本发明涉及用于治疗的新多肽以及它们的功能衍生物和药用可接 受盐。新的多肽各自本身或者一种或多种肽的结合具有抗细菌或真菌 的用途。

蛙的皮肤分泌物含有许多不同类型的抗细菌肽(Barra，D.& Simmaco，M.(1995)在生物技术动态(Trends Biotechnol.)13， 205-209发表了综述：两栖动物的皮分泌物：抗菌肽的潜在资源)。特 别是，已经从蛙属的几个种中分离到多种这样的肽。它们在靠近COOH- 末端都含有2个半胱氨酸残基，形成分子内的二硫化物键。可以将这 些肽区分为4种不同的类型。一类是brevinin 1系列，包括来自Rana brevipoda porsa的brevinin 1(Morikawa，N.，Hagiwara，K.& Nakajima，T.(1992)从蛙Rana brevipoda porsa皮中获得的独 特的抗菌肽Brevinin 1和Brevinin 2，Biochem.Biophys.Res. Commun.189，184-190)，从侧褶蛙(Rana esculenta)中获得的 Brevinin 1E(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa， F.(1994)从侧褶蛙皮分泌物中获得的抗菌肽.编码esculentin的 cDNA分子克隆和新的活性肽的分离，生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 269，11956-11961)，从牛蛙(Rana catesbeiona)中获得的 ranalexin(Clark，D.P.，Durell，S.，Maloy，W.L.& Zasloff，M. (1994)，Ranalexin，来自牛蛙(Rana catesbeiana)皮的一种新的抗 菌肽，结构上类似细菌抗生素，多粘菌素，J.Biol.Chem.269， 10849-10855)，以及从粗皮蛙(Rana rugosal)中获得的gaegurin 5 和6(Park，J.M.，Jung，J.-E.& Lee，B.J.(1994)，从朝鲜 蛙，粗皮蛙皮中获得的抗菌肽生物化学与生物物理研究通讯(Biochem. Biophys.Res.Commun.)205，948-954)。这些肽是由20-24个氨 基酸残基组成。除它们有抗菌活性外，Brevinin 1E和ranalexin也 有高溶血活性。第2类是Brevinin 2肽，其含有29-34个氨基酸。 除来自R.brevipoda porsa的Brevinin 2外(Morikawa，N.， Hagiwara，K.& Nakajima，T.(1992)，从蛙Rana brevipoda porsa 皮中获得的独特的抗菌肽Brevinin-1和Brevinin-2，Biochem. Biophys.Res.Commun.189，184-190)，从侧褶蛙中获得的几种 肽(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F.(1994)， 从侧褶蛙皮分泌物中获得的抗菌肽。编码esculentin的cDNA分子克 隆和新的活性肽的分离，J.Biol.Chem.269，11956-11961)， gaegurins 1-3(Park，J.M.，Jung，J.-E.& Lee，B.J.(1994) 从朝鲜蛙，粗皮蛙皮中获得的抗菌肽，Biochem.Biophys.Res.Commun. 205，948-954)以及从粗皮蛙中获得的皱褶菌素A和B(Suzuki，S.， Ohe，Y.，Okubo，T.，Kakegawa，T.& Tatemoto，K.(1995)， 新的抗菌肽，从粗皮蛙皮中获得的皱褶菌素A，B和C的分离和鉴定， Biochem.Biophys.Res.Commun.212，249-254)都属于这一类。 第3类是从侧褶蛙中获得的37个残基的肽esculentin 2(Simmaco， M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F.(1994)，从侧褶 蛙皮分泌物中获得的抗菌肽.编码esculentin的cDNA分子克隆和新 的活性肽的分离，J.Biol.Chem.269，11956-11961)和gaegurin 4 (Park，J.M.，Jung，J.-E.& Lee，B.J.(1994)，从朝鲜蛙， 粗皮蛙皮中获得的抗菌肽，Biochem.Biophys.Res.Commun.205， 948-954)以及从粗皮蛙中获得的皱褶菌素C(Suzuki，S.，Ohe， Y.，Okubo，T.，Kakegawa，T.& Tatemoto，K.(1995)，新的 抗菌肽，从粗皮蛙皮中获得的皱褶菌素A，B和C的分离和鉴定， Biochem.Biophys.Res.Commun.212，249-254)。最后一类是从 侧褶蛙皮分泌物中获得的esculentin 1(Simmaco，M.，Mignogna， G.，Barra，D.& Bossa，F.(1994)从侧褶蛙皮分泌物中获得的 抗菌肽。编码esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分离， J.Biol.Chem.269，11956-11961)，它是目前已鉴定的所有蛙属肽 中抗菌活性最高的46个氨基酸的肽。此外，它对白色念珠菌 (Candidaalbicans)，酿酒酵母(Saccharomyces core visiae)和绿脓 杆菌(Pseudomonas areuginosa)也有抗菌活性。

本发明的目的之一是提供相对小的抗菌活性多肽。

本发明的另一个目的是提供具有抗细菌或真菌用途的新的多肽。

本发明的再一个目的是提供含有包含在药用可接受载体中的一种 或多种这样多肽的药用组合物。

本发明还有一个目的是提供一种抑制动物如哺乳动物包括人体内 微生物生长的方法。

对于通过以下本发明内容公开所明了的本发明的这些目的以及其 他目的提供下面新的肽：

F L P L I G R V L S G I L-酰胺

L L P I V G N L L K S L L-酰胺

L L P I L G N L L N G L L-酰胺

L L P I V G N L L N S L L-酰胺

V L P I I G N L L N S L L-酰胺

F L P L I G K V L S G I L-酰胺

F F P V I G R I L N G I L-酰胺

L S P N L L K S L L-酰胺

L L P N L L K S L L-酰胺

F V Q W F S K F L G R I L-酰胺

以下是特别优选的多肽：

F L P L I G R V L S G I L-酰胺

L L P I V G N L L K S L L-酰胺

F L P L I G K V L S G I L-酰胺

F F P V I G R I L N G I L-酰胺

F V Q W F S K F L G R I L-酰胺

上述多肽的功能性衍生物和药用可接受盐也包括在本发明范围 内。

本发明多肽各自本身可单独使用或与两种或多种多肽结合使用。

这类多肽可应用于治疗，例如抗菌使用，包括抗细菌或真菌使用。

本发明也提供了使用一种或多种上述公开的多肽来制造抗菌活性 药物。

而且，本发明提供了一种药物组合物，包括活性组分即有效剂量 的一种或多种上述多肽和药用可接受载体或稀释剂。所说的载体或稀 释剂适于口服，静脉，肌肉或皮下给药。

本发明也提供了cDNA克隆，其序列是选自以下公开的克隆Rt- 5，Rt-6和Rt-17所显示的序列。

最后，本发明提供了一种抑制动物如哺乳动物包括人体内微生物 生长的方法，包括给与抗微生物侵染引起紊乱的动物受者抗菌量的一 种或多种上述多肽或其组合物的步骤。

这种方法可以通过口服给药缓释形式的上述组合物直接作用于 肠。此方法也可以通过注射可注射剂量形式的组合物给药。

关于“它们的功能衍生物”的表述，已知在本发明技术领域使用 小的氨基酸替代物制成的多肽并不影响或实际上并不影响多肽的功 能。根据本技术领域常规方法成功地确定可接受的替代物。这样，所 有的多肽具有实际上同样的氨基酸序列，实质上同样的螺旋结构和实 质上一样的生物活性，例如抗菌和溶解活性，这些都在本发明的范围 内。

本发明多肽的药用可接受盐也在本发明的范围内。这些盐可由技 术人员以常规方法制成。例如根据常规方法可制备多肽的碱盐。当包 括权利要求书的本发明公开中使用术语多肽时，是指包括多肽的功能 性衍生物和药用可接受盐。

依据本发明活性多肽可以配制在人或兽药中使用，用于治疗或预 防用途。活性制剂通常以口服，直肠或非经肠道给药，例如通过药物 制剂形式或组合物形式注射，所述药物制剂或组合物包含活性成分与 药用可接受载体结合，载体可以是固体，半固体或液体，或如口服给 药时使用胶囊形式。也可以采用局部用药方式。药物制剂的实例可以 是已知的片剂，滴剂，溶液和栓剂。通常，活性成分构成制剂的小部 分，例如约0.1-约50％重量份。

为制备应用于口服的剂量单位形式的药物组合物，本发明多肽可 以与固体，粉末或其他载体混合，例如乳糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露 糖醇，淀粉如马铃薯淀粉，玉米淀粉，millopectine，纤维素衍生物 或明胶，以及可以包括润滑剂如硬脂酸镁或钙，或由聚乙二醇蜡压缩 成片剂或糖衣药丸。剂量单位也可以肠溶衣包被形式存在。

使用几层载体或稀释剂可制成缓释片剂。

将口服或注射使用的液体制剂做成elexirs，糖浆或悬浮液形 式，例如含有0.1-20％重量份的活性物质，糖以及乙醇，水，甘油， 丙二醇和可能的其它常规类型的添加剂的混合物溶液。

活性成分的给药剂量在一宽范围内变化并且取决于不同因素例如 紊乱的严重程度，病人的年龄和体重，并且可以分别进行调整。

根据本发明，在寻找新的多肽过程中，使用了哈士蟆(Rana tempororia)皮，这种动物是一种在欧洲中部许多地方发现的红色蛙。 从这种蛙皮中获得的cDNA文库是用编码来自侧褶蛙的esulentin 1 前体信号肽DNA片段筛选的。由此方法用潜在编码新肽前体的插入片 段分离出几个克隆。从哈士蟆皮分泌物中分离得到的新肽称为 temporins，发现其自身或协同结合使用时有生物活性如抗细菌活性。

通过下面公开的非限定实施例描述本发明。参见附图解释发明内 容，其中：

图1表示3个克隆的核苷酸序列和存在其中的插入片段以及推导 出的氨基酸序列；和

图2表示哈士蟆皮分泌物的反相HPLC图。

                     材料和方法

酶和试剂。Merck公司的分析纯化学试剂，Carlo Erba公司的HPLC 用溶剂，Perkin Elmer公司的序列分析用化学试剂。Difco公司的抗 菌测定培养基，Sigma公司的琼脂糖(A6013)。Boehringer Mannheim 公司的限制性内切酶和DNA修饰酶，Pharmacia公司的脱氧核糖核苷 酸。DNA序列用“序列测定试剂盒”(version 2.0，U.S.Biochemicals) 测定，使用[a-35S]dATP。合成的肽买自TANA实验室(Huston，USA)。

RNA的分离和克隆方法。为此研究，使用了2个样品的哈士蟆皮。 通过oligo(dT)-纤维素亲和色谱法分离出富含poly(A)的RNA以及根 据Richter等人的方法(1990b)获得cDNA文库(Richter，K.，Egger， R.& Kreil，G.(1990b)编码Bombina variegata皮中韩蛙皮素前体 的cDNA分子克隆，FEBS Lett.262，353-355.)。

包括约10000个克隆的cDNA文库是用Hind III酶切esculentin 1 cDNA获得的240bp片段筛选出的(Simmaco，M.，Mignogna，G.， Barra，D.& Bossa，F.(1994)，从侧褶蛙皮分泌物中获得的抗菌肽。 编码esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分离(J.Biol.Chem. 269，11956-11961)。这一片段编码esculentin 1前体的前区 (prepro-region)。探针用随机引物法标记(Boehringer Mannheim)。 55℃在100mM磷酸钠缓冲液，pH7.2，含850mMNaCl，1mMEDTA， 10xDenhardt’s溶液，0.1％SDS和100mg/ml酵母tRNA进行杂交16小 时。在50℃用SSPE(0.3M NaCl，20mM磷酸钠，pH7.4，2mMEDTA)， 0.2％SDS冲洗滤纸(Whatman 541，11cm×11cm)两次，每次15分钟。 选择阳性克隆并用限制性内切酶裂解分析和进行核苷酸测序。

RNA印迹分析。用含0.8M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶电泳分离出富含 Poly(A)RNA(5mg)(Arrand，J.E.(1985)在核酸杂交中制备核酸探针： 实验方法(Hames，B.D.& Higgins，S.J.，eds)pp 17-45，IRL Press， Oxford)并直接杂交到Nytran sheets(Schleicher & Schuell)。 Rt-17克隆的插入片段用随机引物法标记并用作RNA印迹的探针。在 55℃用0.1x SSPE，0.1％SDS冲洗滤纸，然后作放射自显影。

皮分泌物的收集和提纯。在奥地利萨耳斯堡捕获哈士蟆的3个样 品(每个30-35g)。在实验室的terrarium中保存1年，喂养黄粉虫 幼虫。用温和电击法(12V，脚到头)每间隔3周收集皮分泌物。通过用 10ml 0.05％(体积比)乙酸清洗每只蛙的背部区域，从蛙的体表面收集 分泌物。3只蛙的分泌物合并并冻干。通过Beckman model 332系列 的HPLC分馏适合等分，使用反相柱(Aquapore RP-300，7mm×250mm. Applied Biosystems)，用含10-70％乙腈/异丙醇(4∶1)的0.2％(体 积比)三氟乙酸梯度洗脱，流速1.8ml/min。肽的洗脱液在220nm用 Beckman 165分光光度计检测。收集峰部分的洗脱液并冷冻干燥。取 少量的各峰部分的洗脱液作丹磺酰氯衍生作用和反相HPLC分离后进 行N-末端分析(Simmaco，M.，De Biase，D.，Barra，D.& Bossa， F.(1990b)，使用丹磺酰氯柱前衍生作用和反相高压液相色谱技术进 行氨基酸自动分析和酰胺化残基测定(J.Chromatogr.504，129- 138)。使用大孔的C18柱(4.6mm×150mm，Supelco)，上述同样溶 剂系统作适当改变的梯度进行肽的进一步提纯。

结构分析。氨基酸分析是在6 N HCl汽相水解肽(1-2nmol)24小 时后进行，采用Beckman System Gold分析仪，其装有离子交换柱和 水合茚三酮衍生装置。用Perkin-Elmer model AB476A测序仪自动控 制的Edman降解确定肽的序列。在某些情况下，通过质谱分析和/或羧 基肽酶Y消化确定C-末端的酰胺化状态(Simmaco，M.，De Biase，D.， Barra，D.& Bossa，F.(1990b)使用丹磺酰氯柱前衍生作用和反 相高压液相色谱技术进行氨基酸自动分析和酰胺化残基测定，J. Chromatogr.504，129-138)。

抗菌检测。抑菌活性是检测抗巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BMll，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphyloco ccus aureus) Cowahl，酿脓链球菌(Strepto coccus pyogenes)b溶血型A，绿脓 假单胞菌(Pseudomonasa eruginosa)ATCC 15692，大肠杆菌 (Escherichiacoli)D21，大肠杆菌D21e7，大肠杆菌D21f1，大肠 杆菌D21f2和大肠杆菌D22，采用抑菌圈试验，在LB肉汤/1％琼脂糖 平板接种2×105活菌(Hultmark，D.，Engstrom，.，Andersson， K.，Steiner，H.，Bennich，H.& Boman，H.G.(1983)昆虫免疫 物质.Attacin，来自Hyulophora cecropin的抗菌蛋白系列，EMBO J. 2，571-576)。白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 10261的新鲜培 养物接种于WB肉汤培养基，pH6.5，并在37℃下培养到OD600大约为 0.6。培养物稀释300倍然后接种涂平板，加入测试肽，其浓度是通过 氨基酸分析确定的，37℃过夜。测量抑菌圈和使用在(Hultmark，D.， Engstrom，.，Andersson，K.，Steiner，H.，Bennich，H.& Boman， H.G.(1983)昆虫免疫物质.Attacin，来自Hyulophora cecropin的 抗菌蛋白系列，EMBO J.2，571-576)中的公式，通过对测试物质系 列稀释后获得的抑菌圈的直径计算致死浓度(LC，抑制生长的最低浓 度)。致死浓度值用至少5个试验样本的平均值表示，误差小于1个稀 释度。

                       圆二色性测量

采用装有DP 520信息处理器的Jasco J710分光光度计，使用 2mm光程的石英比色皿，在20℃进行圆二色性测量即CD测量。CD光 谱值是3个系列记录的平均值。椭圆率作为平均摩尔浓度残基椭圆率 (q)，以deg cm2dmol-1表示。氨基酸分析确定肽浓度。

                           结果

编码前体的cDNA克隆分析。编码信号肽和前部分esculentin 1 前体的240bp Hind III酶切片段用作探针筛选由哈士蟆皮中获得的cDNA 文库。检测到6个阳性克隆。存在于克隆Rt-5，Rt-6和Rt-17中的插 入片段序列显示于图1。除poly(A)尾部外，这些cDNAs各自含有323， 356和329个核苷酸。在第1个甲硫氨酸密码子之后，它们含有开放 阅读框架可翻译成含有58(Rt-6)或61个氨基酸(Rt-5和Et-17)的多 肽。所有推导的序列都有典型的肽前体特点。它们开始于含有疏水残 基簇的信号肽。信号肽酶的裂解位置最可能定位在半胱氨酸残基后的 位置22(von Heine，G.(1983)靠近信号序列裂解位置的氨基酸图谱， Eur.J.Biochem.133，17-21)。推断的成熟肽序列先于赖氨酸-精 氨酸，典型的激素原转化酶加工位置。所有这些前体多肽终止于甘氨 酸-赖氨酸序列。通过羧基肽酶E水解将暴露C-末端甘氨酸，这要求 形成COOH-末端酰胺。对于克隆Rt-5和Rt-17预期的最终产品将是含 有13个氨基酸的酰胺化肽，而Rt-6在此区域有9bp的缺失，这样编 码得到仅是十肽。

RNA印迹分析。在来自哈士蟆皮的富含Poly(A)RNA中，来自克隆 Rt-17的探针识别出大量信息，检测到一个单一的400-500范围内的 核苷酸的相当宽的带。同样条件下，从其它的两栖类物种如侧褶蛙， 爪蛙(Xenopus laevis)和Bufo viridis皮中没有获得信号。

皮分泌物中肽的分离和分析。哈士蟆的3个样本在受电刺激后， 获得大约20mg的冷冻干燥材料。在初步HPLC提纯后(图2)，每一级 分都进行N-末端分析，以鉴定预计来自cDNA序列的带有亮氨酸或苯 丙氨酸的氨基酸末端的那些。相关的部分用HPLC进一步提纯并进行氨 基酸和序列分析。根据这一方法，发现了3个预测的肽确实存在于分 泌物中。也分离到结构上与这些肽相关的其它分子。这些肽的序列列 于表1，定名为temporins。在表中也记录了从分泌物中收集到的每一 种肽的量。在图2中所示的HPLC分布型，表示各种肽的洗脱位置。如 表中所示temporin E的结构，在它的N-末端带有缬氨酸，其部分与 temporin D洗脱。Temporins在它的C-末端均酰胺化，如前体(参见 前述)结构所预期的，并含有大量的疏水氨基酸。除temporins H和K 有10个残基长外，这些肽中的每一个都含有13个氨基酸残基。除 temporins C，D，和E外，所有这些肽至少有一个碱性残基(赖氨酸 或精氨酸)。在分析的过程中，在皮分泌物中也发现了22-残基肽(见 表1)。它的序列与蜂毒肽有些相似，蜂毒肽是来自蜜蜂毒液的一种溶 血肽(Habermann，E.(1972)蜜蜂和黄蜂毒液，Science 251， 1481-1485)。这样将其命名为类蜂毒肽(MLP)。

生物活性测定。首先检测提纯的temporins对巨大芽孢杆菌和大 肠杆菌D21的抑菌活性。Temporins A，B，F，G和L对两个菌株都有 活性，而temporins C，D，E，H和K仅对最敏感细菌巨大芽孢杆菌 表现一些活性。

一些Temporins的回收率太低，不能允许详细地鉴定它们的生物 特性。为确定结构和获得更多材料可化学合成Temporins A，B，D和 H。合成的Temporins A和B的抑菌活性用致死浓度值表示，以及和血 红细胞溶解获得的结果一起记录于表2。参考包括来自侧褶蛙的 esulentin 1(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa， F.(1994)从侧褶蛙皮分泌物中获得的抗菌肽。编码esculentin的 cDNA分子克隆和新的活性肽的分离，J.Biol.Chem.269，11956- 11961)，来自昆虫血淋巴的cecropin(Steiner，H.，Hultmark，D.， Engstrm，，Bennich，H.& Boman，H.G.(1981)在昆虫免疫 中涉及的两个抗菌蛋白序列和特异性，Nature 292，246-248)和来 自蜜蜂毒液的蜂毒肽(Habermann，E.(1972)蜜蜂和黄蜂毒液，Science 251，1481-1485)。

合成的Temporins A和B与它们的天然对应物表现同样的活性， 而发现Temporins D和H自身或作为其它蛙属肽的增强物都没有任何 生物活性。对金黄色酿脓葡萄球和酿脓链球菌，Temporin A抗菌活性 大约是Temporin B的3倍多。另一方面，这两种Temporins对大肠 杆菌D21的抗菌活性很低，对于绿脓假单胞菌则完全没有活性。这表 明Temporin A和B特异性抗格兰氏阳性菌。

如cecropins的线性元硫抗菌肽是对真菌没有活性的而防御素 (带有3个S-S键)表现抗真菌活性。Temporin A和B对白色念珠菌有 抗菌活性以及它们的效力等效于报道的来自南美蛙Phyllomedusa Sauvagei的dermaseptin(Mor，A.，Hani，K.& Nicolas，P.(1994) 脊椎动物肽抗生素dermaseptins有重叠结构特性而靶标特定的微生 物，J.Biol.Chem.269，31635-61641)。

同时检测Temporin A和B对大肠杆菌D21的D21e7，D21f1和 D21f2 3个菌株的抗菌活性，连续突变缺失增加了LPS中侧链数量 (Boman，H.G.& Monner，D.A.(1975)来自大肠杆菌K12突变株脂 多糖的鉴定，J.Bacteriol.121，455-464)。由于在envA基因处 的突变，菌株D22产生可渗透性外膜(Normark，S.，Boman，H.G.& Matsson E.(1969)，大肠杆菌突变株，有不正常的细胞分裂和降低 游离和染色体介导的对氨苄青霉素和几种抗生素抗性的能力， J.Bacteriol.97，1334-1342)。存在或不存在基础培养基E的情况 下检测Temporins的活性(Vogel，H.J.& Bonner，D.M.(1956)大 肠杆菌的N-α-乙酰鸟氨酸酶：部分提纯和某些特性，J.Biol.Chem. 218，97-106)。

表3的结果显示培养基E增加了所有检测菌株的tempors活性。 然而，没有发现对格兰氏阳性菌的类似作用。CD光谱显示活性的增加 与螺旋结构的增加有关，如先前发现的FALL-39(Ageberth，G.， Gunne，H.，Odeberg，J.，Kogner，P.，Boman，H.G.& Gudmundsson， G.H.(1995)FALL-39，推断的人的肽抗生素，是无半胱氨酸和在骨 髓和睾丸中表达的，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci. USA)92，195-199)。

在此使用的术语“功能性衍生物”包括有游离羧基的肽和酸加成 盐。因此本发明并不局限于发明公开的这些具体的肽。

表1

哈士蟆皮肽序列和在分泌物中得到的相应量。用星号标注的是根 据cDNAs预测的肽相应前体的结构。a表示酰胺化的COOH-末端。MLP， 类似蜂毒肽的肽。相同的残基用黑体表示。间隔(-)是完全相同的插入 片段。

       肽                序列                   产量

                                        nmol/mg   Temporin A       FLPLIGRVLSGILa           14.5   Temporin B*     LLPIVGNLLKSLLa           19.4   Temporin C       LLPILGNLLNGLLa           37.5   Temporin D       LLPIVGNLLNSLLa           1.1   Temporin E       VLPIIGNLLNSLLa           1.2   Temporin F       FLPLIGKVLSGILa           13.5   Temporin G*     FFPVIGRILNGILa           16.8   Temporin H*     LSP---NLLKSLLa           8.7   Temporin K       LLP---NLLKSLLa           9.8   Temporin L       FVQWFSKFLGRILa           3.6 MLP      FIGSALKVLAGVLPSVISWVK---Qa         5.1 蜂毒肽   GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQa

表2

哈士蟆肽的抗菌和溶解活性。通过接种各有机体的琼脂糖平板上 的抑菌圈计算致死浓度。Cecropin的数据取自Hultmark等人 (1983)。酿脓链球菌β溶血型A和绿脓假单胞菌ATCC 15692是临床 分离物，由Dr.Paolo Visca，Institute of Microbiology， University of Rome La Sapienza惠赠。NT，表示没有检测。 有机体和菌株                       致死浓度

                           Temporin A  Temporin B  Esculentin 1  Cecropin A  MLP   蜂毒肽

                           μM 巨大芽孢杆菌Bmll               1.2         2.8         0.1           0.5         NT    0.6 金黄色酿脓葡萄球菌Cowan        2.3         6.0         0.4           ＞200       NT    0.2 Y.pseudotubercolosis           7.0         7.0         NT            0.5         NT    NT 酿脓链球面β溶血型A            2.0         7.0         NT            NT          NT    NT 大肠杆菌D21                    11.9        21.0        0.2           0.3         NT    0.8 绿脓假单胞菌                   ＞360       ＞360       0.7           NT          NT    NT ATCC15692 白色念球菌                     3.4         4.0         0.5           NT          NT    NT 人红细胞                       ＞120       ＞120       ＞200         ＞400       0.5   0.9

表3

Temeporins A和B对大肠杆菌D21和相关的LPS修饰菌株的抗菌 活性。试验在LB肉汤/1％琼脂糖，有或无培养基E(Vogel & Bonner 1956) 下进行。细菌菌株是由Prof.H.G.Boman，University of Stockholm 惠赠。

                   致死浓度 化合物                D21        D21e7    D21f1  D21f2  D22

                  μM Temporin A            11.9       1.4      0.9    4.8    3.4 Temporin A+ 培养基E   5.3        1.4      3.0    2.0    0.4 Temporin B            21.0       13.2     10.0   3.3    11.2 Temporin B+ 培养基E   3.4        4.2      3.5    9.3    12.2

序列

克隆  Rt-5 1   ACAATTCTGAGCCAACTGAACCACCCGAGCCCAAAGATGTTCACCTTGAAGAAATCCCTG

                                     M  F  T  L  K  K  S  L 61  TTACTCCTCTTTTTCCTTGGGACCATCAACTTATCTCTCTGTGAGGAAGAGAGAAATGCA

 L  L  L  F  F  L  G  T  I  N  L  S  L  C  E  E  E  R  N  A 121 GAAGAAGAAAGAAGAGATGAACCAGATGAAAGGGATGTTCAAGTGGAAAAACGACTTTTA

 E  E  E  R  R  D  E  P  D  E  R  D  V  Q  V  E  K  R  L  L 181 CCAATTGTTGGAAACCTGCTCAAGAGCTTGTTGGGAAAATAACCAAAAATGTTAAGAATG

 P  I  V  G  N  L  L  K  S  L  L  G  K  + 241 GAATTGGAAATCATCTGATGTGGAATATCATTTAGCTAAATGAGCAACAGATGTCTTATT 301 TAAAAAAATAAATATGTTCCATC

克隆  Rt-6 1   GCTTTGTAGGATAGACCTGCACTGAAGTCTTCCAGCCGTCTACATTCTGAGCACCAACTG 61  AACTACCCGAGCCCAAAGATGTTCACCTTGAAGAAATCCCTGTTACTCCTCTTTTTCCTT

                   M  F  T  L  K  K  S  L  L  L  L  F  F  L 121 GGGACCATCAACTTATCTCTCTGTGAGGAAGAGAGAAATGCAGAAGAAGAAAGAAGAGAT

 G  T  I  N  L  S  L  C  E  E  E  R  N  A  E  E  E  R  R  D 181 GAACCAGATGAAAGGGATGTTCAAGTGGAAAAACGACTTTCACCAAACCTGCTCAAGAGC

 E  P  D  E  R  D  V  Q  V  E  K  R  L  S  P  N  L  L  K  S 241 TTGTTGGGAAAATAACCAAAAATGTTAAGAATGGAATTG6AAATCATCTGATGTGGAATA

 L  L  G  K  + 301 TCATTTAGCTAAATGCGCAACAGATGTCTTATTTAAAAAATAAATATGTTGCATAC 克隆  Rt-17 1   CCCCTCCAGCTGTCTACATTCTCATAACCAACTGAACCACCCGAGCCCAAAGATGTTCAC

                                                     M  F  T 61  CTTGAAGAAATCCCTCTTACTCCTTTTCTTCCTTGGGACCATCAACTTATCTCTCTGTGA

  L  K  K  S  L  L  L  L  F  F  L  G  T  I  N  L  S  L  C  E 121 GGAAGAGAGAGATGCCGATGAAGAAAGAAGAGATGATCTCGAAGAAAGGGATGTTGAAGT

  E  E  R  D  A  D  E  E  R  R  D  D  L  E  E  R  D  V  E  V 181 GGAAAAGCGATTTTTTCCAGTGATTGGAAGGATACTCAATGGTATTTTGGGAAAATAACC

  E  K  R  F  F  P  V  I  G  R  I  L  N  G  I  L  G  K  + 241 AAAAAAAGTTAAAACTTTGGAAATGGAATTGGAAATCATCTAATGTGGAATGTCATTTAG 301 CTAAATGCACATCAAATGTCTTATAAAAA