转录增强子序列。如本文所用的，术语“增强子”是指可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是插入以增强启动子的水平或
组织特异性的启动子的先天元件或异源元件。各种增强子是本领域已知的，包括例如，在植
物中具有基因表达增强特性的内含子(美国专利申请公开号2009/0144863)、泛素内含子
(即，玉蜀黍泛素内含子1(参见，例如，NCBI序列S94464))、ω增强子或ω主要增强子
(Gallie等人，(1989)Molecular Biology of RNA[RNA的分子生物学]，编辑：Cech(Liss公
司，纽约)237-256和Gallie等人，(1987)Gene[基因]60：217-25)、CaMV 35S增强子(参见，例如，Benfey等人，(1990)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]9：1685-96)和也可以使用的美
国专利号7,803,992的增强子，其中每一个通过引用并入。以上转录增强子的列表并不意指
是限制性的。任何适当转录增强子都可用于实施例中。

[0231] 终止区对于转录起始区可以是天然的，对于可操作地连接的目的DNA序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可以源自另一种来源(即，对于启动子、目的序
列、植物宿主、或其任何组合而言是外源的或异源的)。

[0232] 方便的终止区可获自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见，Guerineau等人，(1991)Mol Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传
学]262：141-144；Proudfoot，(1991)Cell[细胞]64：671-674；Sanfacon等人，(1991)Genes Dev.[基因与发育]5：141-149；Mogen等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]2：1261-1272；
Munroe等人，(1990)Gene[基因]91：151-158；Ballas等人，(1989)Nucleic Acids Res.[核
酸研究]17：7891-7903以及Joshi等人，(1987)Nucleic Acid Res.[核酸研究]15：9627-
9639。

[0233] 适当时可以优化核酸以增加在宿主生物体中的表达。因此，在宿主生物体是植物的情况下，合成核酸可以使用植物偏好性密码子来合成以改善表达。有关宿主偏好性使用
的讨论，参见，例如Campbell和Gowri，(1990)Plant Physiol.[植物生理学]92：1-11。例如，虽然实施例的核酸序列在单子叶和双子叶植物物种中均可以表达，但是可以修饰序列，以
考虑单子叶或双子叶植物的特定偏好和GC含量偏好，因为这些偏好已经表现出了差异
(Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498)。因而，特定氨基酸的玉
蜀黍偏好性可以源自玉蜀黍的已知基因序列。来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍使用在
Murray等人(同上)的表4中列出。本领域中可获得用于合成植物偏好性基因的方法。参见，
例如，Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498，和Liu H等人Mol 
Bio Rep[分子生物学报告]37：677-684，2010，其通过引用并入本文。玉蜀黍(Zea maize)使用表也可以在kazusa.or.jp//cgi-bin/show.cgi？species＝4577上找到，所述网址可以使
用www前缀进行访问。大豆使用表可以在kazusa.or.jp//cgi-bin/show.cgi？species＝
3847&aa＝1&style＝N上找到，所述网址可以使用www前缀进行访问。

[0234] 在一些实施例中，编码IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的重组核酸分子具有玉蜀黍优化的密码子。

[0235] 已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号的序列、编码外显子-内含子剪接位点信号的序列、编码转座子样重
复序列的序列和得到充分表征的、可能不利于基因表达的其他序列。可以将序列的GC含量
调整至给定细胞宿主的平均水平，如通过参考在所述宿主细胞中表达的已知基因而计算
的。如本文所用的，术语“宿主细胞”是指包含载体并支持表达载体的复制和/或表达的细
胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖类或哺乳动物细
胞、或单子叶或双子叶植物细胞。单子叶宿主细胞的实例是玉蜀黍宿主细胞。当可能时，修
饰序列以避免出现可预见的发夹二级mRNA结构。

[0236] 表达盒可以另外包含5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列在本领域是已知的，并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑
心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院
报]，86：6126-6130)；马铃薯Y病毒属前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人，(1995)Gene[基因]165(2)：233-238)、MDMV前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)、人免疫球
蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人，(1991)Nature[自然]353：90-94)；来自苜蓿花叶病
毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling等人，(1987)Nature[自然]
325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人，(1989)Molecular Biology of 
RNA[RNA的分子生物学]，Cech编著(利斯公司，纽约)，第237-256页)和玉米褪绿斑驳病毒
(maize chlorotic mottle)前导序列(MCMV)(Lommel，等人，(1991)Virology[病毒学]81：
382-385)。还参见，Della-Cioppa等人，(1987)Plant Physiol.[植物生理学]84：965-968。
此类构建体还可以包含“信号序列”或“前导序列”，以促进所述肽的共翻译成或翻译后运输至某些细胞内结构，如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体。

[0237] 如本文所用的，“信号序列”是指已知或怀疑导致跨细胞膜的共翻译或翻译后肽运输的序列。在真核生物中，这典型地涉及分泌到高尔基体内，伴随某些产生的糖基化。通常
将细菌的杀昆虫毒素合成为原毒素，所述原毒素在所述靶标有害生物的肠中被蛋白水解激
活(Chang，(1987)Methods Enzymol.[酶学方法]153：507-516)。在一些实施例中，所述信号序列位于所述天然的序列中，或可以源自实施例的序列。如本文所用的，术语“前导序列”是指当翻译时产生足以引发肽链与亚细胞器的共翻译转运的氨基酸序列的任何序列。因此，
这包括通过进入内质网内、进入液泡、质体(包括叶绿体、线粒体)等中来对运输和/或糖基
化进行靶向的前导序列。靶向叶绿体类囊体腔室的核编码蛋白具有由基质靶向信号肽和腔
靶向信号肽组成的特征二分型转运肽。基质靶向信息位于转运肽的氨基-近端部分。腔靶向
信号肽位于转运肽的羧基近端部分，并且包含用于靶向腔的所有信息。高等植物叶绿体蛋
白质组学的最新研究已在鉴定许多核编码的腔蛋白质中取得了进展(Kieselbach等人FEBS 
LETT[欧洲生化学会联盟通讯]480：271-276，2000；Peltier等人.Plant Cell[植物细胞]
12：319-341，2000；Bricker等人.Biochim.Biophys Acta[生物化学与生物物理学学报]
1503：350-356，2001)，根据本公开可能使用所述核编码的腔蛋白质的腔靶向信号肽。
Kieselbach等人，Photosynthesis Research[光合作用研究]78：249-264，2003报道了来自
拟南芥属(Arabidopsis)约80种蛋白质以及来自菠菜和豌豆的同源蛋白。特别地，此公开物
的表2(其通过引用并入本说明书中)公开了通过其登录号鉴定的来自叶绿体腔的85种蛋白
质(还参见美国专利申请公开2009/09044298)。另外，最近公开的水稻基因组草拟版本
(Goff等人，Science[科学]296：92-100，2002)是可以根据本公开使用的用于腔靶向信号肽
的合适来源。

[0238] 本领域技术人员熟知的合适的叶绿体转运肽(CTP)还包含嵌合CT，这些嵌合CT包括但不限于：来自以下的CTP的N-末端结构域、中心结构域或C-末端结构域：稻1-脱氧-D木
酮糖-5-磷酸合酶、稻-超氧化物歧化酶、稻-可溶性淀粉合酶、稻-NADP-依赖性苹果酸酶、
稻-磷酸2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶2、稻-L-抗坏血酸过氧化物酶5、稻-磷酸葡聚糖水二激
酶、玉米ssRUBISCO、玉米-β-葡糖苷酶、玉米-苹果酸脱氢酶、玉米硫氧还蛋白M-型(美国专利申请公开2012/0304336)。

[0239] 可以针对在叶绿体中的表达来优化待靶向叶绿体的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽基因，以解决植物核与此细胞器之间的使用差异。以此方式，可以使用叶绿体偏
好性序列合成目的核酸。

[0240] 在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以提供处于适当方向以及合适时，处于适当阅读框中的DNA序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或可以涉
及其他操作以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为此目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。

[0241] 许多启动子可用于实施所述实施例。可基于所需结果，选择启动子。核酸可与组成型、组织偏好性、诱导型或其他启动子组合用于在宿主生物体中的表达。用于植物宿主细胞
中的合适的组成型启动子包括，例如Rsyn7启动子的核心启动子和其他在WO 1999/43838和
美国专利号6,072,050中公开的组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)
Nature[自然]313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]
2：163-171)；泛素(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]12：619-
632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18：675-689)；pEMU
(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81：581-588)；MAS(Velten等
人，(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,
659,026)等。其他组成型启动子包括例如以下美国专利号中所讨论的那些：5,608,149；5,
608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,
611。

[0242] 根据所需结果，从诱导型启动子表达基因可能是有益的。用于调节实施例的核苷酸序列在植物中表达的特别引人关注的是伤口诱导型启动子。这种伤口诱导型启动子可以
对由昆虫取食引起的损害作出反应，并且包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan，
(1990)Ann.Rev.Phytopath.[植物病理学年鉴]28：425-449；Duan等人，(1996)Nature 
Biotechnology[自然生物技术]14：494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和
win2(Stanford等人，(1989)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]215：200-208)；系
统素(McGurl等人，(1992)Science[科学]225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier等人，(1993)
Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]22：783-792；Eckelkamp等人，(1993)FEBS Letters[欧
洲生化学会联盟通讯]323：73-76)；MPI基因(Corderok等人，(1994)Plant J.[植物杂志]6
(2)：141-150)等，以上文献通过引用并入本文。

[0243] 此外，可以在实施例的方法和核苷酸构建体中使用病原体诱导型启动子。这种病原体诱导型启动子包括来自发病相关蛋白(PR蛋白)的那些，其在病原体感染后被诱导；例
如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如Redolfi等人，(1983)
Neth.J.Plant Pathol.[荷兰植物病理学杂志]89：245-254；Uknes等人，(1992)Plant Cell
[植物细胞]4：645-656和Van Loon，(1985)Plant Mol.Virol.[植物分子病毒学]4：111-
116。还参见，WO 1999/43819，其通过引用并入本文。

[0244] 引人关注的是在病原体感染部位处或附近局部表达的启动子。参见，例如Marineau等人，(1987)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]9：335-342；Matton等人，(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions[分子植物-微生物相互作用]2：325-331；
Somsisch等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83：2427-2430；
Somsisch等人，(1988)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]2：93-98以及Yang，
(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]93：14972-14977。还参见Chen等人，
(1996)Plant J.[植物杂志]10：955-966；Zhang等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美
国科学院院报]91：2507-2511；Warner等人，(1993)Plant J.[植物杂志]3：191-201；
Siebertz等人，(1989)Plant Cell[植物细胞]1：961-968；美国专利号5,750,386(线虫诱导
型)及其中引用的参考文献。特别引人关注的是玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子，其表达是
由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导的(参见，例如Cordera等人，(1992)
Physiol.Mol.Plant Path.[生理学与分子植物病理学]41：189-200)。

[0245] 可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节剂来调节植物中的基因表达。取决于目标，所述启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学品来诱导基因表达，
或化学抑制型启动子，其中施用化学品来抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知
的，并且包括但不限于由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉蜀黍In2-2启动子、由用作萌前除
草剂的疏水亲电子化合物激活的玉蜀黍GST启动子、以及由水杨酸激活的烟草PR-1a启动
子。其他目的化学调节型启动子包括类固醇应答启动子(参见，例如，Schena等人，(1991)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88：10421-10425和McNellis等人，(1998)
Plant J.[植物杂志]14(2)：247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型和
四环素抑制型启动子(参见，例如，Gatz等人，(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和基因组
学]227：229-237，以及美国专利号5,814,618和5,789,156)，其通过引用并入本文。

[0246] 组织偏好性启动子可以用于靶向特定植物组织内的增强的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽表达。组织偏好性启动子包括描述于以下文献中的那些：Yamamoto等
人，(1997)Plant J.[植物杂志]12(2)：255-265；Kawamata等人，(1997)Plant Cell 
Physiol.[植物细胞生理学]38(7)：792-803；Hansen等人，(1997)Mol.Gen Genet.[分子和
普通遗传学]254(3)：337-343；Russell等人，(1997)Transgenic Res.[转基因研究]6(2)：
157-168；Rinehart等人，(1996)Plant Physiol[植物生理学]112(3)：133l-1341；Van Camp等人，(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2)：525-535；Canevascini等人，(1996)
Plant Physiol.[植物生理学]112(2)：513-524；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell 
Physiol[植物细胞生理学]35(5)：773-778；Lam，(1994)Results Probl.Cell Differ.[细
胞分化的结果和问题]20：181-196；Orozco等人，(1993)Plant Mol Biol.[植物分子生物
学]23(6)：1129-1138；Matsuoka等人，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]
90(20)：9586-9590和Guevara-Garcia等人，(1993)Plant J.[植物杂志]4(3)：495-505。必
要的话，此类启动子可经修饰用于弱表达。

[0247] 叶偏好性启动子是本领域已知的。参见，例如，Yamamoto等人，(1997)Plant J.[植物杂志]12(2)：255-265；Kwon等人，(1994)Plant Physiol.[植物生理学]105：357-67；
Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol[植物细胞生理学]35(5)：773-778；Gotor等人，(1993)Plant J.[植物杂志]3：509-18；Orozco等人，(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生
物学]23(6)：1129-1138以及Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院
院报]90(20)：9586-9590。

[0248] 根偏好性或根特异性的启动子是已知的，并且可以从来自文献中的许多可获得的启动子来选择，或者从不同相容物种重新分离。参见，例如Hire等人，(1992)Plant 
Mol.Biol.[植物分子生物学]20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller
和Baumgartner，(1991)Plant Cell[植物细胞]3(10)：1051-1061(法国菜豆的GRP 1.8基因
中的根特异性控制元件)；Sanger等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]14(3)：
433-443(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露聚糖合成酶(MAS)基因的根特
异性启动子)以及Miao等人，(1991)Plant Cell[植物细胞]3(1)：11-22(编码细胞溶质谷氨
酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还参见，Bogusz等人，
(1990)Plant Cell[植物细胞]2(7)：633-641，其中描述了从来自固氮的非豆科植物榆科山
黄麻(Parasponia andersonii)以及相关的非固氮的非豆科植物山黄麻(Trema 
tomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。这些基因的启动子与β-葡糖醛酸
糖苷酶报告基因连接，并且被引入非豆科作物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科作物百脉
根(Lotus corniculatus)两者中，并且在两种情况下都保留了根特异性启动子活性。Leach
和Aoyagi，(1991)描述了他们对发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高表达的rolC
和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见，Plant Science[植物科学](Limerick[利默里
克])79(1)：69-76)。他们得出结论，增强子和组织偏好性DNA决定簇在所述启动子中是解离
的。Teeri等人，(1989)使用与lacZ的基因融合以显示编码章鱼碱合酶的农杆菌属T-DNA基
因尤其是在根尖的表皮中有活性，并且TR2′基因在完整植物中具有根特异性并且被叶组织
中的创伤刺激，这是与杀昆虫的或杀幼虫的基因一起使用的尤其希望的特征组合(参见，
EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合
的TR1′基因显示相似的特征。另外的根偏好性启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster
等人，(1995)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]29(4)：759-772)；和rolB启动子(Capana
等人，(1994)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]25(4)：681-691)。还参见，美国专利号5,
837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。在US 
20130117883中公开了拟南芥(Arabidopsis thaliana)根偏好性调节序列。

[0249] “种子偏好性”启动子包括种子特异性启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子如种子贮藏蛋白的启动子)以及种子发芽性启动子(在种子发芽期间有活性的那些启动
子)。参见，Thompson等人，(1989)BioEssays[生物测定]10：108，其通过引用并入本文。此类种子偏好性启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米
醇溶蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见，美国专利号6,225,529，其通过引用并入本
文)。γ-玉米醇溶蛋白和Glb-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子
包括但不限于：库尼兹(Kunitz)胰蛋白酶抑制剂3(KTi3)(Jofuku和Goldberg，(1989)Plant 
Cell[植物细胞]1：1079-1093)、豆-β菜豆素、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白1、大豆凝集素、十字花科蛋白等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍
15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、蜡质、收缩素1、收缩素2、球蛋白1等。还参见WO 2000/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种
子偏好性启动子；通过引用并入本文。在双子叶植物中，种子特异性启动子包括但不限于：
来自拟南芥属的种皮启动子，pBAN；和来自拟南芥属的早期种子启动子，p26、p63、和p63tr(美国专利号7,294,760和7,847,153)。在特定组织中具有“偏好性”表达的启动子在所述组
织中比在至少一种其他植物组织中以更高程度表达。一些组织偏好性启动子几乎专门在特
定组织中表达。

[0250] 当需要低水平表达时，可使用弱启动子。通常，如本文所用的术语“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。低水平表达旨在约1/1000转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物之间的水平。可替代地，应当认识到，术语“弱启动子”还涵盖仅在少数细胞中驱动表达但不在其他细胞中表达，从而具有低水平总表达的启动子。当启
动子以不可接受的高水平驱动表达时，可以删除或修饰部分启动子序列以降低表达水平。

[0251] 此类弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO1999/43838和美国专利号6,072,050)、核心35S CaMV启动子等。其他组成型启动子包括例如以下专利文献中
所公开的那些：美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,
399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611，通过引用并入本文。

[0252] 以上启动子的列表并不意指是限制性的。任何适当的启动子都可用于实施例中。

[0253] 通常，表达盒将包含选择性标记基因，用于选择经转化的细胞。利用选择性标记基因来选择经转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷
酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草剂化合物(如草胺磷、溴
草腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D))抗性的基因。合适的选择性标记基因的其他
实例包括但不限于编码对如下的耐受性的基因：氯霉素(Herrera Estrella等人，(1983)
EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]2：987-992)；甲氨蝶呤(Herrera Estrella等人，
(1983)Nature[自然]303：209-213和Meijer等人，(1991)Plant Mol.Biol.[植物分子生物
学]16：807-820)；链霉素(Jones等人，(1987)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]
210：86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人，(1996)Transgenic Res.[转基因研究]5：
131-137)；博来霉素(Hille等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]7：171-176)；
磺酰胺类(Guerineau等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]15：127-136)；溴草
腈(Stalker等人，(1988)Science[科学]242：419-423)；草甘膦(Shaw等人，(1986)Science
[科学]233：478-481以及美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草丁膦(DeBlock
等人，(1987)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]6：2513-2518)。主要参见Yarranton，
(1992)Curr.Opin.Biotech.[生物技术当代观点]3：506-511；Christopherson等人，(1992)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：6314-6318；Yao等人，(1992)Cell[细胞]
71：63-72；Reznikoff，(1992)Mol.Microbiol.[分子微生物学]6：2419-2422；Barkley等人，(1980)在The Operon[操纵子]中，第177-220页；Hu等人，(1987)Cell[细胞]48：555-566；
Brown等人，(1987)Cell[细胞]49：603-612；Figge等人，(1988)Cell[细胞]52：713-722；
Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86：5400-5404；Fuerst
等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86：2549-2553；Deuschle等人，
(1990)Science[科学]248：480-483；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis[博士学位论文]，
University of Heidelberg[德国海德堡大学]；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad. 
Sci.USA[美国科学院院报]90：1917-1921；Labow等人，(1990)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生
物学]10：3343-3356；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]
89：3952-3956；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88：5072-
5076；Wyborski等人，(1991)Nucleic Acids Res.[核酸研究]19：4647-4653；Hillenand-
Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.[热点分子结构生物学]10：143-162；Degenkolb等
人，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]35：1591-1595；
Kleinschnidt，等人，(1988)Biochemistry[生物化学]27：1094-1104；Bonin，(1993)
Ph.D.Thesis[博士学位论文]University of Heidelberg[德国海德堡大学]；Gossen等人，
(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：5547-5551；Oliva等人，(1992)
Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]36：913-919；Hlavka等人，(1985)
Handbook of Experimental Pharmacology[实验药理学手册]，78卷(Springer-Verlag，
Berlin[柏林施普林格出版社])和Gill等人，(1988)Nature[自然]334：721-724。此类公开
内容通过引用并入本文。

[0254] 以上选择性标记基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标记基因都可用于实施例中。

[0255] 植物转化

[0256] 所述实施例的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物。如本文所用的，“引入”意指将所述多核苷酸或多肽呈送给所述植物，以此类方式使得所述序列进入所述植物细胞的内
部。所述实施例的方法不取决于用于将多核苷酸或多肽引入植物中的特定方法，只要所述
多核苷酸或多肽进入所述植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的
方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。

[0257] 如本文所用的，“稳定转化”意指经引入植物中的核苷酸构建体整合到所述植物的基因组中，并且能够被其子代遗传。如本文所用的，“瞬时转化”意指将多核苷酸引入所述植物中并且不整合到所述植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。如本文所用的，“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、及其胚胎和子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶子细胞、根细
胞、韧皮部细胞和花粉)。

[0258] 转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案可以根据要靶向转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而异。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随
后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques
[生物技术]4：320-334)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院
院报]83：5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和5,981,840)、直接基因
转移(Paszkowski等人，(1984)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717-2722)以及弹道
粒子加速(参见，例如美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244和5,932,782；Tomes等
人，(1995)Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基本方法]，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag，Berlin[德国柏林
施普林格出版公司])；和McCabe等人，(1988)Biotechnology[生物技术]6：923-926)；以及
Lecl转化法(WO 00/28058)。对于马铃薯转化法，参见Tu等人，(1998)Plant Molecular 
Biology[植物分子生物学]37：829-838和Chong等人，(2000)Transgenic Research[转基因
研究]9：71-78。可以在以下文献中找到另外的转化方法：Weissinger等人，(1988)
Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]22：421-477；Sanford等人，(1987)Particulate Science 
and Technology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol.
[植物生理学]87：671-674(大豆)；McCabe等人，(1988)Bio/Technology[生物/技术]6：923-
926(大豆)；Finer和McMullen，(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.[体外细胞生物学和发育
生物学]27P：175-182(大豆)；Singh等人，(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]
96：319-324(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：736-740(水稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85：4305-4309(玉蜀黍)；Klein等
人，(1988)Biotechnology[生物技术]6：559-563(玉蜀黍)；美国专利号5,240,855；5,322,
783和5,324,646；Klein等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440-444(玉蜀黍)；
Fromm等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-Van 
Slogteren等人，(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；
Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]84：5345-5349(百合科
(Liliaceae))；De Wet等人，(1985)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues
[胚珠组织的实验操作]，Chapman等人编辑(Longman[朗文出版社]，纽约)，第197-209页(花
粉)；Kaeppler等人，(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9：415-418和Kaeppler等
人，(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(晶须介导的转化)；D′
Halluin等人，(1992)PlantCell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；Li等人，(1993)Plant 
Cell Reports[植物细胞报告]，12：250-255以及Christou和Ford，(1995)Annals of 
Botany[植物学年报]75：407-413(水稻)；Osjoda等人，(1996)Nature Biotechnology[自然
生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌的玉蜀黍)；将其全部通过引用并入本文。

[0259] 在具体实施例中，可以使用各种瞬时转化方法将实施例的序列提供给植物。此类瞬时转化法包括但不限于将IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多核苷酸或其变体和片段直
接引入植物中或者将IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽转录物引入植物中。此类方法包
括例如显微注射或粒子轰击。参见，例如，Crossway等人，(1986)Mol Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]202：179-185；Nomura等人，(1986)Plant Sci.[植物科学]44：53-58；
Hepler等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国科学院院报]91：2176-2180和Hush等人，
(1994)The Journal of Cell Science[细胞科学杂志]107：775-784，将其全部通过引用并
入本文。可替代地，使用本领域已知的技术可以将IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多核苷
酸瞬时地转化至植物中。此类技术包括病毒载体系统，和以阻止DNA后续释放的方式使多核
苷酸沉淀。因此，可以从粒子结合的DNA进行转录，但其被释放以整合至基因组的频率大大
降低了。此类方法包括使用包被有聚乙烯亚胺(PEI；西格玛公司(Sigma)#P3143)的粒子。

[0260] 用于在植物基因组的具体位置靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所需的基因组位置处的插入。参见，例
如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，将其全部通过引用并入本文。简而言之，实施例的多核苷酸可以包含在侧翼为两个不相同重
组位点的转移盒内。将转移盒引入植物中，所述植物已经稳定地将靶位点并入其基因组中，
所述靶位点侧翼为与转移盒的位点相对应的两个不相同的重组位点。提供适当的重组酶，
并将所述转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的具体染色体
位置处。

[0261] 植物转化载体可以由实现植物转化所需的一种或多种DNA载体组成。例如，本领域常见做法是利用由多于一个连续DNA片段组成的植物转化载体。这些载体在本领域中通常
被称为“双元载体”。双元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中
实现有效转化所需的DNA片段的大小和复杂性相当大，并且将功能分离到单独的DNA分子上
是有利的。双元载体典型地含有包含T-DNA转移(如左边界和右边界)所需的顺式作用序列
的质粒载体、经工程改造成能够在植物细胞中表达的选择性标记、和“目的基因”(经工程改造成能够在需要产生转基因植物的植物细胞中表达的基因)。此质粒载体上也存在细菌复
制所需的序列。将顺式作用序列以允许有效转移到植物细胞中并在其中表达的方式进行排
列。例如，所述选择性标记基因和杀有害生物基因位于左边界和右边界之间。通常第二质粒
载体包含反式作用因子，所述反式作用因子介导从农杆菌属到植物细胞的T-DNA转化。如本
领域所理解的，所述质粒通常含有允许通过农杆菌感染植物细胞、以及通过在边界序列切
割进行DNA的转移和vir介导的DNA转移的毒力功能(Vir基因)(Hellens和Mullineaux，
(2000)Trends in Plant Science[植物科学趋势]5：446-451)。若干种类型的农杆菌菌株
(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。通过其他方法如显微投影、显微镜注射、电穿孔、聚乙二醇等来转化植物不需要第二质粒载体。

[0262] 通常，植物转化方法涉及将异源DNA转移到靶植物细胞中(例如未成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，随后施加最大阈值水平的适当选择(取
决于选择性标记基因)以从一组未转化的细胞群中回收经转化的植物细胞。在将异源外源
DNA整合到植物细胞中之后，然后在培养基中施加最大阈值水平的适当选择以杀死未转化
的细胞，并通过定期转移到新鲜培养基中来分离并增殖从所述选择处理中存活的推定经转
化的细胞。通过连续传代和使用适当的选择进行挑战，可以鉴定并增殖这些用所述质粒载
体转化的细胞。然后，可以使用分子和生物化学的方法来证实整合到所述转基因植物的基
因组中的目的异源基因的存在。

[0263] 典型地将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并将其常规培养。随后，在被置于补充有最大阈值水平的选择剂的再生培养基上之后，所述经转化的细胞分化成芽。然后
将所述芽转移到用于回收已生根的芽或小植物的选择性生根培养基上。然后转基因的小植
株成长为成熟植物并产生稔性种子(例如Hiei等人，(1994)The Plant Journal6：271-282；
Ishida等人，(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750)。典型地将外植体
转移到新鲜供应的相同培养基中并将其常规培养。用于生产转基因植物的技术和方法的一
般描述发现于以下文献中：Ayres和Park，(1994)Critical Reviews in Plant Science[植
物科学评论]13：219-239以及Bommineni和Jauhar，(1997)Maydica[美迪卡杂志]42：107-
120。由于经转化的材料含有许多细胞；所以在受试的靶愈伤组织或组织或细胞群的任何部
分中同时存在经转化的细胞和未经转化的细胞。杀死未经转化的细胞并允许经转化细胞增
殖的能力产生经转化的植物培养物。通常，去除未经转化的细胞的能力限制经转化的植物
细胞的快速恢复和转基因植物的成功生成。

[0264] 可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见，例如，McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports[植物细胞报告]5：81-84。然后可以培育这些植株，并用相同的经转化
株系或者不同的株系授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型或诱导型表达的所得杂交
体。可以培育两代或更多代，以确保所需表型特征的表达稳定地保持并遗传，并且然后收获
种子以确保已经实现了所需表型特征的表达。

[0265] 可以通过使植物与病毒或者病毒核酸接触而向植物提供实施例的核苷酸构建体。通常，此类方法涉及将目的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内。应当认识到，可以最初
将所述实施例的重组蛋白合成为病毒多蛋白的一部分，然后可以在体内或在体外通过蛋白
水解加工以产生所需的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽。还认识到，包含实施例的
IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的至少一部分氨基酸序列的这种病毒多蛋白可具有
所需的杀有害生物活性。此类病毒多蛋白和编码它们的核苷酸序列涵盖在所述实施例中。
为植物提供核苷酸构建体并在植物中产生编码的蛋白的方法是本领域已知的，其涉及病毒
DNA或RNA分子。参见，例如美国专利号5,889,191；5,889,190；5,866,785；5,589,367和5,
316,931；通过引用并入本文。

[0266] 用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见，例如，Svab等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]87：8526-8530；Svab和Maliga，(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90：913-917；Svab和Maliga，(1993)EMBO J.
[欧洲分子生物学学会杂志]12：601-606。所述方法依赖于粒子枪递送含有选择性标记的
DNA和通过同源重组将DNA靶向质体基因组。另外，通过利用核编码的和质体导向的RNA合酶
的组织偏好性表达，通过反式激活沉默的质体携带的转基因，实现质体转化。这种系统已被
报道于以下文献中：McBride等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91：
7301-7305。

[0267] 所述实施例进一步涉及实施例的经转化植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶以及根和芽的插条。

[0268] 所述实施例可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的实例包括但不限于玉米(corn，Zea mays)，芸苔属(Brassica)物种(例如，甘蓝
型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))(特别是可用作种子油来源的那些芸苔
属物种)，苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))，水稻(rice，Oryza sativa)，黑麦(rye，
Secale cereale)，高粱(sorghum，Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)，粟(例如，珍珠粟(pearl millet，Pennisetum glaucum)、黍(proso millet，Panicum miliaceum)、谷子
(foxtail millet，Setaria italiea)、龙爪稷(finger millet，Eleusine coracana))，向
日葵(sunflower，Helianthus annuus)，红花(safflower，Carthamus tinctorius)，小麦
(wheat，Triticum aestivum)，大豆(soybean，Glycine max)，烟草(tobacco，Nicotiana 
tabacum)，马铃薯(potato，Solanum tuberosum)，花生(peanut，Arachis hypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))，甘薯(番薯(Ipomoea 
batatas))，木薯(cassava，Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属(Coffea)物种)，椰子
(coconut，Cocos nucifera)，菠萝(pineapple，Ananas comosus)，柑橘树(柑橘属(Citrus)物种)，可可(cocoa，Theobroma cacao)，茶树(tea，Camellia sinensis)，香蕉(芭蕉属
(Musa)物种)，鳄梨(avocado，Persea americana)，无花果(fig，Ficus casica)，番石榴
(guava，Psidium guajava)，芒果(mango，Mangifera indica)，橄榄(olive，Olea 
europaea)，木瓜(番木瓜(Carica papaya))，腰果(cashew，Anacardium occidentale)，澳
洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)，巴旦杏(almond，Prunus amygdalus)，甜菜(sugar beets，Beta vulgaris)，甘蔗(甘蔗属(Saccharum)物种)，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和针叶树。

[0269] 蔬菜包括番茄(tomatoes，Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，莴苣(Lactuca sativa))、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利马豆(lima bean，Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属(Lathyrus)物种)和黄瓜属的成员例如黄瓜(cucumber，C.sativus)、香瓜
(cantaloupe，C.cantalupensis)和甜瓜(musk melon，C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花
属(Rhododendron)物种)、绣球花(hydrangea，Macrophylla hydrangea)、木槿(hibiscus，
Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属(Rosa)物种)、郁金香(郁金香属(Tulipa)物种)、水
仙(水仙属(Narcissus)物种)、矮牵牛(petunias，Petunia hybrida)、康乃馨(carnation，
Dianthus caryophyllus)、一品红(poinsettia，Euphorbia pulcherrima)和菊花。可以用
于实践实施例的针叶树包括(例如)松树如火炬松(loblolly pine，Pinus taeda)、湿地松
(slash pine，Pinus elliotii)、西黄松(ponderosa pine，Pinus ponderosa)、黑松
(lodgepole pine，Pinus contorta)和辐射松(Monterey pine，Pinus radiata)；花旗松
(Douglas-fir，Pseudotsuga menziesii)；西方铁杉(Western hemlock，Tsuga 
canadensis)；北美云杉(Sitka spruce，Picea glauca)；红杉(redwood，Sequoia 
sempervirens)；枞树(true firs)，如银杉(胶冷杉(Abies amabilis))和胶枞(香脂冷杉
(Abies balsamea))；以及雪松，如西方红雪松(北美乔柏(Thuja plicata))和阿拉斯加黄
雪松(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。所述实施例的植物包括作物植物(例如玉
米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)，如玉米和大豆植物。

[0270] 草皮草包括但不限于：一年生早熟禾(annual bluegrass，Poa annua)；一年生黑麦草(黑麦草(Lolium  multiflorum))；加拿大早熟禾(Canada bluegrass，Poa 
compressa)；紫羊茅(Chewing’s fescue，Festuca rubra)；细弱翦股颖(colonial 
bentgrass，Agrostis tenuis)；匍匐翦股颖(creeping bentgrass，Agrostis palustris)；
沙生冰草(crested wheatgrass，Agropyron desertorum)；扁穗冰草(fairway 
wheatgrass，Agropyron cristatum)；硬羊茅(长叶羊茅(Festuca longifolia))；草地早熟
禾(Kentucky bluegrass，Poa pratensis)；鸭茅(orchardgrass，Dactylis glomerata)；多年生黑麦草(perennial ryegrass，Lolium perenne)；红狐茅(紫羊茅(Festuca rubra))；
小糠草(redtop，Agrostis alba)；粗茎早熟禾(rough bluegrass，Poa trivialis)；羊茅
(sheep fescue，Festuca ovina)；无芒雀麦(smooth bromegrass，Bromus inermis)；高羊
茅(tall fescue，Festuca arundinacea)；梯牧草(timothy，Phleum pratense)；绒毛剪股
颖(velvet bentgrass，Agrostis canina)；碱茅(weeping alkaligrass，Puccinellia 
distans)；蓝茎冰草(western wheatgrass，Agropyron smithii)；狗牙根(狗牙根属
(Cynodon)物种)；圣奥古斯丁草(St.Augustine grass，Stenotaphrum secundatum)；结缕
草(结缕属(Zoysia)物种)；百喜草(Bahia grass，Paspalum notatum)；地毯草(carpet 
grass，Axonopus affinis)；假俭草(centipede grass，Eremochloa ophiuroides)；隐花狼尾草(kikuyu grass，Pennisetum clandesinum)；海滨雀稗(seashore paspalum，Paspalum vaginatum)；格兰马草(blue gramma，Bouteloua gracilis)；野牛草(buffalo grass，
Buchloe dactyloids)；垂穗草(sideoats gramma，Bouteloua curtipendula)。

[0271] 目的植物包括提供目的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦、粟等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜耳豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

[0272] 植物转化评估

[0273] 在将异源外源DNA引入植物细胞后，通过各种方法(如分析与已整合的基因相关的核酸、蛋白质和代谢物)证实异源基因在所述植物基因组中的转化或整合。

[0274] PCR分析是移植到土壤中之前在早期阶段筛选转化的细胞、组织或芽中存在并入的基因的快速方法(Sambrook和Russell，(2001)Molecular Cloning：A Laboratory 
Manual.[分子克隆：实验手册]Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出
版社]，Cold Spring Harbor[冷泉港]，NY[纽约州])。使用对目的基因或农杆菌属载体背景
等具有特异性的寡核苷酸引物进行PCR。

[0275] 植物转化可以通过基因DNA印迹分析来证实(Sambrook和Russell，(2001)，同上)。通常，从转化体中提取总DNA，用适当的限制性酶消化，在琼脂凝胶中进行分级并转移到硝
化纤维或尼龙膜上。然后用例如放射性标记的32P靶DNA片段探测膜或“印迹”，以证实根据
标准技术将引入的基因整合到所述植物基因组中(Sambrook和Russell，(2001)，同上)。

[0276] 在RNA印迹分析中，从转化体的特定组织中分离RNA，在甲醛琼脂凝胶中进行分级，并根据本领域常规使用的标准程序将其印迹到尼龙过滤器上(Sambrook和Russell，
(2001)，同上)。然后通过本领域已知的方法通过将所述过滤器与来自杀有害生物基因的放
射性探针杂交来测试由所述杀有害生物基因编码的RNA的表达(Sambrook和Russell，
(2001)同上)。

[0277] 可以对转基因植物进行蛋白质印迹、生物化学测定等，以通过标准程序(Sambrook和Russell，2001，同上)使用与IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽上存在的一个或多个
表位结合的抗体来证实由杀有害生物基因所编码的蛋白质的存在。

[0278] 将基因组编辑技术引入植物的方法

[0279] 在一些实施例中，可以使用基因组编辑技术将所公开的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多核苷酸组合物引入植物的基因组中，或者可以使用基因组编辑技术编辑植物基因
组中先前引入的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多核苷酸。例如，可以通过使用双链断裂
技术(如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等)将所公开的多核苷酸引入植物
基因组中需要的位置上。例如，为了位点特异性插入的目的，可以使用CRISPR-Cas系统将所
公开的多核苷酸引入基因组中需要的位置上。植物基因组中需要的位置可以是任何对于插
入来说需要的靶位点，如适于育种的基因组区域，或者可以是位于具有现有的目的性状的
基因组窗口中的靶位点。现有的目的性状可能是内源性状或先前引入的性状。

[0280] 在一些实施例中，在将所公开的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多核苷酸先前已经引入到基因组中的情况下，可以使用基因组编辑技术来改变或修饰引入的多核苷酸序
列。可以将位点特异性修饰引入所公开的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多核苷酸组合物
中，所述位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的那些修饰，
所述方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过
使用双链断裂技术，如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等。此类技术可用于通过在引入的多核苷酸内的核苷酸的插入、缺失或取代来修饰先前引入的多核苷酸。可替
代地，可以使用双链断裂技术向引入的多核苷酸中添加另外的核苷酸序列。可以添加的另
外的序列包括另外的表达元件(如增强子序列和启动子序列)。在另一个实施例中，基因组
编辑技术可用于在植物的基因组内将另外的杀昆虫活性蛋白定位在本丈公开的公开的
IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多核苷酸组合物附近，以产生杀昆虫活性蛋白的分子堆叠
物。

[0281] “改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”和“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用，并且是指如本文公开的靶序列，当与未改变的靶序列相比时，所述靶序列包含至少一种改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。

[0282] 转基因植物中性状的堆叠

[0283] 转基因植物可以包含本文公开的一种或多种杀昆虫多核苷酸与一种或多种另外的多核苷酸的堆叠件，导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列堆叠的转基因
植物可以通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一种或两种获得。这些方法包含但不
限于：育种各自包含目的多核苷酸的单个系，用随后的基因转化包含本文公开的基因的转
基因植物，并将基因共转化为单个植物细胞。如本文所用的，术语“堆叠”包括使多个性状在同一植物中存在(即，将两个性状并入核基因组中，将一个性状并入核基因组中，并且将一
个性状并入质体的基因组中，或者这两种性状都被并入质体的基因组中)。在一个非限制性
实例中，“堆叠性状”包括其中序列在物理上彼此相邻的分子堆叠物。如本文所用的性状是
指源自特定序列或序列组群的表型。可以使用包含多个基因或在多个载体上分别携带的基
因的单一转化载体进行基因的共转化。如果通过遗传转化植物来堆叠序列，则目的多核苷
酸序列可以在任意时间并以任意顺序组合。可以用共转化方案将所述性状与转化盒的任何
组合所提供的目的多核苷酸一起引入。例如，若引入两个序列，则这两个序列可包含在分开
的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)中。所述序列的表达可以通过相同的启动子
或通过不同的启动子驱动。在某些情况下，可能需要引入将抑制目的多核苷酸的表达的转
化盒。这可以与其他抑制盒或过度表达盒的任何组合进行组合以在所述植物中产生所需性
状组合。进一步应当认识到，可以使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核
苷酸序列。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，将其全部通过引用并入本文。

[0284] 在一些实施例中，单独或与一种或多种另外的抗昆虫性状堆叠的、编码本丈公开的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的多核苷酸可以与一种或多种另外的输入性状(例
如，除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育性、茎强度等)或输出性状(例如，增加的产量、经修饰的淀粉、改善的油特性、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增加的消化性、改善的纤维品质、抗旱性等)堆叠。因此，多核苷酸实施例可用于提供具有灵活地且成本有效地控制任何数量的农艺有害生物的能力的经改善的作物品质的完整
农艺学方案。

[0285] 可用于堆叠的转基因包括但不限于：

[0286] 1.转基因，其赋予昆虫抗性或抗病性并编码：

[0287] (A)植物抗病性基因。通常通过植物中抗病性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用来激活植物防御。可以用经克隆的抗性基因
来转化植物变种，以工程改造对具体病原体菌株具有抗性的植物。参见，例如Jones等人，
(1994)Science[科学]266：789(cloning of the tomato Cf-9 gene for resistance to 
Cladosporium fulvum[克隆番茄Cf-9基因以抵抗番茄叶霉病菌])；Martin等人，(1993)
Science[科学]262：1432(tomato Pto gene for resistance to Pseudomonas syringae 
pv.tomato encodes a protein kinase[用于抵抗丁香假单胞菌番茄致病变体的番茄Pto
基因编码蛋白激酶])；Mindrinos等人，(1994)Cell[细胞]78：1089(Arabidopsis RSP2 
gene for resistance to Pseudomonas syringae[拟南芥RSP2基因用于对抗丁香假单胞
菌])，McDowell和Woffenden，(2003)Trends Biotechnol.[生物科技趋势]21(4)：178-83以
及Toyoda等人，(2002)Transgenic Res.[转基因研究]11(6)：567-82。与野生型植物相比，
对疾病具有抗性的植物对病原体更具抗性。

[0288] (B)编码苏云金芽孢杆菌蛋白质、其衍生物或其上建模的合成多肽的基因。参见，例如，Geiser等人，(1986)Gene[基因]48：109，其公开了Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可购自美国典型培养物保藏中心(American Type 
Culture Collection)(美国马里兰州罗克韦尔市(Rockville，Md.))，例如 登录号
40098、67136、31995和31998下。经遗传工程改造的苏云金芽孢杆菌转基因的其他非限制性
实例在以下专利和专利申请中给出，并为此目的通过引用并入本文：美国专利号5,188,
960；5,689,052；5,880,275；5,986,177；6,023,013、6,060,594、6,063,597、6,077,824、6,
620,988、6,642,030、6,713,259、6,893,826、7,105,332；7,179,965、7,208,474；7,227,
056、7,288,643、7,323,556、7,329,736、7,449,552、7,468,278、7,510,878、7,521,235、7,
544,862、7,605,304、7,696,412、7,629,504、7,705,216、7,772,465、7,790,846、7,858,849和WO 1991/14778；WO 1999/31248；WO 2001/12731；WO 1999/24581和WO 1997/40162。

[0289] 也可以堆叠编码杀有害生物蛋白的基因，所述杀有害生物蛋白包括但不限于：来自假单胞菌属物种如PSEEN3174(Monalysin，(2011)PLoS Pathogens[PLoS病原体]，7：1-
13)、来自假单胞菌蛋白菌菌株CHA0和Pf-5(之前为荧光假单胞菌)(Pechy-Tarr，(2008)
Environmental Microbiology[环境微生物学]10：2368-2386：基因库登录号EU400157)的
杀昆虫蛋白；来自台湾假单胞菌(Liu等人，(2010)J.Agric.Food Chem.[农业与食品化学杂
志]，58：12343-12349)和来自假产碱假单胞菌(Zhang等人，(2009)Annals of 
Microbiology[微生物学杂志]59：45-50和Li等人，(2007)Plant Cell Tiss.Organ Cult.
[植物细胞，组织和器官培养杂志]89：159-168)的杀昆虫蛋白；来自发光杆菌属物种和致病
杆菌属物种(Hinchliffe等人，(2010)The Open Toxicology Journal[开放毒理学杂志]，
3：101-118和Morgan等人，(2001)Applied and Envir.Micro.[应用与环境微生物学]67：
2062-2069)的杀昆虫蛋白；来自美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946的杀昆虫蛋
白；US 9,688,730的PIP-1多肽；US 9,475,847的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽；美国公开号US 
20160186204的PIP-47多肽；PCT公开号WO2016/114973的IPD045多肽、IPD064多肽、IPD074
多肽、IPD075多肽、和IPD077多肽；PCT序列号PCT/US17/56517的IPD080多肽；序列号PCT/
US17/54160的IPD078多肽、IPD084多肽、IPD085多肽、IPD086多肽、IPD087多肽、IPD088多
肽、和IPD089多肽；美国专利公开号US 20160366891的PIP-72多肽；美国公开号US 
20170166921的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽；美国序列号62/521084的IPD098多肽、IPD059
多肽、IPD108多肽、IPD109多肽；美国公开号US20160347799的PtIP-83多肽；美国公开号US 
20170233440的PtIP-96多肽；PCT公开号WO 2017/23486的IPD079多肽；PCT公开号WO 2017/
105987的IPD082多肽、序列号PCT/US17/30602的IPD090多肽、美国序列号62/434020的
IPD093多肽；序列号PCT/US17/39376的IPD103多肽；美国序列号62/438179的IPD101多肽；
美国序列号US 62/508，514的IPD121多肽；和δ-内毒素，包括但不限于Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35，Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry50、Cry51、Cry52、Cry53、Cry54、Cry55、Cry56、Cry57、Cry58、Cry59、Cry60、Cry61、Cry62、Cry63、Cry64、Cry65、Cry66、Cry67、Cry68、Cry69、Cry70、Cry71、和Cry72类的δ-内毒素多肽以及苏云金芽孢杆菌细胞溶解性cyt1和cyt2基因。这些类别的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的成员是本领域技术
人员熟知的(参见，Crickmore等人，“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature[苏云
金芽孢杆菌毒素命名法]”(2011)，网址为lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/
Bt/，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。

[0290] δ-内毒素的实例还包括但不限于：美国专利号5,880,275、7,858,849和8,878,007的Cry1A蛋白；US 9,512,187的Cry1Ac突变体；美国专利号8,304,604、8,304,605和8,476,
226的DIG-3或DIG-11毒素(cry蛋白(如Cry1A、Cry3A)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的N-末端
缺失)；美国专利申请序列号10/525,318、美国专利申请公开号US 20160194364和美国专利
号9,404,121和8,772,577的Cry1B；PCT公开号WO 2016/61197和序列号PCT/US17/27160的
Cry1B变体；美国专利号6,033,874的Cry1C；US 20170233759的Cry1D蛋白；PCT序列号PCT/
US17/53178的Cry1E蛋白；美国专利号5,188,960和6,218,188的Cry1F蛋白；美国专利号7,
070,982、6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体；PCT公开号WO 2017/0233759的Cry1I蛋
白；美国公开US 20170240603的Cry1J变体；美国专利号7,064,249的Cry2蛋白如Cry2Ab蛋
白和US 7208474的Cry2A.127蛋白；Cry3A蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同Cry蛋
白的可变区和保守区的独特组合产生的经工程改造的杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申
请公开号2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,
552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,339,092、7,378,499、7,462,760和9,593,345的Cry8蛋白；Cry9蛋白，例如像Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员，包括美国专利9,000,261和8,802,933以及美国序列号WO 2017/132188的Cry9蛋白；Cry15蛋白，描
述于以下丈献中：Naimov等人，(2008)Applied and Environmental Microbiology[应用与
环境微生物学]，74：7145-7151；美国专利号US 8,933,299的Cry14蛋白；美国专利号6,127,
180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利号US 8,816,157的截短的
Cry34蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,
229的CryET33和cryET34蛋白；美国专利公开号2006/0191034、2012/0278954，和PCT公开号
WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物；美国专利号6,083,499、6,548,291和6,340,
593的Cry35Ab1蛋白；美国专利号9,403,881的Cry46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素；
TIC901或相关毒素；美国专利申请公开号2008/0295207的TIC807；美国专利US 8,513,493
的TIC853；PCT US 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利申请公开号US 20160150795的经工程改造的半翅目毒素蛋白，美国专利号8,236,
757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；美国专利号7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-
040、AXMI-049；WO 2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO 2005/038032的
AXMI-010；WO 2005/021585的AXMI-003；美国专利申请公开号2004/0250311的AXMI-008；美
国专利申请公开号2004/0216186的AXMI-006；美国专利申请公开号2004/0210965的AXMI-
007；美国专利申请号2004/0210964的AXMI-009；美国专利申请公开号2004/0197917的
AXMI-014；美国专利申请公开号2004/0197916的AXMI-004；WO 2006/119457的AXMI-028和
AXMI-029；WO 2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和
AXMI-004；美国专利号8,084,416的AXMI-150；美国专利申请公开号2011/0023184的AXMI-
205；美国专利申请公开号2011/0263488的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-
019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063和AXMI-064；美国专利US 8461421和US 8,461,422的AXMI046、AXMI048、AXMI050、AXMI051、AXMI052、AXMI053、AXMI054、AXMI055、AXMI056、AXMI057、AXMI058、AXMI059、AXMI060、AXMI061、AXMI067、AXMI069、AXMI071、AXMI072、AXMI073、AXMI074、AXMI075、AXMI087、AXMI088、AXMI093、AXMI070、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI125、AXMI126、AXMI127、AXMI129、AXMI151、AXMI161、AXMI164、AXMI183、AXMI132、AXMI137、AXMI138；美国专利申请公开号2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白；WO 2011/103248的AXMI221Z、
AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO 2011/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231；美国专利号8,334,431的AXMI-
115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；美国专利申请公开号2010/0298211的
AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045；美国专利申请公开号2009/0144852
的AXMI-066和AXMI-076；美国专利号8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、
AXMI140、AXMI141、AXMI1 42、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；美国专利US 8461421的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、dsAXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137；美国专利US  8,461,415的AXMI192；美国专利申请公开号US 
20160177332的AXMI281；美国专利号US 8,252,872的AXMI422；美国专利号8,319,019的具
有修饰的蛋白水解位点的Cry蛋白如Cry1A和Cry3A；美国专利申请公开号2011/0064710的
来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。美国序列号62/
607372的Cry蛋白MP032、MP049、MP051、MP066、MP068、MP070、MP091S、MP109S、MP114、MP121、MP134S、MP183S、MP185S、MP186S、MP195S、MP197S、MP208S、MP209S、MP212S、MP214S、MP217S、MP222S、MP234S、MP235S、MP237S、MP242S、MP243、MP248、MP249S、MP251M、MP252S、MP253、MP259S、MP287S、MP288S、MP295S、MP296S、MP297S、MP300S、MP304S、MP306S、MP310S、MP312S、MP314S、MP319S、MP325S、MP326S、MP327S、MP328S、MP334S、MP337S、MP342S、MP349S、MP356S、MP359S、MP360S、MP437S、MP451S、MP452S、MP466S、MP468S、MP476S、MP482S、MP522S、MP529S、MP548S、MP552S、MP562S、MP564S、MP566S、MP567S、MP569S、MP573S、MP574S、MP575S、MP581S、MP590、MP594S、MP596S、MP597、MP599S、MP600S、MP601S、MP602S、MP604S、MP626S、MP629S、MP630S、MP631S、MP632S、MP633S、MP634S、MP635S、MP639S、MP640S、MP644S、MP649S、MP651S、MP652S、MP653S、MP661S、MP666S、MP672S、MP696S、MP704S、MP724S、MP729S、MP739S、MP755S、MP773S、MP799S、MP800S、MP801S、MP802S、MP803S、MP805S、MP809S、MP815S、MP828S、MP831S、MP844S、MP852、MP865S、MP879S、MP887S、MP891S、MP896S、MP898S、MP935S、MP968、MP989、MP993、MP997、MP1049、MP1066、MP1067、MP1080、MP1081、MP1200、MP1206、MP1233、和MP1311。
Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员所熟知的(综述参见van Frannkenhuyzen，(2009)
J.Invert.Path.[无脊椎动物病理学杂志]101：1-16)。使用Cry蛋白作为转基因植物性状是
本领域技术人员熟知的，并且Cry-转基因植物(包括但不限于表达以下的植物：Cry1Ac、
Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+CrylAc、Cry2Ab、Cry3A、
mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt)已获得法规性审批(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal[植物生物技术杂志]9：283-300和CERA
(2010)环境风险评估的转基因作物数据库中心(CERA)(GM Crop Database Center for 
Environmental Risk Assessment(CERA))，ILSI研究基金会(ILSI  Research 
Foundation)，华盛顿特区，网址为cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。本领域技术人员熟知的不只一种杀有害生物蛋白
也可以在植物中表达，如Vip3Ab和Cry1Fa(US 2012/0317682)；Cry1BE和Cry1F(US 2012/
0311746)；Cry1CA和Cry1AB(US 2012/0311745)；Cry1F和CryCa(US 2012/0317681)；Cry1DA
和Cry1BE(US 2012/0331590)；Cry1DA和Cry1Fa(US 2012/0331589)；Cry1AB和CrylBE(US 
2012/0324606)；Cry1Fa和Cry2Aa以及Cry1T和Cry1E(US 2012/0324605)；Cry34Ab/35Ab&
Cry6Aa(US 20130167269)；Cry34Ab/VCry35Ab&Cry3Aa(US 20130167268)；Cry1Da&Cry1Ca
(US 9796982)；Cry3Aa&Cry6Aa(US 9798963)；以及Cry3A&Cry1Ab或Vip3Aa(US 9,045,
766)。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，所述杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7,491,869
的脂质酰基水解酶，和胆固醇氧化酶，如来自链霉菌属(Purcell等人，(1993)Biochem 
Biophys Res Commun[生物化学与生物物理学研究通讯]15：1406-1413)。杀有害生物蛋白
还包括美国专利号5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020
中的VIP(营养期杀昆虫蛋白)毒素等。其他VIP蛋白质是本领域技术人员熟知的(参见，
lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html，其可以使用“www”前缀在万
维网上访问)。杀有害生物蛋白还包括PCT序列号PCT/US2017/000510的Cyt蛋白(包括Cyt1A
变体)；杀有害生物蛋白还包括毒素复合物(TC)蛋白，所述毒素复合物(TC)蛋白可从生物体
如致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属获得(参见，美国专利号7,491,698和8,084,
418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独
立毒素的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强
“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类
型的TC蛋白。如本文所提及的，A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)增强了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的实例包括但不限于莱科毒素-1肽及其
突变体(美国专利号8,334,366)。产生的组合还可以包括目的多核苷酸中的任何一个的多
个拷贝。

[0291] (C)编码昆虫特异性激素或信息素(如蜕化类固醇和保幼激素)、其变体、基于其的模拟物、或者其拮抗剂或激动剂的多核苷酸。参见，例如Hammock等人，(1990)Nature[自然]
344：458，该文献公开了经克隆的保幼激素酯酶(保幼激素的灭活剂)的杆状病毒表达。

[0292] (D)编码昆虫特异性肽的多核苷酸，其在表达时破坏受影响有害生物的生理机能。例如，参见以下公开内容：Regan，(1994)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]269：9(表达克隆产
生编码昆虫利尿激素受体的DNA)；Pratt等人，(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化
学与生物物理研究通讯]163：1243(在太平洋折翅蠊(Diploptera puntata)中鉴定咽侧体
抑制素(allostatin))；Chattopadhyay等人，(2004)Critical Reviews in Microbiology
[微生物学评论]30(1)：33-54；Zjawiony，(2004)J Nat Prod[天然产物杂志]67(2)：300-
310；Carlini和Grossi-de-Sa，(2002)Toxicon[毒素]40(11)：1515-1539；Ussuf等人，
(2001)Curr Sci.[当代科学]80(7)：847-853以及Vasconcelos和Oliveira，(2004)Toxicon
[毒素]44(4)：385-403。还参见，Tomalski等人的美国专利号5,266,317，他们公开了编码昆虫特异性毒素的基因。

[0293] (E)编码如下酶的多核苷酸，所述多核苷酸负责单萜、倍半萜烯、类固醇、异羟肟酸、苯丙素衍生物或具有杀昆虫活性的其他非蛋白质分子的超累积。

[0294] (F)编码参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶的多核苷酸；例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然还是合成的。参见，PCT申请WO 
1993/02197，所属人为Scott等人，该文献公开了愈创葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序
列。含有几丁质酶编码序列的DNA分子可以例如从登录号39637和67152下的 获得。
还参见，Kramer等人，(1993)Insect Biochem.Molec.Biol.[昆虫生物化学与分子生物学]
23：691，他们教导编码烟草钩虫几丁质酶的cDNA的核苷酸序列；和Kawalleck等人，(1993)
Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]21：673，他们提供欧芹ubi4-2多泛素基因的核苷酸
序列；以及美国专利号6,563,020、7,145,060和7,087,810。

[0295] (G)编码刺激信号转导的分子的多核苷酸。例如，参见Borella等人，(1994)Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]24：757，该文献公开了绿豆钙调素cDNA克隆的核苷酸序列，
以及Griess等人，(1994)Plant Physiol.[植物生理学]104：1467，他们提供了玉蜀黍钙调
素cDNA克隆的核苷酸序列。

[0296] (H)编码疏水力矩肽(hydrophobic moment peptide)的多核苷酸。参见，PCT申请WO 1995/16776和美国专利号5,580,852，其公开了速普肽(其抑制真菌植物病原体)的肽衍
生物，以及PCT申请WO 1995/18855和美国专利号5,607,914(教导了赋予疾病抗性的合成抗
微生物肽)。

[0297] (I)编码膜通透酶、通道形成剂(channel former)或通道阻断剂的多核苷酸。例如，参见Jaynes等人，(1993)Plant Sci.[植物科学]89：43，该文献公开了天蚕素-β裂解肽类似物的异源表达，以提供对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)具有抗性的转基
因烟草植物。

[0298] (J)编码病毒侵入性蛋白质或由其衍生的复合毒素的基因。例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累赋予对由外源蛋白基因来源的病毒以及由相关病毒导致的病毒
感染和/或疾病发展的抗性。参见，Beachy等人，(1990)Ann.Rev.Phytopathol.[植物病理学
年鉴]28：451。外壳蛋白介导的抗性已赋予经转化的植物抵抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病
毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒。同上。

[0299] (K)编码昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素的基因。因此，靶向昆虫肠道中关键代谢功能的抗体将使受影响的酶失活，杀灭昆虫。Cf.Taylor等人，摘要#497，SEVENTH 
INT′L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS[关于分子植物-微生物相
互作用的第七届国际研讨会](爱丁堡，苏格兰，1994)(通过生产单链抗体片段在转基因烟
草中酶促失活)。

[0300] (L)编码病毒特异性抗体的基因。参见，例如Tavladoraki等人，(1993)Nature[自然]366：469，他们提出表达重组抗体基因的转基因植物不受病毒侵袭。

[0301] (M)编码由病原体或寄生虫在自然中产生的发育阻滞蛋白的多核苷酸。因此，真菌内α-1，4-D-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁均-α-1，4-D-半乳糖醛酸酶来促进真菌定植和植物营养释放。参见Lamb等人，(1992)Bio/Technology[生物技术]10：1436。Toubart等人，(1992)Plant J.[植物杂志]2：367描述了编码豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因
的克隆和表征。

[0302] (N)编码由植物在自然中产生的发育抑制蛋白的多核苷酸。例如，Logemann等人，(1992)Bio/Technology[生物技术]10：305表明，表达大麦核糖体失活基因的转基因植物具
有增加的对真菌疾病的抗性。

[0303] (O)参与系统获得抗性(SAR)应答的基因和/或发病相关基因。Briggs，(1995)Current Biology[当代生物学]5(2)，Pieterse和Van Loon，(2004)Curr.Opin.Plant Bio.
[植物生物学当代观点]7(4)：456-64，以及Somssich，(2003)Cell[细胞]113(7)：815-6。

[0304] (P)抗真菌基因(Cornelissen和Melchers，(1993)Pl.Physiol.[植物生理学]101：709-712，和Parijs等人，(1991)Planta[植物]183：258-264，以及Bushnell等人，(1998)
Can.J.of Plant Path.[加拿大植物病理学杂志]20(2)：137-149)。还参见，美国专利申请
序列号09/950,933；11/619,645；11/657,710；11/748,994；11/774,121以及美国专利号6,
891,085和7,306,946。用于感知几丁质片段的LysM受体样激酶作为对真菌病原体的植物防
御应答中的第一步(US 2012/0110696)。

[0305] (Q)解毒基因，如伏马菌素、白僵菌素、念珠菌素和玉米赤霉烯酮及其结构相关的衍生物的基因。例如，参见美国专利号5,716,820；5,792,931；5,798,255；5,846,812；6,
083,736；6,538,177；6,388,171和6,812,380。

[0306] (R)编码胱抑素(Cystatin)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多核苷酸。参见，美国专利号7,205,453。

[0307] (S)防御素基因。参见，WO 2003/000863和美国专利号6,911,577；6,855,865；6,777,592和7,238,781。

[0308] (T)赋予对线虫抗性的基因。参见，例如PCT申请WO 1996/30517；PCT申请WO 1993/19181、WO 2003/033651，以及Urwin等人，(1998)Planta[植物]204：472-479，和
Williamson，(1999)Curr Opin Plant Bio.[植物生物学当代观点]2(4)：327-31；美国专利
号6,284,948和7,301,069以及miR164基因(WO2012/058266)。

[0309] (U)赋予对疫霉根腐病抗性的基因，如Rps 1、Rps 1-a、Rps 1-b、Rps 1-c、Rps 1-d、Rps 1-e、Rps 1-k、Rps 2、Rps 3-a、Rps 3-b、Rps 3-c、Rps 4、Rps 5、Rps 6、Rps 7和其他Rps基因。参见，例如Shoemaker等人，Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping 
in Soybean[大豆中疫霉根腐病抗性基因图谱]，Plant Genome IV Conference[植物基因
组第四次会议]，圣迭戈市，加利福尼亚州(1995)。

[0310] (V)赋予对褐茎腐病抗性的基因，如美国专利号5,689,035所述，并为此目的通过引入并入本文。

[0311] (W)赋予对炭疽菌抗性的基因，如美国专利申请公开US 2009/0035765中所述，并为此目的通过引用并入本文。这包括可以用作单一基因座转化的Rcg基因座。

[0312] 2.赋予对除草剂的抗性的转基因，例如：

[0313] (A)编码对如下除草剂的抗性的多核苷酸，所述除草剂抑制生长点或分生组织，如咪唑啉酮或磺酰脲。此类别的示例性基因编码突变体ALS和AHAS酶，分别如以下文献中所
述：Lee等人，(1988)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]7：1241和Miki等人，(1990)
Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]80：449。还参见，美国专利号5,605,011；5,013,
659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937和5,
378,824；美国专利申请序列号11/683,737和国际公开WO 1996/33270。

[0314] (B)编码对草甘膦(分别由突变体5-烯醇丙酮酰-3-磷酸合酶(EPSP)和aroA基因赋予的抗性)和其他膦酰基化合物如草铵膦(草丁膦乙酰转移酶(PAT)和吸水链霉菌草丁膦乙
酰转移酶(bar)基因)和吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)有抗性的
蛋白质的多核苷酸。参见，例如Shah等人的美国专利号4,940,835，其公开了EPSPS形式的能
赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。Barry等人的美国专利号5,627,061也描述了编码EPSPS酶
的基因。还参见，美国专利号6,566,587；6,338,961；6,248,876；6,040,497；5,804,425；5,
633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；5,094,945、4,940,835；5,866,
775；6,225,114；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；
Re.36,449；RE 37,287E和5,491,288以及国际公开EP 1173580；WO 2001/66704；EP 
1173581和EP 1173582，为此目的将以上专利通过引用并入本文。还给予植物草甘磷抗性，
使所述植物表达编码草甘磷氧化还原酶的基因，这在美国专利号5,776,760和5,463,175中
进行了更全面地描述，为此目的将这两份专利通过引用并入本文。另外，可通过过量表达编
码草甘磷N-乙酰转移酶的基因，来赋予植物草甘磷抗性。参见，例如美国专利号7,462,481；
7,405,074以及美国专利申请公开号2008/0234130。编码突变aroA基因的DNA分子可以在
登录号39256下获得，并且所述突变基因的核苷酸序列公开于Comai的美国专利号
4,769,061中。Kumada等人的欧洲申请号0 333 033和Goodman等人的美国专利号4,975,374
公开了赋予除草剂(如L-草铵膦)抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。Leemans等人
的EP申请号0 242 246和0 242 236中提供了草丁膦乙酰基转移酶基因的核苷酸序列；De 
Greef等人，(1989)Bio/Technology[生物技术]，7：61描述了表达编码草丁膦乙酰转移酶活
性的嵌合bar基因的转基因植物的生产。还参见，美国专利号5,969,213；5,489,520；5,550,
318；5,874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616和5,879,903，为此目的将以上专利通过引用并入本文。赋予苯氧基丙酸和环己酮(如稀禾啶和吡氟氯禾灵)
抗性的示例性基因是Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因，其描述于以下文献中：Marshall等
人，(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]83：435。

[0315] (C)编码对抑制光合作用的除草剂(如三嗪(psbA和gs+基因)和苯甲氰(腈水解酶基因))具有抗性的蛋白质的多核苷酸。Przibilla等人，(1991)Plant Cell[植物细胞]3：
169描述了用编码突变体psbA基因的质粒对衣藻进行转化。Stalker的美国专利号4,810,
648中公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，并且包含这些基因的DNA分子可在 登录
号53435、67441和67442下获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达描述于以下文
献中：Hayes等人，(1992)Biochem.J.[生物化学杂志]285：173。

[0316] (D)编码已经被引入到各种植物中对乙酰羟酸合酶具有抗性的蛋白质的多核苷酸，已经发现其使表达此酶的植物对多种类型的除草剂具有抗性(参见，例如，Hattori等
人，(1995)Mol Gen Genet.[分子和普通遗传学]246：419)。赋予除草剂抗性的其他基因包
括：编码大鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因
(Shiota等人，(1994)Plant Physiol[植物生理学]106：17)，针对谷胱甘肽还原酶和超氧化
物歧化酶的基因(Aono等人，(1995)Plant Cell Physiol[植物细胞生理学]36：1687)和各
种磷酸转移酶的基因(Datta等人，(1992)Plant Mol Biol[植物分子生理学]20：619)。

[0317] (E)编码对靶向原卟啉原氧化酶(protox)的除草剂的抗性的多核苷酸，所述原卟啉原氧化酶是生产叶绿素所必需的。原卟啉原氧化酶用作多种除草剂化合物的靶标。这些
除草剂还抑制存在的所有不同种类的植物的生长，导致其完全破坏。美国专利号6,288,
306、6,282,83和5,767,373和国际公开WO 2001/12825中描述了包含对这些除草剂具有抗
性的改变的原卟啉原氧化酶活性的植物的发育。

[0318] (F)aad-1基因(最初来自鞘脂单胞菌(Sphingobium herbicidovorans))编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)蛋白。所述性状赋予对2，4-二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基
丙酸酯(通常称为“fop”除草剂，如喹禾灵)除草剂的耐受性。用于植物中除草剂耐受性的
aad-1基因本身首先在WO 2005/107437中公开(还参见US 2009/0093366)。来自食酸丛毛单
胞菌(Delftia acidovorans)的aad-12基因，其编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-12)蛋
白，所述蛋白通过用芳氧基链烷酸酯部分(包括苯氧基生长素(例如2，4-D，MCPA)以及吡啶
氧基生长素(例如氯氟吡氧乙酸，三氯吡氧乙酸))使若干种除草剂失活来赋予对2，4-二氯
苯氧基乙酸和吡啶氧基乙酸酯除草剂的耐受性。

[0319] (G)编码美国专利申请公开2003/0135879中公开的、用于赋予麦草畏耐受性的除草剂抗性麦草畏单加氧酶的多核苷酸；

[0320] (H)编码美国专利号4,810,648中所公开的、用于赋予溴苯腈耐受性的溴草腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子；

[0321] (I)编码以下文献中描述的、用于达草灭耐受性的八氢番茄红素(crtl)的多核苷酸分子：Misawa等人，(1993)Plant J.[植物杂志]4：833-840和Misawa等人，(1994)Plant 
J.[植物杂志]6：481-489。

[0322] 3.赋予或贡献于改变的谷物特征的转基因

[0323] 如：

[0324] (A)改变的脂肪酸，例如，通过以下各项：

[0325] (1)下调硬脂酰-ACP以增加植物的硬脂酸含量。参见，Knultzon等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：2624和WO 1999/64579(Genes to Alter 
Lipid Profiles in Corn[改变玉米脂质谱的基因])。

[0326] (2)通过FAD-2基因修饰提高油酸和/或通过FAD-3基因修饰降低亚麻酸(参见，美国专利号6,063,947、6,323,392、6,372,965和WO 1993/11245)。

[0327] (3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，如在WO 2001/12800中。

[0328] (4)改变LEC1，AGP，Dek1，Superall，mil ps和各种Ipa基因如Ipa1、Ipa3、hpt或hggt。例如，参见WO 2002/42424、WO 1998/22604、WO 2003/011015、WO 2002/057439、WO 
2003/011015、美国专利号6,423,886、6,197,561、6,825,397、和美国专利申请公开号US 
2003/0079247、US 2003/0204870以及Rivera-Madrid等人，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.
[美国科学院院报]92：5620-5624。

[0329] (5)基因编码用于制备长链多不饱和脂肪酸的δ-8去饱和酶(美国专利号8,058,571和8,338,152)、用于降低饱和脂肪的δ-9去饱和酶(美国专利号8,063,269)、用于改善
ω-3脂肪酸谱的报春花属(Primula)Δ6-去饱和酶。

[0330] (6)与脂质和糖代谢调节相关的分离的核酸和蛋白质，特别是用于生产转基因植物和调节种子储存化合物(包括脂质、脂肪酸、淀粉或种子储存蛋白)的水平的方法中以及
用于调节植物种子大小、种子数、种子重量、根长和叶子大小的方法中的脂质代谢蛋白
(LMP)(EP 2404499)。

[0331] (7)改变植物中糖诱导型2(HSI2)蛋白的高水平表达，以增加或减少植物中HSI2的表达。增加HSI2的表达增加油含量，而降低HSI2的表达降低脱落酸敏感性和/或增加抗旱性
(美国专利申请公开号2012/0066794)。

[0332] (8)细胞色素b5(Cb5)单独或与FAD2一起表达，以调节植物种子中的油含量，特别是增加ω-3脂肪酸的水平，并改善ω-6与ω-3脂肪酸的比例(美国专利申请公开号2011/
0191904)。

[0333] (9)核酸分子编码wrinkledl样多肽，用于调节糖代谢(美国专利号8,217,223)。

[0334] (B)改变的磷含量，例如，通过

[0335] (1)引入植酸酶编码基因将增强植酸的分解，向经转化的植物添加更多的游离磷酸。例如，参见Van Hartingsveldt等人，(1993)Gene[基因]127：87，该文献公开了黑曲霉
(Aspergillus niger)植酸酶基因的核苷酸序列。

[0336] (2)调节降低植酸盐含量的基因。例如，这可以在玉蜀黍中通过以下方法来完成：克隆然后重新引入与一个或多个等位基因相关联的DNA，如在以低水平的植酸为特征的玉
蜀黍突变体中经鉴定的LPA等位基因，例如WO2005/113778中所述；和/或改变肌醇激酶活
性，如WO 2002/059324、美国专利申请公开号2003/0009011、WO 2003/027243、美国专利申
请公开号2003/0079247、WO 1999/05298、美国专利号6,197,561、美国专利号6,291,224、美国专利号6,391,348、WO 2002/059324、美国专利申请公开号2003/0079247、WO1998/45448、WO 1999/55882、WO 2001/04147中所述。

[0337] (C)改变的碳水化合物(例如，通过改变影响淀粉分支模式的酶的基因而影响其)，或改变硫氧还蛋白如NTR和/或TRX(参见，美国专利号6,531,648，为此目的将其通过引用结
合)和/或γ玉米醇溶蛋白敲除或突变体如cs27或TUSC27或en27的基因(参见，美国专利号
6,858,778和美国专利申请公开号2005/0160488、美国专利申请公开号2005/0204418，为此
目的将其通过引用并入)。参见，Shiroza等人，(1988)J.Bacteriol.[细菌学杂志]170：810
(链球菌突变果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz等人，(1985)Mol.Gen.Genet.
[分子遗传学和基因组学]200：220(枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)，Pen等
人，(1992)Bio/Technology[生物/技术]10：292(生产表达地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的转基因
植物)，Elliot等人，(1993)Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]21：515(番茄转化酶基因
的核苷酸序列)， 等人，(1993)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]268：22480(大麦α-淀
粉酶基因的定向诱变)和Fisher等人，(1993)Plant Physiol.[植物生理学]102：1045(玉米
胚乳淀粉分支酶II)，WO 1999/10498(通过修饰UDP-D-木糖4-差向异构酶、脆性1和2、Ref1、HCHL、C4H改善的可消化性和/或淀粉提取)，美国专利号6,232,529(通过改变淀粉水平
(AGP)生产高油种子的方法)。本文提及的脂肪酸修饰基因也可用于通过淀粉和油途径的相
互关系影响淀粉含量和/或组成。

[0338] (D)改变的抗氧化剂含量或组成，如改变生育酚或生育三烯酚。例如，参见，涉及操作抗氧化剂水平的美国专利号6,787,683、美国专利申请公开号2004/0034886和WO 2000/
68393，和通过改变尿黑酸香叶基香叶基转移酶(hggt)的WO 2003/082899。

[0339] (E)改变的种子必需氨基酸。例如，参见美国专利号6,127,600(增加种子中必需氨基酸积累的方法)、美国专利号6,080,913(增加种子中必需氨基酸积累的二元方法)、美国
专利号5,990,389(高赖氨酸)、WO 1999/40209(种子中氨基酸组成的改变)、WO 1999/29882
(用于改变蛋白质的氨基酸含量的方法)、美国专利号5,850,016(种子中氨基酸组成的改
变)、WO 1998/20133(具有升高水平的必需氨基酸的蛋白质)、美国专利号5,885,802(高甲
硫氨酸)、美国专利号5,885,801(高苏氨酸)、美国专利号6,664,445(植物氨基酸生物合成
酶)、美国专利号6,459,019(赖氨酸和苏氨酸增加)、美国专利号6,441,274(植物色氨酸合
酶β亚基)、美国专利号6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)、美国专利号5,939,599(高硫)、美国专利号5,912,414(甲硫氨酸增加)、WO 1998/56935(植物氨基酸生物合成酶)、WO 1998/45458
(具有较高百分比的必需氨基酸的工程改造的种子蛋白)、WO 1998/42831(赖氨酸增加)、美
国专利号5,633,436(增加含硫氨基酸含量)、美国专利号5,559,223(具有含可编程水平的
必需氨基酸的明确结构的合成储存蛋白，用于改善植物的营养价值)、WO 1996/01905(苏氨
酸增加)、WO 1995/15392(赖氨酸增加)、美国专利申请公开号2003/0163838、美国专利申请
公开号2003/0150014、美国专利申请公开号2004/0068767、美国专利号6,803,498、WO 
2001/79516。

[0340] 4.控制雄性不育的基因：

[0341] 有若干种赋予遗传性雄性不育的方法，如在基因组内单独位置处赋予雄性不育的多个突变基因，如Brar等人在美国专利号4,654,465和4,727,219中所公开的，以及染色体
易位，如Patterson在美国专利号3,861,709和3,710,511中所述。除这些方法之外，
Albertsen等人的美国专利号5,432,068描述了核雄性不育的系统，其包括：鉴定对雄性能
育性至关重要的基因；沉默这种对雄性能育性至关重要的天然基因；从基本的雄性能育性
基因中除去天然启动子并用诱导型启动子替换；将此经遗传工程改造的基因插回入植物；
并因此产生雄性不育的植物，因为诱导型启动子不是“开”的，导致雄性能育性基因不被转
录。通过诱导或将启动子打“开”来恢复能育性，所述启动子反过来又允许赋予雄性能育性
的基因被转录。

[0342] (A)在绒毡层特异性启动子的控制下以及应用化学品N-Ac-PPT引入脱乙酰酶基因(WO 2001/29237)。

[0343] (B)引入各种雄蕊特异性启动子(WO 1992/13956、WO 1992/13957)。

[0344] (C)引入barnase和barstar基因(Paul等人，(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]19：611-622)。

[0345] 关于细胞核雄性和雌性不育系统和基因的另外的实例，也可参见美国专利号5,859,341；6,297,426；5,478,369；5,824,524；5,850,014和6,265,640，所有这些专利都通过引用并入本文。

[0346] 5.创建用于位点特异性DNA整合的位点的基因。

[0347] 这包括引入可以在FLP/FRT系统中使用的FRT位点和/或可以在Cre/Loxp系统中使用的Lox位点。例如，参见Lyznik等人，(2003)Plant Cell Rep[植物细胞报告]21：925-932
和WO 1999/25821，以上文献通过引用并入本文。可以使用的其他系统包括噬菌体Mu的Gin
重组酶(Maeser等人，(1991)Vicki Chandler，The Maize Handbook[玉蜀黍手册]，第118章
(Springer-Verlag[施普林格出版社]，1994))、大肠杆菌的Pin重组酶(Enomoto等人，1983)
和pSRi质粒的R/RS系统(Araki等人，1992)。

[0348] 6.影响非生物胁迫抗性的基因

[0349] 包括但不限于开花、穗和种子发育、提高氮利用效率、改变氮反应性、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、抗盐性或耐盐性以及在胁迫下产量的增加。

[0350] (A)例如，参见：WO 2000/73475，其中通过改变苹果酸来改变水分利用效率；美国专利号5,892,009、5,965,705、5,929,305、5,891,859、6,417,428、6,664,446、6,706,866、
6,717,034、6,801,104、WO 2000/060089、WO 2001/026459、WO 2001/035725、WO 2001/
034726、WO 2001/035727、WO 2001/036444、WO 2001/036597、WO 2001/036598、WO 2002/
015675、WO 2002/017430、WO 2002/077185、WO 2002/079403、WO 2003/013227、WO 2003/
013228、WO 2003/014327、WO 2004/031349、WO 2004/076638、WO 199809521。

[0351] (B)WO 199938977描述了基因，所述基因包括有效减轻冷冻、高盐度和干旱对植物的负面影响以及赋予植物表型其他积极作用的CBF基因和转录因子。

[0352] (C)美国专利申请公开号2004/0148654和WO 2001/36596，其中脱落酸在植物中被改变，导致改善的植物表型，如增加的产量和/或增加的对非生物胁迫的耐受性。

[0353] (D)WO 2000/006341、WO 2004/090143、美国专利号7,531,723和6,992,237，其中细胞分裂素表达被修饰，导致具有增加的胁迫耐受性的植物，如耐旱性和/或增加的产量。
还可参见，WO 2002/02776、WO 2003/052063、JP 2002/281975、美国专利号6,084,153、WO 
2001/64898、美国专利号6,177,275和美国专利号6,107,547(提高氮利用率和改变氮反应
性)。

[0354] (E)对于乙烯改变，参见美国专利申请公开号2004/0128719、美国专利申请公开号2003/0166197和WO 2000/32761。

[0355] (F)对于植物转录因子或非生物胁迫的转录调节子，参见，例如，美国专利申请公开号2004/0098764或美国专利申请公开号2004/0078852。

[0356] (G)增加液泡焦磷酸酶如AVP1表达以提高产量的基因(美国专利号8,058,515)；编码HSFA4或HSFA5(A4或A5类热休克因子)多肽(寡肽转运蛋白(OPT4样)多肽)的核酸；间隔期
2样(PLA2样)多肽或Wuschel相关同源框1样(WOX1样)多肽(美国专利申请公开号US 2011/
0283420)。

[0357] (H)下调编码聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白的多核苷酸以调节程序性细胞死亡(美国专利号8,058,510)以增加活力。

[0358] (I)编码用于赋予抗旱性的DTP21多肽的多核苷酸(美国专利申请公开号US 2011/0277181)。

[0359] (J)编码用于调节发育、调节对胁迫的应答和调节胁迫耐受性的ACC合酶3(ACS3)蛋白的核苷酸序列(美国专利申请公开号US 2010/0287669)。

[0360] (K)编码赋予耐旱性表型(DTP)以赋予抗旱性的蛋白质的多核苷酸(WO 2012/058528)。

[0361] (L)用于赋予耐旱性和耐盐性的生育酚环化酶(TC)基因(美国专利申请公开号2012/0272352)。

[0362] (M)针对胁迫耐受性的CAAX氨基末端家族蛋白质(美国专利号8,338,661)。

[0363] (N)SAL1编码基因的突变具有增加的胁迫耐受性，包括耐旱性增加(美国专利申请公开号2010/0257633)。

[0364] (O)编码选自下组的多肽的核酸序列的表达，该组由以下组成：GRF多肽、RAA1样多肽、SYR多肽、ARKL多肽、和YTP多肽，这些多肽增加产量相关性状(美国专利申请公开号
2011/0061133)。

[0365] (P)调节植物中编码III类海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)多肽的核酸的表达，用于增强植物中的产量相关性状，特别是增加种子产量(美国专利申请公开号2010/0024067)。

[0366] 影响植物生长和农艺性状(如产量、开花、植物生长和/或植物结构)的其他基因和转录因子可被引入或渐渗到植物中，参见例如WO 1997/49811(LHY)、WO 1998/56918
(ESD4)、WO 1997/10339和美国专利号6,573,430(TFL)、美国专利号6,713,663(FT)、WO 
1996/14414(CON)、WO 1996/38560、WO 2001/21822(VRN1)、WO 2000/44918(VRN2)、WO 
1999/49064(GI)、WO 2000/46358(FR1)、WO 1997/29123、美国专利号6,794,560、美国专利
号6,307,126(GAI)、WO 1999/09174(D8和Rht)以及WO 2004/076638和WO 2004/031349(转
录因子)。

[0367] 7.赋予增加的产量的基因

[0368] (A)由编码核酸的1-氨基环丙烷-1-羧酸酯脱氨酶样多肽(ACCDP)转化的转基因作物植物，其中，与所述植物的野生型品种相比，在所述作物植物中的核酸序列的表达使所述
植物具有增加的根生长、和/或增加的产量、和/或增加的对环境胁迫的耐受性(美国专利号
8,097,769)。

[0369] (B)已显示，使用种子偏好性启动子的玉蜀黍锌指蛋白基因(Zm-ZFP1)的过表达能促进植物生长、增加每株植物的籽粒数和总籽粒重量(美国专利申请公开号2012/
0079623)。

[0370] (C)已显示，玉蜀黍侧生器官界限(LOB)结构域蛋白(Zm-LOBDP1)的组成型过表达能增加每株植物的籽粒数和总籽粒重量(美国专利申请公开号2012/0079622)。

[0371] (D)通过调节植物中编码VIM1(甲基化1中的变体)样多肽或VTC2样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽或DUF1685多肽或ARF6样(生长素应答因子)多肽(WO 2012/038893)的核酸
的表达来增强植物中产量相关的性状。

[0372] (E)调节植物中编码Ste20样多肽或其同源物的核酸的表达，得到相对于对照植物具有增加的产量的植物(EP 2431472)。

[0373] (F)编码用于修饰植物根系结构的核苷二磷酸酶激酶(NDK)多肽及其同源物的基因(美国专利申请公开号2009/0064373)。

[0374] 8.赋予植物可消化性的基因。

[0375] (A)通过调节木聚糖合成酶的表达来改变存在于植物细胞壁中的木聚糖水平(美国专利号8,173,866)。

[0376] 在一些实施例中，堆叠的性状可以是已经获得监管许可的性状或事件，包括但不限于如下具有监管许可的事件，其是本领域技术人员熟知的并且可以在环境风险评估中心
(cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database，其可以使用www前缀进行访问)和在国际农
业生物技术应用服务部门(isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp，其可以使用www
前缀进行访问)找到。

[0377] 基因沉默

[0378] 在一些实施例中，堆叠的性状可以处于一种或多种目的多核苷酸沉默的形式，导致对一种或多种靶标有害生物多肽的抑制。在一些实施例中，通过抑制DNA构建体的使用来
实现所述沉默。

[0379] 在一些实施例中，编码IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的多肽或其片段或变体的一种或多种多核苷酸可以与编码具有如上所述的杀昆虫活性或农艺性状的一种或多
种多肽的一种或多种多核苷酸堆叠，并且任选地可以进一步包括提供如下丈所述一种或多
种靶多核苷酸的基因沉默的一种或多种多核苷酸。

[0380] “抑制DNA构建体”是重组DNA构建体，当被转化或稳定整合到植物的基因组中时，导致所述植物中靶基因的“沉默”。所述靶基因对于所述植物可以是内源的或转基因的。如
本文中关于靶基因所用的“沉默”通常是指抑制由所述靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水
平，和/或酶活性或蛋白质功能性的水平。术语“抑制”包括调低、降低、下降、减少、抑制、消除和预防。“沉默”或“基因沉默”并没有指定机制，并且包括但不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi的方法和基于小RNA的方法。

[0381] 抑制DNA构建体可以包含源自目的靶基因的区域，并且可以包含目的靶基因的正义链(或反义链)的全部或部分核酸序列。取决于待使用的方法，所述区域可以与目的基因
的全部或部分正义链(或反义链)具有100％同一性或小于100％同一性(例如，至少50％或
者51％和100％之间任何整数的同一性)。

[0382] 抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选择了目的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建
体、产生双链RNA的构建体、以及(更普遍地)RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体(如siRNA
(短干扰RNA)构建体和miRNA(微小RNA)构建体)。

[0383] “反义抑制”是指能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物的产生。

[0384] “反义RNA”是指与靶标初级转录物或mRNA的全部或部分互补、并且阻断靶标分离的核酸片段表达的RNA转录物。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、
3′非编码序列、内含子或编码序列互补。

[0385] “共抑制”是指能够抑制靶蛋白表达的正义RNA转录物的产生。“正义”RNA是指包含mRNA并且可以在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已通过着眼于以正义方向过表达与天然mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA
减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见，Vaucheret等人，(1998)Plant J.[植物杂
志]，16：651-659和Gura，(2000)Nature[自然]404：804-808)。

[0386] 另一个变化描述了植物病毒序列用于指导近端mRNA编码序列的抑制的用途(PCT公开号WO 1998/36083)。

[0387] 最近的工作已经描述了并入互补方向上的全部或部分mRNA编码序列的“发夹”结构的用途，所述“发夹”结构产生了已表达的RNA的潜在“茎-环”结构(PCT公开WO 1999/
53050)。在这种情况下，所述茎由对应于相对于启动子在正义或反义方向上插入的目的基
因的多核苷酸形成，并且所述环由目的基因的一些多核苷酸形成，这些多核苷酸在所述构
建体中不具有互补序列。这增加了已回收的转基因植物中共抑制或沉默的频率。对于发夹
抑制的综述，参见Wesley等人，(2003)Methods in Molecular Biology，Plant Functional Genomics：Methods and Protocols[分子生物学中的方法，植物功能基因组：方法和方案]
236：273-286。

[0388] 具有由来自待抑制的基因的至少30个核苷酸形成的茎和由随机核苷酸序列形成环的构建体也已被有效地用于抑制(PCT公开WO 1999/61632)。

[0389] 也已经描述了使用多聚-T和多聚-A序列来产生茎-环结构中的茎(PCT公开WO 2002/00894)。

[0390] 另一个变化包括使用合成重复序列促进茎-环结构中的茎的形成。已经显示用这种重组DNA片段制备的转基因生物体中由PCT公开WO 2002/00904中所述的形成环的核苷酸
片段编码的蛋白质的水平降低。

[0391] RNA干扰是指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，(1998)Nature[自然]391：806)。植物中相应的过程通常称为转录后基因沉默
(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为压抑(quelling)。转录后基因沉默的过程被认为是
进化上保守的细胞防御机制，用于预防外源基因的表达，并且通常为不同的区系(flora)和
门(phyla)所共享(Fire等人，(1999)Trends Genet.[遗传学趋势]15：358)。这种来自外源
基因表达的保护可以应答于源自病毒感染的双链RNA(dsRNA)的产生或者从通过特异性破
坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应将转座子元件随机整合到宿主基因组中而逐
步形成。dsRNA在细胞中的存在通过尚未完全表征的机制来触发RNAi应答。

[0392] 细胞中长dsRNA的存在刺激被称为切丁酶(dicer)的核糖核酸酶III酶的活性。切丁酶参与将dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的dsRNA短片(Berstein等人，(2001)
Nature[自然]409：363)。源自切丁酶活性的短干扰RNA的长度典型地为约21至约23个核苷
酸并且包含约19个碱基对双链体(Elbashir等人，(2001)Genes Dev.[基因与发育]15：
188)。切丁酶也已经涉及从涉及翻译控制的保守结构的前体RNA中切除21-和22-核苷酸时
序小RNA(stRNA)(Hutvagner等人，(2001)Science[科学]293：834)。RNAi应答也是内切核酸
酶复合物的特点，所述内切核酸酶复合物通常被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其介导
与siRNA双链体的反义链具有序列互补性的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双
链体的反义链互补的区域的中间(Elbashir等人，(2001)Genes Dev.[基因与发育]15：
188)。此外，RNA干扰还可以涉及小RNA(例如miRNA)介导的基因沉默，推测是通过调节染色
质结构的细胞机制，并且从而防止靶基因序列的转录(参见例如，Allshire，(2002)Science
[科学]297：1818-1819；Volpe等人，(2002)Science[科学]297：1833-1837；Jenuwein，
(2002)Science[科学]297：2215-2218以及Hall等人，(2002)Science[科学]297：2232-
2237)。因此，本公开的miRNA分子可用于经由与RNA转录物的相互作用或者通过与特定基因
序列的相互作用来介导基因沉默，其中这种相互作用导致转录或转录后水平的基因沉默。

[0393] 进一步提供了允许产生自沉默元件的RNAi增加的方法和组合物。在这类实施例中，所述方法和组合物采用第一多核苷酸，其包含可操作地连接到植物细胞中有活性的启
动子的靶标有害生物序列的沉默元件；以及第二多核苷酸，其包含抑制增强子元件，所述抑
制增强子元件包含靶标有害生物序列或者与在植物细胞中有活性的启动子可操作地连接
的活性变体或其片段。具有抑制增强子元件的沉默元件的组合表达导致从所述沉默元件产
生的抑制性RNA的扩增增加超过了仅单独通过所述沉默元件的表达可实现的增加程度。除
了特异性RNAi物种本身的扩增增加之外，所述方法和组合物进一步允许产生可以增强破坏
靶基因表达的有效性的多种RNAi物种群体。正如，当抑制增强子元件在植物细胞中与沉默
元件组合表达时，所述方法和组合物可以允许在整个植物内系统地产生RNAi；生产比仅单
独用沉默元件构建体所能观察到的更大量的RNAi；以及更多的RNAi加载入植物韧皮部中，
从而通过RNAi方法更好地防治取食韧皮部的昆虫。因此，各种方法和组合物提供了将抑制
性RNA递送至靶生物体的改善方法。参见，例如美国专利申请公开2009/0188008。

[0394] 如本文所用的，“抑制增强子元件”包含如下多核苷酸，所述多核苷酸包含待抑制的靶序列或者其活性片段或变体。应当认识到，抑制增强子元件不需要与靶序列相同，但是
所述抑制增强子元件可以包含所述靶序列的变体，只要所述抑制增强子元件与靶序列具有
足够的序列同一性，以允许由所述沉默元件产生的RNAi的水平增加超过仅通过所述沉默元
件的表达可达到的增加程度。相似地，所述抑制增强子元件可以包含所述靶序列的片段，其
中所述片段具有足够的长度以允许由所述沉默元件产生的RNAi的水平增加超过仅通过所
述沉默元件表达可实现的增加程度。

[0395] 应当认识到，可以使用来自相同靶序列或来自不同靶序列或者来自相同靶序列的不同区域的多种抑制增强子元件。例如，所使用的抑制增强子元件可以包含源自靶序列的
不同区域(即来自3′UTR、编码序列、内含子和/或5′UTR)的靶序列片段。此外，如本文别处所述，所述抑制增强子元件可以包含在表达盒中，并且在具体实施例中，所述抑制增强子元件
在与所述沉默元件相同或不同的DNA载体或构建体上。所述抑制增强子元件可以可操作地
连接到如本文公开的启动子上。应当意识到，可以组成型或替代地表达抑制增强子元件，或
可替代地，所述元件能以阶段特异性方式使用本文别处讨论的各种可诱导或组织偏好性或
发育调节的启动子产生。

[0396] 在具体实施例中，使用沉默元件和抑制增强子元件两者时，RNAi的系统性产生发生在整个植物中。在另外的实施例中，本公开的植物或植物部分具有比用单独的沉默元件
构建体的表达所能观察到的更多的RNAi加载入植物韧皮部中，并且从而通过RNAi方法更好
地防治取食韧皮部的昆虫。在具体实施例中，本公开的植物、植物部分和植物细胞可以进一
步被表征为允许产生多种RNAi种类，这些RNAi种类可以增强破坏靶基因表达的有效性。

[0397] 在具体实施例中，沉默元件和抑制增强子元件的组合表达使植物细胞、植物、植物部分、植物组织或韧皮部中抑制性RNA的浓度增加超过单独表达所述沉默元件时所能达到
的增加水平。

[0398] 如本文所用的，当与适当的对照植物相比时，“抑制性RNA的水平增加”包括在具有所述组合表达的植物中产生的RNAi水平的任何统计学上显著的增加。例如，当与适当的对
照相比时，植物、植物部分或植物细胞中RNAi水平的增加可以包含植物、植物部分、植物细
胞或韧皮部中RNAi水平的至少约1％、约1％-5％、约5％-10％、约10％-20％、约20％-30％、约30％-40％、约40％-50％、约50％-60％、约60％-70％、约70％-80％、约80％-90％、约
90％-100％或更高的增加。

[0399] 在其他实施例中，当与适当的对照相比时，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中RNAi水平的增加可以包含植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中RNAi水平的至少约1倍、约1
倍-5倍、约5倍-10倍、约10倍-20倍、约20倍-30倍、约30倍-40倍、约40倍-50倍、约50倍-60倍、约60倍-70倍、约70倍-80倍、约80倍-90倍、约90倍-100倍或更多倍的增加。美国专利申请公开2011/0301223和美国专利申请公开2009/0192117中可以找到用于防治蝽象和草盲
蝽属(Lygus)的沉默元件和抑制增强子元件组合表达的实例。

[0400] 一些实施例涉及通过干扰核糖核酸(RNA)分子下调昆虫有害生物物种中靶基因的表达。PCT公开WO 2007/074405描述了抑制无脊椎动物有害生物(包括科罗拉多马铃薯甲虫
(Colorado potato beetle))中靶基因表达的方法。PCT公开WO 2005/110068描述了抑制无
脊椎动物有害生物(特别是包括西方玉米根虫)中靶基因表达的方法，所述方法作为控制昆
虫侵袭的手段。此外，PCT公开WO 2009/091864描述了用于抑制来自昆虫有害生物物种(包
括来自草盲蝽属的有害生物)的靶基因的组合物和方法。核酸分子包括用于靶向液泡ATP酶
H亚基的RNAi，可用于控制如美国专利申请公开号2012/0198586中所述的鞘翅目有害生物
群体和侵袭。PCT公开WO 2012/055982描述了抑制或下调编码以下的靶基因表达的核糖核
酸(RNA或双链RNA)：昆虫核糖体蛋白，如核糖体蛋白L19、核糖体蛋白L40或核糖体蛋白
S27A；昆虫蛋白酶体亚基，如Rpn6蛋白、Pros 25、Rpn2蛋白、蛋白酶体β1亚基蛋白或Prosβ2蛋白；COPI囊泡的昆虫β-外被体、COPI囊泡的γ-外被体、COPI囊泡的β′-外被体蛋白或ζ-外被体；昆虫跨膜四蛋白(Tetraspanin)2A蛋白(推定的跨膜结构域蛋白)；属于肌动蛋白家族
的昆虫蛋白，如肌动蛋白5C；昆虫泛素-5E蛋白；昆虫Sec23蛋白，其是参与细胞内蛋白质转
运的GTP酶激活剂；涉及运动活性的作为非常规肌球蛋白的昆虫皱纹蛋白质；涉及核替代
mRNA剪接调节的昆虫曲颈蛋白；昆虫囊泡H+-ATP酶G亚基蛋白和昆虫Tbp-1如Tat结合蛋白。
PCT公开WO2007/035650描述了抑制或下调编码Snf7的靶基因表达的核糖核酸(RNA或双链
RNA)。美国专利申请公开2011/0054007描述了靶向RPS10的多核苷酸沉默元件。美国专利申
请公开2014/0275208和US 2015/0257389描述了靶向RyanR和PAT3的多核苷酸沉默元件。
PCT专利申请公开WO 2016/138106描述了靶向外被体α或γ的多核苷酸沉默元件。美国专利
申请公开2012/029750、US20120297501和2012/0322660描述了干扰核糖核酸(RNA或双链
RNA)，所述干扰核糖核酸在被昆虫有害生物物种摄取时起作用以下调昆虫有害生物中靶基
因的表达，其中所述RNA包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件是包含经退火的互补链
的双链RNA区域，所述双链RNA区域的一条链包含或由如下核苷酸序列组成，所述核苷酸序
列至少部分地与靶基因中的靶标核苷酸序列互补。美国专利申请公开2012/0164205描述了
干扰双链核糖核酸以抑制无脊椎动物有害生物的潜在靶标，包括：Chd3同源序列、β-微管蛋白同源序列、40kDa V-ATP酶同源序列、EF1α同源序列、26S蛋白质体亚基p28同源序列、保幼激素环氧化物酶水解酶同源序列、溶胀依赖氯通道蛋白同源序列、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶
蛋白同源序列、Act42A蛋白同源序列、ADP-核糖因子1同源序列、转录因子IIB蛋白同源序
列、几丁质酶同源序列、泛素缀合酶同源序列、甘油醛-3-磷酸脱氢酶同源序列、泛素B同源
序列、保幼激素酯酶同源物、和α微管蛋白同源序列。

[0401] 在有害生物控制方面的用途

[0402] 在有害生物控制或使其他生物体工程化中使用包含实施例的核酸序列或其变体的菌株作为杀有害生物剂的一般方法是本领域已知的。

[0403] 可以选择已知占据一种或多种目的作物的“植物圈”(叶面、叶际、根围和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境中成功地与野生型微生物竞争，为表
达IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的基因供给稳定的维持和表达，并且理想的是，增
加对所述杀有害生物剂的保护使其不受环境降解和失活的影响。

[0404] 可替代地，通过将异源基因引入细胞宿主中来产生IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽。异源基因的表达直接或间接地导致杀有害生物剂在细胞内产生和维持。然后，
当将细胞应用于一种或多种靶标有害生物的环境中时，在延长所述细胞中所产生的毒素的
活性的条件下处理这些细胞。所得产物保留所述毒素的毒性。然后可以根据常规技术配制
这些天然包封的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽，以施用于靶标有害生物所寄宿的环
境(例如，土壤、水和植物的叶子)中。参见，例如EPA 0192319及其中引用的参考文献。

[0405] 杀有害生物组合物

[0406] 在一些实施例中，活性成分能以组合物的形式施用并且可以与其他化合物同时或相继施用于需要处理的作物区域或植物。这些化合物可以是在单次施用所述制剂后允许长
期对靶区域进行给予的肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、杀有害生物肥皂、休眠油、聚合物和/或延时释放的或可生物降解的运载体制剂。它们还可以是选择性除草
剂、化学杀昆虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀有害生物剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制品中的若干种的混合物，如果需要，与在制剂领域内
通常使用的另外的农业上可接受的运载体、表面活性剂或促进施用的佐剂一起。合适的运
载体和佐剂可以是固体或液体，并且对应于在制剂技术中常常采用的物质，例如天然的或
再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。类似地，制剂可以制备成可食用的“诱饵”或者塑成有害生物“陷阱”以允许靶标有害生物取食或摄取所述有害生物制剂。

[0407] 施用含有由细菌菌株产生的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽中的至少一种的活性成分或农用化学组合物的方法包括叶子施用、种子涂层和土壤施用。施用次数和施
用速度取决于相应有害生物侵袭的强度。

[0408] 可以将组合物配制成粉末、尘剂、丸剂、颗粒、喷雾、乳液、胶体、溶液等，并且可以通过干燥、冻干、匀浆、萃取、过滤、离心、沉降或浓缩包含所述多肽的细胞培养物等常规方法进行制备。在所有这类含有至少一种这样的杀有害生物多肽的组合物中，所述多肽能以按重量计从约1％至约99％的浓度存在。

[0409] 可以通过本公开的方法在给定区域中杀灭鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目或鞘翅目有害生物或减少其数量，或者可以预防性地将其施用于环境区域以防止易感有害
生物的侵袭。优选地，所述有害生物摄入杀有害生物有效量的多肽或与其接触。如本文所用
的，“杀有害生物有效量”是指能够对至少一种有害生物造成死亡或显著减少有害生物生
长、取食或正常生理发育的杀有害生物剂的量。所述量将根据例如待控制的具体靶标有害
生物，待处理的特定环境、地点、植物、作物或农业场所，环境条件以及杀有害生物有效的多肽组合物施用的方法、速率、浓度、稳定性和数量等因素而变化。制剂也可以根据气候条件、环境因素和/或施用频率和/或有害生物侵袭的严重程度而变化。

[0410] 可以通过用所需的农业上可接受的运载体配制细菌细胞、晶体和/或孢子悬浮液或分离的蛋白组分来制备所需的杀有害生物剂组合物。可以在施用之前以适当方式(如冻
干、冷冻干燥、干燥)或者在水性运载体、培养基或合适的稀释剂(如盐水或其他缓冲液)中
配制所述组合物。配制的组合物可以是尘剂或颗粒状物质的形式或者在油(植物或矿物)或
水或油/水乳液中的悬浮液或者作为可湿性粉剂或者与适用于农业应用的任何其他运载体
材料组合的形式。合适的农业运载体可以是固体或液体，并且是本领域公知的。术语“农业
上可接受的运载体”涵盖通常用于杀有害生物剂制剂技术的所有佐剂、惰性组分、分散剂、
表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些是杀有害生物剂制剂技术人员所熟知的。制剂可以与
一种或多种固体或液体佐剂混合，并通过各种方法(例如通过使用常规制剂技术将杀有害
生物组合物与合适的佐剂均匀混合、共混和/或研磨)制备。美国专利号6,468,523中描述了
合适的制剂和施用方法，其通过引用并入本文。还可以用一种或多种化学组合物处理植物，
所述化学组合物包括一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂。示例性化学组合物包括：果
实/蔬菜除草剂：莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草铵膦、氯吡嘧磺隆Gowan、百草枯、戊炔草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、茚嗪氟草胺(Indaziflam)；果实/蔬菜杀昆虫剂：涕灭威、苏云金芽孢杆菌、甲萘威、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、二嗪磷、马拉硫磷、阿维菌素、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、λ-氯氟氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、双苯氟脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、唑虫酰胺、噻虫胺、螺螨酯、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、氯虫酰胺、氰虫酰胺、Spinoteram、杀虫脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氯虫双酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、Cyanopyrafen、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、Spinotoram、硫双威、氟啶虫酰胺、甲硫威、因灭汀-苯甲酸盐、茚虫威、噻唑磷、苯线磷、硫线磷、蚊蝇醚、苯丁锡、噻螨酮、灭多威、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮；果实/蔬菜杀真菌剂：多菌
灵、百菌清、EBDC、硫、甲基硫菌灵、嘧菌酯、霜脲氰、氟啶胺、乙膦酸、异菌脲、醚菌酯、甲霜灵/精甲霜灵、肟菌酯、噻唑菌胺、丙森锌、肟菌酯、环酰菌胺、富马酸噁咪唑、氰霜唑、咪唑菌酮、苯酰菌胺、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、环氟菌胺、啶酰菌胺；谷物除草剂：异丙隆、溴苯腈、碘苯腈、苯氧基类、氯磺隆、炔草酸、禾草灵、吡氟草胺、噁唑禾草灵、双氟磺草胺、氟草烟、甲磺隆、醚苯磺隆、氟酮磺隆、碘磺隆、丙苯磺隆、氟吡酰草胺、甲磺胺磺隆、氟丁酰草胺、唑啉草酯、酰嘧磺隆、噻吩磺隆甲基、苯磺隆、氟啶嘧磺隆、磺酰磺隆、磺酰草吡唑、甲氧磺草胺、氟噻草胺、肟草酮、吡咯磺隆；谷物杀真菌剂：多菌灵、百菌清、嘧菌酯、环唑醇、嘧菌环胺、丁苯吗啉、氟环唑、醚菌酯、喹氧灵、戊唑醇、肟菌酯、硅氟唑、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌胺、丙硫菌唑、氟嘧菌酯；谷物杀昆虫剂：乐果、λ-氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、α-氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、Clorphyriphos、甲胺磷、乙酰甲胺磷、抗蚜威、甲硫威；玉蜀黍除草剂：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S-)二甲酚草胺、草铵膦、草甘膦、异噁唑草酮、(S-)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、苯吡唑草酮、环磺酮(Tembotrione)、嘧啶肟草醚、酮脲磺草吩酯、氟噻草胺、吡咯磺隆；玉蜀黍杀昆虫剂：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、λ-氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、螺甲螨酯、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、杀虫隆、七氟菊酯、嘧丙磷、乙虫腈、氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素、甲硫威、螺螨酯、螺虫乙酯；玉蜀黍杀真菌剂：种衣酯、福美双、丙硫菌唑、戊唑醇、肟菌酯；水稻除草剂：丁草胺、敌稗、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草酯、杀草隆、四唑酰草胺、唑吡嘧磺隆、苯噻草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、禾草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、去稗安、苯并双环酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚、丙炔噁草酮、乙氧嘧磺隆、丙草胺、甲基磺草酮、特呋三酮、噁草酮、噁唑禾草灵、吡丙醚；水稻杀昆虫剂：二嗪磷、杀螟硫磷、仲丁威、久效磷、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、噻虫胺、乙虫腈、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氯氰菊酯、毒死蜱、杀螟丹、甲胺磷、醚菊酯、三唑磷、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、克百威、丙硫克百
威；水稻杀真菌剂：甲基硫菌灵、嘧菌酯、环丙酰菌胺、敌瘟磷、嘧菌腙、异稻瘟净、稻瘟灵、戊菌隆、噻菌灵、咯喹酮、三环唑、肟菌酯、双氯氰菌胺、氰菌胺、硅氟唑、噻酰菌胺；棉花除草剂：敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、吡氟禾草灵-丁基、草甘膦、达草灭、二甲戊乐灵、嘧硫草醚钠、三氟啶磺隆、得杀草、草铵膦、丙炔氟草胺、塞苯隆；棉花杀昆虫剂：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、马拉硫磷、久效磷、阿维菌素、啶虫脒、因灭汀-苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威、λ-氯氟氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氯虫双酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、
Spinotoram、γ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2
(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、氟啶虫胺腈、丙溴磷、三唑磷、硫丹；棉花杀真菌剂：土菌灵、甲霜灵、喹硫磷；大豆除草剂：甲草胺、灭草松、氟乐灵、氯嘧磺隆-乙基、氯酯磺草胺、噁唑禾草灵、氟磺胺草醚、吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊乐灵、得杀草、草铵膦；大豆杀昆虫剂：λ-氯氟氰菊酯、灭多威、对硫磷、硫威(Thiocarb)、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀虫脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂：嘧菌酯、环唑醇、氟环唑、粉唑醇、吡唑醚菌酯、戊唑醇、肟菌酯、丙硫菌唑、四氟醚唑；甜菜除草剂：杀草敏、甜菜安、乙氧氟草黄、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、氟胺磺隆、得杀草、喹禾灵；甜菜杀昆虫剂：吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ/λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、氰虫酰胺、氟虫腈、克百威；卡诺拉油菜除草剂：二氯吡啶酸、禾草灵、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐灵、胺苯磺隆、喹草酸、喹禾灵、烯草酮、得杀草；卡诺拉油菜杀真菌剂：嘧菌酯、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、丙氯灵、烯菌酮；卡诺拉油菜杀昆虫剂：克百威、有机磷酸盐类、拟除虫菊酯、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ以及λ氯氟氰菊酯、τ-氟氰胺菊酯、乙虫腈、多杀菌素、Spinotoram、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。

[0411] 在一些实施例中，除草剂是莠去津、除草定、敌草隆、氯磺隆、甲磺隆、噻吩磺隆甲基、苯磺隆、乙草胺、麦草畏、异噁唑草酮、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆、嘧硫草醚钠、丙炔氟草胺、氯嘧磺隆-乙基、嗪草酮、喹禾灵、精异丙甲草胺(S-metolachlor)、环己通(Hexazinne)或其组合。

[0412] 在一些实施例中，杀昆虫剂是高氰戊菊酯、氯虫苯甲酰胺、灭多威、茚虫威、草氨酰或其组合。

[0413] 杀有害生物和杀昆虫活性

[0414] “有害生物”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。昆虫有害生物包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目
(Trichoptera)等，特别是鳞翅目和鞘翅目。

[0415] 本领域的技术人员会知道，不是所有的化合物均对所有有害生物同样有效。实施例的化合物显示针对昆虫有害生物的活性，其可以包括经济上重要的农艺学、森林、温室、
苗圃观赏植物、食物和纤维，公共和动物健康，国内和商业结构，家庭和储存产品有害生物。

[0416] 鳞翅目幼虫包括但不限于：夜蛾科(Noctuidae)中的夜蛾、地老虎、尺蠖和实夜蛾亚科，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda JE Smith)(秋夜蛾(fall armyworm))；甜菜夜
蛾(S.exigua Hübner)(甜菜夜蛾(beet armyworm))；斜纹夜蛾(S.litura Fabricius)(斜
纹夜蛾(tobacco  cutworm)，茶蚕(cluster caterpillar))；蓓带夜蛾(Mamestra 
configurata Walker)(披肩粘虫(bertha armyworm))；甘蓝夜蛾(M.brassicae Linnaeus)
(菜夜蛾(cabbage moth))；小地老虎(Agrotis ipsilon Hufhagel)(黑切根虫(black 
cutworm))；西方灰地老虎(A.orthogonia Morrison)(西部切根虫(western cutworm))；粒
肤地老虎(A.subterranea Fabricius)(粒肤切根虫(granulate cutworm))；棉叶波纹夜蛾
(Alabama argillacea Hübner)(棉叶虫(cotton leaf worm))；粉纹夜蛾(Trichoplusia 
ni Hübner)(甘蓝银纹夜蛾(cabbage looper))；大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens 
Walker)(大豆夜蛾(soybean looper))；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner，
velvetbean caterpillar)；粗长须夜蛾(Hypena scabra Fabricius)(苜猜绿夜蛾(green 
cloverworm))；烟芽夜蛾(Heliothis  virescens Fabricius)(烟青虫(tobacco 
budworm))；一星黏虫(Pseudaletia umpuncta Haworth)(夜蛾)；粗皮委夜蛾(Athetis 
mindara Barnes and Mcdunnough)(粗皮切根虫(rough skinned cutworm))；暗缘地老虎
(Euxoa messoria Harris)(暗黑切根虫(darksided cutworm))；棉斑实蛾(Earias 
insulana Boisduval)(多刺螟蛉(spiny bollworm))；翠纹钻夜蛾(E.vittella 
Fabricius)(斑点螟蛉(spotted bollworm))；棉铃虫(Helicoverpa armigera Hübner)(美
洲螟蛉(American bollworm))；玉米穗虫(玉米穗蛾(corn earworm)或棉螟蛉(cotton 
bollworm))；斑马纹夜蛾(Melanchra picta Harris)(斑马纹夜蛾(zebra caterpillar))；
柑橘夜蛾(Egira(Xylomyges)curialis Grote)(柑橘地老虎(citrus cutworm))；来自螟蛾
科玉米螟(Ostrinia nubilalis Hübner，欧洲玉米螟(European corn borer))的螟虫、鞘
蛾、结网虫、锥形虫(coneworms)、和雕叶虫(skeletonizers)；脐橙螟蛾(Amyelois 
transitella Walker)(脐橙螟(naval orangeworm))；地中海粉螟(Anagasta kuehniella 
Zeller)(地中海粉斑螟(Mediterranean flour moth))；干果斑螟(Cadra cautella 
Walker)(粉斑螟(almond moth))；二化螟(Chilo suppressalis Walker)(水稻螟虫(rice 
stem borer))；斑禾草螟(C.partellus)，(高粱螟(sorghum borer))；米螟(Corcyra 
cephalonica Stainton)(米蛾(rice moth))；玉米根草螟(Crambus caliginosellus 
Clemens)(玉米根结网虫(corn root webworm))；早熟禾草螟(C.teterrellus Zincken)
(早熟禾草螟(bluegrass webworm))；稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenée)
(稻纵卷叶螟(rice leaf roller))葡萄里予螟(Desmia funeralis Hübner)(葡萄野螟
(grape leaffolder))；甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus)(甜瓜野螟(melon 
worm))；黄瓜绢野螟(D.nitidalis Stoll)(泡菜虫(pickleworm))；巨座玉米螟(Diatraea 
grandiosella Dyar)(西南玉米秆草螟(southwestern  corn borer))、蔗螟
(D.saccharalis Fabrieius)(甘蔗螟虫(surgarcane borer))；墨西哥稻螟(Eoreuma 
loftini Dyar)(墨西哥稻螟(Mexican rice borer))；烟草粉斑螟(Ephestia elutella Hü
bner)(烟草飞蛾(tobacco(cacao)moth))；大蜡螟(Galleria mellonella Linnaeus)(大蜡
蛾(greater wax moth))；水稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis Walker)(草地螟
(sod webworm))；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum Hulst)(向日葵螟(sunflower 
moth))；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus Zeller)(小玉米茎蛀虫(lesser 
cornstalk borer))；小蜡螟(Achroia grisella Fabricius)(小蜡蛾(lesser wax 
moth))；草地螟(Loxostege sticticalis Linnaeus)(草地螟(beet webworm))；茶树螟
(Orthaga thyrisalis Walker)(茶树蛾(tea tree web moth))；豆英野螟(Maruca 
testulalis Geyer)(豆英蛀螟(bean pod borer))；印度谷螟(Plodia interpunctella Hü
bner)(印度谷螟(Indian meal moth))；三化螟(Scirpophaga incertulas Walker)(三化
螟(yellow stem borer))；温室螟(Udea rubigalis Guenée)(芹菜卷叶螟(celery 
leaftier))；和卷蛾科(Tortricidae)中的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫，西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana Walsingham)(西部黑头蚜虫(Western blackheaded 
budworm))；东部黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald)(东部黑头蚜虫(Eastern 
blackheaded budworm))；果树黄卷蛾(Archips argyrospila Walker)(果树卷叶蛾(fruit 
tree leaf roller))；罗萨娜黄卷蛾(A.rosana Linnaeus)(欧洲卷叶蛾(European leaf 
roller))；和其他黄卷蛾属物种，苹小卷叶蛾(Adoxophyes orana Fischer von 
)(苹果小卷蛾(summer fruit tortrix moth))；条纹向日葵螟(Cochylis 
hospes Walsingham)(带状向日葵斑蛾(banded sunflower moth))；榛小卷蛾(Cydia 
latife rreana Walsingham)(filbertworm)；苹果蠹蛾(C.pomonella Linnaeus)(苹果蚕
蛾(codling moth))；杂色卷叶蛾(Platynota flavedana Clemens)(色稻纵卷叶螟
(variegated leafroller))；荷兰石竹小卷蛾(P.stultana Walsingham)(杂食卷叶蛾
(omnivorous leafroller))；鲜食葡萄小卷蛾(Lobesia botrana Denis&Schiffermüller)
(欧洲葡萄蛾(European grape vine moth))；苹白小卷蛾(Spilonota ocellana Denis&
Schiffermüller)(苹果芽小卷叶蛾(eyespotted bud moth))；萄果实虫主虫(Endopiza 
viteana Clemens)(葡萄小卷叶蛾(grape berry moth))；女贞细卷蛾(Eupoecilia 
ambiguella Hübner)(葡萄果蠹蛾(vine moth))；巴西苹果卷叶虫(Bonagota salubricola 
Meyrick)(巴西苹果小卷叶蛾(Brazilian apple leafroller))；东方果实蛾(Grapholita 
molesta  Busck)(梨小食心虫(oriental fruit moth))；向日葵芽蛾(Suleima 
helianthana Riley)(向日葵芽蛾(sunflower bud moth))；带卷蛾属物种(Argyrotaenia 
spp.)；卷叶蛾属物种(Choristoneura spp.)。

[0417] 鳞翅目中选择的其他农艺学有害生物包括但不限于秋星尺蠖(Alsophila pometaria Harris)(秋星尺蠖(fall cankerworm))；桃条麦蛾(Anarsia lineatella 
Zeller)(桃条麦蛾(peach twig borer))；栎橙纹犀额蛾(Anisota senatoria J.E.Smith)
(橙色斑纹橡木虫(orange striped oakworm))；柞蚕(Antheraea pernyi Guérin-Mé
neville)(中橡木柞蚕虫(Chinese Oak Tussah Moth))；家蚕(Bombyx mori Linnaeus)(桑
蚕(Silkworm))；棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella Busck)(棉叶潜蛾(cotton leaf 
perforator))；纹黄豆粉蝶(Colias eurytheme Boisduval)(苜蓿粉蝶(alfalfa 
caterpillar))；核桃舟蛾(Datana integerrima Grote&Robinson)(核桃天社蛾(walnut 
caterpillar))；落叶松毛虫(Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov)(西伯利亚蚕蛾
(Siberian silk moth))，白尺蠖蛾(Ennomos subsignaria Hübner)(榆角尺蠖(elm 
spanworm))；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris)(椴尺蠖(linden looper))；黄毒蛾
(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus)(棕尾毒蛾(browntail moth))；黑拟蛉蛾
(Harrisina americana Guérin-Méneville)(野棉花夜蛾(grapeleaf skeletonizer))；牧
草天蚕蛾(Hemileuca oliviae Cockrell)(牧草天蚕蛾(range caterpillar))；美国白蛾
(Hyphantria  cunea Drury)(美国白蛾(fall webworm))；番茄茎麦蛾(Keiferia 
lycopersicella Walsingham)(番茄蛲虫(tomato pinworm))；东部铁杉尺蠖(Lambdina 
fiscellaria fiscellaria Hulst)(东部铁杉尺蠖(Eastern hemlock looper))；西部铁杉
尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)(西部铁杉尺蠖(Western hemlock looper))；柳
毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)(雪毒蛾(satin moth))；舞毒蛾(Lymantria dispar 
Linnaeus)(舞毒蛾(gypsy moth))；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata Haworth)(五点
天蛾(five spotted hawk moth)，番茄天蛾(tomato hornworm))；烟草天蛾(M.sexta 
Haworth)(番茄天蛾(tomato hornworm)、烟草天蛾(tobacco hornworm))；冬尺蠖蛾
(Operophtera brumata Linnaeus)(冬尺蠖蛾(winter moth))；春尺蠖(Paleacrita 
vernata Peck)(春尺蠖(spring cankerworm))；美洲大芷凤蝶(Papilio cresphontes 
Cramer)(大黄带凤蝶(giant swallowtail)，柑桔凤蝶(orange dog))；加州木角斗蛾
(Phryganidia californica Packard)(加州槲蛾(California oakworm))；柑桔潜蛾
(Phyllocnistis citrella Stainton)(柑桔潜叶蛾(citrus leafminer))；斑幕潜叶蛾
(Phyllonorycter blancardella Fabricius)(斑点幕型潜叶虫(spotted tentiform 
leafminer))；欧洲粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)(大白粉蝶(large white 
butterfly))；菜青虫(P.rapae Linnaeus)(小白粉蝶(small white butterfly))；暗脉菜
粉蝶(P.napi Linnaeus)(绿脉菜粉蝶(green veined white butterfly))；洋蓟葱羽蛾
(Platyptilia carduidactyla Riley)(洋蓟羽蛾(artichoke plume moth))；小菜蛾
(Plutella xylostella Linnaeus)(小菜蛾(diamondback moth))；棉红铃虫
(Pectinophora gossypiella Saunders)(粉螟蛉(pink bollworm))；多形云粉蝶(Pontia 
protodice)(Boisduval和Leconte)(南方菜青虫(Southern cabbageworm))；杂食尺蠖
(Sabulodes aegrotata Guenée)(杂食尺蠖(omnivorous looper))；红抚天社蛾(Schizura 
concinna J.E.Smith)(红疣天社蛾(red humped caterpillar))；麦蛾(Sitotroga 
cerealella Olivier)(麦蛾(Angoumois grain moth))；松异带蛾(Thaumetopoea 
pityocampa Schiffermuller)(松树列队毛虫(pine processionary caterpillar))；幕谷
蛾(Tineola bisselliella Hummel)(负袋夜蛾(webbing clothesmoth))；番茄斑潜蝇
(Tuta absoluta Meyrick)(番茄斑潜蝇(tomato leafminer))；苹果巢蛾(Yponomeuta 
padella Linnaeus)(巢蛾(ermine moth))；Heliothis subflexa Guenée；天幕毛虫属
(Malacosoma)物种和古毒蛾属(Orgyia)物种。

[0418] 引人关注的是鞘翅目的幼虫和成虫，包括来自长角象虫科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫，包括但不限于：墨西哥棉铃象
(Anthonomus grandis Boheman)(棉铃象甲(boll weevil))；稻水象甲(Lissorhoptrus 
oryzophilus Kuschel)(稻水象虫(rice water weevil))；谷象(Sitophilus granarius 
Linnaeus)(谷象(granary weevil))；米象(S.oryzae Linnaeus)(米象(rice weevil))；三
叶草叶象(Hypera punctata Fabricius)(车轴草叶象虫(clover leaf weevil))；密点细
枝象(Cylindrocopturus adspersus LeConte)(向日葵茎象鼻虫(sunflower stem 
weevil))；黄褐小爪象(Smicronyx fulvus LeConte)(红葵花籽象甲(red sunflower seed 
weevil))；灰色小爪象(S.sordidus LeConte)(灰葵花籽象甲(gray sunflower seed 
weevil))；玉米隐啄象(Sphenophorus maidis Chittenden)(玉米象虫(maize 
billbug)))；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括但不限于：马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata Say)(科罗拉多马铃薯甲
虫)；玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)(西方玉米根虫)；北方玉
米根虫(D.barberi(Smith和Lawrence))(北方玉米根虫(northern corn rootworm))；黄瓜
十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi Barber)(南方玉米根虫(southern 
corn rootworm))；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria Melsheimer)(玉米跳甲(corn 
flea beetle))；十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze)(十字花科蔬菜跳甲
(Crucifer flea beetle))；黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)(黄曲条跳甲(stripped 
flea beetle))；肖叶甲褐斑(Colaspis brunnea Fabricius)(葡萄肖叶甲(grape 
colaspis))；橙足负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)(谷叶甲虫(cereal leaf 
beetle))；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius)(向日葵叶甲(sunflower 
beetle)))；来自瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachna 
varivestis Mulsant)(墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle)))；金龟子和来自金龟子科
(Scarabaeidae)的其他甲虫，包括但不限于：日本丽金龟(Popillia japonica Newman)(日
本甲虫)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis Arrow)(北方独角仙(northern 
masked chafer)，白蛴螬(white grub))；南方圆头犀金龟(C.immaculata Olivier)(南方
独角仙(southern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogus 
majalis Razoumowsky)(欧洲金龟子(European chafer))；长毛食叶然金龟(Phyllophaga 
crinita Burmeister)(白蛴螬(white grub))；胡萝卜金龟(Ligyrus gibbosus De Geer)
(胡萝卜金龟(carrot beetle)))；来自皮蠹科(Dermestidae)的红缘皮蠹(carpet 
beetle)；来自叩甲科(Elateridae)、伪金针虫属物种(Eleodes spp.)、梳爪叩头虫属物种
(Melanotus spp.)的金针虫；宽胸金针虫属物种(Conoderus spp.)；叩甲属物种(Limonius 
spp.)；缺隆叩甲属物种(Agriotes spp.)；特尼塞拉属物种(Ctenicera spp.)；埃俄罗斯属
物种(Aeolus  spp.)；来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫和来自拟步甲科
(Tenebrionidae)的甲虫。

[0419] 引人关注的是双翅目的成虫和未成熟的虫，包括潜叶虫玉米斑潜蝇(Agromyza parvicornis Loew)(玉米斑潜蝇(corn blotch leafminer))；摇蚊科(包括但不限于：高粱
瘿蚊(Contarinia sorghicola Coquillett)(高梁瘿蚊(sorghum midge))；黑森瘿蚊
(Mayetiola destructor Say)(黑森蝇(Hessian fly))；麦红吸浆虫(Sitodiplosis 
mosellana  Géhin)(小麦吸浆虫(wheat midge))；葵花籽蚊(Neolasioptera 
murtfeldtiana Felt)(向日葵籽瘿蚊(sunflower seed midge))；果蝇(实蝇科
(Tephritidae))、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit Linnaeus)(果蝇(frit flies))；蛆虫(包
括但不限于：灰地种蝇(Delia platura Meigen)(种蝇(seedcorn maggot))；麦地种蝇
(D.coarctata Fallen)(麦种蝇(wheat bulb fly))和其他地种蝇属，美洲麦秆蝇
(Meromyza americana Fitch)(美洲麦秆蝇(wheat stem maggot))；家蝇(Musca 
domestica Linnaeus)(家蝇(house flies))；夏厕蝇(Fannia canicularis Linnaeus)、小
舍蝇(F.femoralis Stein)(小家蝇(lesser houseflies))；厩螫蝇(Stomoxys calcitrans 
Linnaeus)(螫蝇(stable flies))；秋家蝇，角蝇，绿头苍蝇，金蝇属物种(Chrysomya 
spp.)；蝇属物种(Phormia spp.)；和其他麝香蝇(muscoid fly)有害生物、马蝇虻属物种
(horse flies Tabanus spp.)；肤蝇胃蝇属物种(bot flies Gastrophilus spp.)；狂蝇属
物种(Oestrus spp.)；纹皮蝇皮蝇属物种(cattle grubs Hypoderma spp.)；鹿蝇斑虻属物
种(deer flies Chrysops spp.)；绵羊虱蝇(Melophagus ovinus Linnaeus)(绵羊蜱)和其
他短角亚目(Brachycera)，蚊子伊蚊属物种(mosquitoes Aedes spp.)；疟蚊属物种
(Anopheles spp.)；家蚊属物种(Culex spp.)；黑蝇原蚋属物种(black flies 
Prosimulium spp.)；蚋属物种(Simulium spp.)；吸血蠓、沙蝇、眼菌蚊(sciarid)和其他长角亚目(Nematocera)。

[0420] 作为目的昆虫包括了半翅目和同翅目的成体和若虫，例如但不限于：来自球蚜科(Adelgidae)的球蚜、来自盲蝽科(Miridae)的盲蝽、来自蝉科(Cicadidae)的蝉、叶蝉、小绿叶蝉属物种(Empoasca spp.)；来自叶蝉科(Cicadellidae)的，来自菱蜡蝉科(Cixiidae)、
青翅飞虱科(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、瓢蜡蝉科(Issidae)和(Delphacidae)的
飞虱，来自角蝉科(Membracidae)的角蝉，来自木虱科(Psyllidae)的木虱，来自粉虱科
(Aleyrodidae)的粉虱，来自蚜科(Aphididae)的蚜虫，来自根瘤蚜科(Phylloxeridae)的葡
萄根瘤蚜，来自粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧，来自链介壳虫科(Asterolecanidae)、蚧
科(Coccidae)、粉蚧科(Dactylopiidae)、盾蚧科(Diaspididae)、绒蚧科(Eriococcidae)、
旌介壳虫科(Ortheziidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)和绵蚧科(Margarodidae)
的介壳虫，来自网蝽科的网蝽，来自蝽科(Pentatomidae)的椿象，长蝽(cinch bug)，土长蝽属物种(Blissus spp.)；和来自长蝽科(Lygaeidae)的其他籽长蝽、来自沫蝉科
(Cercopidae)的沫蝉、来自缘蝽科(Coreidae)的南瓜缘蝽和来自红蝽科(Pyrrhocoridae)
的秋恙螨和棉蝽。

[0421] 来自同翅目的农艺重要成员进一步包括但不限于：豌豆蚜(Acyrthisiphon pisum Harris)(豌豆蚜虫(pea aphid))；黑豆蚜(Aphis craccivora Koch)(蚕豆蚜(cowpea 
aphid))；黑豆蚜(A.fabae Scopoli)(蚕豆蚜(black bean aphid))；棉蚜(A.gossypii 
Glover)(棉蚜(cotton aphid)，瓜叶菊蚜虫(melon aphid))；玉米根蚜(A.maidiradicis 
Forbes，corn root aphid)；苹果黄蚜(A.pomi De Geer)(苹蚜(apple aphid))；绣线菊蚜
(A.spiraecola Patch，spirea aphid)；茄粗额蚜(Aulacorthum solani Kaltenbach)(指
顶花无网长管蚜(foxglove aphid))；草莓钉蚜(Chaetosiphon fragaefolii Cockerell)
(草莓毛管蚜(strawberry aphid))；麦双尾蚜(Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko)
(俄罗斯小麦蚜虫(Russian wheat aphid))；车前圆尾蚜(Dysaphis plantaginea 
Paaserini)(苹粉红劣蚜(rosy apple aphid))；苹果绵蚜(Eriosoma lanigerum 
Hausmann，woolly apple aphid)；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae Linnaeus)(菜蚜
(cabbage aphid))；桃粉大尾蚜(Hyalopterus pruni Geoffroy)(桃大尾蚜(mealy plum 
aphid))；萝卜蚜(Lipaphis erysimi Kaltenbach，turnip aphid)；麦无网长管蚜
(Metopolophium dirrhodum Walker)(麦蚜虫(cereal aphid))；马铃薯长管蚜
(Macrosiphum euphorbiae Thomas)(马铃薯蚜(potato aphid))；桃蚜(Myzus persicae 
Sulzer，peach-potato aphid，green peach aphid))；莴苣衲长管蚜(Nasonovia 
ribisnigri Mosley)(莴苣蚜(lettuce aphid))；瘿绵对属物种(Graptostethus spp.)(根
蚜虫(root aphids)和倍蚜(gall aphids))；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch，corn 
leaf aphid)；禾谷缢管蚜(R.padi Linnaeus，bird cherry-oat aphid)；麦二叉蚜
(Schizaphis graminum Rondani，greenbug)；牛鞭草蚜(Sipha flava Forbes)(甘蔗黄蚜
(yellow sugarcane aphid))；麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius，English grain 
aphid)；苜蓿斑蚜(Therioaphis maculata Buckton，spotted alfalfaaphid)；茶二叉蚜
(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe)(黑色柑橘蚜(black citrus aphid)和褐
色橘蚜(T.citricida Kirkaldy)(桔二叉蚜(brown citrus aphid))；球属物种(Adelges 
spp.)(球蚜(adelgids))；长山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix Pergande)(山胡桃
根瘤蚜(pecan phylloxera))；烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)(烟粉虱(tobacco 
whitefly)，甘薯粉虱(sweetpotato whitefly))；银叶粉虱(B.argentifolii Bellows&
Perring，silverleaf whitefly)；柑橘粉虱(Dialeurodes citri Ashmead)(柑桔粉虱
(citrus whitefly))；结翅白粉虱(Trialeurodes abutiloneus)(带状翅白粉虱
(bandedwinged whitefly)和温室粉虱(T.vaporariorum Westwood)(温室粉虱
(greenhouse whitefly))；马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae Harris)(马铃薯叶蝉
(potato leafhopper))；灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen，smallerbrown 
planthopper)；二点叶蝉(Macrolestes quadrilineatus Forbes)(紫菀叶蝉(aster 
leafhopper))；黑尾叶蝉(Nephotettix cinticeps Uhler)(绿叶蝉(green leafhopper))；
二条斑黑尾叶蝉(M.nigropictus )(稻叶蝉(rice leafhopper))；褐飞虱(Nilaparvata 
lugens brown planthopper)；玉米蜡蝉(Peregrinus maidis Ashmead)(玉米飞虱
(corn planthopper))；白背飞虱(Sogatella furcifera Horvath，whire-backed 
planthopper)；稻条背飞虱(Sogatodes orizicola Muir)(稻飞虱(rice delphacid))；苹
果白叶蝉(Typhlocyba pomaria McAtee)(苹白小叶蝉(white apple leafhopper))；葡萄
斑叶蝉属物种(Erythroneoura spp.)(葡萄叶蝉(grape leafhoppers))；十七年蝉
(Magicicada septendecim Linnaeus)(周期蝉(periodical cicada))；吹绵蚧(lcerya 
purchasi Maskell，cottony cushion scale)；梨圆蚧(Quadraspidiotus perniciosus 
Comstock，San Jose scale)；臀纹粉蚧(Planococcus citri Risso)(桔粉蚧(citrus 
mealybug))；粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)(其他粉蚧系群)；梨木虱(Cacopsylla 
pyricola Foerster，pear psylla)；柿木虱(Trioza diospyri Ashmead，persimmon 
psylla)。

[0422] 来自半翅目的目的农艺重要物种包括但不限于：拟绿蝽(Acrosternum hilare Say)(稻绿蝽(green stink bug))；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer)(南瓜虫(squash 
bug))；美洲谷长蝽(Blissus leucopterus leucopterus Say)(麦长蝽(chinch bug))；方
翅网蝽(Corythuca gossypii Fabricius)(棉网蝽(cotton lace bug))；番茄蝽
(Cyrtopeltis modesta Distant，tomato bug)；棉蝽(Dysdercus suturellus Herrich-
)(棉红蝽(cotton stainer))；褐臭蝽(Euschistus servus Say，brown stink 
bug)；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois，one-spotted stink bug)；长蝽属
物种(Graptostethus spp.)(果实蝽系群(complex of seed bugs))；松叶根蝽
(Leptoglossus corculus Say，leaf-footed pine seed bug)；美洲牧草盲蝽(Lygus 
lineolaris Palisot de Beauvois)(牧草盲蝽(tarnished plant bug))；牧草盲蝽
(L.Hesperus Knight)(西部牧草盲蝽(Western tarnished plant bug))；牧草盲蝽
(L.pratensis Linnaeus，common meadow bug)；长毛草盲蝽(L.rugulipennis Poppius，
European tarnished plant bug)；长绿盲蝽(Lygocoris pabulinus Linnaeus)(苹绿盲蝽
(common green capsid))；稻绿蝽(Nezara viridula Linnaeus)(南方绿椿象(southern 
green stink bug))；美洲稻蝽(Oebalus pugnax Fabricius)(稻褐蝽(rice stink bug))；
马利筋长蝽(Oncopeltus fasciatus Dallas)(大马利筋长蝽(large milkweed bug))；棉
跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter)(棉跳盲蝽(cotton fleahopper))。

[0423] 此外，实施例可以对半翅目有效，如草莓蝽(Calocoris norvegicus Gmelin)(草莓长蝽(strawberry bug))；荒野奥盲蝽(Orthops campestris Linnaeus)；苹果盲蝽
(Plesiocoris rugicollis Fallen)(苹盲蝽(apple capsid))；番茄蝽(Cyrtopeltis 
modestus Distant，tomato bug)；黑斑烟盲蝽(Cyrtopeltis notatus Distant)(吸蝇
(suckfly))；白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus Reuter，whitemarked 
fleahopper)；皂英蝽(Diaphnocoris chlorionis Say)(皂角蝽(honeylocust plant 
bug))；洋葱蝽(Labopidicola allii Knight)(葱盲蝽(onion plant bug))；棉盲蝽
(Pseudatomoscelis seriatus Reuter，cotton fleahopper)；苜蓿褐盲蝽(Adelphocoris 
rapidus Say，rapid plant bug)；四线盲蝽(Poecilocapsus lineatus Fabricius)(四线
叶虫(four-lined plant bug))；小长蝽(Nysius ericae Schilling)(多彩长蝽(false 
chinch bug))；假麦长蝽(Nysius raphanus Howard，false chinch bug)；稻绿蝽(Nezara 
viridula Linnaeus)(南方绿椿象(Southern green stink bug))；扁盾蝽属物种
(Eurygaster spp.)；缘蝽科物种(Coreidae spp.)；红蝽科物种(Pyrrhocoridae spp.)；谷
蛾科物种(Tinidae spp.)；负子蝽科物种(Blostomatidae spp.)；猎蝽科(Reduviidae)物
种和臭虫科(Cimicidae)物种。

[0424] 另外，包括蜱螨目(Acari)(螨类)的成体和幼虫，如小麦瘤瘿螨(Aceria tosichella Keifer)(小麦卷叶螨(wheat curl mite))；麦岩螨(Petrobia latens Mü
ller)(褐色小麦螨(brown wheat mite))；在叶螨科(Tetranychidae)中蜘蛛螨和红螨，苹
果全爪螨(Panonychus ulmi Koch)(欧洲红螨(European red mite))；二斑叶螨
(Tetranychus urticae Koch)(二点叶螨(two spotted spider mite))；迈叶螨
(T.mcdanieli McGregor)(迈叶螨(McDaniel mite))；朱砂叶螨(T.cinnabarinus 
Boisduval，carmine spider mite)；土耳其斯坦叶螨(T.turkestani Ugarov&Nikolski，
strawberry spider mite)；细须螨科中的葡萄短须螨，桔短须螨(Brevipalpus lewisi 
McGregor，citrus flat mite)；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他叶取食
螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科
(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱。黑脚
硬蜱(Ixodes scapularis Say)(鹿蜱(deertick))；全环硬蜱(I.holocyclus Neumann)(澳
大利亚致瘫痪埤(Australian paralysis tick))；变异矩头蜱(Dermacentor variabilis 
Say)(美洲犬蜱(American dog tick))；美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum Linnaeus)
(孤星蜱(lone star tick))以及在痒螨科、蒲螨科和疥螨科中的痒螨和疥螨。

[0425] 引人关注的是缨尾目(Thysanura)的昆虫有害生物，如衣鱼(Lepisma saccharina Linnaeus)(蠹虫(silverfish))；斑衣鱼(Thermobia domestica Packard)(小灶衣鱼
(firebrat))。

[0426] 所覆盖的另外节肢动物有害生物包括：蜘蛛目中的蜘蛛如褐隐毒蛛(Loxosceles reclusa Gertsch and Mulaik)(褐皮花蛛(brown recluse spider))和黑寡妇蜘蛛
(Latrodectus mactans Fabricius)(黑寡妇毒蛛(black widow spider))，以及蚰蜒目
(Scutigeromorpha)中的蜈蚣如蚰蜒(Scutigera coleoptrata Linnaeus)(蚰蜒(house 
centipede))。

[0427] 引人关注的昆虫有害生物包括椿象和其他相关昆虫的超家族，包括但不限于属于以下各科的物种：蝽科(稻绿蝽、茶翅蝽(Halyomorpha halys)、Piezodorus guildini、褐臭蝽、拟绿蝽、英雄美洲蝽(Euschistus heros)、美洲蝽(Euschistus tristigmus)、拟绿蝽、褐蝽(Dichelops melacanthus)、和蓓蝽(Bagrada hilaris)(蓓蝽(Bagrada Bug)))，龟蝽
科(Plataspidae)(筛豆龟蝽(Megacopta cribraria)-豆平腹蝽蟓(Bean plataspid))和土
蝽科(Scaptocoris castanea-Root stink bug)，以及鳞翅目物种包括但不限于：小菜蛾，
例如，玉米穗虫；大豆夜蛾，例如大豆尺夜蛾，以及黎豆夜蛾(例如梨豆夜蛾)。

[0428] 用于测量杀有害生物活性的方法是本领域中所熟知的。参见，例如，Czapla和Lang，(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]83：2480-2485；Andrews等人，(1988)
Biochem.J.[生物化学杂志]252：199-206；Marrone等人，(1985)J.of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]78：290-293以及美国专利号5,743,477，将其全部通过引用以其整体并入
本文。通常，在取食测定中混合并使用了所述蛋白质。参见，例如，Marrone等人，(1985)，J.of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]78：290-293。此类测定可以包括将植物与一种或多
种有害生物接触，并且确定所述植物存活和/或造成所述有害生物死亡的能力。

[0429] 线虫包括寄生线虫如根结线虫、胞囊线虫、和腐线虫，包括异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)、和球异皮线虫属物种
(Globodera spp.)；特别是胞囊线虫的成员，包括但不限于：大豆异皮线虫(Heterodera 
glycines)(大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode))；甜菜异皮线虫(Heterodera 
schachtii)(甜菜胞囊线虫(beet cyst nematode))；燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)
(谷物胞囊线虫(cereal cyst nematode))和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和
马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯胞囊线虫(potato cyst nematodes))。腐线虫
包括短体线虫属物种(Pratylenchus spp)。

[0430] 种子处理

[0431] 为了保护并提高产量生产和性状技术，种子处理方案可以为昆虫、杂草和疾病提供另外的作物计划灵活性和成本有效的控制。种子材料可以用包含化学或生物除草剂、除
草剂安全剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、发芽抑制剂和增强剂、营养素、植物生长调节剂和激活
剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀鸟剂和/或杀软体动物剂的组合的组合物进行处理，典型地进行表面处理。这些化合物典型地与制剂领域中通常使用的其他运载体、表面活性剂或促进施
加的佐剂一起配制。所述涂层可通过用液体制剂浸渍增殖材料或通过用组合的湿或干制剂
进行涂覆来施加。在以下提供了可用作种子处理的各种类型的化合物的实例：The 
Pesticide Manual：A World Compendium，C.D.S.Tomlin Ed.，Published by the British Crop Production Council[农药手册：世界纲要，C.D.S.汤姆林编辑，由英国作物生产委员
会出版]，其通过引用并入本文。

[0432] 可用于作物种子的一些种子处理包括但不限于下列一种或多种：脱落酸，阿拉酸式苯-S-甲基，阿维菌素，杀草强，阿扎康唑，固氮螺菌属(azospirillum)，印楝素，嘧菌酯，芽孢杆菌属物种(包括蜡状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、巨大芽孢杆菌
(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、球形芽孢杆菌(Bacillus 
sphaericus)、枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌物种中的一种或多种)，短根瘤菌属物种
(bradyrhizobium spp.)(包括甜菜慢生根瘤菌(bradyrhizobium betae)、香炉盘慢生根瘤
菌(bradyrhizobium canariense)、埃氏慢生根瘤菌(bradyrhizobium elkanii)、西表岛慢
生根瘤菌(bradyrhizobium iriomotense)、慢生型大豆根瘤菌(bradyrhizobium 
japonicum)、bradyrhizobium liaonigense、bradyrhizobium pachyrhizi和/或圆明慢生
根瘤菌(bradyrhizobium yuanmingense))，克菌丹，萎锈灵，壳聚糖，噻虫胺，铜，溴氰虫酰胺，苯醚甲环唑，氯唑灵，氟虫腈，咯菌腈，氟嘧菌酯，氟喹唑，解草胺，氟草肟，超敏蛋白，抑霉唑，吡虫啉，种菌唑，isoflavenoids，脂质几丁寡糖，代森锰锌，锰，代森锰，精甲霜灵，甲霜灵，叶菌唑，腈菌唑，PCNB，氟唑菌苯胺，青霉菌属，吡噻菌胺，氯菊酯，啶氧菌酯，丙硫菌唑，唑菌胺酯，氯虫酰胺，精-异丙甲草胺，皂苷，氟唑环菌胺，TCMTB，戊唑醇，噻苯咪唑，噻虫嗪，硫威，福美双，甲基立枯磷，三唑醇，木霉属，肟菌酯，灭菌唑和/或锌。PCNB种皮是指包含喹硫磷和氯唑灵的EPA注册号00293500419。TCMTB是指2-(硫氰基甲基硫代)苯并噻唑。

[0433] 可以测试具有具体转基因性状的种子品种和种子以确定哪些种子处理方案和施加率可以补充所述品种和转基因性状以增加产量。例如，具有良好产量潜力但丝黑穗病易
感性的品种可以受益于使用提供针对丝黑穗病的保护的种子处理，具有良好产量潜力但胞
囊线虫易感性的品种可以受益于使用提供针对胞囊线虫的保护的种子处理等。同样，涵盖
赋予抗昆虫的转基因性状的品种可以从种子处理赋予的第二种作用方式中获益，涵盖赋予
除草剂抗性的转基因性状的品种可以从用安全剂的种子处理中获益，这种安全剂增强植物
对所述除草剂的抗性等。此外，当与种子处理组合时，正确使用种子处理所产生的良好根系
建立和早期出苗可能导致更有效的氮利用，更好的抗干旱能力以及包含某种性状的一种或
多种品种的产量潜力的总体增加。

[0434] 用于杀灭昆虫有害生物和控制昆虫群体的方法

[0435] 在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫有害生物的方法，所述方法包括使昆虫有害生物同时地或依次地与杀昆虫有效量的本公开的重组IPD059、IPD098、IPD108或IPD109
多肽接触。

[0436] 在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫有害生物的方法，所述方法包括使昆虫有害生物与杀昆虫有效量的重组IPD059多肽接触，所述重组IPD059多肽具有与SEQ ID NO：
39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、或SEQ ID NO：78至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、
60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0437] 在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫有害生物的方法，所述方法包括使昆虫有害生物与杀昆虫有效量的重组IPD098多肽接触，所述重组IPD098多肽具有与SEQ ID NO：
102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：
113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：117至少50％、51％、
52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0438] 在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫有害生物的方法，所述方法包括使昆虫有害生物与杀昆虫有效量的重组IPD108多肽接触，所述重组IPD108多肽具有与SEQ ID NO：
131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、或SEQ ID NO：135至少50％、51％、
52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0439] 在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫有害生物的方法，所述方法包括使昆虫有害生物与杀昆虫有效量的重组IPD109多肽接触，所述重组IPD109多肽具有与SEQ ID NO：
138至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、
64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、
79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0440] 在一些实施例中，提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括使昆虫有害生物群体同时地或依次地与杀昆虫有效量的本公开的重组IPD059、IPD098、IPD108
或IPD109多肽接触。

[0441] 在一些实施例中，提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括使昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的重组IPD059多肽接触，所述重组IPD059多肽具有与SEQ 
ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、或SEQ ID NO：78至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、
60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0442] 在一些实施例中，提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括使昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的重组IPD098多肽接触，所述重组IPD098多肽具有与SEQ 
ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：
107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：117至少50％、
51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、
66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0443] 在一些实施例中，提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括使昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的重组IPD108多肽接触，所述重组IPD108多肽具有与SEQ 
ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、或SEQ ID NO：135至少50％、
51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、
66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0444] 在一些实施例中，提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括使昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的重组IPD109多肽接触，所述重组IPD109多肽具有与SEQ 
ID NO：138至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、
62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0445] 如本文所用的，“控制有害生物群体”或“控制有害生物”是指对有害生物的任何影响，其导致对有害生物造成的损害的限制。控制有害生物包括但不限于以一定方式杀灭有害生物、抑制有害生物发育、改变有害生物能育性或生长，使得有害生物对植物造成较少的
损害，减少所产生后代的数量，产生适应力较弱的有害生物，产生易受捕食者攻击的有害生
物或阻止有害生物啃食植物。

[0446] 在一些实施例中，提供了用于控制对杀有害生物蛋白具有抗性的昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括使昆虫有害生物群体同时地或依次地与杀昆虫有效量的本公开的
重组IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽接触。

[0447] 在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，所述方法包括使至少一种编码本公开的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的重组多核苷酸在植
物或其细胞中表达。

[0448] 在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，所述方法包括使编码IPD059多肽的重组多核苷酸在植物或其细胞中表达，所述IPD059多肽具有与
SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：
44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：6l、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、或SEQ ID NO：78至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、
58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0449] 在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，所述方法包括使编码IPD098多肽的重组多核苷酸在植物或其细胞中表达，所述IPD098多肽具有与
SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：117至少
50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0450] 在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，所述方法包括使编码IPD098多肽的重组多核苷酸在植物或其细胞中表达，所述IPD098多肽具有与
SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、或SEQ ID NO：124至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、
60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0451] 在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，所述方法包括使编码IPD108多肽的重组多核苷酸在植物或其细胞中表达，所述IPD108多肽具有与
SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、或SEQ ID NO：135至少
50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0452] 在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，所述方法包括使编码IPD108多肽的重组多核苷酸在植物或其细胞中表达，所述IPD108多肽具有与
SEQ ID NO：136至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、
62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0453] 在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，所述方法包括使编码IPD109多肽的重组多核苷酸在植物或其细胞中表达，所述IPD109多肽具有与
SEQ ID NO：138至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、
62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性。

[0454] 抗昆虫管理(IRM)策略

[0455] 苏云金芽孢杆菌δ-内毒素在转基因玉米植物中的表达已被证明是控制农业上重要的昆虫有害生物的有效手段(Perlak等人，1990；1993)。然而，昆虫已经进化，这些昆虫对在转基因植物中表达的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素是具有抗性的。如果这种抗性普遍存在，
它将明显限制包含编码这种苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的基因的种质的商业价值。

[0456] 增加转基因杀昆虫剂对靶标有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的一种方法是提供非转基因(即，非杀昆虫蛋白)庇护所(一部分非杀昆虫作物/玉
米)，用于与生产对靶标有害生物具有活性的单一杀昆虫蛋白的转基因作物一起使用。美国
环境保护局(United States Environmental Protection Agency)(epa.gov/oppbppdl/
biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm，其可以使用www前缀进行访问)发布了与
生产一种对靶标有害生物具有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的要求。另外，国
家玉米种植者协会(National Corn Growers Association)在其网站上(ncga.com/
insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn，所述网址可使用www前缀访问)也
提供了有关庇护所要求的类似指导。由于庇护区内的昆虫所造成的损失，较大的庇护所可
能会降低总产量。

[0457] 增加转基因杀昆虫剂对靶标有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的另一种方法是具有杀昆虫基因的储存库，所述储存库可以有效地对抗昆虫有害
生物的组，并通过不同的作用方式显现其作用。

[0458] 在植物中表达对相同昆虫物种有毒的两种或更多种杀昆虫组合物，每种杀昆虫剂以有效水平表达是实现对抗性发展的控制的另一种方法。这是基于以下原则：对两种不同
作用模式的抗性演变比仅一种远远更不可能。例如，Roush概述了双重毒素战略(也称为“金
字塔”或“堆叠”)，用于管理杀昆虫转基因作物(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.L
ond.B.[英国皇家学会，英国皇家学会哲学学报B](1998)353：1777-1786)。每种都能有效抵
抗靶标有害生物并几乎没有或没有交叉抗性的两种不同蛋白质的堆叠或金字塔结构可以
允许使用较小的庇护所。美国环境保护局要求所种植非Bt玉米的结构性庇护所(通常为
5％)比单一性状产品(通常为20％)显著更少。存在提供庇护所的IRM效应的各种方法，包括在田地中的各种几何种植模式和包装好(in-bag)的种子混合物，如进一步通过Roush所讨论的。

[0459] 在一些实施例中，本公开的IPD059、IPD098、IPD108和IPD109多肽可用作与其他杀有害生物蛋白(包括但不限于Bt毒素、致病杆菌属物种或发光杆菌属物种杀昆虫蛋白、其他
杀昆虫活性蛋白等)组合(即，金字塔化)的抗昆虫管理策略。

[0460] 提供了在促进抗昆虫管理的转基因植物中控制一种或多种鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵袭的方法，所述方法包括在植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白。

[0461] 在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵袭并促进抗昆虫管理的方法包括针对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫呈现本公开的至少一种IPD059、IPD098、
IPD108或IPD109多肽杀昆虫蛋白。

[0462] 在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵袭并促进抗昆虫管理的方法包括在转基因植物中表达本公开的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽和针
对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有不同作用模式的Cry蛋白或其他杀昆虫蛋白。

[0463] 还提供了降低鳞翅目和/或鞘翅目昆虫对在所述植物中表达杀昆虫蛋白以控制所述昆虫物种的转基因植物产生抗性的可能性的方法，所述方法包括表达与针对所述昆虫物种
具有不同作用模式的第二杀昆虫蛋白组合的本公开的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽。

[0464] 还提供了转基因植物的有效鳞翅目和/或鞘翅目抗昆虫管理的手段，所述手段包括在植物中以高水平共表达对鳞翅目和/或鞘翅目具有毒性的两种或更多种杀昆虫蛋白，
但是每种都展现出不同的实行其杀灭活性的模式，其中这两种或更多种杀昆虫蛋白包含本
公开的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽和Cry蛋白。

[0465] 另外，提供了用于获得让监管部门批准种植或商业化表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的蛋白质的植物的方法，所述方法包括参考、提交或依据昆虫测定结
合数据的步骤，所述数据显示IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽不与此类昆虫中的Cry
蛋白竞争结合位点。

[0466] 提高植物产量的方法

[0467] 提供了用于提高植物产量的方法。所述方法包括提供表达编码本文公开的杀有害生物多肽序列的多核苷酸的植物或植物细胞，并在有害生物(所述多肽对其具有杀有害生
物活性)侵袭的田地中种植所述植物或其种子。在一些实施例中，所述多肽对鳞翅目、鞘翅
目、双翅目、半翅目或线虫有害生物具有杀有害生物活性，并且所述田地被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫有害生物侵袭。

[0468] 如本文所定义的，植物的“产量”是指植物生产的生物质的质量和/或数量。如本文所用的，“生物质”是指任何经测量的植物产物。生物质产量的增加是所测量的植物产物的
产量上的任何改善。增加植物产量具有若干个商业应用。例如，增加植物叶生物质可以增加
用于人或动物消耗的叶菜类的产量。此外，增加叶生物质可用于增加植物来源的药物或工
业产品的产量。产量上的增加可以包括任何统计学上显著的增加，包括但不限于，与不表达
杀有害生物序列的植物相比，产量上至少增加1％、至少增加3％、至少增加5％、至少增加
10％、至少20％增加、至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大的增加。

[0469] 在具体方法中，表达本文公开的IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的植物的经改善的有害生物抗性使得植物产量得到增加。IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多肽的表达
导致有害生物侵袭植物或在所述植物上取食的能力下降，从而提高植物产量。

[0470] 加工方法

[0471] 进一步提供了加工植物、植物部分或种子以从包含IPD059、IPD098、IPD108或IPD109多核苷酸的植物、植物部分或种子获得食物或饲料产品的方法。可以对本文提供的
植物、植物部分或种子进行加工以产生通过加工具有商业价值的植物、植物部分或种子获
得的衍生物的油、蛋白质产物和/或副产品。非限制性实例包括包含编码IPD059、IPD09g、
IPD108或IPD109多肽的核酸分子的转基因种子，其可以被加工以产生大豆油、大豆产品和/
或大豆副产品。

[0472] “加工”是指用于获得任何大豆产品的任何物理和化学方法，并且包括但不限于热调节(heat conditioning)、剥落和研磨、挤出、溶剂萃取或水性浸泡以及全部或部分种子
萃取。

[0473] 以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。

[0474] 实验

[0475] 实例1-昆虫取食测定

[0476] 在来自下面所述的植物组织的澄清且脱盐的提取物上进行杀昆虫活性生物测定筛选，以评估其蛋白对各种以下品种的影响：鳞翅目物种(欧洲玉米螟(玉米螟)、玉米穗蛾
(玉米穗虫)、黑切根虫(小地老虎)、秋夜蛾(草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(大豆尺夜蛾)和黎豆夜
蛾(梨豆夜蛾))，和鞘翅目物种(西方玉米根虫(玉米根萤叶甲))。

[0477] 鳞翅目测定

[0478] 在基于人工琼脂的饮食(南国产品公司(Southland Products Inc.)，湖村(Lake Village)，阿肯色州)上以96孔格式进行鳞翅目体外取食测定。将饮食(100μL)用澄清且脱
盐的样品(25μL)覆盖，并允许其干燥。将对照孔用25μL的50mM Tris缓冲液，pH 8.0覆盖。将两至五只新生幼虫置于每个孔中，以在27℃取食72至96小时。针对新生幼虫死亡率、发育迟
缓的严重程度或无作用，对所述蛋白质对幼虫的作用进行评分。评分以数值记录为死亡
(3)、严重地发育迟缓(2)(很少生长或根本没有生长但活着，并且相当于一龄幼虫)、发育迟
缓(1)(生长到二龄，但不等同于对照)、或者标准(0)(类似于在仅施加缓冲液的情况下在饮
食上饲喂幼虫)。使每种样品经受蛋白酶K和热处理(这导致活性丧失)，表明样品本质上是
蛋白质。在欧洲玉米螟(玉米螟)、玉米穗蛾(玉米穗虫)、黑切根虫(小地老虎)、秋夜蛾(草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(大豆尺夜蛾)和黎豆夜蛾(梨豆夜蛾)上测定每种样品。

[0479] 鞘翅目测定

[0480] 在基于人工琼脂的饮食(南国产品公司，湖村，阿肯色州)上以96孔格式进行鞘翅目体外取食测定。将饮食(75μL)用澄清且脱盐的样品(25μL)覆盖，并允许其干燥。将对照孔用25μL的50mM Tris缓冲液，pH 8.0覆盖。将三至六只新生西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)幼
虫置于每个孔中，以在27℃取食72小时。针对新生幼虫死亡率、发育迟缓的严重程度或无作
用，对所述蛋白质对幼虫的作用进行评分。评分以数值记录为死亡(3)、严重地发育迟缓(2)
(很少生长或根本没有生长但活着，并且相当于一龄幼虫)、发育迟缓(1)(生长到二龄，但不
等同于对照)、或者标准(0)(类似于在仅施加缓冲液的情况下在饮食上饲喂幼虫)。使每种
样品经受蛋白酶K和热处理(这导致活性丧失)，表明样品本质上是蛋白质。在西方玉米根虫
(玉米根萤叶甲)上测定每种样品。

[0481] 实例2-筛选植物提取物的杀昆虫活性

[0482] 从澄清且脱盐的植物提取物中观察到针对ECB和WCRW的杀昆虫活性。收集植物并将其在液N2中速冻，并储存在-80℃以备将来使用。从储存中取出冷冻样品并且在液N2温度
下，用 2010球磨机(SPEX Sample 麦塔成(Metuchen)，新泽西州)将
其研磨成细粉。为了从植物样品中提取蛋白质，将4mL的提取缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，
150mM氯化钾，2.5mM EDTA，1.5％聚乙烯聚吡咯烷酮和完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂
(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)，德国))添加至每1克的鲜重组织中。将悬浮液在摇床
上于4℃轻微搅动15分钟。通过在6000x g下离心15分钟来澄清匀浆，随后通过Whatman 
0.45μm过滤器(GE医疗集团(GE)，皮斯卡塔韦市(Piscataway)，新泽西州)过滤。通过使用
10mL ZebaTM Spin脱盐柱(赛默科技公司(Thermo Scientific)，伊利诺伊州)将其脱盐到
50mM Tris，pH 8.0中来去除小分子和污染性缓冲液组分。如上所述对脱盐的上清液进行生
物测定以确定活性。表1列出了活性植物样品、其杀昆虫活性和多肽序列标识符。

[0483] 表1

[0484]

[0485] 实例3-IPD059Aa多肽的分离与鉴定

[0486] 从来自粘叶水龙骨(PS-8568)植物组织的澄清且脱盐的提取物中观察到针对欧洲玉米螟((ECB)(玉米螟))的杀昆虫活性。这种杀昆虫活性表现出指示蛋白质性质的热敏感
性和蛋白酶敏感性。

[0487] 从在-80℃的储存中取出粘叶水龙骨(PS-8568)植物组织并且在液氮温度下，用2010球磨机(SPEX Sample 麦塔成，新泽西州)将其研磨成细粉。
通过以4mL/每1克的鲜重组织的比例添加提取缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，150mM氯化钾，
2.5mM EDTA，1.5％聚乙烯聚吡咯烷酮和完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂(罗氏诊断公
司，德国))，从所述植物组织中提取蛋白质。通过在平面摇床上于4℃下轻微搅动15分钟，使样品保持悬浮状态。通过在6000xg下离心15分钟来澄清匀浆，随后通过Whatman 0.45μm过
TM
滤器(GE医疗集团，皮斯卡塔韦市，新泽西州)过滤。使用10mL Zeba  Spin脱盐柱(赛默科技
公司，伊利诺伊州)将PS-8568脱盐到50mM Tris，pH 8.0中，然后将其加载到在相同缓冲液
中平衡的5mL HiTrapTMQ-FF柱(GE医疗集团，皮斯卡塔韦市，新泽西州)上。将在50mM Tris，pH 8.0中从0.0M至0.6M NaCl的线性30柱体积梯度用于洗脱结合的蛋白质。在上述生物测
定中针对ECB测定洗脱的级分和流出物。从未结合树脂的流出级分中检测到针对ECB的活
性。合并流出级分，并在10mL ZebaTM Spin脱盐柱(赛默科技公司，伊利诺伊州)上将缓冲液
交换到50mM甲酸钠，pH 4.4中，并将其加载到在相同缓冲液中平衡的1mL Mono 柱(GE医
疗集团)上。运行从0％至80％洗脱缓冲液(50mM甲酸钠，pH 4.4，1.0M NaCl)的70柱体积线
性梯度，并收集1mL洗脱的蛋白质的级分。如前所述对洗脱的蛋白质级分进行生物测定，并
在以约3.8-8.2mS/em2电导率洗脱的级分中检测到ECB活性。合并活性Mono  级分，将其
在10kD MWCO过滤器(密理博公司(Millipore)，马萨诸塞州)上浓缩，并作为抛光步骤加载
到SuperdexTM 7510/300GLTM柱(GE医疗集团，皮斯卡塔韦市，新泽西州)上。施加具有50mM 
Tris，pH 8.0的等度梯度，并针对ECB测定0.5mL洗脱级分。基于LDS-PAGE，所述活性级分含
有一个大约19kDa的蛋白质条带，并命名为IPD059Aa(SEQ ID NO：39)。

[0488] 在蛋白质用胰蛋白酶消化后，通过质谱(MS)分析进行蛋白质鉴定。在用CoomassieTM亮蓝G-250染料染色的LDS-PAGE凝胶上跑样之后获得用于MS鉴定的蛋白质。将
所述目的条带从凝胶上切下，脱色，用二硫苏糖醇还原，并且然后用碘乙酰胺烷基化。用胰
TM
蛋白酶消化过夜后，使用在QToF Premiere 质谱仪( 米尔福德市(Milford)，马
萨诸塞州)上的电喷雾离子源与NanoAcquityTM纳米-LC系统( 米尔福德市，马萨
诸塞州)偶联来进行胰蛋白酶消化的肽的液相色谱串联质谱(LC-MSMS)分析，用从2％乙腈、
0.1％甲酸至60％乙腈、0.1％甲酸的梯度。

[0489] 使用Protein Lynx Global Server( 米尔福德市，马萨诸塞州)分析所得的LCMS数据以产生DeNovo序列数据。将氨基酸序列依据包括植物蛋白质序列的公共和杜
邦先锋公司(DUPONT-PIONEER)内部数据库进行BLASTTM搜索(基本局部比对搜索工具(Basic 
Local Alignment Search Tool)；Altschul等人，(1993)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]
215：403-410；还参见ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，其可以使用www前缀访问)。在杜邦先锋公司所有的植物蛋白质数据库中，将氨基酸序列与蛋白质进行比对。

[0490] 通过 494蛋白质测序仪(赛默科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)上的Edman降解测序确定蛋白质的N-末端序列。还鉴定了具有从29位天冬氨酸开始的IPD059Aa
(SEQ ID NO：39)的残基1-28的N-末端缺失的蛋白质序列，并将所得的多肽命名为
IPD059AaTR1(SEQ ID NO：78)。

[0491] 实例4-粘叶水龙骨、皱叶鸟巢蕨蝴蝶变种、江南卷柏和维多利亚卷柏的转录组测序以及cDNA的克隆

[0492] 针对粘叶水龙骨(Id.#PS-8568)、皱叶鸟巢蕨蝴蝶变种(Id.#PS-9146)、江南卷柏(Id.#NY011)、和维多利亚卷柏(Id.#PS-10890)的转录组如下制备。通过使用 试
剂盒 从冷冻组织中分离总RNA用于总RNA分离。使用TruSeqTM mRNA-Seq试剂盒
和来自 Inc.(圣迭戈市，加利福尼亚州)的方案制备来自所得总RNA的测序文
库。简而言之，将mRNA经由附接至寡(dT)珠分离，片段化至180nt的平均大小，通过随机六聚体引发反转录为cDNA，末端修复，加3′A尾，并与 索引的TruSeqTM衔接子连接。使
用 TruSeqTM引物PCR扩增所连接的cDNA片段，并在Agilent DNA 
7500芯片上检查纯化的PCR产物的质量和数量。在质量和数量评估之后，通过用双特异性核
酸酶(DSN)( 莫斯科，俄罗斯)处理将100ng转录物文库标准化。通过添加200mM 
Hepes缓冲液完成标准化，随后进行热变性，并在68℃退火5小时。将退火的文库用2μL的DSN酶处理25分钟，根据制造商方案通过 柱进行纯化，并使用
衔接子特异性引物扩增12个循环。用 XP珠(贝克曼基因组学公司(Beckman 
Genomics)，丹佛市(Danvers)，马萨诸塞州)纯化最终产物，并在Agilent
DNA 7500芯片上检查质量和数量。

[0493] 根据 基因组分析仪(Genome Analyzer)IIx上的制造商方案对标准化的转录物文库进行测序。将每个文库与两个流动细胞泳道杂交，并使用Illumina克隆簇生
成方法在 上扩增、封闭、线性化和引物杂交。在基因组分析仪IIx上完成测序，每个
标准化文库产生六千万个75bp的配对端读数。

[0494] 实例5-克隆编码IPD059Aa的cDNA

[0495] 针对通过来自PS-8568装配体的内部转录组的可读框(ORF)预期的蛋白质序列，搜索通过LCMS测序(描述于实例2中)鉴定的IPD059Aa(SEQ ID NO：39)的肽序列。所述肽给出
了与对应于IPD059Aa多肽(SEQ ID NO：39)的转录物的完全匹配。将转录物序列用于设计
SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140的引物，所述引物用于克隆IPD059Aa cDNA序列(SEQ ID 
NO：1)，其中使用HF PCR试剂盒(ClontechTM，特拉贝拉大街1290号，山景城，加
利福尼亚州94043)，以及使用 II试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo 
Fischer Scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)，将从来自粘叶水龙骨的总RNA制备的cDNA
作为模板。使用 -T easy试剂盒(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)
将PCR产物克隆到 -T载体中。对克隆进行测序，并且IPD059Aa cDNA序列显示为
SEQ ID NO：1且编码的IPD059Aa多肽序列显示为SEQ ID NO：39。使用SEQ ID NO：1的DNA作为模板，使用SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：140的引物产生在Asp29处具有蛋白质起始位点的序列。

[0496] 实例6-IPD059Aa同源物的鉴定

[0497] 可以通过在针对序列相似性的默认参数下进行BLASTTM(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul)；Altschul等人，(1993)J.Mol.Biol.
[分子生物学杂志]215：403-410；还参见ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，可以使用www前缀登录
该网址)搜索来确定基因同一性。分析IPD059Aa(SEQ ID NO：1)的多核苷酸序列。在来自水
蕨(Ceratopteris richardii)(NCBI BAC55101)的NCBI数据库中发现了一种与IPD059Aa多
肽(SEQ ID NO：39)具有49％同一性的遥远同源物，并将其命名为IPD059Fa(SEQ ID NO：76)。

[0498] 通过在蕨类植物和其他原始植物的杜邦先锋公司内部转录组数据库中进行BLASTTM确定的基因同一性鉴定了IPD059Aa(SEQ ID NO：39)的多个同源物。IPD059Aa同源物
和从中鉴定它们的生物体显示在表2中。

[0499] 表2

[0500]

[0501]

[0502] 通过从总RNA的逆转录，从具有来自内部数据库鉴定的同源物的来源生物体产生cDNA。使用针对每种同源物的编码序列设计的引物，从它们各自的cDNA中PCR扩增同源物，
并亚克隆到含有DMMV启动子的植物瞬时载体中。通过测序确认克隆的PCR产物。

[0503] 如在Needle程序(EMBOSS工具套件)中执行的，如使用Needleman-Wunsch算法计算的IPD059Aa(SEQ ID NO：39)同源物的氨基酸序列同一性的矩阵表显示在表3A-3C中。所述
表的空白部分未示出。

[0504] 表3A

[0505]

[0506] 表3B

[0507]

[0508]

[0509] 表3C

[0510]

[0511]

[0512] IPD059同源物的系统发育树显示在图1中。选定亚组的IPD059同源物的氨基酸序列比对显示在图2、图3和图4中。

[0513] 实例7-IPD059Aa和同源物在大豆或矮菜豆叶中的瞬时表达以及昆虫生物测定

[0514] 为了证实IPD059Aa(SEQ ID NO：39)的活性，将相应的基因克隆到使用dMMV启动子(Dey等人，(1999)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]40：771-782)控制下的瞬时表达系统
中。将农杆菌属细胞悬浮液引入完整组织的植物细胞以使得可重复感染和随后的植物来源
的转基因表达可被测量或研究的农杆菌浸润法是本领域熟知的(Kapila等人，(1997)Plant 
Science[植物科学]122：101-108)。简而言之，用测试和对照菌株的标准化细菌细胞培养物
对大豆(大豆(Glycine max))或完整的加利福尼亚小白(菜豆(Phaseolus vulgaris))变种
矮菜豆的切除的叶圆盘进行农杆菌浸润。4天后，仅用4只新生的欧洲玉米螟(玉米螟)侵袭
叶圆盘。对照叶圆盘是用仅含有DsRed2荧光标记(ClontechTM，特拉贝拉大街1290号，山景
城，加利福尼亚州94043)表达载体的农杆菌产生的。将来自未浸润植物的叶圆盘作为第二
对照。侵袭后三天对绿叶组织的消耗量进行评分。

[0515] 瞬时表达的IPD059Aa(SEQ ID NO：39)保护叶圆盘免受侵袭昆虫的消耗，而观察到阴性对照和未处理组织的总绿组织消耗(表4)。

[0516] 表4

[0517]

[0518]

[0519]

[0520] 测试的IPD059Aa同源物的活性谱总结在表5中，其中“+++”表示平均活性评分为<＝10％的消耗的叶圆盘，“++”表示平均活性评分为11％-50％的消耗的叶圆盘，“+”表示平均活性评分为51％-70％的消耗的叶圆盘，并且“-“表示平均活性评分为>70％的消耗的叶圆盘。

[0521] 表5

[0522]

[0523]

[0524] 实例8-IPD098Aa多肽的分离与鉴定

[0525] 从皱叶鸟巢蕨蝴蝶变种(PS-9146)植物组织的澄清且脱盐的提取物中观察到针对西方玉米根虫((WCRW)(玉米根萤叶甲))的杀昆虫活性。这种杀昆虫活性表现出指示蛋白质
性质的热敏感性和蛋白酶敏感性。

[0526] 从在-80℃的储存中取出皱叶鸟巢蕨蝴蝶变种(PS-9146)植物组织并且在液N2温度下，用 2010球磨机(SPEX Sample 麦塔成，新泽西州)将其研磨
成细粉。通过以4mL/1克的鲜重组织的比例添加提取缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，150mM氯化
钾，2.5mM EDTA，1.5％聚乙烯聚吡咯烷酮和完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂(罗氏诊断
公司，德国))，从所述植物组织中提取蛋白质。将悬浮液在摇床上于4℃轻轻搅动15分钟。通过在6000x g下离心15分钟来澄清匀浆，随后通过Whatman 0.45μm过滤器(GE医疗集团，皮
斯卡塔韦市，新泽西州)过滤。使用10mL ZebaTM Spin脱盐柱(赛默科技公司，伊利诺伊州)将PS-9146脱盐到50mM Tris，pH 8.0中，并将其分成3个等体积。将分离的上清液分别加载到
在50mM Tris，pH 8.0中平衡的1mL HiTrapTMQ-HP柱(GE医疗集团，皮斯卡塔韦市，新泽西州)上，并且在50mM Tris，pH 8.0中施加从0M至0.7M NaCl的线性70柱体积梯度。收集未结合的
和洗脱的蛋白质级分，并在上述体外生物测定中针对WCRW进行测定。在以大约10.2-
2
15.2mS/cm 洗脱的级分中检测到针对WCRW的活性。合并级分，并将其在3kDa MWCO过滤器
(颇尔生命科学公司(Pall Life Sciences)，华盛顿港市，纽约州)上浓缩，并将其加载到
HiLoadTM16/60Superdex 200尺寸排阻柱(GE医疗集团，皮斯卡塔韦市，新泽西州)上。施加
50mM Tris，pH 8.0的等度梯度，并针对WCRW测定洗脱的1mL级分。合并活性级分，将其稀释
以降低NaCl浓度，并注入到在50mM Tris，pH 8.0中平衡的1mL 柱(GE医疗集团，皮
斯卡塔韦市，新泽西州)上。进行从0％至50％洗脱缓冲液(50mM Tris pH 8.0，1.0M NaCl)
的25柱体积线性梯度，以产生1mL洗脱的蛋白质的级分。如前所述对洗脱的蛋白质进行生物
测定，并在以约17.6-25.0mS/cm2电导率洗脱的级分中检测到WCRW活性。基于LDS-PAGE，所
述活性级分含有一个大约17kDa的蛋白质条带(其命名为IPD098Aa)。

[0527] 在用CoomassieTM亮蓝G-250染料染色的LDS-PAGE凝胶上跑样之后获得用于MS鉴定的蛋白质。将所述目的条带从凝胶上切下，脱色，用二硫苏糖醇还原，并且然后用碘乙酰胺
烷基化。用胰蛋白酶消化过夜后，使用在QToF PremiereTM质谱仪( 米尔福德市
(Milford)，马萨诸塞州)上的电喷雾离子源与NanoAcquityTM纳米-LC系统( 米尔
福德市，马萨诸塞州)偶联来进行胰蛋白酶消化的肽的液相色谱串联质谱(LC-MSMS)分析，
用从2％乙腈、0.1％甲酸至60％乙腈、0.1％甲酸的梯度。

[0528] 通过使用 (矩阵科学公司(Matrix Science)，英国伦敦NW3 1QY，铂金斯巷10号)的数据库搜索进行蛋白质鉴定。针对包含来自皱叶鸟巢蕨蝴蝶变种(PS-9146)源植
物的转录物的内部转录组数据库和公众蛋白数据库Swiss-Prot(使用Mascot搜索引擎(矩
阵科学公司))，进行搜索。还通过获取所得的LCMS数据进行蛋白质鉴定，所述数据使用
Protein Lynx Global Server( 米尔福德市，马萨诸塞州)分析以产生DeNovo序
列数据。将氨基酸序列依据包括植物蛋白质序列的公共和杜邦先锋公司内部数据库进行
BLASTTM搜索(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)；Altschul等
人，(1993)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403-410；还参见ncbi.nlm.nih.gov/
BLAST/，其可以使用www前缀访问)。在杜邦先锋公司所有的植物蛋白质数据库中，将氨基酸
序列与蛋白质进行比对。

[0529] 通过 494蛋白质测序仪(赛默科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)上的Edman降解测序确定蛋白质的N-末端序列。所得的氨基酸序列用于验证所述蛋白质的真实
N-末端为甘氨酸。

[0530] 实例9-IPD098Aa的克隆和大肠杆菌表达

[0531] 使用 试剂盒(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)通过逆转录从RNA样品PS-9146产生cDNA。使用SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：143的引物从PS-
9146cDNA PCR扩增IPD098Aa cDNA(SEQ ID NO：79)。然后将cDNA克隆到框内具有C-末端His
标签的pET24(Novagen公司)的NdeI/BamHI位点中进行纯化。对克隆进行测序，并且
IPD098Aa cDNA序列显示为SEQ ID NO：79且编码的IPD098Aa多肽序列显示为SEQ ID NO：102。

[0532] 将含有相应的IPD098基因插入物的pET24质粒DNA转化到感受态BL21-DE3大肠杆菌细胞中用于重组蛋白表达。将大肠杆菌细胞在37℃用40μg/mL卡那霉素选择生长过夜，然
后接种到新鲜的2x YT培养基(1∶50)中，并进一步生长至约0.8的光密度。在该点，将细胞在
1mM IPTG的存在下进行冷却，并在16℃进一步生长16小时以诱导蛋白质表达。根据制造商
的方案，通过使用Ni-NTA琼脂糖( 德国)的固定化金属离子色谱纯化经大肠杆菌
表达的蛋白质。

[0533] 实例10-IPD098Aa同源物的鉴定

[0534] 可以通过在针对序列相似性的默认参数下进行BLASTTM(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul)；Altschul等人，(1993)J.Mol.Biol.
[分子生物学杂志]215：403-410；还参见ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，可以使用www前缀登录
该网址)搜索来确定基因同一性。分析IPD098Aa(SEQ ID NO：79)的多核苷酸序列。在杜邦先
锋公司内部植物转录组数据库中进行BLASTTM确定的基因同一性鉴定了IPD098Aa蛋白质(SEQ 
ID NO：102)的多个同源物。在公共数据库中鉴定了具有低水平序列同一性的IPD098Aa(SEQ 
ID NO：102)的另外的同源物。IPD098Aa同源物和从中鉴定它们的生物体显示在表6中。

[0535] 如在Needle程序(EMBOSS工具套件)中执行的，如使用Needleman-Wunsch算法计算的IPD098Aa同源物的氨基酸序列同一性的矩阵表显示在表7A-7B中。所述表的空白部分未示出。

[0536] 表6

[0537]

[0538]

[0539] 表7A

[0540]

[0541] 表7B

[0542]

[0543] 实例11-在大肠杆菌中表达的IPD098Aa和同源物以及昆虫生物测定

[0544] 针对鞘翅目WCRW(玉米根萤叶甲)测定了一系列浓度的纯化的IPD098Aa同源物。为了测量针对WCRW(玉米根萤叶甲)的杀昆虫活性，在每个96孔生物测定板中，使用25μL的纯
化的蛋白质样品与35μL的人工WCRW饮食(基于Bio-Serv F9800B)混合来进行生物测定。将
可变数量的玉米根萤叶甲新生虫(3至9只)置于96孔板的每个孔中。将测定在25℃无光照下
运行四天，并且然后对死亡率和发育迟缓进行评分。结果显示在表8中。

[0545] 表8

[0546] 标识符 多肽 活性 对WCRW的影响IPD098Aa SEQ ID NO：102 Y 在51ppm下的死亡
IPD098Ab SEQ ID NO：103 Y 在248ppm下的死亡
IPD098Ba SEQ ID NO：105 Y 在85ppm下的发育迟缓
IPD098Bb SEQ ID NO：106 Y 在250ppm下的发育迟缓
IPD098Bc SEQ ID NO：107 Y 在348ppm下的轻度发育迟缓
IPD098Bd SEQ ID NO：108 Y 在946ppm下的轻度发育迟缓
IPD098Da SEQ ID NO：114 Y 在1407ppm下的死亡
IPD098Db SEQ ID NO：115 Y 在338ppm下的轻度发育迟缓
IPD098Ea SEQ ID NO：116 N 在917ppm下无活性
IPD098Fa SEQ ID NO：118 无可溶性表达 ND

[0547] 实例12-IPD098Aa的作用方式

[0548] 掺入人工饮食中的纯化的重组蛋白的生物活性揭示了IPD098Aa多肽(SEQ ID NO：102)对西方玉米根虫(WCRW)幼虫的毒性。为了理解IPD098Aa多肽(SEQ ID NO：102)毒性的
机制，通过体外竞争测定评估纯化的蛋白质与WCRW中肠组织的特异性结合。根据
Wolfersberger等人修改的方法(Comp Bioch Physiol[比较生物化学生理学]86A：301-308
(1987))，使用氨基肽酶酶活性追踪富集，从三龄WCRW幼虫中分离中肠以制备刷状缘膜囊泡
(BBMV)。BBMV代表昆虫中肠组织的上皮细胞衬里的顶膜组分，因此用作模拟系统，用于在摄
取后，杀昆虫蛋白在肠内如何相互作用。

[0549] 表达重组的IPD098Aa(SEQ ID NO：102)，并使用羧基末端聚组氨酸融合标签(10x His)将其从大肠杆菌表达系统纯化。全长纯化的蛋白质用Alexa- 488(生命技术公
司(Life Technologies))标记，并使用缓冲液交换树脂(生命技术公司，A30006)按照制造
商的建议将未掺入的荧光团与标记的蛋白质分离。在结合实验之前，通过凝胶密度测定对
蛋白质进行定量，随后进行包括将BSA作为标准的SDS-PAGE分辨样品的Simply (赛
默科技公司染色。

[0550] 结合缓冲液由20mM Bis-Tris、137mM NaCl、2.7mM KCl(pH 6.0)、0.1％20和2X完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂(罗氏公司，05956 489 001)组成，pH 6.0。为了证明
特异性结合并评估亲和力，在浓度增加的未标记IPD098Aa多肽(SEQ ID NO：102)的不存在
和存在下，将BBMV(10ug)与40nM Alexa标记的IPD098Aa多肽(SEQ ID NO：102)在100μL结合
缓冲液中在室温孵育1小时。使用20000x g离心以沉淀BBMV以分离保留在溶液中的未结合
的毒素。然后将BBMV沉淀用结合缓冲液洗涤两次以消除剩余的未结合的毒素。将最终的
BBMV颗粒(具有结合的荧光毒素)溶于还原Laemmli样品缓冲液中，加热至100℃持续5分钟，
并使用3％-8％Tris-乙酸盐聚丙烯酰胺凝胶(生命技术公司)经受SDS-PAGE。通过数字荧光
成像系统(Image Quant LAS4010，GE医疗集团)测量来自每种样品的凝胶中Alexa标记的
IPD098Aa多肽(SEQ ID NO：102)的量。数字图像通过密度测量软件(Phoretix 1D，TotalLab
有限公司)分析。

[0551] 基于将Alexa标记的IPD098Aa多肽(SEQ ID NO：102)的结合降低50％所需的未标记蛋白质的浓度(EC50值)，估计IPD098Aa多肽(SEQ ID NO：102)对WCRW BBMV的表观亲和力。
对于与WCRW BBMV(图1)结合的IPD098Aa多肽(SEQ ID NO：102)，这个值大约为1.4μM。

[0552] 实例13-IPD108Aa多肽的分离与鉴定

[0553] 从来自红卷柏(NY011)植物组织的澄清且脱盐的提取物中观察到针对欧洲玉米螟((ECB)(玉米螟))的杀昆虫活性。这种杀昆虫活性表现出指示蛋白质性质的热敏感性和蛋
白酶敏感性。

[0554] 蛋白质分离是从已储存在-80℃的NY011(红卷柏)的冷冻组织样品中进行的。对于每克组织，使用5mL提取缓冲液(100mM Tris、150mM KCl、2.5mM EDTA、1.5％聚乙烯聚吡咯
烷酮(PVPP)，pH 8，含蛋白酶抑制剂)。将植物材料在液N2温度下用 粉碎
(600rpm，2min，2x)，然后添加提取缓冲液，并将悬浮液摇动30分钟，然后以20000xg离心10分钟。将上清液转移至新鲜的管中，并且向组织中添加缓冲液(为初始体积的1/2体积)，并
重复提取。

[0555] 将上清液过滤并用10kDa MWCO过滤器浓缩，以在单个SuperdexTM200(GE医疗集团)尺寸排阻柱上进行若干次运行。收集活性级分并脱盐到20mM Tris，pH 8中，然后在8mL 
Mono 柱(GE医疗集团)上运行。用25柱体积梯度(缓冲液B：20mM Tris+0.5M NaCl，pH 8)
进行Mono 色谱法，收集1.5mL级分。合并活性级分(12.O-16.2mS/cm)并将其脱盐到25mM 
BisTris，pH 6.8中，加载到4mL Mono 柱(GE医疗集团)上，并且用100％B
74(GE医疗集团，pH 4.4-按1∶15稀释)洗脱。合并活性级分并将其脱盐到20mM MES，pH 6.5
中，加载到使用30柱体积梯度至缓冲液B(20mM MES、0.25M NaCl，pH 6.5)的1mL Mono
柱上，并收集1mL级分。活性与对应于10.2-12.3mS/cm的级分相关。将质谱用于溶液内和凝
胶内样品分析，并且鉴定出与命名为IPD108Aa(SEQ ID NO：131)的活性进行比对的转录物。

[0556] 实例14-IPD108Aa的克隆和大肠杆菌表达

[0557] 针对通过来自红卷柏NY011的转录组装配体的可读框(ORF)预测的蛋白质序列，搜索通过LCMS测序(如描述于实例8中)鉴定的IPD108Aa(SEQ ID NO：131)的肽序列。所述肽给
出了与对应于IPD108Aa(SEQ ID NO：125)的转录物的完全匹配。将所述编码序列用于设计
SEQ ID NO：144和SEQ ID NO：145的引物，以克隆IPD108Aa cDNA序列。通过
II试剂盒(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)使用从来自红卷柏NY011的总RNA
制备的cDNA作为模板，通过聚合酶链式反应产生此克隆。将PCR产物凝胶纯化，用BamHI和
XhoI限制性酶消化，并连接到经修饰的pET28a载体(Novagen公司)(具有N-末端6x His标
签，随后是凝血酶切割位点、麦芽糖结合蛋白标签和因子Xa切割位点)中。将克隆测序从而
验证克隆。

[0558] 将具有编码IPD108Aa多肽(SEQ ID NO：131)的IPD108Aa cDNA(SEQ ID NO：125)的经修饰的pET28a载体转化到化学感受态BL21(DE3)细胞 中。将经转化的大
肠杆菌细胞在37℃用卡那霉素选择生长过夜，然后接种到新鲜的2x YT培养基(1∶200)中，
并进一步生长至约0.8的光密度(OD600)。通过添加1.0mM IPTG诱导蛋白质表达，并使这些
细胞在16℃进一步生长16小时。根据制造商的方案，通过使用直链淀粉树脂(新英格兰生物
实验室，伊普斯威奇(Ipswich)，马萨诸塞州)的亲和色谱法来纯化经大肠杆菌表达的蛋白
质。使用6K MWCO Flextubes(IBI公司，皮斯塔，爱荷华州)，将纯化的级分透析到1X PBS缓
冲液(1∶400)中，在搅拌板上于4℃过夜。将洗脱的蛋白质用于饮食生物测定，从而评估针对多种鳞翅目幼虫的蛋白质活性。

[0559] 实例15-IPD108Aa同源物的鉴定

[0560] 可以通过在针对序列相似性的默认参数下进行BLASTTM(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul)；Altschul等人，(1993)J.Mol.Biol.
[分子生物学杂志]215：403-410；还参见ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，可以使用www前缀登录
该网址)搜索来确定基因同一性。分析IPD108Aa(SEQ ID NO：125)的多核苷酸序列。在杜邦
先锋公司内部植物转录组数据库中进行BLASTTM确定的基因同一性鉴定了IPD108Aa蛋白质
(SEQ ID NO：131)的多个同源物。IPD108Aa同源物和从中鉴定它们的生物体显示在表9中。

[0561] 表9

[0562]

[0563] 如在Needle程序(EMBOSS工具套件)中执行的，如使用Needleman-Wunsch算法计算的IPD108Aa同源物的氨基酸序列同一性的矩阵表显示在表10中。所述表的空白部分未示
出。

[0564] 表10

[0565]IPD108Da IPD108Dd IPD108Df IPD108Dj IPD108Eb
IPD108Aa 67 63.3 63.3 62.1 53.1
IPD108Da - 63 62.1 60.4 50.8
IPD108Dd - - 87.5 82.6 50.2
IPD108Df - - - 83.3 52.1
IPD108Dj - - - - 52

[0566] 使用SuperScript 第一链合成试剂盒(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)，通过从总RNA的逆转录，从具有来自内部数据库鉴定的同源物的来源生物
体产生cDNA。使用为每个同源物(具有5′载体重叠延伸)的编码序列设计的引物(表11)，从
其各自cDNA PCR扩增同源物。合成了具有载体重叠延伸作为 基因片段(集成DNA
技术公司(Integrated DNA Technologies)，科拉尔维尔市，爱荷华州)的IPD108Eb多核苷
酸(SEQ ID NO：130)。

[0567] 表11

[0568] 基因名称 正向引物SEQ ID 反向引物SEQ IDIPD108Da SEQ ID NO：146 SEQ ID NO：147
IPD108Dd SEQ ID NO：148 SEQ ID NO：149
IPD108Df SEQ ID NO：150 SEQ ID NO：151
IPD108Dj SEQ ID NO：152 SEQ ID NO：153

[0569] 使用Gibson 预混物(新英格兰生物实验室，伊普斯威奇，马萨诸塞州)，将含有IPD108Aa同源物序列的PCR产物和合成序列亚克隆到经修饰的pET28a载体
中，所述载体框内具有N-末端6x His标签，随后是凝血酶切割位点、MBP标签
和因子Xa切割位点(对于PCR产物，用BamHI/XhoI(新英格兰生物实验室，伊普斯威奇，马萨
诸塞州)消化，并且对于合成序列，用BamHI消化)。通过测序确认克隆的PCR产物。

[0570] 用含有IPD108同源物的质粒DNA转化化学感受态BL21(DE3)细胞用于重组蛋白表达。将经转化的大肠杆菌细胞在37℃用卡那霉素选择生长过夜，然后接种
到新鲜的2x YT培养基(1∶100)中，并进一步生长至约0.8-1.2的光密度。通过添加1.0mM 
IPTG诱导蛋白质表达，并使这些细胞在16℃进一步生长16小时。根据制造商的方案，通过使
用直链淀粉树脂(新英格兰生物实验室，伊普斯威奇，马萨诸塞州)的亲和色谱法来纯化经
大肠杆菌表达的蛋白质。使用6K MWCO Flextubes(IBI公司，皮斯塔，爱荷华州)，将纯化的
级分透析到50mM碳酸盐缓冲液(pH 10.0)中，在搅拌板上于4℃过夜。将洗脱的蛋白质用于
饮食生物测定，从而评估针对多种鳞翅目幼虫的蛋白质活性。

[0571] 实例16-在大肠杆菌中表达的IPD108同源物以及昆虫生物测定

[0572] 在并入基于琼脂的鳞翅目饮食(南国产品公司，湖村，阿肯色州)的纯化的N-6xHis-MBP-IPD108同源物上，以96孔板形式进行针对五种有害生物物种：玉米穗蛾(CEW)
(玉米穗虫)、欧洲玉米螟(ECB)(玉米螟)、秋夜蛾(FAW)(草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(SBL)(大豆
尺夜蛾)、和黎豆夜蛾(VBC)(梨豆夜蛾)的生物测定。每个样品使用四个重复。将样品稀释到
饮食中，等分到孔中，并将两只至五只新生昆虫置于板的每个孔中。在27℃孵育四天之后，
对幼虫死亡率或发育迟缓的严重程度进行评分。评分以数值记录为死亡(3)、严重地发育迟
缓(2)(很少生长或根本没有生长但活着，并且相当于一龄幼虫)、发育迟缓(1)(生长到二
龄，但不等同于对照)、或者标准(0)。活性结果显示在表12中。

[0573] 表12

[0574]标识符 多肽 PPM BCW CEW ECB FAW SBL VBC
IPD108Db SEQ ID NO：132 375 0 0 2.25 0 0.5 0
IPD108Dd SEQ ID NO：133 125 0 0 2.25 0 0.75 0
IPD108Df SEQ ID NO：134 62.5 0 0 2 0 0 0
IPD108Dj SEQ ID NO：135 31.25 0 0 2 0 0.25 0
IPD108Eb SEQ ID NO：136 375 0 0 1 0 0 0.5

[0575] 实例17-IPD109Aa多肽的分离与鉴定

[0576] 从来自维多利亚卷柏(PS-10890)植物组织的澄清且脱盐的提取物中观察到针对西方玉米根虫((WCRW)(玉米根萤叶甲))的杀昆虫活性。这种杀昆虫活性表现出指示蛋白质
性质的热敏感性和蛋白酶敏感性。

[0577] 蛋白质分离是从已储存在-80℃的PS-10890(维多利亚卷柏)的冷冻组织样品中进行的。对于每克新鲜组织，使用5mL提取缓冲液(100mM Tris、150mM KCl、2.5mM EDTA、1.5％聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)，pH  8，含蛋白酶抑制剂)。将植物材料在液N2温度下用
粉碎(600rpm，2min，2x)，然后添加提取缓冲液，并将悬浮液摇动30分钟，
然后以20000xg离心10分钟。将上清液转移至新鲜的管中，并且向组织中添加缓冲液(为初
始体积的1/2体积)，并重复提取。

[0578] 将上清液过滤，浓缩(10kDa)并脱盐到20mM Tris，pH 8中。将脱盐的提取物通过在20mM Tris，pH 8中平衡的串联的两个5mL CaptoTMQ(GE医疗集团)柱运行。用20mM Tris+
0.5M NaCl(pH 8)的步骤梯度洗脱结合的蛋白质。将CaptoTMQ洗脱液脱盐到20mM MES，pH 
6.5中，并加载到在此缓冲液中平衡的1mL Mono 柱上。用30柱体积梯度洗脱结合的蛋白
质至20mM MES+0.4M NaCl，pH 6.5，收集1mL级分。用对应于12.8-22.3mS/cm的电导率范围
的级分洗脱WCRW活性。

[0579] 从两次Mono 运行中合并活性Mono 级分，并将其脱盐到25mM BisTris，pH 7中，然后在4mL Mono 柱(GE医疗集团)上运行。将100％B洗涤液(B：Polybuffer 74，pH 
4.2-用H2O按1∶15稀释)用于洗脱蛋白质，并且合并活性级分并将其浓缩，然后在2x 
TM TM
Superdex 200(GE医疗集团)尺寸排阻柱上运行。在100mM(NH4)HCO3中进行Superdex 200柱
运行，收集1mL级分。合并活性级分并将其脱盐到20mM Tris，pH 8.6中，然后加载到1mL 
Mono 柱上，使用0至100％，25柱体积梯度(缓冲液B：20mM Tris+0.25M NaCl，pH 8.6)。
收集1mL级分并用10kDa MWCO过滤装置浓缩，然后进行生物测定。活性与对应于14.4-
21.8mS/cm的级分相关。将质谱用于溶液内和凝胶内样品分析，并且鉴定出与命名为
IPD109Aa(SEQ ID NO：137)的活性进行比对的转录物。

[0580] 实例18-IPD109Aa的克隆和大肠杆菌表达

[0581] 获得来自维多利亚卷柏PS-10890样品的总RNA，并使用 第一链合成试剂盒( 卡尔斯巴德，加利福尼亚州)通过逆转录产生cDNA。然后将cDNA用作
使用KOD Hot Start Master ( 麦迪逊，威斯康星州)以及SEQ ID NO：
154和SEQ ID NO：155的引物进行PCR反应的模板。

[0582] 使用BamHI/HindIII限制性位点(框内具有N-末端6x His标签，随后是凝血酶切割位点)，将编码IPD109Aa(SEQ ID NO：138)的IPD109Aa cDNA(SEQ ID NO：137)亚克隆到
pET28a载体( 麦迪逊，威斯康星州)中。然后扩增表达载体，并且在重组蛋白在
大肠杆菌中表达之前，测序确认IPD109Aa cDNA(SEQ ID NO：137)。用含有IPD109Aa基因的
pET28a质粒DNA转化化学感受态BL21(DE3)细胞( 卡尔斯巴德，加利福尼亚
州)，用于重组蛋白表达。将经转化的大肠杆菌细胞在37℃用卡那霉素选择生长过夜，然后
接种到新鲜的2x YT培养基(1∶200)中，并进一步生长至约0.8的光密度(OD600)。通过添加
1.0mM IPTG诱导蛋白质表达，并使这些细胞在16℃进一步生长16小时。根据制造商的方案，
通过使用TalonTM钴树脂(Clonetech公司，山景城，加利福尼亚州)的固定化金属离子色谱法
来纯化经大肠杆菌表达的蛋白质。使用6K MWCO Flextubes(IBI公司，皮斯塔，爱荷华州)，
将纯化的级分透析到1X PBS缓冲液(1∶400)中，在搅拌板上于4℃过夜。将纯化的IPD109Aa
蛋白质(SEQ ID NO：138)用于饮食生物测定，从而评估针对多种鳞翅目和鞘翅目有害生物
幼虫的蛋白质活性。

[0583] 实例19-农杆菌介导的玉蜀黍的稳定转化

[0584] 对于杀昆虫多肽的农杆菌介导的玉蜀黍转化，采用Zhao的方法(美国专利号5,981)。简而言之，从玉蜀黍中分离未成熟的胚，并且将胚与农杆菌悬浮液接触，其中细菌能
够将编码本公开的杀昆虫多肽的多核苷酸转移至至少一种未成熟胚的至少一个细胞中(步
骤1：感染步骤)。在此步骤中，将未成熟胚浸泡在农杆菌悬浮液中，引发接种。使所述胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。将所述未成熟胚在有抗生素但没有选择剂的固
体培养基上培养用于消除农杆菌，并持续经感染的细胞的静置期。接着，在含有选择剂的培
养基上培养经接种的胚，并且回收正在生长的经转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在含
选择剂的固体培养基上培养所述未成熟胚，使经转化的细胞选择性生长。然后将愈伤组织
再生成植物(步骤5：再生步骤)，并将生长在选择培养基上的愈伤组织在固体培养基上培养
以再生植物。

[0585] 为了检测叶组织中的杀昆虫多肽，将4个冻干叶穿孔/样品粉碎并重悬于含有0.1％TWEENTM 20的100μL PBS(PBST)、含有1片/7mL完整迷你蛋白酶抑制剂(罗氏公司
1183615301)的1％β-巯基乙醇中。将悬浮液超声处理2分钟，并且然后在4℃、20,000g下离
心15分钟。向上清液等份1/3体积的3X LDS样品缓冲液(InvitrogenTM，加利福尼
亚州，美国)中，添加含有1片/7mL完整迷你蛋白酶抑制剂的1％B-ME。将反应在80℃加热10
分钟，并且然后离心。将上清液样品按照制造商(InvitrogenTM)说明书装载在具有MES运行
缓冲液的4％-12％Bis-Tris Midi凝胶上，并使用 装置(InvitrogenTM)转移到硝酸
纤维素膜上。将硝酸纤维素膜在含有5％脱脂奶粉的PBST中孵育2小时，然后在PBST中的亲
和纯化的兔抗杀昆虫多肽中孵育过夜。将膜用PBST冲洗三次并且然后在PBST中孵育15分
钟，并且然后在具有山羊抗兔HRP的PBST中孵育持续3小时之前5分钟进行两次，持续2小时。
使用ECL蛋白质印迹试剂(GE医疗集团)和 MR膜可以观察到所检测的
蛋白质。为了检测根中的杀昆虫蛋白，将根冻干，并且将2mg粉末/样品悬浮于LDS中，添加含有1片/7mL完整迷你蛋白酶抑制剂的1％β-巯基乙醇。将反应在80℃加热10分钟，并且然后
在4℃、20,000g下离心15分钟。将上清液样品按照制造商(InvitrogenTM)说明书装载在具有
TM
MES运行缓冲液的4％-12％Bis-Tris Midi凝胶上，并使用 装置(Invitrogen )转移
到硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜在含有5％脱脂奶粉的PBST中孵育2小时，然后在PBST
中的亲和纯化的多克隆兔抗杀昆虫抗体中孵育过夜。将膜用PBST冲洗三次并且然后在PBST
中孵育15分钟，并且然后在具有山羊抗兔HRP的PBST中孵育持续3小时之前5分钟进行两次，
持续2小时。使用ECLTM蛋白质印迹试剂(GE医疗集团)和 MR膜可以检测
到抗体结合的杀昆虫蛋白。

[0586] 使用本领域已知的标准生物测定法测试杀昆虫蛋白表达阳性的转基因玉蜀黍植物的杀有害生物活性。这些方法包括例如根切除生物测定和全植物生物测定。参见例如，美
国专利申请公开号2003/0120054。

[0587] 实例20-用于在植物中表达杀昆虫多肽的表达载体构建体

[0588] 可以构建植物表达载体以包括包含杀昆虫多肽编码序列的转基因盒，所述杀昆虫多肽编码序列在与增强子元件组合的紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子的控制下[Dey N和
Maiti IB，1999，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]40(5)：771-82]。这些构建体可用于产生转基因玉蜀黍事件，以测试通过本公开的杀昆虫多肽的表达提供的针对玉米根虫的功
效。

[0589] 事件的T0温室效应可以通过免受西方玉米根虫的根保护来测量。使用由Oleson等人，(2005)[J.Econ Entomol.[经济昆虫学杂志]98(1)：1-8]开发的方法，根据损伤的根的
节点数测量根保护(CRWNIS＝玉米根虫节点损伤评分)。根损伤评分测量为从“0”到“3”，其中“0”表示无可见根损伤，“1”表示1个根损害节点，“2”表示2个根节点损害，并且“3”表示3个根节点损害的最大评分。中间评分(例如1.5)表示损害节点的额外分数(例如损伤的一个
半节点)。

[0590] 对本公开的各种所说明的实施例的上述描述并不旨在是详尽的或者限制范围于所公开的精确形式。虽然为了说明目的而在本文描述了具体实施例和实例，但是如相关领
域的技术人员将认识到的，在本公开范围内的各种等效修饰是可能的。本文提供的教导可
以应用于除了上述实例之外的其他目的。根据上述教导，许多修改和变化是可能的，并且因
此在所附权利要求书的范围内。

[0591] 可以根据上述详细描述进行这些改变和其他改变。通常，在以下权利要求书中，所用的术语不应被解释为将范围限制于说明书和权利要求书中公开的具体实施例。

[0592] 背景技术、具体实施方式和实例中引用的每个文献(包括专利、专利申请、杂志文章、摘要、手册、书籍或其他公开内容)的全部公开内容通过引用以其整体并入本文。

[0593] 就使用的数字(例如量、温度、浓度等)而言，已努力确保其准确性，但仍应允许有一些实验误差和偏差。除非另有说明，份为重量份，分子量为平均分子量；温度为摄氏度；并且压力为大气压或接近大气压。