技术领域
[0001] 本
发明涉及一种鹰嘴豆多肽部位的制备方法及其应用,是利用鹰嘴豆豆瓣、鹰嘴豆渣为原料制备的具有抗菌活性的多肽部位,具有抗细菌、抗
真菌等
生物活性,在医药、食品领域具有很好的应用前景。
背景技术
[0002] 抗生素的发现曾是
人类医学史上的一个里程碑。然而,由于抗生素的滥用而不时地引起耐药菌的出现,而且出现的
频率超过新型抗生素的开发速度,使得许多曾经高度有效的抗生素药物失效,以至于给感染性
疾病的
治疗带来诸多新的问题,传统抗生素的使用
正面临着严峻的挑战。研究和应用无毒、无公害、无耐药的新型抗菌制剂替代抗生素已成发展趋势。
[0003]
植物在生长过程中每天要与环境中几百万种的病原菌
接触,随时都可能遭受
微生物的侵袭,而植物没有象
哺乳动物那样特异的免疫系统,因而非特异的天然免疫体系对植物起着重要的保护作用。人们发现,生物受到微生物感染后,迅速、大量产生具有抗菌活性的小分子多肽(即抗菌肽)参与
机体免疫。抗菌肽几乎是所有生物中都有的重要免疫分子,是植物非特异天然免疫体系的重要组成部分。目前已从微生物、植物、昆虫、
节肢动物、两栖动物、哺乳动物甚至人体内鉴定出上千种抗菌肽,这类抗菌肽在合成机制、
氨基酸组成和作用机制等方面不同于传统的微生物(包括细菌、真菌和链霉菌等)产生的多肽类抗生素。抗菌肽作为传统抗生素的可能替代物以其无比优越的特性越来越成为人们关注的热点。抗菌肽(antibacterial peptide,ABP)又称抗微生物肽(antimicrobial peptide,AMP)或肽抗生素(peptide antibiotics),是广泛存在于自然界生物中的一种具有抗茵、抗病毒、抗寄生虫、提高机体免疫
力等生物学功能的活性多肽,它是生物非特异性防御系统的免疫应答产物,具有广谱抗菌活性,不仅可以抑制多种细菌或真菌,甚至可以在不伤及正常细胞的情况下抑
制动物体内的
肿瘤细胞。抗菌肽是机体天然免疫系统的重要组成部分,并能够在机体发生特异性免疫应答之前发挥抗感染作用。目前,抗菌肽的研究和开发已成为国内外研究的热点之一。抗菌肽具有广谱抗菌和其它优良的特性,与它自身的结构特点密不可分。虽然抗菌肽种类繁多,来源也不同,但它们的一级结构(即氨基酸序列)具有较强的保守性。抗菌肽相对分子
质量小(<10KD左右)。而植物抗菌肽一般为40-90个氨基酸残基组成的多肽,富含半胱氨酸,通常具有数个β-折叠和一段α-螺旋结构。不同来源、不同结构的抗菌肽的一级结构(即氨基酸序列)具有较强的保守性,且具有以下共同特点:
[0004] ①N端富含极性氨基酸,如赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)等,呈强
碱性,含过剩的正电荷,使抗菌肽呈阳离子特性,这一特征使抗菌肽具有
表面活性剂活性;;②C端通常酰胺化,呈中性疏
水性,富含丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、甘氨酸(Gly)等非极性氨基酸,这可能与抗菌肽的广谱抗菌活性有关;③中间连接部分富含脯氨酸(Pro),末端大多酰胺化,它也直接影响抗菌肽的杀菌活性;④大部分抗菌肽在第二位上的氨基酸为
色氨酸(Trp),它对抗菌肽的杀菌活性的高低起着至关重要的作用。
[0005] 传统抗生素是通过消除微生物生长或生存必需的功能,如阻挠细菌
蛋白质的合成或者改变酶的活性来达到杀菌目的,而细菌通过改变一种基因就足以对付抗生素的这种进攻。抗菌肽则作用于细菌细胞膜,导致膜的通透性增大,以此穿透、杀灭细菌。细菌必须改变膜的结构,即改变相当部分的基因才能防御抗菌肽的进攻,而这几乎是不可能的。因此,抗菌肽极大地减少了产生耐药性的可能,这也是与抗生素相比的一大优势。抗菌肽是动物机体分泌的小分子短肽,也是机体成分之一,因此具有安全无毒
副作用的生物学特性,从而避免了传统抗生素类药物对机体免疫系统的损害。抗菌肽在100℃加热10min条件下仍能保持活力,对pH值有较强适应性,
水溶性好。抗菌肽对正常的真核细胞几乎没有杀伤作用,只作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。其原因在于:
[0006] 由于高等动物细胞膜上有大量的胆固醇和蛋白质,特别是前者,阻碍抗菌肽的疏水面插入磷脂双分子层中。
[0007] 哺乳动物细胞膜外层脂质为其所特有的呈电中性的两性磷脂,主要是卵磷脂和鞘磷脂;而细菌细胞膜则含有大量的带有负电荷的磷脂(如磷脂酰甘油和心磷脂),且有时其含量会超过50%,使其必然暴露于细胞外膜;此外,革兰阴性菌细胞壁主要由带大量负电荷的脂多糖组成。
[0008] 可能是由于微生物与高等动物细胞膜的膜外结构的区别:高等动物细胞膜外表面的唾液酸与膜的距离有 它可能与抗菌肽的带正电区结合而阻止抗菌肽接近细胞膜发挥杀伤作用。
[0009] 哺乳动物的真核细胞中存在着高度发达的细胞骨架系统,其中的微丝和微管与细胞膜内层有许多结合位点,这种结构是维持细胞特殊形状和渗透压的首要因素,高度发达的细胞骨架系统,在哺乳动物细胞对抗菌肽溶胞作用的敏感性上发挥着重要作用。
[0010] 目前食品工业中的
防腐剂主要以山梨酸、苯
甲酸及其盐类等化学合成剂为主,此类化合物容易在加工过程中超标而对人体造成危害。抗菌肽用作食品防腐保鲜剂不仅具有广谱抗菌活性、有效杀灭霉腐微生物,而且抗菌肽分子量较小、热
稳定性强、水溶性好、无免疫原性、对人无毒副作用,另外抗菌肽在人体内还可以被蛋白酶降解,双重安全的保证使得抗菌肽在食品工业领域逐渐显示出广阔的应用前景。
[0011] 医药工业是抗菌肽应用最为广泛和最有前途的行业,随着抗生素的长期广泛应用,许多病源菌对它们产生了耐药性,抗生素添加剂的使用则严重破坏了动物肠道的微生物平衡,且易在动物体内残留,严重影响畜产品质量和人类健康,而具有广谱抗菌且有独特抗菌机制的抗菌肽显然在这方面的应用研究中具有明显优势。随着人们对抗菌肽结构与活性的关系、抗菌肽作用机制及其基因表达调控机制认识的不断深入,将抗菌肽与病原体表面特异受体结合的配体连接,完全有可能设计出一批能够特异作用于肿瘤、真菌或病毒的高效肽类抗生素、抗肿瘤药物、抗病毒药物,使人类摆脱此类疾病的折磨,给医药卫生的发展和疾病治疗带来不可估量的现实意义。
[0012] 癌症是人类疾病中的一大难题,目前使用的
化疗药物能杀死癌细胞,但也同时杀死人体内正常细胞,副作用极大。抗菌肽能抑制某些肿瘤细胞的生长而对人体正常细胞无害,极有可能成为无毒或低毒的抗肿瘤新药,这给抗癌药物的开发带来了希望。
[0013] 抗菌肽在
化妆品上用作防腐剂,鱼类抗菌肽不仅是营养成分,更重要的是它的抗菌和美容作用,比化学防腐剂用于化妆品具有独特的优势和广泛的市场潜力。
[0014] 抗菌肽在农业和
畜牧业中的应用:1、抗菌肽作为
饲料添加剂普通抗生素的作用具有专一性,而且容易使机体产生抗药性,导致产生的作用效果不佳。抗菌肽不仅具有广谱抗菌作用,而且对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的功能,属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂,可作为畜禽饲料添加剂取代或部分取代目前饲养动物所用的抗生素,减少抗生素对动物体的危害以及减少动物养殖中对药物的依赖。2、转基因动物借鉴已成功的昆虫抗菌肽转基因工程,如转基因蚊子、转基因
马铃薯、转基因水稻等,把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达,从而产生抗病新品种,开辟了一条发展畜牧生产的新思路。3、在绿色畜牧业发展中发挥重要作用:由于抗生素在畜禽生产中的大量的使用。药物在畜禽体内严重残留及其耐药微生物的产生使动物性食品的安全性问题日益突出,这严重威胁着人民身体健康和整个养殖业的可持续发展,也给我国畜产品出口贸易带来了巨大的损失。抗菌肽具有广谱抗菌活性且快速杀菌,不受传统抗生素耐药突变株影响,不易产生耐药菌株,与传统抗生素协同作用,中和内毒素和在动物体内起有效作用等特性。所以在绿色、安全、环保的畜牧业发展中,抗菌肽也发挥着重要的作用。
[0015] 抗菌肽在植物领域的研究与应用:植物病害多达数百种,几乎所有作物在生长期内都会遭到不同程度的危害,培育抗病新品种是防治植物病害的根本途径。抗菌肽具有广谱杀菌效果及不易引起病原微生物产生耐药性等优点。因而,将抗菌肽基因转入
农作物,是培育作物抗病新品种的有效策略。
[0016] 抗
氧化剂和抗氧化多肽:随着人们生活水平提高和生活方式的改变,糖尿病、心
血管疾病,尤其是高脂血症和动脉粥样硬化所致的冠心病,日益严重威胁着人类的健康,在美国、欧洲和许多亚洲国家(包括中国),它已成为居民死亡的主要原因。
[0017] 引起动脉粥样硬化、心血管疾病的危险因素相当广泛,其中,高血脂、
高血压、糖尿病、低水平的高
密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-c)、高水平的低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein chofesterol,LDL-c)等是主要诱因。大量研究显示,氧化应激的增强在动脉粥样硬化的起始阶段起着关键性作用,自由基和脂质过氧化是其主要原因。
[0018] 一般条件下,抗氧化防御体系可以通过酶(如过氧化物岐化酶和谷胱甘肽过氧化物酶)和非酶抗
氧化剂(如抗氧化维生素、微量元素、辅酶和辅酶因子)清除反应物质。然而,在一定条件下,内源性防御系统不能防御自身产生的自由基,进而不能保护机体不受损伤。这就产生了氧化应激,氧化应激是指机体内高活性分子如
活性氧簇(ROS)和活性氮簇(RNS)产生过多或消除减少,从而导致组织损伤。ROS包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH·)、过氧化氢(H2O2)等,RNS包括一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)、过氧亚
硝酸基阴离子(ONOO-)等。在正常状态下机体可产生少量ROS参与正常代谢,同时体内存在清除、抑制自由基反应的体系,使得过多的自由基被清除或使自由基减少,保持自由基的产生和清除的平衡;但在某些病理状态下,这一机制遭到破坏,体内自由基产生过多或清除过慢,体内自由基显著增加。
自由基很不稳定,能与体内各种物质发生反应,如引发不饱和
脂肪酸发生脂质过氧化反应,损伤膜的结构,它们还进攻
碳水化合物、蛋白质、脂类、核酸等物质,从而导致细胞或组织损伤和死亡。为了保持自由基的产生和清除之间的平衡,适当的清除自由基和活性氧是
预防生物体多种疾病的最有效的方法之一。
[0019] 脂质氧化也是食品工业和消费者所关心的焦点,因为脂质氧化可以产生许多有毒气体和毒性物质。尤其,在食品中脂质过氧化反应影响食品的营养价值,可能产生一些有害物质。空气污染物和
烟草中的氧化剂在
皮肤里可以引起一些有害的反应,或者被血液循环所吸收,引起副反应。另外,紫外
辐射能促进一系列氧化剂的产生。
[0020] 因此,在过去的十几年里,人类营养学和生物化学研究的焦点是从食物成分中寻找抗氧化剂,以便延缓脂质过氧化反应。自由基清除剂就是一类预防性抗氧化剂。因此,抗氧化剂对防止氧化应激保护机体起到了重要作用。比较好的抗氧化剂被用来保存食品,延缓因氧化反应而产生的食品变色和变质。合成的抗氧化剂高效,但是有一定的毒性和危害。在人体营养和生物化学领域中,食物来源的天然抗氧化剂因其高效、毒性小而成为研究的热点。人们宁愿选择天然抗氧化剂也不愿选用合成的抗氧化剂。
[0021] 抗氧化剂具有清除自由基和延缓脂质过氧化反应的发生。抗氧化剂近些年来在国内外发展很快,用途也越来越广。自从Harman提出自由基理论以来,人们认识到人体内氧化产生的自由基与人的衰老和许多疾病有关。因此抗氧化剂不仅用于含脂肪食品的抗氧化,而且作为功能因子用于保健食品及化妆品等的开发。抗氧化剂的种类很多,化学合成的抗氧化剂,如丁羟基茴香醚(BHA)、丁羟
甲苯(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)和
没食子酸丙酯(PG),都被用来防止食品中自由基的形成,从而延缓脂类氧化。然而,合成抗氧化剂由于其毒副作用,各国政府纷纷控制其添加量,防止过量添加。于是人们把目光逐步转向从各种植物、动物组织中提取天然抗氧化剂,寻找高效、低毒的抗氧化剂一直是近年来研究者们关注的课题,特别是寻找食物来源的天然氧化剂具有非常重要的意义。
[0022] 自从Marcuse首次报道抗氧化多肽后,已经从食物蛋白中分离到一些具有抗氧化能力的多肽,并且它们的抗氧化活性广泛的被研究。和酶抗氧化剂相比,抗氧化多肽有一些优势。那就是在不同的条件下,抗氧化肽结构简单、比较稳定没有毒副作用。而且,它们不仅具有抗氧化活性,还具有营养价值和功能特性。
[0023] 本发明通过研究发现,鹰嘴豆豆瓣中含有丰富的多肽类成分,提取鹰嘴豆瓣中多肽,结合鹰嘴豆丰富的营养成分开发具有抗微生物功能的鹰嘴豆多肽粉是很有现实意义。发明内容:
[0024] 本发明目的在于,提供一种鹰嘴豆多肽部位的制备方法及其应用,该方法中的原料为鹰嘴豆发芽除牙之后的豆瓣或干燥的
有机溶剂提取小分子化合物后的鹰嘴豆渣,采用
粉碎先粉粹
脱脂,利用
乙醇提取,C18反相柱层析纯化,最后由
超滤膜技术制备总多肽部位,再利用现代
喷雾干燥技术或
冷冻干燥精制而成的鹰嘴豆多肽粉。该鹰嘴豆多肽粉主要由分子量为:4002.5,4151.3,4037.43Da、4191.8Da,4276.8Da,4249.63Da,4346.2Da,4426.8Da,4459.3Da,4531.55.8Da、4614.15D4a、5100.29Da、5168.98Da、5383.8.2Da、5485.2Da,
5876.8Da,6267.6Da,6403.1Da,7023.8Da、7923.5.57Da,7934.21Da和7604.3Da等20的多种多肽密集共存的部位,该鹰嘴豆多肽部位被验证其抗细菌和真菌活性,不但是具有广泛的抗微生物活性,而且具有一定的抗氧化和降血糖活性,同时具有增强体液免疫及全身免疫的功能,富含人体易消化和吸收的纯天然植物来源多肽和蛋白质。该鹰嘴豆多肽粉部位的特点是既保留了鹰嘴都多肽蛋白质的同时还实现变废为宝和资源充分利用的目的;该鹰嘴豆多肽粉作为天然
抗菌剂、食品添剂或药物,可用于食品和医药行业。
[0025] 本发明所述的一种鹰嘴豆多肽部位的制备方法,该方法中的原料为鹰嘴豆发芽除牙之后的豆瓣或干燥的
有机溶剂提取小分子化合物后的鹰嘴豆渣,具体操作按下列步骤进行:
[0026] a、取鹰嘴豆发芽除牙之后的豆瓣或干燥的有机溶剂提取小分子化合物后的鹰嘴豆渣,粉碎后,按料液重量比为1∶5加入石油醚,在室温下搅拌1-2小时,反复提取3-4次至未有油脂提取出来为止,抽滤,合并沉淀,自然干燥至未有石油醚溶剂残留为止,得到脱脂的鹰嘴豆粉;
[0027] b、将步骤a中充分脱脂的鹰嘴豆粉中加入50%乙醇,料液重量比为1∶5,在室温下搅拌提取2-3小时,每次提取3-4次,减压抽滤,合并提取液,分离杂物,得到多肽粗提取溶液备用;
[0028] c、将步骤b中得到的多肽粗提取溶液,利用蒸馏水稀释至乙醇浓度为10%-20%,稀释的提取溶液,上已用10%-20%的乙醇,流速为3毫升/MIN,在UV-280NM下进行洗脱平衡好的反相C18
硅胶柱,并用浓度为50%-80%乙醇洗脱,得到粗多肽部位:
[0029] d、将步骤c得到的粗多肽部位利用
旋转蒸发仪浓缩至无乙醇溶液残留后,采用截留分子量为1KDa的再生
纤维素平板膜,浓缩过程中压力0.15MPa,
温度25℃,流速35m/s,浓缩倍数为5-10倍,得到鹰嘴豆多肽浓缩物,依次经过离心,喷雾干燥或冷冻干燥,过筛,紫外灭菌,
包装,即可得到鹰嘴豆多肽粉。
[0030] 所述方法获得的鹰嘴豆多肽粉在制备抗细菌、抗真菌生物活性的药物中的用途。
[0031] 所述方法获得的鹰嘴豆多肽粉在制备
食品添加剂中的用途。
[0032] 本发明所述的一种鹰嘴豆多肽部位的制备方法及其应用,该鹰嘴豆多肽粉的原料是由鹰嘴豆发芽除牙之后的豆瓣或干燥的有机溶剂提取小分子化合物后的鹰嘴豆渣,结合多肽类化合物的物理化学性质、结合现代反相柱层析和超滤膜技术工艺制成的多肽密集共存的粉。通过本发明所述的方法获得的鹰嘴豆多肽部位是来自鹰嘴豆原料中的游离多肽,与其它制备多肽的方法比较具有尽少使用化学
试剂,不需要复杂的提取分离流程,设备简单,易于放大制备等优点;该鹰嘴豆多肽粉被验证其抗细菌和真菌活性,该鹰嘴豆多肽部位不但是具有广泛的抗微生物活性,而且具有一定的抗氧化和降血糖活性,同时具有增强体液免疫及全身免疫的功能,富含人体易消化和吸收的纯天然植物来源多肽和蛋白质,既保留了鹰嘴都多肽蛋白质的同时还实现变废为宝和资源充分利用。
附图说明
[0034] 图2为本发明多肽部位的质谱图;
[0035] 图3为本发明多肽部位的液质谱图;
[0036] 图4为本发明多肽抗的白色念珠菌活性图;
[0037] 图5为本发明多肽抗金黄色葡萄球菌活性结果图;
[0038] 图6为本发明多肽抗大肠埃希氏菌活性结果图;
[0039] 图7为本发明SDS-PAGE
电泳图谱;
[0040] 图8为本发明SDS-PAGE电泳图谱。
具体实施方式
[0042] 鹰嘴豆豆瓣多肽粉的制备:
[0043] a、取鹰嘴豆发芽除牙之后的豆瓣,用水冲洗3次至完全干净,分别用纱布过滤,合并清洗后的鹰嘴豆豆瓣,低温干燥,控制温度在40℃,将干燥后的鹰嘴豆豆瓣,经粉碎机粉碎,粉碎粒度为200目,按料液重量比为1∶5加入石油醚,在室温下搅拌1小时,反复提取3次至未有油脂提取出来为止,抽滤,合并沉淀,自然干燥至未有石油醚溶剂残留为止,得到脱脂的鹰嘴豆粉;
[0044] b、将步骤a中充分脱脂的鹰嘴豆粉中加入浓度为50%食用乙醇,料液比为1∶5,在室温下搅拌提取2小时,每次提取3次,减压抽滤,合并提取液,分离杂物,得到多肽粗提取溶液备用;
[0045] c、将步骤b中得到的多肽粗提取溶液,利用蒸馏水稀释至乙醇浓度为10%,将稀释的提取溶液,上已用10%的乙醇,流速为3毫升/MIN,在UV-280NM下进行洗脱平衡好的反相C18硅胶柱,再用浓度为50%乙醇洗脱,得到粗多肽部位:
[0046] d、将步骤c得到的粗多肽部位利用
旋转蒸发仪浓缩至无乙醇溶液残留后,采用截留分子量为1KDa的再生
纤维素平板膜,浓缩过程中压力0.15MPa,温度25℃,流速35m/s,浓缩倍数为5-10倍,得到鹰嘴豆多肽浓缩物,依次经过离心,喷雾干燥,过筛,紫外灭菌,包装,即可得到鹰嘴豆多肽粉。
[0047] 实施例2
[0048] a、取干燥的有机溶剂提取小分子化合物后的鹰嘴豆渣,粉碎后,粉碎粒度为200目,按料液重量比为1∶5加入石油醚,在室温下搅拌2小时,反复提取4次至未有油脂提取出来为止,抽滤,合并沉淀,自然干燥至未有石油醚溶剂残留为止,得到脱脂的鹰嘴豆粉;
[0049] b、将步骤a中充分脱脂的鹰嘴豆粉中加入浓度为50%食用乙醇,料液比为1∶5,在室温下搅拌提取3小时,每次提取4次,减压抽滤,合并提取液,分离杂物,得到多肽粗提取溶液备用;
[0050] c、将步骤b中得到的多肽粗提取溶液,利用蒸馏水稀释至乙醇浓度为20%,将稀释的提取溶液,上已用20%的乙醇,流速为3毫升/MIN,在UV-280NM下进行洗脱平衡好的反相C18硅胶柱,再用浓度为80%乙醇洗脱,得到粗多肽部位:
[0051] d、将步骤c得到的粗多肽部位利用旋转蒸发仪浓缩至无乙醇溶液残留后,采用截留分子量为1KDa的再生纤维素平板膜,浓缩过程中压力0.15MPa,温度25℃,流速35m/s,浓缩倍数为5-10倍,得到鹰嘴豆多肽浓缩物,依次经过离心,冷冻干燥,过筛,紫外灭菌,包装,即可得到鹰嘴豆多肽粉。
[0052] 实施例3
[0053] 鹰嘴豆豆瓣多肽粉的制备:
[0054] a、取鹰嘴豆发芽除牙之后的豆瓣,用水冲洗3次至完全干净,分别用纱布过滤,合并清洗后的鹰嘴豆豆瓣,低温干燥,控制温度在40℃,将干燥后的鹰嘴豆豆瓣,经粉碎机粉碎,粉碎粒度为200目,按料液重量比为1∶5加入石油醚,在室温下搅拌2小时,反复提取4次至未有油脂提取出来为止,抽滤,合并沉淀,自然干燥至未有石油醚溶剂残留为止,得到脱脂的鹰嘴豆粉;
[0055] b、将步骤a中充分脱脂的鹰嘴豆粉中加入浓度为50%食用乙醇,料液比为1∶5,在室温下搅拌提取3小时,每次提取4次,减压抽滤,合并提取液,分离杂物,得到多肽粗提取溶液备用;
[0056] c、将步骤b中得到的多肽粗提取溶液,利用蒸馏水稀释至乙醇浓度为20%,稀释的提取溶液,上已用20%的乙醇,流速为3毫升/MIN,在UV-280NM下进行洗脱平衡好的反相C18硅胶柱,并用浓度为60%乙醇洗脱,得到粗多肽部位:
[0057] d、将步骤c得到的粗多肽部位利用旋转蒸发仪浓缩至无乙醇溶液残留后,采用截留分子量为1KDa的再生纤维素平板膜,浓缩过程中压力0.15MPa,温度25℃,流速35m/s,浓缩倍数为5-10倍,得到鹰嘴豆多肽浓缩物,依次经过离心,冷冻干燥,过筛,紫外灭菌,包装,即可得到鹰嘴豆多肽粉。
[0058] 实施例4
[0059] 鹰嘴豆豆渣多肽粉的制备:
[0060] a、取干燥的有机溶剂提取小分子化合物后的鹰嘴豆渣,经粉碎机粉碎,粉碎粒度为200目,按料液比为1:5加入石油醚,在室温下搅拌1小时,反复提取3次至未有油脂提取出来为止,抽滤,合并沉淀,自然干燥至未有石油醚溶剂残留为止,得到脱脂的鹰嘴豆粉;
[0061] b、将步骤a中充分脱脂的鹰嘴豆粉中加入浓度为50%食用乙醇,料液比为1∶5,在室温下搅拌提取2小时,每次提取3次,减压抽滤,合并提取液,分离杂物,得到多肽粗提取溶液备用;
[0062] c、将步骤b中得到的多肽粗提取溶液,利用蒸馏水稀释至乙醇浓度为10%-20%,稀释的提取溶液,上已用10%的乙醇,流速为3毫升/MIN,在UV-280NM下进行洗脱平衡好的反相C18硅胶柱,并用浓度为50%乙醇洗脱,得到粗多肽部位:
[0063] d、将步骤c得到的粗多肽部位利用旋转蒸发仪浓缩至无乙醇溶液残留后,采用截留分子量为1KDa的再生纤维素平板膜,浓缩过程中压力0.15MPa,温度25℃,流速35m/s,浓缩倍数为5-10倍,得到鹰嘴豆多肽浓缩物,依次经过离心,再喷雾干燥,过筛,紫外灭菌,包装,即可得到鹰嘴豆多肽粉。
[0064] 实施例5
[0065] 鹰嘴豆豆瓣多肽粉的制备:
[0066] a、取鹰嘴豆发芽除牙之后的豆瓣,用水冲洗3次至完全干净,分别用纱布过滤,合并清洗后的鹰嘴豆豆瓣,低温干燥,控制温度在40℃,将干燥后的鹰嘴豆豆瓣,经粉碎机粉碎,粉碎粒度为200目,按料液重量比为1∶5加入石油醚,在室温下搅拌2小时,反复提取4次至未有油脂提取出来为止,抽滤,合并沉淀,自然干燥至未有石油醚溶剂残留为止,得到脱脂的鹰嘴豆粉;
[0067] b、将步骤a中充分脱脂的鹰嘴豆粉中加入50%乙醇,料液比为1∶5,在室温下搅拌提取2小时,每次提取3次,减压抽滤,合并提取液,分离杂物,得到多肽粗提取溶液备用;
[0068] c、将步骤b中得到的多肽粗提取溶液,利用蒸馏水稀释至乙醇浓度为15%,将稀释的提取溶液,上已用浓度为15%的乙醇,流速为3毫升/MIN,在UV-280NM下进行洗脱平衡好的反相C18硅胶柱,并用浓度为80%乙醇洗脱,得到粗多肽部位:
[0069] d、将步骤c得到的粗多肽部位利用旋转蒸发仪浓缩至无乙醇溶液残留后,采用截留分子量为1KDa的再生纤维素平板膜,浓缩过程中压力0.15MPa,温度25℃,流速35m/s,浓缩倍数为5-10倍,得到鹰嘴豆多肽浓缩物,依次经过离心,冷冻干燥,过筛,紫外灭菌,包装,即可得到鹰嘴豆多肽粉。
[0070] 实施例6
[0071] 鹰嘴豆豆渣多肽粉的制备:
[0072] a、取干燥的有机溶剂提取小分子化合物后的鹰嘴豆渣,经粉碎机粉碎,粉碎粒度为200目,按料液比为1∶5加入石油醚,在室温下搅拌1.5小时,反复提取3次至未有油脂提取出来为止,抽滤,合并沉淀,自然干燥至未有石油醚溶剂残留为止,得到脱脂的鹰嘴豆粉;
[0073] b、将步骤a中充分脱脂的鹰嘴豆粉中加入浓度为50%食用乙醇,料液比为1∶5,在室温下搅拌提取3小时,每次提取3次,减压抽滤,合并提取液,分离杂物,得到多肽粗提取溶液备用;
[0074] c、将步骤b中得到的多肽粗提取溶液,利用蒸馏水稀释至乙醇浓度为15%,将稀释的提取溶液,上已用浓度为15%的乙醇,流速为3毫升/MIN,在UV-280NM下进行洗脱平衡好的反相C18硅胶柱,并用浓度为70%乙醇洗脱,得到粗多肽部位:
[0075] d、将步骤c得到的粗多肽部位利用旋转蒸发仪浓缩至无乙醇溶液残留后,采用截留分子量为1KDa的再生纤维素平板膜,浓缩过程中压力0.15MPa,温度25℃,流速35m/s,浓缩倍数为5-10倍,得到鹰嘴豆多肽浓缩物,依次经过离心,冷冻干燥,过筛,紫外灭菌,包装,即可得到鹰嘴豆多肽粉。
[0076] 实施例7
[0077] 鹰嘴豆豆瓣多肽粉的制备:
[0078] a、取鹰嘴豆发芽除牙之后的豆瓣用水冲洗3次至完全干净,分别用纱布过滤,合并清洗后的鹰嘴豆豆瓣,低温干燥,控制温度在40℃,将干燥后的鹰嘴豆豆瓣,经粉碎机粉碎,粉碎粒度为200目,按料液重量比为1∶5加入石油醚,在室温下搅拌2小时,反复提取4次至未有油脂提取出来为止,抽滤,合并沉淀,自然干燥至未有石油醚溶剂残留为止,得到脱脂的鹰嘴豆粉;
[0079] b、将步骤a中充分脱脂的鹰嘴豆粉中加入浓度为50%食用乙醇,料液比为1∶5,在室温下搅拌提取2.5小时,每次提取4次,减压抽滤,合并提取液,分离杂物,得到多肽粗提取溶液备用;
[0080] c、将步骤b中得到的多肽粗提取溶液,利用蒸馏水稀释至乙醇浓度为18%,将稀释的提取溶液,上已用18%的乙醇,流速为3毫升/MIN,在UV-280NM下进行洗脱平衡好的反相C18硅胶柱,并用浓度为70%乙醇洗脱,得到粗多肽部位:
[0081] d、将步骤c得到的粗多肽部位利用旋转蒸发仪浓缩至无乙醇溶液残留后,采用截留分子量为1KDa的再生纤维素平板膜,浓缩过程中压力0.15MPa,温度25℃,流速35m/s,浓缩倍数为5-10倍,得到鹰嘴豆多肽浓缩物,依次经过离心,再喷雾干燥,过筛,紫外灭菌,包装,即可得到鹰嘴豆多肽粉。
[0082] 实施例8
[0083] 鹰嘴豆豆渣多肽粉的制备:
[0084] a、取鹰嘴豆发芽除牙之后的豆瓣或干燥的有机溶剂提取小分子化合物后的鹰嘴豆渣,经粉碎机粉碎,粉碎粒度为200目,按料液比为1:5加入石油醚,在室温下搅拌1.5小时,反复提取4次至未有油脂提取出来为止,抽滤,合并沉淀,自然干燥至未有石油醚溶剂残留为止,得到脱脂的鹰嘴豆粉;
[0085] b、将步骤a中充分脱脂的鹰嘴豆粉中加入50%乙醇,料液比为1∶5,在室温下搅拌提取2小时,每次提取4次,减压抽滤,合并提取液,分离杂物,得到多肽粗提取溶液备用;
[0086] c、将步骤b中得到的多肽粗提取溶液,利用蒸馏水稀释至乙醇浓度为10%%,稀释的提取溶液,上已用20%的乙醇,流速为3毫升/MIN,在UV-280NM下进行洗脱平衡好的反相C18硅胶柱,并用浓度为60%乙醇洗脱,得到粗多肽部位:
[0087] d、将步骤c得到的粗多肽部位利用旋转蒸发仪浓缩至无乙醇溶液残留后,采用截留分子量为10KDa的再生纤维素平板膜,浓缩过程中压力0.15MPa,温度25℃,流速35m/s,浓缩倍数为5-10倍,得到鹰嘴豆多肽浓缩物,依次经过离心,再喷雾干燥,过筛,紫外灭菌,包装,即可得到鹰嘴豆多肽粉。
[0088] 实施例9
[0089] 将实施例1-8任意一种鹰嘴豆多肽粉,利用SDS-PAGE电泳、LC/MS技术测量多肽分子质量,其结果表明:从SDS-PAGE电泳分析结果证实,该部位的多肽主要分布于分量4.1KDA-20Kda之间的区域;LC/MS技术进一步证实该多肽部位是由分量:4002.5,4151.3,
4037.43Da、4191.8Da,4276.8Da,4249.63Da,4346.2Da,4426.8Da,4459.3Da,4531.55.8Da、
4614.15D4a、5100.29Da、5168.98Da、5383.8.2Da、5485.2Da,5876.8Da,6267.6Da,
6403.1Da,7023.8Da、7923.5.57Da,7934.21Da和7604.3Da等20的多种多肽密集共存的部位。
[0090] 实施例10
[0091] 将实施例1-8任意一种鹰嘴豆多肽粉按常规方法进行活性筛选:穴孔抑菌筛选法,穴孔抑菌操作为如下:
[0092] 1.融化琼脂培养基,待其温度降至46±0.5℃,加入已培养好的菌液,使试验菌悬液浓度为5×105cfu/ml-5×106cfu/ml,倒平皿,15-20ml/皿,放置20mine使其
凝固;
[0093] 2.用琼脂打孔器打孔,直径为5-6mm,4-5孔/皿,均匀分布,各样片中心之间相距25mm以上,与平板的周缘相距15mm以上;
[0094] 3.样品浓度一般为100mg/ml(100mM);每孔加样品溶液20μl,盖好平皿,置于温度37℃
培养箱30-60min,使溶液完全被吸收,倒置培养16h-18h,用游标卡尺测量抑菌环的直径并记录;
[0095] 4.评价
[0096] 抑菌作用的判断:抑菌环直径大于7mm者,判为有抑菌作用;抑菌环直径小于或等于7mm者,判为无抑菌作用(表1):
[0097] 表多肽抗微生物活性结果
[0098]
[0099] 从表中抗菌活性筛选结果证实,本发明得到的鹰嘴豆多肽部位均对CA(白色念珠菌);EC(大肠埃希氏菌);SA(金黄色葡萄球菌)具有很好抑制活性。