多糖组合物及使用方法
阅读：357发布：2020-05-15
专利汇可以提供多糖组合物及使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及多糖组合物及使用方法，具体而言，本发明部分地涉及聚N-乙酰化葡糖胺(PNAG)的组合物和PNAG特异性 抗体 在 预防 和 治疗 由某些PNAG阳性的病原体导致的感染中的用途，以及在检测(包括诊断)方法中的用途。，下面是多糖组合物及使用方法专利的具体信息内容。
1.药物组合物，其包含有效量的具有下式的分离多糖
其中n至少是5，R选自-NH-CO-CH3和-NH2，条件是低于50％的R基团是-NH-CO-CH3，用于在具有或有风险发生非ica/pga的PNAG阳性的病原体感染的个体中诱导针对该病原体的免疫应答，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是这样的病原体：其不含有出现在染色体DNA的相同的相邻延伸区中并与登记号为AF086783的ica基因座的4-基因核苷酸序列或与登记号为AAC74106.1、AAC74107.1、AAC74108.1和AAC74109.1的pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列。
2.药物组合物，其包含有效量的具有下式的分离多糖
其中n至少是5，R选自-NH-CO-CH3和-NH2，条件是低于50％的R基团是-NH-CO-CH3，用于在具有或有风险发生非ica/pga的PNAG阳性的病原体感染的个体中诱导针对该病原体的免疫应答，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体不含有与ica/pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列，并且其中所述病原体不是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、百日咳博德特菌、副百日咳菌(B.parapertussis)、B.bronchoseptica、新洋葱伯克霍尔德杆菌(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德菌(B.dolosa)、大叶性肺炎放线杆菌、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、鲍氏不动杆菌。
3.权利要求1或2的药物组合物，其中所述分离的多糖与载体缀合，任选地，其中所述分离的多糖与载体通过接头缀合，进一步任选地，其中载体是肽载体。
4.权利要求1-3任一项的药物组合物，其中
(a)低于30％、低于20％、低于10％或低于5％的R基团是–NH-CO-CH3，和/或(b)没有R基团是–NH-CO-CH3，和/或
(c)n至少是15、至少是20，至少是50，至少是100，至少200，至少300，至少400或至少
500，和/或
(d)所述分离的多糖的分子量为100-500kDa。
5.权利要求1-4任一项的药物组合物，其中所述分离的多肽与佐剂一起施用，并且任选地配制为
(a)进行全身性施用，或
(b)经局部施用。
6.药物组合物，其包含有效量的PNAG特异性-抗体或PNAG特异性-抗体片段，用于在具有或有风险发生非ica/pga的PNAG阳性的病原体感染的个体中诱导针对该病原体的免疫应答，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是这样的病原体：其不含有出现在染色体DNA的相同的相邻延伸区中并与登记号为AF086783的ica基因座的4-基因核苷酸序列或与登记号为AAC74106.1、AAC74107.1、AAC74108.1和AAC74109.1的pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列。
7.药物组合物，其包含有效量的PNAG特异性-抗体或PNAG-特异性抗体片段，用于在具有或有风险发生非ica/pga的PNAG阳性的病原体感染的个体中诱导针对该病原体的免疫应答，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体不含有与ica/pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列，并且其中所述病原体不是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、百日咳博德特菌、副百日咳菌(B.parapertussis)、B.bronchoseptica、新洋葱伯克霍尔德杆菌(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德菌(B.dolosa)、大叶性肺炎放线杆菌、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、鲍氏不动杆菌。
8.权利要求6或7的药物组合物，其中所述抗体或抗体片段配制为：
(a)通过全身施用，或
(b)通过局部施用，
任选地，其中所述抗体或抗体片段是：
(a)F598(ATCC PTA-5931)抗体或其片段，
(b)F628(ATCC PTA-5932)抗体或其片段，或
(c)F630(ATCC PTA-5933)抗体或其片段，
进一步任选地，其中所述抗体或抗体片段与试剂缀合，任选地，其中所述试剂是细胞毒性剂。
9.权利要求1-8任一项的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是：
(i)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性球菌，
(ii)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性杆菌，
(iii)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性球菌或球杆菌，
(iv)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性杆菌，
(v)非ica/pga的PNAG阳性的真菌，或者
(vi)非ica/pga的PNAG阳性的寄生虫。
10.权利要求9的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是：
(a)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性球菌，选自肺炎链球菌、A组链球菌、B组链球菌或肠球菌属，
(b)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性杆菌，选自利斯特菌属、难辨梭菌、枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌，
(c)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性球菌或球杆菌，选自脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、非典型流感嗜血杆菌、螺杆菌属或弯曲杆菌属，
(d)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性杆菌，选自脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、B.vulgatis、啮齿类柠檬酸杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌或鼠伤寒沙门氏菌，(e)非ica/pga的PNAG阳性的真菌，选自白色念珠菌(酵母)、白色念珠菌(菌丝)、曲霉属、镰刀菌属或隐球菌属，或者
(f)非ica/pga的PNAG阳性的寄生虫，选自伯氏疟原虫或恶性疟原虫。
11.权利要求1-10任一项的药物组合物，其中所述个体是
(a)人，或
(b)灵长类、马、牛、猪、山羊、绵羊、狗或猫。
12.权利要求1-11任一项的药物组合物，其中所述个体
(a)感染非ica/pga的PNAG阳性的病原体，或
(b)具有感染非ica/pga的PNAG阳性的病原体的风险。
13.权利要求1-12任一项的药物组合物，其用于治疗或预防非ica/pga的PNAG阳性的病原体的感染。
14.一种制备PNAG多糖的方法，该方法包括：
从浓缩的微生物细胞体制品中用乙醇沉淀多糖粗制品；
用溶菌酶和溶葡萄球菌酶共同消化粗制多糖，随后依次用核酸酶和蛋白酶K消化，形成消化的多糖制品；
对所述消化的多糖制品进行尺寸分离；
分离乙酰化的多糖组分；以及
将乙酰化的多糖组分去乙酰化，产生具有低于50％的乙酸盐取代的PNAG多糖，其中微生物细胞体制品来自非-ica/pga的PNAG阳性的微生物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是这样的病原体：其不含有出现在染色体DNA的相同的相邻延伸区中并与登记号为AF086783的ica基因座的4-基因核苷酸序列或与登记号为AAC74106.1、AAC74107.1、AAC74108.1和AAC74109.1的pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列。
15.一种制备PNAG多糖方法，包括：
从微生物培养物制备不纯的多糖，其中所述微生物培养物是非-ica/pga的PNAG阳性的微生物培养物；
将不纯的多糖与酸或碱温育，产生半纯的多糖制品；
中和所述制品；
将中和的制品在氢氟酸中温育；以及
(a)从制品中分离乙酰化的多糖，和将乙酰化的多糖去乙酰化，产生具有低于50％的乙酸盐取代的PNAG多糖，或者
(b)从所述制品分离具有低于50％的乙酸盐取代的PNAG多糖，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是这样的病原体：其不含有出现在染色体DNA的相同的相邻延伸区中并与登记号为AF086783的ica基因座的4-基因核苷酸序列或与登记号为AAC74106.1、AAC74107.1、AAC74108.1和AAC74109.1的pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列。
16.一种制备PNAG多糖的方法，该方法包括：
从浓缩的微生物细胞体制品中用乙醇沉淀多糖粗制品；
用溶菌酶和溶葡萄球菌酶共同消化粗制多糖，随后依次用核酸酶和蛋白酶K消化，形成消化的多糖制品；
对所述消化的多糖制品进行尺寸分离；
分离乙酰化的多糖组分；以及
将乙酰化的多糖组分去乙酰化，产生具有低于50％的乙酸盐取代的PNAG多糖，其中微生物细胞体制品来自非-ica/pga的PNAG阳性的微生物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的微生物不含有与ica/pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列，并且其中所述病原体不是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、百日咳博德特菌、副百日咳菌(B.parapertussis)、B.bronchoseptica、新洋葱伯克霍尔德杆菌(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德菌(B.dolosa)、大叶性肺炎放线杆菌、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、鲍氏不动杆菌。
17.一种制备PNAG多糖方法，包括：
从微生物培养物制备不纯的多糖，其中所述微生物培养物是非-ica/pga的PNAG阳性的微生物培养物；
将不纯的多糖与酸或碱温育，产生半纯的多糖制品；
中和所述制品；
将中和的制品在氢氟酸中温育；以及
(a)从制品中分离乙酰化的多糖，和将乙酰化的多糖去乙酰化，产生具有低于50％的乙酸盐取代的PNAG多糖，或者
(b)从所述制品分离具有低于50％的乙酸盐取代的PNAG多糖；
其中所述非ica/pga的PNAG阳性的微生物不含有与ica/pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列，并且其中所述病原体不是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、百日咳博德特菌、副百日咳菌(B.parapertussis)、B.bronchoseptica、新洋葱伯克霍尔德杆菌(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德菌(B.dolosa)、大叶性肺炎放线杆菌、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、鲍氏不动杆菌。
18.权利要求14-17任一项的方法，还包括将载体缀合到所述分离的多糖上，任选地，所述载体是肽载体，
进一步任选地，其中所述乙酰化的多糖
(a)通过化学方法去乙酰化，任选地，其中所述乙酰化的多糖与碱溶液温育进行去乙酰化，或者
(b)经酶促去乙酰化。
19.一种生产抗体的方法，包括:
向非人的个体施用有效量的分离自非ica/pga的PNAG阳性的病原体的PNAG多糖和佐剂以产生抗体，以及
从个体中分离抗体，任选地，其中所述抗体是多克隆抗体，
其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是这样的病原体：其不含有出现在染色体DNA的相同的相邻延伸区中并与登记号为AF086783的ica基因座的4-基因核苷酸序列或与登记号为AAC74106.1、AAC74107.1、AAC74108.1和AAC74109.1的pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列。
20.一种生产单克隆抗体的方法，包括：
向非人的个体施用有效量的分离自非ica/pga的PNAG阳性的病原体的PNAG多糖和佐剂以产生抗体，
从个体中收集脾细胞，
将来自个体的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，和
收集从融合的亚克隆中产生的抗体，
其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是这样的病原体：其不含有出现在染色体DNA的相同的相邻延伸区中并与登记号为AF086783的ica基因座的4-基因核苷酸序列或与登记号为AAC74106.1、AAC74107.1、AAC74108.1和AAC74109.1的pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列。
21.一种生产抗体的方法，包括:
向非人的个体施用有效量的分离自非ica/pga的PNAG阳性的病原体的PNAG多糖和佐剂以产生抗体，以及
从个体中分离抗体，任选地，其中所述抗体是多克隆抗体，
其中所述非ica/pga的PNAG阳性的微生物不含有与ica/pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列，并且其中所述病原体不是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、百日咳博德特菌、副百日咳菌(B.parapertussis)、B.bronchoseptica、新洋葱伯克霍尔德杆菌(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德菌(B.dolosa)、大叶性肺炎放线杆菌、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、鲍氏不动杆菌。
22.一种生产单克隆抗体的方法，包括：
向非人的个体施用有效量的分离自非ica/pga的PNAG阳性的病原体的PNAG多糖和佐剂以产生抗体，
从个体中收集脾细胞，
将来自个体的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，和
收集从融合的亚克隆中产生的抗体，
其中所述非ica/pga的PNAG阳性的微生物不含有与ica/pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列，并且其中所述病原体不是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、百日咳博德特菌、副百日咳菌(B.parapertussis)、B.bronchoseptica、新洋葱伯克霍尔德杆菌(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德菌(B.dolosa)、大叶性肺炎放线杆菌、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、鲍氏不动杆菌。
23.权利要求19-22任一项的方法，其中
(a)所述PNAG多糖是低于50％乙酰化的，和/或
(b)还包括分离抗体，和/或
(c)其中所述个体是兔子。
24.检测非ica/pga的PNAG阳性的病原体的方法，包括：
使疑似含有非ica/pga的PNAG阳性的病原体的样品与PNAG特异性抗体或抗体片段接触，以及
检测所述抗体或抗体片段与样品的结合，
其中所述抗体或抗体片段的结合表明样品中存在所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体，
任选地，
(a)其中所述样品是葡萄球菌阴性的，和/或
(b)其中所述样品是来自个体的生物样品，任选地，其中所述生物样品是尿、血、脓、皮肤、唾液、关节液、淋巴液或乳，和/或
(c)其中抗体或抗体片段与可检测的标记缀合，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是这样的病原体：其不含有出现在染色体DNA的相同的相邻延伸区中并与登记号为AF086783的ica基因座的4-基因核苷酸序列或与登记号为AAC74106.1、AAC74107.1、AAC74108.1和AAC74109.1的pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列。
25.检测非ica/pga的PNAG阳性的病原体的方法，包括：
使疑似含有非ica/pga的PNAG阳性的病原体的样品与PNAG特异性抗体或抗体片段接触，以及
检测所述抗体或抗体片段与样品的结合，
其中所述抗体或抗体片段的结合表明样品中存在所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体，
任选地，
(a)其中所述样品是葡萄球菌阴性的，和/或
(b)其中所述样品是来自个体的生物样品，任选地，其中所述生物样品是尿、血、脓、皮肤、唾液、关节液、淋巴液或乳，和/或
(c)其中抗体或抗体片段与可检测的标记缀合，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的微生物不含有与ica/pga基因座的全部四个核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列，并且其中所述病原体不是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、百日咳博德特菌、副百日咳菌(B.parapertussis)、B.bronchoseptica、新洋葱伯克霍尔德杆菌(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德菌(B.dolosa)、大叶性肺炎放线杆菌、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、鲍氏不动杆菌。
26.权利要求14-25任一项的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是：
(i)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性球菌，
(ii)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性杆菌，
(iii)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性球菌或球杆菌，
(iv)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性杆菌，
(v)非ica/pga的PNAG阳性的真菌，或者
(vi)非ica/pga的PNAG阳性的寄生虫。
27.权利要求26的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是：
(a)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性球菌，选自肺炎链球菌、A组链球菌、B组链球菌或肠球菌属，
(b)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性杆菌，选自利斯特菌属、难辨梭菌、枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌，
(c)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性球菌或球杆菌，选自脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、非典型流感嗜血杆菌、螺杆菌属或弯曲杆菌属，
(d)非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性杆菌，选自脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、B.vulgatis、啮齿类柠檬酸杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌或鼠伤寒沙门氏菌，(e)非ica/pga的PNAG阳性的真菌，选自白色念珠菌(酵母)、白色念珠菌(菌丝)、曲霉属、镰刀菌属或隐球菌属，或者
(f)非ica/pga的PNAG阳性的寄生虫，选自伯氏疟原虫或恶性疟原虫。
多糖组合物及使用方法
[0001] 本申请为2013年5月30日提交的发明名称为“多糖组合物及使用方 法”的PCT申请PCT/US2013/043283的分案申请，所述PCT申请进入中 国国家阶段日期为2015年1月29日，申请号为201380040356.1。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求2012年5月30日提交的美国临时申请61/653389和2013 年5月26日提交的美国临时申请61/827661的优先权，这些临时申请除权 利要求外的内容引入本文作为参考。
[0004] 政府支持
[0005] 本发明部分地得到NIH(NIAID)基金号RO1AI046706的支持。美国 政府享有本发明的某些权利。
技术领域
背景技术
[0007] 开发针对不论是细菌、病毒、真菌或天然寄生虫导致的各种感染的免 疫疗法是高度优先的。许多当前的免疫疗法通过种属特异性抗原靶向于特 定的微生物物种。靶向于多种微生物并对其有效的免疫疗法较为少见。
[0008] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(S. epidermidis)在其表面表达聚-N-乙酰基葡糖胺(PNAG)多糖抗原。PNAG由 这些细菌体内的ica基因座的基因产物体内合成。类似的，大肠杆菌和其 他革兰氏阴性菌含有称为pga位点的同源性基因座，其同样编码可用于合 成PNAG的蛋白质的合成。因此，含有完整ica或pga位点的细菌能产生 PNAG。之前发现，该抗原的去乙酰化形式在刺激抗原特异性的免疫应答 方面特别有效，其部分特征在于诱导调理素抗体。
发明内容
[0009] 本发明部分地基于预料不到的和令人惊讶的发现，多糖聚N-乙酰基葡 糖胺(PNAG)由多种以前不知道或未提示能表达该多糖的病原体表达。本发 明因此提供了包含该多糖或其特异性抗体的组合物，其用于预防和/或治疗 由这些特定病原体引起的感染，并且任选地用于治疗和/或预防可由所述感 染导致的疾病或障碍。
[0010] 令人惊讶的，根据本发明，发现表达PNAG的病原体包括许多种类和 类型。这些种类和特定的病原体如下：(a)革兰氏阳性球菌：肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae)的疫苗和非疫苗株，A组链球菌属例如酿脓链 球菌(Streptococcus pyogenes)、B组链球菌例如无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和C组链球菌例如停乳链球菌(Streptococcus dysagalactiae)和粪 肠球菌(Enterococcus faecalis)；(b)革兰氏阳性杆菌：单核细胞增生利斯特 菌(Listeria monocytogenes)、难辨梭菌(Clostridium difficile)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和耻垢分枝杆 菌(M.smegmatis)；(c)革兰氏阴性球菌和球杆菌：脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)、非典型流感嗜血杆菌 (Non-typable Hemophilus influenzae)、杜氏嗜血菌(Hemophilus ducreyi)、 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；(d) 革兰氏阴性杆菌：脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、多形拟杆菌(B. thetaiotamicron)、B vulgatis、啮齿类柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)、 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒杆菌(Salmonella enterica serovar typhi)和 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar typhimurium)；(e)真菌：白色 念珠菌(酵母)、白色念珠菌(菌丝)、黄曲霉菌、镰刀菌属物种例如腐皮镰刀 菌(Fusarium solani)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)；以及(f)寄生 虫：伯氏疟原虫(Plasmodium bergei)和恶性疟原虫(P.falciparum)(包括子孢 子)；和阴道毛滴虫(T.vaginalis)。这些病原体的PNAG表达是尤其令人惊 讶的，因为它们均没有可鉴定的与葡萄球菌ica位点或大肠杆菌pga位点 相关的基因座，所述基因座编码参与PNAG以及某些细菌中相关的多糖合 成的蛋白。因此，这些病原体在本文中被称为非ica/pga的病原体，以表明 其不含有可鉴别的ica或pga基因座。
[0011] 本发明还提供了用于检测任何前述病原体的方法，例如使用对PNAG 特异性的抗体。
[0013]
[0014] 其中n至少是5，R选自-NH-CO-CH3和-NH2，条件是低于50％的R 基团是-NH-CO-CH3。
[0015] 另一方面，本发明提供了一种方法，包括向具有或有风险发生非 ica/pga的PNAG阳性的病原体感染的个体施用能诱导针对病原体的免疫 应答的有效量的与载体缀合的分离多糖，其中所述多糖具有下式结构
[0016]
[0017] 其中n是5或更多，R选自基团-NH-CO-CH3和-NH2，条件是低于50％ 的R基团是-NH-CO-CH3。
[0018] 另一方面本发明提供了包含下式的分离多糖的药物组合物
[0019]
[0020] 其中n至少是5，R选自基团-NH-CO-CH3和-NH2，条件是低于50％ 的R基团是-NH-CO-CH3，用于预防或治疗个体中非ica/pga的PNAG阳 性病原体的感染。
[0021] 另一方面，本发明提供了包含与载体缀合的分离多糖的药物组合物， 其中所述多糖具有下式结构
[0022]
[0023] 其中n是5或更多，R选自基团-NH-CO-CH3和-NH2，条件是低于50％ 的R基团是-NH-CO-CH3，用于预防或治疗个体中非ica/pga的PNAG阳 性病原体的感染。
[0024] 在某些实施方案中，分离的多糖与载体通过接头缀合。在某些实施方 案中，所述载体是肽载体。每个多糖可缀合至一个或多个载体。载体可以 是多糖。在某些实施方案中，所述载体多糖不是N-乙酰基(β)1-6葡糖胺。
[0025] 在某些实施方案中，等于或小于45％、等于或小于40％、等于或小于 35％、等于或小于30％、等于或小于25％、等于或小于20％、等于或小 于15％、等于或低于10％、等于或低于5％、等于或低于1％的R基团是 -NH-CO-CH3。在某些实施方案中，R基团是–NH-CO-CH3。
[0026] 在有些实施方案中，n至少是9，至少是10，至少是20，至少是50， 至少是100，至少100，至少200，至少300，至少400或至少500。
[0027] 在某些实施方案中，分离的多糖的分子量为100-500kDa。在某些实 施方案中，分离的多糖分子量为至少900道尔顿、至少2000道尔顿、至少 2500道尔顿、至少5000道尔顿、至少7500道尔顿、至少10000道尔顿、 至少25000道尔顿、至少50000道尔顿、至少75000道尔顿、至少100000 道尔顿、至少125000道尔顿、至少150000道尔顿、至少200000道尔顿、 至少250000道尔顿、至少300000道尔顿、至少350000道尔顿、至少400000 道尔顿、至少450000道尔顿或至少500000道尔顿。
[0028] 在某些实施方案中，分离的多糖与佐剂一起施用或配制，或与佐剂联 合使用。
[0029] 在某些实施方案中，分离的多糖经全身性施用或配制用于全身施用。 在某些实施方案中，分离的多糖经局部施用或配制用于局部施用。
[0030] 在某些实施方案中，分离的多糖以组合物形式提供，其还包括可药用 的载体。
[0031] 另一方面，本发明提供了一种方法，包括向具有或有风险感染非 ica/pga的PNAG阳性的病原体的个体施用有效量的PNAG特异性抗体或 PNAG特异性抗体片段。
[0032] 另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含PNAG特异性的抗 体或PNAG特异性的抗体片段，用于预防或治疗个体的非ica/pga的PNAG 阳性的病原体的感染。
[0033] 在某些实施方案中，所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是非ica/pga 的PNAG阳性的革兰氏阳性球菌。在某些实施方案中，所述非ica/pga的 PNAG阳性的革兰氏阳性球菌是肺炎链球菌、A组链球菌、B组链球菌、 C组链球菌或肠球菌。
[0034] 在某些实施方案中，所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是非ica/pga 的PNAG阳性的革兰氏阳性杆菌，在某些实施方案中，所述非ica/pga的 PNAG阳性的革兰氏阳性杆菌是利斯特菌属、难辨梭菌、枯草芽孢杆菌、 结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌。
[0035] 在某些实施方案中，所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是非ica/pga 的PNAG阳性的革兰氏阴性球菌或球杆菌。在某些实施方案中，所述非 ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性球菌或球杆菌是脑膜炎奈瑟球菌、淋病 奈瑟球菌、非典型流感嗜血杆菌、螺杆菌属物种或弯曲杆菌属物种。
[0036] 在某些实施方案中，所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是非ica/pga 的PNAG阳性的革兰氏阴性杆菌。在某些实施方案中，所述非ica/pga的 PNAG阳性的革兰氏阴性杆菌是脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、B.vulgatis、啮 齿类柠檬酸杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。在一些实施方 案中，所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是非ica/pga的PNAG阳性 的真菌。在某些实施方案中，非ica/pga的PNAG阳性的真菌是白色念珠 菌(酵母)、白色念珠菌(菌丝)、曲霉属、镰刀菌属或隐球菌属。
[0037] 在某些实施方案中，所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是非ica/pga 的PNAG阳性的寄生虫。在某些实施方案中，所述非ica/pga的PNAG阳 性的寄生虫是伯氏疟原虫或恶性疟原虫。
[0038] 在某些实施方案中，所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体是阴道毛 滴虫。
[0040] 在某些实施方案中，所述个体感染了非ica/pga的PNAG阳性的病原 体。在某些实施方案中，所述个体具有感染非ica/pga的PNAG阳性的病 原体的风险。
[0041] 在某些实施方案中，抗体或抗体片段全身性施用或经配制用于全身性 施用。在某些实施方案中，抗体或抗体片段局部施用或配制用于局部施用。
[0042] 另一方面，本发明提供了一种方法，包括从浓缩的微生物细胞体制品 中用乙醇沉淀多糖粗制品；用溶菌酶和溶葡萄球菌酶共消化粗制多糖，随 后依次用核酸酶和蛋白酶K消化，形成消化的多糖制品；对所述消化的多 糖制品进行尺寸分离；分离乙酰化的多糖组分；以及将乙酰化的多糖组分 去乙酰化，产生具有低于50％的乙酸盐取代的PNAG多糖，其中微生物细 胞体制品来自非-ica/pga的PNAG阳性的微生物。在某些实施方案中，多 糖制品使用柱进行尺寸分离。在某些实施方案中，所述方法产生的PNAG 多糖具有低于40％的乙酸盐取代。
[0043] 另一方面，本发明提供了一种方法，包括从微生物培养物制备不纯的 多糖；将不纯的多糖与酸或碱温育，产生半纯的多糖制品；中和所述制品； 将中和的制品在氢氟酸中温育；从制品中分离乙酰化的多糖；以及将乙酰 化的多糖去乙酰化，产生具有低于50％的乙酸盐取代的PNAG多糖，其中 所述微生物培养物是非-ica/pga的PNAG阳性的微生物培养物。在某些实 施方案中，该方法产生了具有低于40％的乙酸盐取代的PNAG多糖。
[0044] 另一方面，本发明提供了一种方法，包括从微生物培养物制备不纯的 多糖；将不纯的多糖与酸或碱温育，产生半纯的多糖制品；中和所述制品； 将中和的制品在氢氟酸中温育；以及从所述制品分离具有低于50％的乙酸 盐取代的PNAG多糖，其中所述微生物培养物是非-ica/pga的PNAG阳性 的微生物培养物。在某些实施方案中，分离了具有低于40％的乙酸盐取代 的PNAG多糖。
[0045] 在某些实施方案中，所述方法还包括将载体缀合到所述分离的多糖上。 在某些实施方案中，所述载体是肽载体。
[0046] 在某些实施方案中，所述乙酰化的多糖通过化学方法去乙酰化。
[0047] 在某些实施方案中，所述乙酰化的多糖与碱溶液温育进行去乙酰化。 在某些实施方案中，所述乙酰化的多糖经酶促去乙酰化。
[0048] 另一方面，本发明提供了一种生产抗体的方法，包括向个体施用有效 量的分离自非-ica/pga的PNAG阳性的病原体的PNAG多糖和佐剂以产生 抗体，并从个体中分离抗体。在某些实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。
[0049] 另一方面，本发明提供了一种生产单克隆抗体的方法，包括向个体施 用有效量的分离自非-ica/pga的PNAG阳性的病原体的PNAG多糖和佐剂 以产生抗体，从个体中收集脾细胞，将来自个体的脾细胞与骨髓瘤细胞融 合，并收集从融合亚克隆中产生的抗体。
[0050] 在某些实施方案中，所述方法还包括分离抗体。
[0051] 在某些实施方案中，PNAG多糖是低于50％乙酰化的。
[0052] 在某些实施方案中，所述个体是兔子。在某些实施方案中，所述个体 是人。
[0053] 另一方面，本发明提供了一种检测非-ica/pga的PNAG阳性的病原体 的方法，包括使疑似含有非-ica/pga的PNAG阳性的病原体的样品与PNAG 特异性抗体或抗体片段接触，检测所述抗体或抗体片段与样品的结合，其 中所述抗体或抗体片段的结合表明样品中存在所述非-ica/pga的PNAG阳 性的病原体。
[0054] 在某些实施方案中，所述样品是葡萄球菌阴性的。
[0055] 在某些实施方案中，所述样品是来自个体的生物样品。在某些实施方 案中，所述生物样品是尿、血、脓、皮肤、唾液、关节液、淋巴液或乳。 在某些实施方案中，所述样品来源于可植入或植入的医疗器械的拭子，或 一小块医疗设备，或病人护理设备的表面。
[0056] 在某些实施方案中，所述抗体或抗体片段是人源化抗体或嵌合抗体或 其片段。在某些实施方案中，所述抗体是人抗体。在某些实施方案中，所 述抗体或抗体片段是F598(ATCC PTA-5931)抗体或其片段。在某些实施方 案中，所述抗体或抗体片段是F628(ATCC PTA-5932)抗体或其片段。在某 些实施方案中，所述抗体或抗体片段是F630(ATCC PTA-5933)抗体或其片 段。针对PNAG的多克隆抗血清也可用于某些情况下。上述的生物材料 PTA-5931、PTA-5932、PTA-5933是2004年4月21日保藏于美国典型培 养物保藏中心(ATCC)的杂交瘤细胞系，保藏编号分别为：ATCC PTA-5931、ATCC PTA-5932和ATCC PTA-5933，保藏地址为：马纳萨 斯，弗吉尼亚州20110-2209美国。
[0057] 在某些实施方案中，所述抗体或抗体片段与试剂缀合。
[0058] 在某些实施方案中，所述试剂是细胞毒性剂，例如抗生素或放射性同 位素。在某些实施方案中，所述试剂是可检测的标记。在某些实施方案中， 所述可检测的标记是放射性标记、酶、生物素分子、抗生物素蛋白或荧光 染料。
[0060] 图1.感染后4小时开始的腹膜内(ip)和局部给予PNAG抗体MAb F598的效果。该图显示了最低接种量的48小时实验数据。实验详情：接 种为1x105/眼；在感染后4和24小时ip注射200μg MAb；感染后24和 32小时局部应用20μg MAb。数据点代表了每只小鼠的数值；横线表示组 的平均分值。P值：Mann Whitney U检验。
[0061] 图2.感染后4小时开始的ip和局部给予PNAG抗体MAb F598的效 果。该图显示了低接种量的48小时实验数据。实验详情：接种为2x105/ 眼；在感染后4小时ip注射500μg MAb；感染后24和32小时局部应用 50μg MAb。数据点代表了每只小鼠的数值；横线表示组的平均分值。P 值：Mann Whitney U检验。
[0062] 图3.感染后4小时开始的局部施用PNAG抗体MAb F598的效果。 该图显示了中接种量的32小时实验数据。实验详情：接种为5.1x106/眼； 感染后4、8、24小时局部应用MAb。数据点代表了每只小鼠的数值；横 线表示组的平均分值。P值：Mann Whitney U检验。
[0063] 图4.感染后4小时开始的局部施用PNAG抗体MAb F598的效果。 该图显示了高接种量的32小时实验数据。实验详情：接种为5x107/眼；感 染后4、8、24小时局部应用MAb，32小时后结束实验。数据点代表了每 只小鼠的数值；横线表示组的平均分值。P值：Mann Whitney U检验。
[0064] 图5.用肺炎链球菌D39激发后的CBA/N小鼠生存率(N＝12/组).
[0065] 图6.9GlcNH2-TT缀合物疫苗的抗体针对酿脓链球菌(A组链球菌) 引起的致死皮肤感染的保护效力。
[0066] 图7.兔抗9GlcNH2-TT缀合疫苗的抗体对用B组脑膜炎菌株B16B6 激发的2-3日龄幼年小鼠脑膜炎(脑部细菌)的保护效力。数据点代表了每一 小鼠的log10CFU/脑；横线代表组的中间分值。P值：Mann Whitney U检 验。
[0067] 图8.与PBS(实验1)或针对HIV的人IgG1Mab(MAb F105，实验2) 相比，在小鼠中施用针对PNAG的人IgG1MAb后结肠炎评分的下降。数 据点代表了每一小鼠的评分，横线代表组中间分值。P值：Mann Whitney U检验。
[0068] 图9.四个参数的个体评分比较，用于确定用针对PNAG的MAb F598或对照的针对HIV的人IgG1MAb(F105)治疗的TRUC小鼠的总体 组织学评分。
[0069] 图10.兔抗9GlcNH2-TT缀合疫苗的抗体对单核细胞增生利斯特菌 的保护效力。
[0070] 图11.兔抗dPNAG-TT抗体介导的4种肺炎链球菌株系的调理素杀 伤。杀伤以正常兔血清作为对照比较。
[0072] 图13.兔抗9GlcNH2-TT抗体介导的3种粪肠球菌株系的调理素杀伤. 杀伤以正常兔血清作为对照比较。
[0073] 图14.针对PNAG的MAb F598对A组链球菌的调理素杀伤。杀伤 以铜绿假单胞菌特异性的MAb F429藻酸盐作为对照比较。
[0074] 图15.针对PNAG的MAb F598对白色念珠菌的调理素杀伤。杀伤 以铜绿假单胞菌特异性的MAb F429藻酸盐作为对照比较。
[0075] 图16.脑膜炎奈瑟球菌血清群B株系的杀菌作用。
[0076] 图17.淋病奈瑟球菌的杀菌作用。
[0077] 图18.脑膜炎奈瑟球菌杀菌的抑制。
[0078] 图19.淋病奈瑟球菌杀菌的抑制。
[0079] 发明详述
[0080] 本发明部分地涉及关于PNAG在众多细菌和非细菌病原体上表达的令 人意外的发现。所述发现至少基于两个理由是意料不到的。首先，本发明 发现的表达PNAG的病原体均没有ica或pga基因座。ica和pga基因座各 自编码与多糖合成、包括PNAG合成有关的4个蛋白。在本发明之前认为， 病原体必须具有ica或pga基因座以合成PNAG。ica基因座存在于金黄色 葡萄球菌和表皮葡萄球菌中，其在本发明之前已知能表达PNAG，而pga 基因座在某些革兰氏阴性生物中存在。这些新发现的PNAG阳性病原体是 如何在缺乏这些基因座的情况下合成PNAG是不清楚的。本发明的发现显 示PNAG可在缺乏所述基因座及其编码的蛋白的情况下合成。其次，被发 现能表达PNAG的病原体种类众多，包括细菌和非细菌病原体。在本发明 之前，并没有显示不表达可识别的ica/pga基因座的病原体能合成PNAG， 同样未显示非细菌的病原体能表达PNAG。
[0081] 这些众多的细菌和非细菌病原体表达PNAG的发现提供了预防、治疗 和/或诊断由所述病原体引起的感染的新的途径。因此，本发明尤其涉及从 新的PNAG阳性病原体中分离和/或衍生PNAG和dPNAG，以及它们在刺 激免疫应答(包括产生对PNAG特异性的抗体所需要的免疫应答)、检测 PNAG和表达PNAG的病原体，以及预防和治疗表达PNAG的病原体引 起的感染中的用途。所述表达PNAG的病原体包括但不限于本文所述的非 -ica/pga的表达PNAG的病原体。
[0082] 非-ica/pga的PNAG阳性的病原体
[0083] 本文新发现的表达PNAG的病原体称为非-ica/pga的PNAG阳性的病 原体，以表明其不含有与已知能表达PNAG的病原体例如金黄色葡萄球菌、 表皮葡萄球菌或大肠杆菌的四基因ica/pga基因座具有任何显著相似度的 基于DNA的基因座。ica或pga基因座编码四种蛋白(2-糖基转移酶、N- 去乙酰化酶以及用于输出合成的多糖的蛋白)。某些非-ica/pga的PNAG病 原体不包括在单个基因座内编码这四个蛋白的基因。
[0084] 示范性的ica基因座的核苷酸序列(来自金黄色葡萄球菌)已在 GenBank提交，登记号为AF086783。根据本发明，认为是“非-ica”的病原 体不具有可识别的ica基因座。例如，所述病原体在染色体DNA的相同 的相邻延伸区中不含有与AF086783的ica基因座的完整4-基因核苷酸序 列具有至少25％同一性的核苷酸序列。非-ica的PNAG阳性的病原体排除 了葡萄球菌属。
[0085] 示范性的pga基因座的核苷酸序列(来自大肠杆菌K12亚株MG1655) 已在Genbank提交，基因座内的4个基因登记号分别为AAC74106.1、 AAC74107.1、AAC74108.1和AAC74109.1。根据本发明，认为是“非-pga” 的病原体不具有可识别的pga基因座。例如，所述病原体在染色体DNA 的相同的相邻延伸区中不含有与AAC74106.1,AAC74107.1,AAC74108.1 和AAC74109.1的四条核苷酸序列具有至少25％同一性的核苷酸序列。非 -pga的PNAG阳性的病原体排除了大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、百日咳博德 特菌、副百日咳菌(B.parapertussis)、B.bronchoseptica、新洋葱伯克霍尔 德杆菌(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德菌(B.dolosa)、大叶性 肺炎放线杆菌、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、 鲍氏不动杆菌和志贺菌属的某些菌株。
[0086] 所述非-ica/pga的PNAG阳性的病原体包括革兰氏阴性和革兰氏阳性 细菌、真菌和寄生虫。更具体而言，所述非-ica/pga的PNAG阳性细菌包 括革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性球菌或球杆菌，以及革 兰氏阴性杆菌。非-ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性球菌包括肺炎链球 菌、A组链球菌(酿脓链球菌)、B组链球菌(无乳链球菌)、C组链球菌(停 乳链球菌)和肠球菌属(粪肠球菌和屎肠球菌)。所述非-ica/pga的PNAG阳 性的革兰氏阳性杆菌包括单核细胞增生利斯特菌、难辨梭菌、枯草芽孢杆 菌、结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌。非-ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴 性球菌或球杆菌包括脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、非典型流感嗜血杆 菌、杜氏嗜血菌、幽门螺杆菌和空肠弯曲杆菌。非-ica/pga的PNAG阳性 的革兰氏阴性杆菌包括脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、B.vulgatis、啮齿类柠檬 酸杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
[0087] 非-ica/pga的PNAG阳性的真菌包括白色念珠菌(酵母)、白色念珠菌(菌 丝)、曲霉属、镰刀菌属或隐球菌属物种。非-ica/pga的PNAG阳性的寄生 虫包括伯氏疟原虫或恶性疟原虫。
[0088] 非-ica/pga的PNAG阳性的病原体可以是阴道毛滴虫。
[0089] 本发明涉及PNAG多糖作为抗原在个体体内诱导对PNAG多糖特异 性的免疫应答的用途。所述免疫在本文中称为主动免疫。个体可以是具有 或处于发生由任一前述非-ica/pga的PNAG阳性的病原体引起的感染的风 险的那些个体。感染可通过施用PNAG多糖进行预防或治疗。
[0090] 本发明还涉及PNAG特异性抗体(或抗体片段)在诱导个体中PNAG多 糖特异性的免疫应答中的用途。所述免疫在本文中称为主动免疫。个体可 以是具有或处于发生由任一前述非-ica/pga的PNAG阳性的病原体引起的 感染的风险的那些个体。感染可通过施用PNAG特异性抗体(或抗体片段) 进行预防或治疗。
[0091] PNAG和dPNAG多糖
[0092] PNAG多糖是聚N-乙酰基-β-1-6葡糖胺(即，其由通过β1-6键所连接 的葡糖胺单体单元组成)。当乙酰基存在时，其与葡糖胺单体N-连接(与O- 连接不同)。PNAG具有如下结构式：
[0093]
[0094] 其中n是整数，R选自-NH-CO-CH3和-NH2。“n”不受限制的可以是 2-500。
[0095] PNAG可以在体外合成，或可从天然来源分离，例如新描述的PNAG 阳性病原体。PNAG的天然形式以1-100％乙酰化形式(即其中R是 -NH-CO-CH3)的混合物存在，其中更高的乙酰化形式(即具有50％以上乙 酰化的)是更主要的形式。
[0096] 以前发现较低的乙酰化形式是高度免疫原性的，在体内的免疫刺激测 定中显示，其与高乙酰化形式相比更容易诱导调理素保护性抗体。施用 dPNAG后产生的抗体识别dPNAG，在某些情况下，高乙酰化形式的PNAG 也能达到这一效果。这些结果使低乙酰化形式的PNAG成为刺激体内保护 性免疫应答的适当的疫苗候选物。因此，本发明同样涉及低乙酰化形式的 PNAG在刺激个体主动免疫中的用途。所述低乙酰化形式的PNAG在本文 中称为去乙酰化PNAG(或dPNAG)。dPNAG与上文显示的结构相同，除 了低于50％的R基团是-NH-CO-CH3(即，低于50％的氨基被乙酰基取代)。 dPNAG可以是全部或部分去乙酰化的，条件是乙酰化的范围是0-50％。 全去乙酰化的dPNAG(即其中R仅为NH2)在本文中指同聚物。部分去乙 酰化的dPNAG(即其中R可以是–NH2或–NH-CO-CH3，条件是低于50％ 的R是–NH-CO-CH3)在本文中指异聚物。例如，低于49％、低于45％、 低于40％、低于35％、低于30％、低于25％、低于20％、低于15％、低 于10％、低于5％或低于1％的R基团为–NH-CO-CH3。在某些情况下， 乙酰化的水平为40％或以下、35％或以下、20％或以下或15％或以下。
[0097] 本发明涉及高乙酰化和低乙酰化形式的PNAG在各种应用中的用途。 作为非限制性的实例，高乙酰化的PNAG可用于制备抗体，用于诊断或其 他非治疗目的。
[0098] 本发明涉及天然形式(高或低乙酰化)和合成形式(即完全从头合成的) 的PNAG的用途。应理解，所述合成形式可通过已知数量和顺序的β1-6 彼此连接的葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺单元合成。某些情况下，合成形式可 少至4个单体。
[0099] 已公开的美国专利申请号US-2011-0150880描述了合成的寡糖、其合 成及其与载体的缀合。该参考文献的具体和全部的教导被引入本文作为参 考。在某些实施方案中，合成的寡糖可用于和载体缀合。一个实例是寡糖- 载体缀合物，其包含通过如下接头与载体缀合的寡糖
[0100]
[0101] 或
[0102]
[0103] 其中n大于1，m是选自1-10的数字，p是选自1-20的数字，R是H 或烷基，其中所述接头与寡糖O-连接，与载体N-连接。在某些实施方案 下，“n”可以是2-10、2-5或2、3或4。
[0104] 另一个实例是带O-连接接头的寡糖，其中所述接头包括：
[0105]
[0106]
[0107] 其中所述寡糖是聚葡糖胺。例如，所述聚葡糖胺可以是2-20个单体长、 5-11个单体长的β-1-6连接的葡糖胺。
[0108] PNAG和dPNAG的尺寸可以变化，由特定的用途决定。通常PNAG 和dPNAG的分子量范围为约900道尔顿(Da)至750千道尔顿(kDa)。在某 些方面，PNAG或dPNAG的分子量低于2kDa。在某些实施方案中，PNAG 或dPNAG的分子量为至少约2200道尔顿，或至少约2500道尔顿，或至 少约3000道尔顿。在某些实施方案中，PNAG或dPNAG可以是至少9、 至少10个单体单元长，或至少12个单体单元长，或至少15个单体单元长。 在其他方面，PNAG或dPNAG分子量至少为100kDa，任选其范围为 100-500kDa。
[0109] 如本文中进一步详细的讨论，PNAG和dPNAG，包括低分子量版本 的PNAG和dPNAG，可以与载体例如载体蛋白缀合。当与载体缀合时， PNAG和dPNAG可以小到2-3个单元单体，但优选至少4-6个单体单元 长。多糖通常介于800Da到1,000kDa。该尺寸的PNAG或dPNAG形式 可根据本文所述方法从头合成。当不含载体化合物使用时，PNAG或 dPNAG可为约100kDa或更大。
[0110] PNAG的制备
[0111] 本发明涉及天然和合成形式的dPNAG和PNAG的用途，包括从本文 所述非-ica/pga的表达PNAG的病原体分离或衍生的dPNAG和PNAG。 本文所用的天然的PNAG或dPNAG是指存在于天然来源中的且任选可从 其中分离或衍生的那些。
[0112] PNAG和dPNAG抗原可以以分离形式提供和/或使用。分离的多糖， 例如分离的dPNAG，是从其正常存在或合成的环境中取出并至少部分分 离的那些。在某些情况下，分离的多糖能从其他化合物中充分分离，以进 行结构和功能鉴定。例如，分离的多糖可进行“测序”以确定其化学组成。
[0113] dPNAG可分离自天然PNAG，或其可通过使用本文所述的去乙酰化 方法从更高度乙酰化的天然PNAG衍生。体外合成的dPNAG可从其合成 反应混合物中分离，由此将其与反应底物、酶、辅因子、催化剂或反应副 产物分离。
[0114] PNAG和dPNAG可由任何携带ica基因座的微生物(包括细菌)菌株 制备。携带ica的菌株包括天然表达ica基因座的菌株，例如但不限于表 皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌。具体的菌株包括表皮葡萄球菌 RP62A(ATCC号35984)、表皮葡萄球菌RP12(ATCC号35983)、表皮葡 萄球菌M187、金黄色葡萄球菌RN4220(pCN27)和金黄色葡萄球菌MN8 粘液。携带ica的菌株还包括那些用ica基因座内的基因转化的(例如肉葡 萄球菌TM300(pCN27))。
[0115] 天然的PNAG可由多种方法制备，包括从微生物培养物(包括细胞和 无细胞培养物上清)中提取粗制天然PNAG制品，使富含高分子量天然 PNAG的物质从粗制PNAG制品中分离，使用溶剂例如甲醇、乙醇、丙酮 或任何其他本领域技术人员已知能引起多糖从水溶液中沉淀的有机溶剂来 沉淀含有富含高分子量PNAG物质的不纯PNAG。提取粗制天然PNAG 制品和分离、沉淀不纯的天然PNAG制品的步骤可使用现有技术中已知的 方法进行，如已公开的美国申请号US-2005-0118198-A1中所述。
[0116] 不纯的PNAG物质随后经纯化和去乙酰化产生dPNAG。去乙酰化可 通过化学法或酶法进行。在某些情况下，化学法去乙酰化可包括将不纯的 PNAG与碱或酸温育，产生半纯的PNAG制品，中和所述制品，并进一步 处理该中和的制品以产生dPNAG。
[0117] 酶促去乙酰化通常包括将不纯的PNAG与酶温育，例如消化生物材料 的细菌酶类，包括细胞壁分解剂，如溶菌酶、溶葡萄球菌酶和蛋白酶K， 以及核酸酶，例如降解DNA和RNA的DNase和RNase。随后添加溶剂， 使PNAG从溶液中沉淀出来，收集沉淀物，将PNAG再次溶解于碱例如 NaOH，或酸例如HCl中，随后中和。如果温育步骤使用了酸，则中和可 用碱完成，或者如果温育步骤使用了碱，则中和用酸完成。中和物质的不 溶性组分随后例如用氢氟酸温育处理，产生纯的天然PNAG抗原，或再次 溶解于pH<4.0的缓冲液中，随后进行分子筛和/或离子交换色谱处理。
[0118] 另一种分离方法包括通过将培养物与强碱或酸温育，从微生物(包括细 菌)培养物中提取粗制PNAG混悬液的步骤。优选地，所述培养物在强碱 或酸中搅拌至少2小时，更优选至少5、10、15、18或24小时。所述强碱 或酸可以是任何类型的强碱或酸，但优选至少1M的NaOH或HCl的强度。 在某些实施方案中，所述强碱或酸是5M的NaOH或5M的HCl。所述酸 或碱溶液随后进行离心，收集细胞体。在某些实施方案中，提取的步骤重 复若干次。所得的酸或碱溶液中和至约pH7，随后透析产生不溶性的不纯 的PNAG。
[0119] dPNAG也可从头合成。从头合成dPNAG的方法描述于已公开的美国 专利申请号US-2005-0118198-A1和US-2011-0150880-A1中。
[0120] 某些方法可从原料中衍生dPNAG，所述原料例如但不限于多聚葡萄 糖(即葡聚糖)、多聚葡糖胺例如壳多糖或壳聚糖、多聚葡糖胺糖醛酸以及 多聚半乳糖胺糖醛酸也可用于产生本发明的dPNAG抗原。
[0121] PNAG和dPNAG制品可以有多种纯度。本文中，纯的PNAG或 dPNAG制品是超过92％无污染的PNAG或dPNAG制品。这些污染物包 括半乳糖、磷酸盐、磷壁酸等。在某些实施方案中，PNAG和dPNAG组 合物至少是93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％无污染物或100％ 无污染物的。在某些实施方案中，dPNAG组合物不含高度乙酰化的PNAG。
[0122] PNAG或dPNAG组合物的纯度水平可通过本领域已知的方法评价。 例如，所述纯度可通过化学分析法、气相色谱和核磁共振来验证材料的结 构方面。
[0123] 载体
[0124] PNAG和dPNAG，不论是从头合成的或者衍生自天然来源的，均可 以缀合或未缀合的形式使用。当为缀合形式时，PNAG或dPNAG可与载 体(或载体化合物，所述术语在本文中可互换使用)直接或通过接头缀合。 所述缀合可在多糖的任何位置进行，包括在其末端之一或两个末端。
[0125] 本文所述“载体”是指通过直接连接或者使用接头连接到多糖的化合 物，所述载体可以是具有免疫活性(免疫原性)或其可以是惰性的。当用于 体内时，应当理解载体是能安全施用于个体的。
[0126] 载体包括但不限于蛋白质、或者肽、多糖、核酸、或者其它聚合物、 脂类、和小分子。载体蛋白包括例如血浆蛋白，例如血清白蛋白、免疫球 蛋白、载脂蛋白、转铁蛋白；细菌多肽，例如TRPLE、β-半乳糖苷酶，多 肽，例如疱疹gD蛋白、变应原、白喉和破伤风类毒素、沙门氏菌鞭毛蛋 白、嗜血杆菌菌毛蛋白、嗜血杆菌15kDa、28-30kDa和40kDa膜蛋白、 大肠杆菌、热标记肠毒素ltb、霍乱毒素，和病毒蛋白，其中包括轮状病毒 VP、呼吸道合胞病毒f和g蛋白。
[0127] 可特别用于免疫的载体蛋白包括钥孔虫戚血兰素、血清白蛋白、牛甲 状腺球蛋白、或者大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用在被免疫的个体中有免 疫原性的任何其它化合物作为载体。
[0128] 将多糖与蛋白缀合的许多方法在本领域中众所周知。通常，应该激活 多糖，或者使其易于缀合(即，至少使多糖一部分能够与蛋白或者其它分子 共价结合)。许多此类方法在本领域众所周知。可参考已公开的美国专利申 请US-2005-0118198-A1和US-2011-0150880-A1和美国专利号4356170、 4663160、4619828、4808700、4711779。
[0129] 所述载体可通过接头或者间隔基团与PNAG或dPNAG缀合。可以采 用本领域公知的任何方式将多糖与接头或者间隔基团缀合，包括例如利用 多糖的游离还原末端与间隔基团或者接头生成共价键。共价键的生成可通 过将PNAG或dPNAG的游离还原末端转换成游离1-氨基葡糖苷，随后通 过乙酰化作用与间隔基团共价连接(Lundquist等人，期刊《糖化学》
1991 年第10期第377页)。或者，使用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯作为间隔基团 上的活性基团，将PNAG或dPNAG共价连接到间隔基团上(Kochetkow， 《糖研究》1986年第146期C1页)。还可以使用碘和氢氧化钾将PNAG 或dPNAG的游离还原末端转化为内酯(Isebell等人，《糖化学的方法》， Academic Press，纽约(1962年))。通过间隔基团或者接头上的伯氨基基团， 内酯可以共价连接到间隔基团上。还可以利用还原胺化作用，将PNAG或 dPNAG的游离还原末端共价连接到接头或者间隔基团上。
1991 年第10期第377页)。或者，使用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯作为间隔基团 上的活性基团，将PNAG或dPNAG共价连接到间隔基团上(Kochetkow， 《糖研究》1986年第146期C1页)。还可以使用碘和氢氧化钾将PNAG 或dPNAG的游离还原末端转化为内酯(Isebell等人，《糖化学的方法》， Academic Press，纽约(1962年))。通过间隔基团或者接头上的伯氨基基团， 内酯可以共价连接到间隔基团上。还可以利用还原胺化作用，将PNAG或 dPNAG的游离还原末端共价连接到接头或者间隔基团上。
[0130] 抗体
[0131] 本发明包括结合PNAG和/或dPNAG的抗体。所述抗体可以是单克隆 或多克隆抗体。结合dPNAG的抗体也可结合高度乙酰化形式的PNAG。 抗体可以使用dPNAG或PNAG，或合成的由高于3个葡糖胺或N-乙酰基 葡糖胺的单糖单元组成的寡糖制备，任选与载体缀合和/或与佐剂结合使 用。抗体可使用来自非-ica/pga的PNAG阳性的病原体或携带ica或携带 pga的病原体的PNAG或dPNAG制备。
[0132] 多克隆抗体通常通过多次皮下或腹膜内注射抗原和佐剂在动物中产 生。PNAG或dPNAG或缀合的合成寡糖的多克隆抗体通常通过注射单独 的缀合或未缀合形式的PNAG或dPNAG或缀合形式的合成的寡糖，或其 与载体的组合而产生。制备所述多克隆抗体的方法描述于公开的美国专利 申请US-2005-0118198-A1中。
[0133] 简言之，缀合或未缀合形式的PNAG或dPNAG，或缀合形式的寡糖 与诸如弗氏不完全佐剂的佐剂组合(例如，1-3体积的弗氏佐剂中含有100 μg缀合物，用于兔子或小鼠)，在多个位点进行皮内注射。约1个月后， 动物用1/5到1/10初始量的抗原或抗原缀合物与佐剂通过在多个位点皮下 注射进行激发。一至二周后给动物放血，测定血清中抗体的存在。动物可 以被重复激发，直到抗体滴度平稳。动物可用单独的PNAG或dPNAG或 合成的寡糖缀合物，PNAG或dPNAG缀合物或合成的寡糖缀合物，或 PNAG或dPNAG与不同载体的缀合物，或合成的寡糖缀合物激发，含或 不含佐剂。在某些实施方案中，激发剂可包括PNAG而非dPNAG，或其 可以含有dPNAG和PNAG的混合物。
[0134] 除了提供多克隆抗体的来源，免疫的动物还可用于产生PNAG特异性 和dPNAG特异性的单克隆抗体。本文中，术语“单克隆抗体”是指免疫球 蛋白的同种(即单个克隆)群体，其结合某一抗原同样的表位。单克隆抗体 具有同样的Ig基因重排，因此具有相同的结合特异性。当使用dPNAG或 合成的寡糖缀合物产生抗体时，所述表位可以以高度乙酰化的PNAG和 dPNAG存在，这样针对dPNAG的抗体也可结合PNAG。
[0135] 制备单克隆抗体的方法是本领域已知的。单克隆抗体可通过多种方法 制备。在一种方法中，分离自免疫动物的脾细胞经与杂交瘤细胞融合或通 过EB病毒转化进行永生化，随后筛选并鉴定表达所需抗体的克隆。其他 方法包括分离重排的Ig基因序列，并克隆至永生化细胞系中。所述方法还 详述于公开的美国专利申请US-2005-0118198-A1和US-2011-0150880-A1 中，并且所述教导引入本文作为参考。
[0136] 对PNAG特异性的抗体可不限于鼠、人或嵌合抗体，例如但不限于人 源化抗体。
[0137] 人单克隆抗体可通过本领域已知的任何方法制备，包括美国专利号 5567610、5565354、5571893，Kozber,J.Immunol.133:3001(1984),Brodeur, 等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,p.51-63 (Marcel Dekker,Inc,new York,1987)和Boerner等,J.Immunol.,147: 86-95(1991)中公开的那些。人抗体可通过从血液或其他产生针对相关抗原 (例如dPNAG或PNAG)的抗体的人其他组织收集产生抗体的淋巴细胞而 获得。这些淋巴细胞可经处理产生能在实验室适当培养条件下自我生长的 细胞。细胞培养物可经筛选用于产生针对相关抗原的抗体，随后克隆。克 隆的培养物可用于产生dPNAG或PNAG的人单克隆抗体，或编码所述抗 体重链和轻链可变区的遗传片段可被克隆并插入核酸载体中，用于产生不 同类型抗体。除了用于制备人单克隆抗体的常规方法以外，所述抗体也可 通过免疫能产生人抗体的转基因动物获得(例如Jakobovits等，PNAS USA, 90:2551(1993),Jakobovits等，Nature,362:255-258(1993),Bruggermann 等，Year in Immunol.,7:33(1993)和授予Lonberg的美国专利5569825)。
[0138] 本文中，“人源化的单克隆抗体”是含有至少人类恒定区域和来自非人 类动物的抗原结合区域，例如一个、两个或三个CDR的单克隆抗体或者 其功能活性片段。人源化抗体具有特殊的临床应用，其特异性识别相关抗 原，但不会激发人体针对抗体本身的免疫应答。例如，鼠CDR可被移植 到人抗体的框架区中以制备人源化的抗体。参见L.Riechmann等人， Nature 332,323(1988)；M.S.Neuberger等人，Nature 314,268(1985)和 EPA 0 239 400。或者，人源化的单克隆抗体可通过用人抗体的类似区域替 换非人抗体的非CDR区域构建，同时保留原始抗体的表位特异性。例如， 非人CDR和任选的某些框架区域可通过共价结合到人FR和/或Fc/pFc' 区域产生功能抗体。在美国，已经有从特异性鼠抗体区域合成人源化抗体 的商业机构，例如Protein Design Labs(Mountain View California), Abgenix和Medarex。同样可参考欧洲专利申请0239400。
[0139] 本发明也包括结合抗原的抗体片段。本领域已知，只有抗体分子的一 个小部分(即互补位)涉及抗体与抗原表位的结合(通常参见，Clark， WR(1986)《现代免疫学实验基础》Wiley&Sons，Inc，纽约；Roitt，I(1991 年)《核心免疫学》第7版，Blackwell Scientific Publications，Oxford)。 例如，抗体的pFc’和Fc区域是补体级联的效应子，但并不涉及抗原结合。 PFc’区域被酶促断裂的抗体或者制备的缺少pFc’区域的抗体被命名为 F(ab’)2片段，保留了完整抗体的两个抗原结合位点。由于其具有两个抗原 结合位点，分离的F(ab’)2片段被称为二价单克隆片段。相似的是，Fc区 域被酶促断裂的抗体或者制备的缺少Fc区域的抗体被命名为Fab片段， 保留了完整抗体分子的一个抗原结合位点。更进一步的是，Fab片段是由 共价连接的抗体轻链和命名为Fd(重链可变区域)的一部分抗体重链构成 的。Fd片段是抗体特异性的主要决定因子(在未改变抗体特异性条件下， 单个的Fd片段可与多达10条不同的轻链结合)，并且单独的Fd片段保留 着结合抗原表位的能力。
[0140] 术语Fab、Fc、pFc’、F(ab’)2和Fv还具有标准的免疫学含义[Klein， 《免疫学》(John wiley，纽约，1982年)；Clark，WR(1986)《现代免疫学 实验基础》(Wiley&Sons，Inc，纽约)；Roitt，I(1991)《核心免疫学》第 7版(Blackwell Scientific Publication，Oxford)]。众所周知的功能活性抗体 片段包括但不限于抗体的F(ab’)2、Fab、Fv和Fd片段。与完整抗体相比， 缺少完整抗体Fc片段的这些片段很显然在循环中更加迅速，可更少发生非 特异性组织结合(Wahl等人，期刊《Nucl Med》1983年第24期第316-325 页)。例如，根据Ladner等人的美国专利4946778公开的方法，构建单链 抗体。此单链抗体包括通过柔性接头连接的重链与轻链的可变区。还报道 了获得单一区域抗体(“Fd”)的方法(参见例如，Ward等人《，自然》1989 年第341期第644-646页)，其含有分离的可变重链单一结构域；并且公开 了一种利用与目标抗原表位结合的足够亲和力来鉴别抗体重链可变区(VH单结构域抗体)的筛选方法。基于公知的抗体重链和轻链可变区序列，制备 重组Fv片段的方法在本领域众所周知并已经公开，例如Moore等人的美 国专利4462334。公开了使用并产生抗体片段的其它参考文献包括例如Fab 片段(Tijssen，《酶免疫测定的实施与理论》(Elsevieer，Amsterdam，1985))， Fv片段(Hochman等人，《生物化学》1973年第12期第1130页；Sharon 等人，《生物化学》1976年第15期第1591页；Ehrilch等人，美国专利 4355023)，和抗体分子的部分(Audilore-Hargreaves，美国专利4470925)。 因此，在不破坏抗体对于dPNAG抗原表位的特异性的条件下，本领域技 术人员可以从完整抗体的各个部分构建抗体片段。可以理解，由抗dPNAG 抗体识别的抗原表位也可以存在于高度乙酰化的PNAG上。
[0141] 用途
[0142] 本发明的多糖、合成寡糖和抗体可用于多种不同的应用，包括体外、 原位和体内的应用。多糖和合成寡糖可用于在体内免疫个体，以预防或治 疗由非-ica/pga的PNAG阳性的病原体导致的感染。多糖和合成寡糖也可 用于开发PNAG或dPNAG特异性抗体，其可用于在体内免疫个体，以预 防或治疗由非-ica/pga的PNAG阳性的病原体导致的感染。
[0143] 来自于非-ica/pga的PNAG阳性的病原体的PNAG和/或dPNAG可 用于筛选结合伙伴，例如抗体。抗体也可用于检测表达PNAG的病原体， 包括检测(即诊断)个体的感染。本发明因此还提供了用于产生结合PNAG 和dPNAG的抗体的方法。
[0144] 来自于非-ica/pga的PNAG阳性的病原体的PNAG和/或dPNAG可用 于在具有或处于发生由任一表达PNAG的病原体(包括携带和未携带ica基 因座的)引起的感染的风险的个体中诱导免疫应答。应当理解，“来自于非 -ica/pga的PNAG阳性的病原体的PNAG和/或dPNAG”表示使用本文所 述方法从非-ica/pga的PNAG阳性的病原体产生的多糖。免疫应答诱导可 预防或部分或完全治疗所述感染。部分治疗所述感染可包括减轻症状的严 重性或频率，和/或部分减少患者体内的病原体载量。当患者正被施用或将 要被施用一种或多种其他治疗剂时，部分治疗可以是有效的。通过向个体 施用诱导免疫应答例如针对PNAG或dPNAG(或表达PNAG的病原体)的 抗体反应的有效量的任何PNAG或dPNAG或其组合物完成免疫应答诱 导。
[0145] 本文中，个体为温血哺乳动物，包括例如人、灵长类、马、牛、猪、 山羊、绵羊、狗或猫。在某些实施方案中，个体是非啮齿类个体。非啮齿 类个体是前文所定义的任何个体，但特别排除了啮齿类动物，例如小鼠、 大鼠和兔子。在某些实施方案中，优选的个体是人。
[0146] 所述个体可以是具有或处于发生由表达PNAG的病原体(无论携带或 未携带ica基因座的)引起的感染的风险。处于发生由表达PNAG的病原体 引起的感染的风险的个体可能正处于暴露于所述病原体的风险中。如本文 所述，大量的非-ica/pga的PNAG阳性的病原体对一类或多类抗生素具有 耐药性。因此，由于其不能通过使用抗生素消灭，个体可能将暴露在所述 病原体下。具有感染风险的人群包括，例如新生儿个体、免疫妥协个体(例 如正接受化疗的个体)、使用免疫抑制剂的个体(包括移植)、透析个体、经 高风险手术的个体以及具有体内医疗器械例如静脉导管(例如中枢导管)或 假肢(例如髋或膝关节置换假体)的个体。
[0147] 与蛋白质载体缀合的PNAG或dPNAG和合成的寡糖可以诱导免疫应 答的有效量施用至个体。所述有效量可以是足以帮助个体产生本身的免疫 保护的量，例如诱导对PNAG和/或dPNAG特异性的抗体的生成，诱导记 忆细胞的生成，以及可能的细胞毒的淋巴细胞反应等。所述免疫应答可随 后预防暴露在所述病原体下的个体的由表达PNAG的病原体导致的感染。 本领域技术人员能通过本领域已知的方法判定PNAG或dPNAG或合成的 寡糖缀合物疫苗的量是否足以诱导主动免疫。例如，PNAG或dPNAG或 合成的寡糖缀合物疫苗在哺乳动物中产生PNAG特异性抗体的能力可通过 使用PNAG抗原在小鼠或其他个体中筛选产生的抗体进行。诱导免疫应答 的PNAG或dPNAG的量范围可以为约1至100μg，但这不是限制性的。
[0148] 对PNAG和/或dPNAG特异性的抗体或抗体片段可用于诱导个体的被 动免疫，例如，在具有暴露在表达PNAG的病原体(包括非-ica/pga的PNAG 阳性的病原体)下风险的个体中预防全身性感染。诱导对感染的被动免疫的 方法包括向个体施用有效量的对PNAG和/或dPNAG或合成寡糖特异性的 抗体，以诱导对PNAG或表达PNAG的病原体(包括非-ica/pga的PNAG 阳性的病原体)的免疫应答。
[0149] 抗体或抗体片段可施用给任何具有发生非-ica/pga的PNAG阳性的病 原体导致的感染风险的个体，在某些实施方案中可特别适用于不能诱导对 PNAG和/或dPNAG的主动免疫的个体。PNAG或dPNAG或合成的寡糖 缀合疫苗可能不能完全有效的预防或消除某些个体的感染，因此这些个体 可受益于使用对PNAG和/或dPNAG特异性的抗体的治疗。不能诱导免疫 应答的个体包括免疫妥协的个体(例如，正接受化疗的个体、具有AIDS的 个体等)，或未发育免疫系统的个体(例如早产的婴儿)。
[0150] 抗体或抗体片段以有效量施用至个体，诱导对PNAG或表达PNAG 的病原体例如非-ica/pga的PNAG阳性的病原体的免疫应答。本文中，有 效量的诱导免疫应答的抗体或抗体片段是足以(i)预防暴露于所述病原体的 个体发生感染；(ii)抑制感染的进展，即，妨碍或减缓其进展；和/或(iii)减 轻感染，即消除感染个体体内的微生物的抗体或其片段的量。微生物包括 细菌、病毒、真菌、寄生虫等。
[0151] 使用那些本领域技术人员已知的方法，可以确定抗体或抗体片段的用 量是否是体外调理素作用分析中的有效量，其预示着抗体调理作用的程度。 调理微生物例如细菌的抗体是加入到微生物样品中时引起微生物被吞噬的 抗体。调理素作用分析可以是比色测定法、化学发光测定法、荧光测定法 或放射标记摄取测定法、细胞介导的细胞毒性分析或测定物质调理能力的 其他分析方法。
[0152] 药物组合物和制剂
[0153] 通常，当体内施用时，本发明的多糖、抗体和抗体片段以可药用的组 合物形式施用。所述组合物可包括可药用的载体、盐、缓冲剂、防腐剂、 佐剂和任选的其他预防或治疗成分。可药用的载体表示一种或多种相容的 固体或液体填充剂、稀释剂或包囊物质，其适合人体或其他动物给药。可 药用载体中的术语：“载体”表示与多糖、抗体或抗体片段混合有利于应用 (包括给药)的天然或者合成的有机成分或者无机成分。药物组合物的成分 应当能与多糖、抗体或抗体片段混合，以致各成分之间不存在实质削弱所 需药用效果的相互作用。
[0154] 可药用的盐包括但不限于由下列酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、 硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲 烷磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸、苯磺酸。另外，可药用的盐 可以制备成碱金属或者碱土金属盐，例如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。
[0155] 适当的缓冲剂包括乙酸和盐(1-2％重量/体积)；柠檬酸和盐(1-3％重量/ 体积)；硼酸和盐(0.5-2.5％重量/体积)；磷酸与盐(0.8-2％重量/体积)。适合 的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％重量/体积)、氯丁醇(0.3-0.9％重量/体 积)、对羟基苯甲酸酯类(0.01-0.25％重量/体积)和硫柳汞(0.004-0.02％重量/ 体积)。
[0156] 适于肠胃外给药的组合物通常包括所述多糖、抗体或抗体片段的无菌 水制剂，其与接受者的血液是等渗的。可接受的溶媒和溶剂包括水、林格 溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，通常无菌的不挥发性油可以用做溶剂或 者悬浮介质。为了此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，其中包括合 成的甘油单酯、甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸，可应用于可注射的制 剂。适合皮下给药、肌内给药、腹膜内给药、静脉内给药等方式的载体配 方可以参见《雷明顿药物学》(Mack Publishing Company，Easton，PA)。
[0157] 所述多糖、寡糖、抗体和抗体片段以有效量给药。多糖或寡糖的剂量 范围为1-100μg可以是有效的，这取决于施用的方式。抗体或抗体片段剂 量范围为0.1-100mg/kg和0.1-20mg/kg，取决于施用的方式。绝对用量取 决于各种因素，其中包括，给药是实施在尚未受细菌感染的高危个体还是 已经受感染的个体，共同治疗，用药次数和个体病人的参数，其中包括年 龄、身体状况、身高和体重。这些是本领域普通技术人员公知的因素，可 以通过不超出常规的实验获得。通常优选的是，根据合理的医学判断，所 用的最大剂量是最高的安全剂量。
[0158] 可以考虑所述多糖、抗体和/或抗体片段的多种给药方式。通常，免疫 方案涉及将高剂量的抗原给药，经过几周后，接着将低剂量的抗原给药。 还可以施用进一步的剂量。如果需要，被动免疫的给药方案完全不同于高 频率的给药方案。可以使用增强抗细菌感染的免疫响应和/或随后保护免受 感染的任何给药方案。通过不超出常规的实验，本领域普通技术人员可以 确定递送多次剂量的具体抗原所需的给药间隔。疫苗可以在1到6个月内 施用，任选以相同的时间间隔给药。对于抗体和抗体片段，给药间隔通常 在14-180天。
[0159] 可以采用各种给药途径。所选的具体方式取决于例如待治疗的具体症 状、有效治疗所需的剂量。一般地讲，实施本发明方法可以采用医学可接 受的任何给药方式，也就是，在未造成临床不可接受副作用的条件下产生 有效水平的免疫应答的任何方式。优选的给药方式是胃肠外途径。术语“胃 肠外”包括皮下注射、静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、或者输注技术。 其它途径包括但不限于口腔、鼻、皮肤、舌下、和局部途径。
[0160] 其它递送系统可以包括限时释放系统、缓释递送系统、或者持续释放 递送系统。这样的系统可以避免本发明多糖的重复给药，增加了个体与医 生的便利。许多类型的释放递送系统是可用的，对于本领域普通技术人员 众所周知。它们包括基于聚合物的系统，例如聚乳酸和聚乙醇酸、聚酐和 聚己内酯；脂类的非聚合物系统，其中包括固醇，例如胆固醇、胆固醇酯， 和脂肪酸，或者中性脂肪，例如甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯；水凝胶 释放系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；使用常规粘合剂和赋形剂的蜡包 衣压缩片剂，部分融合的植入片等。特定实例包括但不限于：(a)基质中含 有某种形式多糖的侵蚀系统，参见美国专利4452775(Kent)；4667014(Nestor 等人)；4748034和5239660(Leonard)；(b)活性化合物以可控速率透过聚合 物的扩散系统，参见美国专利3832253(Higuchi等人)和3854480 (Zaffaroni)。此外，可以使用基于泵的硬件递送系统，其中一些系统适合 植入。
[0161] 第二药物
[0162] dPNAG和/或PNAG-特异性抗体可与其他药物联合递送。其他药物的 性质可依赖于dPNAG或PNAG特异性抗体是否施用。
[0163] 例如，当施用以诱导主动免疫和/或产生抗体时，dPNAG可与佐剂联 合。本文中，术语佐剂是指与抗原(例如dPNAG)联合施用(包括在同一时 间、同一制剂中等)以加强抗原特异性免疫应答的物质。佐剂包括但不限于 铝化合物，例如凝胶、氢氧化铝和磷酸铝以及弗氏完全或不完全佐剂(其中 dPNAG抗原整合到在石蜡油乳浊液中稳定水的水相中)。可以采用不同类 型的油例如鲨烯油或者花生油替换石蜡油。具有佐剂特性的其它材料包括 BCG(减毒的结核分支杆菌)、磷酸钙、左旋咪唑、异丙肌苷、聚阴离子(例 如，多聚A:U)、蘑菇多糖、白喉毒素、脂质A、皂苷、QS-21和肽，例如 胞壁酰二肽。稀土盐，例如镧和铈，也可以用做佐剂。佐剂的用量取决于 个体和所用的具体dPNAG抗原(例如，乙酸盐取代水平)，并且不需要过度 实验就可以由本领域技术人员很容易地确定。
[0164] 所述药物可以是抗微生物剂，例如抗菌剂、抗病毒药、抗寄生虫药、 抗真菌药等。
[0165] 所述药物可以是抗菌药物(例如抗生素)、另一种细菌抗原或另一种抗 菌的抗体或其混合物或组合。抗生素在治疗细菌感染的用途是常规的。抗 原诱导主动免疫和抗体诱导被动免疫的用途也是常规的。在该实施方案中， 常规的给药溶媒(例如片剂、植入片、可注射溶液等)可以含有本发明活性 剂和抗生素和/或其他抗原和/或其他抗体。此外，抗生素和/或其他抗原和/ 或其他抗体可以分别用药。抗生素可以与dPNAG或抗dPNAG抗体缀合。
[0166] 抗菌的抗生素是众所周知的，包括但不限于：青霉素G、青霉素V、 氨苄西林、阿莫西林、巴氨西林、环青霉素、依匹西林、海他西林、匹氨 西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、 羧苄西林、替卡西林、avlocillin、美洛西林、哌拉西林、氮卓西林、头孢 西林、头孢霉定、头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢唑林、头孢呋肟酯、头孢 孟多、头孢尼西、头孢西丁、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢甲肟、头孢曲松、 拉氧头孢、头孢替坦、头孢哌酮、头孢他啶、亚胺培南、棒酸钾、特美汀、 舒巴坦、新霉素、红霉素、甲硝唑、氯霉素、克林霉素、林克霉素、万古 霉素、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类和利福平 (参见《古德曼和吉尔曼治疗学药理学基础》第8版，1993年，McGraw Hill Inc)。
[0167] 多糖抗原(除PNAG和dPNAG外)和多糖特异性抗体(除PNAG特异性 抗体外)是本领域已知的。实例包括伤寒沙门氏菌荚膜Vi抗原(Szu，S.C.， X.Li，A.L.Stone和J.B.Robbins，《Vi荚膜多糖结构与免疫特性之间的 关系》，《感染与免疫》1991年第59期第4555-4561页)；大肠杆菌K5 荚膜(Vann，W，MA Schmidt，B Jann和K Jann，《泌尿道感染性大肠 杆菌的荚膜多糖(K5抗原)结构，010：K5：H4，与脱硫肝素相似的聚合物》， 《欧洲生物化学杂志》1981年第116期第359-364页)；金黄色葡萄球菌类 型5的荚膜(Foumier JM K Hannon，M Moreau，WW Karakawa和WF Vann，《从金黄色葡萄球菌分离类型5的荚膜多糖》，Ann.Inst. Pasteur/Microbiol.(巴黎)，1987年第138期第561-567页)；苜蓿根瘤菌外 多糖II(Glazebrook J和GC Walker，《通过苜蓿根瘤菌，一种新型外多糖 能够功能性替代苜蓿生节瘤中卡尔科弗卢尔结合的外多糖》，《细胞》1989 年第65期第661-672页)；B组葡萄球菌类型III(Wessels MR，V.Pozsgay， DL Kasper和HJ Jennings，《B组类型III葡萄球菌荚膜多糖低聚糖重复 单元的结构与免疫化学》《，生物化学杂志》1987年第262期第8262-8267 页)；绿脓假单胞菌Fisher7O-特异侧链(Knirel，YA，NA Paramonov，EV Vinogradov，AS Shashkow，BA NK Kochetkov，ES Stanislavsky和EV Kholodkova《，绿脓假单胞菌的体细胞抗原，绿脓假单胞菌O3(Lanyi)、 025(Wokatsch)和Fisher免疫类型3和7脂多糖的O-特异多糖链的结构》， 《欧洲生物化学杂志》1987年第167期第549页)；宋内氏痢疾杆菌的氧- 特异侧链(Kenne.L，B Lindberg和K Petersson，《宋内氏痢疾杆菌相I 脂多糖氧特异侧链的结构研究》，《糖类研究》1980年第78期第119-126 页)；肺炎链球菌类型I荚膜(Lindberg，B，Lindqvist，B，Lonngren J， Powell DA，《肺炎链球菌类型I荚膜多糖的结构研究》，《糖类研究》1980 年第78期第111-117页)；和肺炎链球菌组抗原(Jennings HJ，C.Lugowski 和NM Young，《肺炎链球菌类型I复合多糖碳物质的结构》，《生物化 学》1980年第19期第4712-
4719页)。其他非多肽抗原和非多糖特异性抗 体是本领域技术人员已知的，可与本发明的组合物联合使用。
4719页)。其他非多肽抗原和非多糖特异性抗 体是本领域技术人员已知的，可与本发明的组合物联合使用。
[0168] 检测和诊断分析
[0169] dPNAG和合成寡糖抗原及其抗体也可用于确定个体或者样品免疫状 态的诊断测定，或者可以作为免疫分析的试剂。例如，抗体可以用于检测 表面具有PNAG的微生物例如细菌样品的存在。如果微生物存在于样品， 那么抗体还可以用于治疗感染的个体。抗体还可以用于筛选存在PNAG抗 原的微生物，并且可以从复杂的混合物中分离dPNAG或PNAG抗原以及 含有dPNAG或PNAG抗原的微生物。
[0170] 通过标记dPNAG或抗体和/或将dPNAG或抗体固定在不溶性的基质 上，可实现上述测定或者本领域公知的任何其它测定。使用dPNAG和/或 其抗体的分析与诊断方法使用了至少一种下列试剂：标记的分析物类似物、 固定的分析物类似物、标记的结合配偶体、固定的结合配偶体、立体缀合 物。所用的标记可以是任何不干扰分析物与其结合配偶体结合的可测的功 能性标记。在免疫测定中使用的多种标记众所周知。例如，可以直接检测 的化合物，如荧光色素、化学发光标记、放射性标记，以及通过反应或者 衍生作用例如通过酶作用可以测得的化合物。这样类型标记的实例包括 32P、14C、125I、3H和131I放射同位素，荧光基团例如稀土螯合物或者荧光 素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶、例如萤火 虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利4737456)，萤光素， 2,3-dihydrophthalavinedione，辣根过氧化酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳 糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖基氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧 化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。杂环氧化酶，例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶， 与利用过氧化氢氧化染料前体的酶例如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物 酶偶联，生物素卵白素、自旋标记、噬菌体标记、和稳定的自由基。
[0171] 通过本领域技术人员公知的方法，所述标记可以与dPNAG或抗 dPNAG抗体缀合。例如，美国专利3940475和3645090举例说明了荧光 基团和酶与抗体的结合。本发明能采用的通常重复使用的抗原与抗体的其 它测定法包括竞争测定法和夹心测定法。
[0172] 下列实施例旨在举例说明，并非对本发明的范围加以限制。
具体实施方式
[0173] 实施例
[0174] 实施例1:多种微生物物种的细菌表面多糖聚-N-乙酰基葡糖胺 (PNAG)的表达[0175] 抗体直接结合：生物体在多种培养基中生长以促进PNAG产生，温度 范围为20℃至37℃，24-72小时，大气氧条件(21％O2)、5％CO2或在缺 氧情况下。来自平板的细胞直接在PBS(磷酸盐缓冲液)中悬浮，而来自培 养液中的细胞经洗涤后再悬浮于PBS中。
[0176] 将样品置于载玻片上，用甲醇固定1分钟。样品随后用与Alexafluor 488(AF488)(1:313稀释的1.63mg/ml储存液，最终浓度5.2ug/ml)直接缀 合的Mab F429(阴性对照，对铜绿假单孢菌藻酸盐抗原特异性的人IgG1) 温育，或用与AF488(1:833稀释的4.35mg/ml储存液，最终浓度5.2ug/ml) 直接缀合的MAb F598(对PNAG特异性的人IgG1)在含有0.5％BSA的 PBS中温育过夜，4℃，含4uM Syto 83。样品用PBS洗涤，装上1.5盖玻 片，用于共焦分析。
[0177] MAb F598结合PNAG的特异性：生物体在多种培养基中生长以促进 PNAG产生，温度范围为20℃至37℃，24-72小时，大气氧条件(21％O2)、 5％CO2或在缺氧情况下。来自平板的细菌细胞直接在TBS(tris缓冲盐溶 液pH 6.5)中悬浮，而来自培养液中的细胞经洗涤后再悬浮于TBS中。
[0178] 通常，样品用壳多糖酶、Dispersin B或高碘酸盐处理，随后暴露于 MAb F598。在pH6.5的TBS中的样品与(a)50μg/ml壳多糖酶(阴性对照)、 (b)Dispersin B(消化PNAG)在37℃温育24小时，或(c)与0.4M高碘酸盐 在37℃温育2小时。PNAG被高碘酸盐裂解，Dispersin B消化，未受壳 多糖酶影响。细胞随后与针对PNAG的人IgG单克隆抗体(Mab)或针对非 相关抗原即铜绿假单胞菌藻酸盐的IgG1单克隆抗体(MAb F429)(阴性对 照，对铜绿假单胞菌藻酸盐抗原特异性的人IgG1)反应。非相关抗原的抗 体不应当结合PNAG。
[0179] 具体而言，洗涤样品，取10μl试样风干在载玻片上，随后用甲醇固 定1分钟。MAb F429(阴性对照)直接与AF488缀合(1:313稀释的1.63 mg/ml储存液，最终浓度5.2ug/ml)，MAb F598(抗-PNAG,批次2)与 AF488(1:833稀释的4.35mg/ml储存液，最终浓度5.2ug/ml)直接缀合，其 在含有0.5％BSA的PBS中温育过夜，4℃，含4uM Syto 83(染红DNA)。 样品用PBS洗涤，载玻片上装上1.5盖玻片，用于共焦分析。
[0180] 表1
[0181]
[0182]
[0183]
[0184] ND＝未完成。
[0185] 此外，在患有肺炎链球菌中耳炎的儿童以及两名非典型流感嗜血菌中 耳炎儿童中获取的中耳渗出液(MEF)样本中的感染细菌上检测到壳多糖酶 抗性的、dispersin B-敏感的PNAG。同样的感染菌也用肺炎链球菌或流感 嗜血菌特异性抗体染色。一名结核分枝杆菌感染患者的肺组织中也检测到 PNAG。在用肺炎链球菌血清群19A感染的毛丝鼠鼻咽液中，可容易的观 察到带有血清群19A荚膜的壳多糖酶抗性的、dispersin B-敏感的PNAG 抗原的共区域化。在用啮齿类柠檬酸杆菌感染的小鼠胃肠道内，可在与上 皮细胞结合的微生物周围检测到PNAG。在白色念珠菌感染的角膜炎小鼠 的眼组织中，在真菌细胞的DNA阳性的部分检测到PNAG。
[0186] 此外，共焦显微镜分析显示，与MAb F598反应但不与MAb F429反 应的细菌株系包括霍乱弧菌2R1和霍乱弧菌0395。
[0187] 与PNAG的多克隆兔抗体反应但不与正常的兔血清反应的细菌菌株包 括多形拟杆菌和Bacteroides vulgatis。
[0188] 实施例2：胃肠道中的啮齿类柠檬酸杆菌
[0189] 样品和与AF488(1:313稀释的1.63mg/ml储存液，最终浓度5.2ug/ml) 直接缀合的MAb F429(阴性对照，对铜绿假单胞菌藻酸盐抗原特异性的人 IgG1)或与AF488(1:833稀释的4.35mg/ml储存液，最终浓度5.2ug/ml)直 接缀合的MAb F598(对PNAG特异性的人IgG1)在含有0.5％BSA的PBS 中反应过夜，4℃，含4uM Syto 83(用于细胞核染色)。样品用PBS洗涤， 装上1.5盖玻片，用于共焦分析。
[0190] 使用F598抗体的结果显示，感染小鼠的胃肠道中的啮齿类柠檬酸杆 菌菌落中存在PNAG。MAb F429未对菌落染色，进一步验证了F598MAb 染色的特异性(数据未显示).[0191] 实施例3：耳和鼻灌洗液中的肺炎链球菌
[0192] 该实施例证实了患中耳炎的毛丝鼠的耳鼻灌洗液中荚膜19A型肺炎链 球菌上PNAG的共表达。
[0193] 将样品与50μg/ml Dispersin B或壳多糖酶在TBS中温育过夜，随后 用1:50的F598(1mg/ml)或F429(1mg/ml)和兔抗肺炎链球菌19A荚膜多 糖(1:100)在BSA/PBS中在4℃标记过夜，随后在室温下用1:200的与 AF488缀合的山羊抗人IgG和山羊抗兔AF568温育1小时。
[0194] 结果显示，中耳炎毛丝鼠的鼻咽灌洗液中的肺炎链球菌细胞周围存在 PNAG。用壳多糖酶和Dispersin B处理，随后暴露在对照MAb F429中 的样品呈阴性。用Dispersin B处理，随后暴露于MAb F598的样品呈阴 性，而用壳多糖酶处理随后暴露在Mab F598中的样品呈阳性，证明中耳 炎毛丝鼠的鼻咽灌洗液中存在PNAG。染色图案与兔抗SPn 19A染色重叠 (数据未显示)。
[0195] 类似的，壳多糖酶处理后，使用PNAG特异性MAb F598染色，在感 染肺炎链球菌19A的中耳炎毛丝鼠的耳灌洗液和鼻腔中也检测到PNAG， 但使用对照MAb F429未检测到。染色图案与兔抗SPn 19A染色重叠(数 据未显示)。
[0196] 实施例4：中耳炎儿童的人耳灌洗液中的肺炎链球菌或非典型流感嗜 血杆菌[0197] 耳液样品与100μg/ml DNaseI在37℃孵育过夜，随后在37℃用50 μg/ml壳多糖酶或Dispersin B在TBS中温育24小时。洗涤样品，取10μl 试样风干在载玻片上，热固定，用50μg/ml F598(AP01)或F429(1mg/ml) 和小鼠抗肺炎链球菌磷脂酰胆碱(1:100)或豚鼠抗流感嗜血杆菌(热杀灭全 细胞，1:100)在含有0.5％BSA(PBS/BSA)的PBS中在4℃下标记过夜。样 品用PBS洗涤，用1:250的与AF488缀合的抗人IgG、1:200的山羊抗鼠 IgG或与AF568缀合的山羊抗豚鼠IgG在室温下温育1小时。清洗并安装 载玻片。
[0198] 结果证实，具有肺炎链球菌感染(中耳炎)的人耳液中存在PNAG。暴 露于壳多糖酶和MAb F429，或暴露于Dispersin B和MAb F598的样品 呈阴性，而暴露于壳多糖酶和MAb F598的样品呈阳性。染色图案与抗肺 炎链球菌磷脂酰胆碱的小鼠抗体染色有重叠(数据未显示)。
[0199] 实施例5：血中的伯氏疟原虫和恶性疟原虫
[0200] 疟疾感染的小鼠(伯氏疟原虫NK-65感染的BALB/CJ，感染后18天) 的未染色新鲜血涂片进行共聚焦显微镜检查。涂片用免疫组化笔分成壳多 糖酶、Dispersin B和高碘酸盐处理三个孔。加热固定载玻片，用50μg/ml 壳多糖酶或Dispersin B在TBS中37℃处理24小时，或用0.4M高碘酸 盐在37℃处理2小时。载玻片用PBS洗涤，与直接缀合AF488(绿色)的 MAb F598(1.3mg/ml储存液；1:250稀释，等价于每600μl中2.4μl；最 终浓度5.2μg/ml或每600μl中3.12μg；每孔加入200μl)温育。还加入4μM Syto 83(DNA染料-红色)的PBS溶液，含有0.5％BSA(BSA/PBS)；二者均 在室温下温育4小时。载玻片用PBS洗涤，用1.5μm盖玻片覆盖，用于 共焦显微镜观察。
[0201] 结果显示，脑型疟疾死亡的小鼠血液中存在PNAG。用Dispersin B或 高碘酸盐处理并用MAb F598染色的样品呈阴性，而用壳多糖酶处理并用 MAb F598染色的样品呈阳性(数据未显示)。
[0202] 使用类似的方法分析感染恶性疟原虫的人血中PNAG的表达。用对照 MAb F429染色的样品和用Dispersin B或高碘酸盐处理后用MAb F598染 色的样品呈阴性(数据未显示)。用壳多糖酶处理的样品或未处理的样品、 随后用F598染色则呈阳性(数据未显示)。F598的染色图案与红细胞内 DNA鉴定重叠，表明疟原虫的存在，因为人红细胞不含有细胞核或DNA(数 据未显示)。
[0203] 实施例6:肺中的洋葱伯克霍尔德菌(B.dolosa)
[0204] 使用类似于前述实施例中的方法，对来自死于洋葱伯克霍尔德菌肺炎 和败血症的囊性纤维化患者的肺组织进行切片，分析PNAG表达。使用 TO-PRO-3染色肺细胞核。用抗洋葱伯克霍尔德菌小鼠血清随后用AF568 驴抗小鼠IgG显影。PNAG使用针对9GlcNH2-TT PNAG糖形的兔抗血清、 随后用AF488山羊抗兔IgG显影。阴性对照是正常兔血清用TO-PRO-3 染核。PNAG表达与洋葱伯克霍尔德菌细胞染色重叠(数据未显示).
[0205] 实施例7：眼中的白色念珠菌
[0206] 根据厂商说明书，将石蜡包埋的白色念珠菌感染小鼠眼组织切片用 EzDewax脱石蜡，室温下将载玻片在水中水合2小时，随后用 0.5％BSA/PBS处理2小时。样品进一步用与AF488(1:313稀释的1.63 mg/ml储存液，最终浓度5.2ug/ml)直接缀合的MAb F429(阴性对照)，或 与AF488(1:833稀释的4.35mg/ml储存液，最终浓度5.2ug/ml)直接缀合 的PNAG的MAb F598在含有0.5％BSA的PBS中温育过夜，4℃，含4uM Syto 83。样品用PBS洗涤，装配1.5μm盖玻片用于共焦分析。
[0207] 结果显示，使用MAb F598的核出现共焦染色，MAb F429则没有， 证实了白色念珠菌的体内PNAG表达(数据未显示)。
[0208] 实施例8:白色念珠菌角膜炎的小鼠模型中MAb F598对微生物 PNAG的效果。
[0209] 抓破麻醉的雄性C57Bl/6小鼠角膜(3X1mm)，随后接种约105-107CFU/ 眼的白色念珠菌SC5314(5μl体积)，诱导角膜炎。感染后4小时通过IP 注射和/或局部施用PNAG-特异性MAb(F598)或对照人IgG1MAb(F429)， 并在感染后24和32小时再次施用抗体。在感染后24和32小时检查小鼠， 如果在该时间点，对照显示无法康复的角膜损伤，将动物安乐死，测定CFU/ 眼。如果在36小时对照受损眼损伤不超过3+，继续感染直至48小时，随 后安乐死小鼠，由不具备小鼠治疗知识的观察者确定CFU/眼和角膜病变评 分。角膜病变评分如下：
[0210] 评分4：角膜穿孔
[0211] 评分3:前段覆盖密集不透明物
[0212] 评分2:瞳孔覆盖密集不透明物
[0213] 评分1:瞳孔部分覆盖弱不透明物
[0214] 评分0:与未感染的对侧眼相同。
[0215] 与用对照MAb F429处理的小鼠相比，通过IP注射和/或局部施用Mab F598治疗的白色念珠菌感染小鼠眼部细菌水平显著下降，角膜病变下降。 这些数据显示于图1-4。
[0216] PNAG的抗体在白色念珠菌角膜炎模型中具有治疗效果，表明PNAG 的体内表达，并可能通过疫苗和PNAG的免疫疗法预防或治疗真菌感染。
[0217] 实施例9：9GlcNH2-TT缀合疫苗的多克隆抗体对肺炎链球菌引起的 致死性肺炎的保护效果
[0218] 肺炎链球菌菌株D39在胰蛋白酶解酪蛋白大豆液体培养基(TSB)中生 长过夜，37℃，5％CO2。培养物用Todd-Hewitt培养基+1％葡萄糖稀释至 OD 650nm＝0.1，在37℃生长直到OD＝0.45(约2.5小时)。CBA/N小鼠在 异氟醚麻醉条件下眼眶后(RO)注射37.5μl热灭活的正常山羊血清或针对 稀释至50μL PBS的抗9GlcNH2-TT缀合物疫苗的山羊抗血清。小鼠被注 射24小时后，将细菌制品稀释至OD 650nm＝0.45(对于该试验，将83μL 稀释到917μL PBS中，获得3x 107CFU/mL。小鼠用氯胺酮/赛拉嗪麻醉(每 只小鼠250μL)，经鼻滴注2x 10μL剂量的细菌。监测小鼠7天。这些结 果显示于图5。
[0219] 此外，在FVB小鼠中经鼻感染血清群9V DSM 11865菌株4小时后给 予mAb F598，发现与抗生素头孢噻肟(在感染后1小时和4小时给药)在降 低小鼠肺中细菌载荷方面一样有效。
[0220] 实施例10：9GlcNH2-TT缀合疫苗的多克隆抗体对于酿脓链球菌(A 组链球菌)引起的致死性皮肤感染的保护效果
[0221] 小鼠为CD1(ICR)6-周龄雌性小鼠。组1(8只)对应于注射正常兔血清 (NRS)的小鼠，组2(8只)对应注射9GlcNH2-TT的小鼠。细菌为A组链球 菌(GAS)菌株950771，处于107CFU/ml的对数期。抗体为多克隆兔抗 -9GlcNH2-TT，用量为200μl/小鼠/剂，NRS用量为
200μl/小鼠/剂.
200μl/小鼠/剂.
[0222] 在第0天，将存储的GAS细菌细胞在血琼脂平板(BAP)上划线，在37℃ 孵育过夜，接种到1试管的含1％葡萄糖的Todd-Hewitt酵母提取物培养 基(THY+G)，在37℃静态培养。小鼠在感染前24小时IP注射。第一天， 小鼠在感染前4小时二次IP免疫。为制备感染接种物，使用10ml THY+G 和细菌悬液OD600nm＝0.05，置于37℃直到OD600nm＝0.15。将其稀释， 在-5 -6BAP上铺板测定CFU：将10μl 10 和10 稀释液平铺在BAP上(每个 稀释度2块板)。为制备感染接种物，将10ml THY+G培养物转移到15ml 锥形管中，将管在2000rpm离心20分钟，获得菌细胞团块。弃去上清， 将团块悬浮在1ml THY+G培养基中后转移至微量离心机中，在
8000rpm 离心2分钟。弃去上清，将菌细胞团块混悬于500μl注射用水中，随后转 移至1ml
27号注射器，放置在冰上。制备1:4稀释的50mg/ml戊巴比妥 和注射用水[最终浓度10μg/ml]，IP注射(每只0.3ml麻醉溶液)。右胁刮 毛并用乙醇擦拭，随后每只小鼠皮下注射0.1ml细菌悬液(即5x105CFU/ 小鼠)。为证实实际的接种量，稀释细菌悬液并铺板计数。注射的细菌悬液 浓度为1.7x106CFU/ml，表明每只小鼠注射了1.7x105CFU。观察小鼠，对 垂死小鼠实施安乐死。结果显示于图6。
8000rpm 离心2分钟。弃去上清，将菌细胞团块混悬于500μl注射用水中，随后转 移至1ml
27号注射器，放置在冰上。制备1:4稀释的50mg/ml戊巴比妥 和注射用水[最终浓度10μg/ml]，IP注射(每只0.3ml麻醉溶液)。右胁刮 毛并用乙醇擦拭，随后每只小鼠皮下注射0.1ml细菌悬液(即5x105CFU/ 小鼠)。为证实实际的接种量，稀释细菌悬液并铺板计数。注射的细菌悬液 浓度为1.7x106CFU/ml，表明每只小鼠注射了1.7x105CFU。观察小鼠，对 垂死小鼠实施安乐死。结果显示于图6。
[0223] 实施例11：针对9GlcNH2-TT缀合疫苗的兔抗体对于用B组脑膜炎 奈瑟球菌激发的2-3日龄幼鼠脑膜炎(脑中细菌)的保护作用
[0224] 小鼠为2-3日龄的CD-1新生小鼠。脑膜炎奈瑟球菌在血琼脂板上生 长过夜，将细菌细胞刮入PBS，调节在600nm的OD值，给予不同的激发 剂量。在感染前24小时注射NRS(50μl IP(NRS来自Accurate))或兔抗 9GlcNH2-TT缀合疫苗的血清(50μl IP(兔4.2,血4-3/4-4))。小鼠在24小时 后用50μl血清群B脑膜炎奈瑟球菌菌株B16B6按如下稀释度IP激发：
5x105、5x106或5x108。24小时后杀死小鼠，取脑，匀浆并平铺在巧克力 琼脂平板上进行细菌计数，结果如图7中所示。
5x105、5x106或5x108。24小时后杀死小鼠，取脑，匀浆并平铺在巧克力 琼脂平板上进行细菌计数，结果如图7中所示。
[0225] 实施例12：施用全长人IgG1MAb F598对易感传染性结肠炎的小鼠 的保护效果[0226] TRUC小鼠缺乏后天和先天免疫系统(Garrett等人，Cell 2007 131(1):33-45；Garrett等，Cell Host Microbe,2010 8(3):292-300)。这些小 鼠在8周龄的时候会自发出现传染性结肠炎。新生的TRUC小鼠在其出生 第一周时便IP给予50μg MAb F598或PBS或MAb F598或对照的人IgG1 MAb，每周三次，直到第8周处死。取出小鼠肠道，根据文献处理评价结 肠炎(Garrett等，Cell 2007 131(1):33-45；Garrett等，Cell Host Microbe, 2010 8(3):
292-300)。比较施用MAb F598或对照IgG1MAb的小鼠组的总 体的结肠炎病理学评分，结果示于图8和9。
292-300)。比较施用MAb F598或对照IgG1MAb的小鼠组的总 体的结肠炎病理学评分，结果示于图8和9。
[0227] 在其他实验中，第7天开始的每周mAb F598给药显著的减少了在8 周龄时总体的组织病理学损伤(由一名病理学家盲法测定)。
[0228] 当WT新生儿由TRUC母鼠交叉喂养时，其在8周形成自发的结肠炎， 但程度较TRUC后代为轻。为评价mAb F598对于未受免疫系统功能损伤 的WT小鼠结肠炎的治疗效果，由TRUC母鼠喂养的WT小鼠在4周龄 时开始治疗，每两周注射mAb F598或对照的人IgG1mAb F105，在8周 时测定结肠病理学。与对照组相比，mAb F598显著减少了接受治疗的小 鼠的总体病理学评分，单核细胞浸润和反应性增生显著下降，但损伤方面 并不显著，因为大多数对照的损伤评分为0(数据未显示)。
[0229] 实施例13：兔抗9GlcNH2-TT缀合疫苗的抗体对单核细胞增生利斯 特菌菌株10403S的保护效果
[0230] 2-3日龄新生CD1小鼠进行IP免疫24小时后给予50μl NRS(n＝15) 或兔抗9GlcNH2-TT缀合疫苗免疫血清(n＝15)。小鼠通过IP用单核细胞增 生利斯特菌激发(％X
10^8CFU，50ul)。在24小时内监测生存情况，通 过卡方和Yates校正分析总体生存率，P.001。结果示于图10。
10^8CFU，50ul)。在24小时内监测生存情况，通 过卡方和Yates校正分析总体生存率，P.001。结果示于图10。
[0231] 疟疾的有效疫苗可能需要多种疟原虫抗原，但作为确定PNAG是否为 多价疫苗的候选疫苗抗原成分的第一步，感染PNAG阳性的伯氏疟原虫 ANKA的C57BL/6小鼠用200μL PNAG的多克隆抗体或对照生理血清进 行IP注射治疗，每3天注射一次，从感染当天开始，直到感染后20天。PNAG的抗体显著延长了所治疗小鼠的存活期，预防了脑型疟疾的发展。 在第9天，用正常血清治疗的8只小鼠有5只死亡，为低水平寄生虫血症， 剩余3只在第30天死亡，为高水平寄生虫血症。对于用PNAG抗体治疗3 周的小鼠，仅有1只在第7天死于脑型疟疾，4只发生寄生虫血症水平升 高并在第33天死亡，该日期是最后一次注射抗体后13天。1只直到第22 天未检测到寄生虫血症，并在第40天死亡(末次注射抗体后20天)。2只小 鼠几乎未检测到寄生虫血症，在45天的试验周期内保持存活。根据最初计 划，抗体治疗在20天停止。如果进一步增加抗体治疗时间，可能会观察到 延长的存活周期。
[0232] 实施例14：PNAG抗体介导了对多种表达PNAG的病原体的调理素 或杀菌活性[0233] 肺炎链球菌和粪肠球菌调理素杀菌方案类似于Skurnik等人公开的金 黄色葡萄球菌方案(J Clin Invest.2010,120(9):3220-33)，除了使用HL60细 胞替代新鲜人PMN作为吞噬细胞来源。HL60细胞用0.8％DMF分化6 天，调节至1.3x106/ml。细菌在37℃生长过夜(不振荡)。将肺炎链球菌置 于5％CO2，THY+1％葡萄糖(THY+G)中。粪肠球菌在大气条件下生长。 试验结束时将细菌菌株铺板在TSB+血琼脂上。补体被目标菌株金黄色葡 萄球菌MN8吸收，其在CSB中振荡生长过夜。C':Invitrogen目录号 31203/S批次号510908698270补体血清，金黄色葡萄球菌MN8细胞吸收。 兔抗体针对以下两种抗原之一：
[0234] 1.与破伤风毒素缀合的脱乙酰化PNAG(dPNAG)(dPNAG-TT): Maira-Litran等人Infect Immun.2005,73(10):6752-62.勘误表：Infect Immun.2005,73(11):7789；和[0235] 2.与TT缀合的合成9GlcNH2寡糖:Gening等人，Infect Immun. 2010,78(2):764-72。
[0236] PNAG的人MAb MAb F598也进行了试验(Kelly-Quintos等人，Infect Immun.2006,74(5):2742-50)。
[0237] 结果示于图11-13.
[0238] A组链球菌调理素杀伤方案如下：使用A组链球菌(GAS)菌株771、 188，使用的MAb批号：F598AP1-01[19mg/ml]，新解冻x1。MAb F598 的对照：铜绿假单孢菌藻酸盐的MAb F429[1.0mg/ml]。金黄色葡萄球菌 MN8菌株来自冷冻的储备库，37℃接种到含10ml THB+G的50ml锥形 瓶中，松盖振荡。GAS 771和188在ON板的THY+G中生长，37℃ OD650＝0.05时接种，静置培养。金黄色葡萄球菌MN8Dica来自冷冻的储 备库，37℃接种到含10ml THB+G的CSB溶液的50ml锥形瓶中，松盖 振荡。试验结束时，GAS菌株铺板在含血的TSA上。补体被目标金黄色 葡萄球菌MN8Δica或GAS 771细菌吸收，其分别在THB+G振荡或 THY+G静态生长过夜。缓冲液：HBSS+0.1％明胶。C':补体血清，来自 Invitrogen目录号31203/S批号510908698270，由金黄色葡萄球菌MN8 Dica或GAS 771或188吸收。
[0239] 结果示于图14。
[0240] 白色念珠菌调理素杀伤方案如下:白色念珠菌在YPD培养基(酵母提 取物/蛋白胨/葡萄糖)上生长至OD 1.0，随后离心沉淀，再悬浮于 MEM+1％BSA，OD调节至0.4(650nm)，悬液随后1：10稀释。MAb F429 从杂交瘤上清用蛋白质A纯化，随后用pH 6.5PBS透析，储存在-20℃。 缓冲液：MEM+1％BSA。C':来自兔的补体血清，Sigma批号106K6029, 目录号S7764。补体由白色念珠菌细胞吸收。吞噬细胞从TRIMA颈捐献 者处获得。
[0241] 结果示于图15。
[0242] 脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌的杀菌方案如下：正常兔血清(NRS 取自-20°库，Accurate Chemical,批号2008)和兔抗9GlcNH2-TT缀合疫苗 抗体储存在-20℃，使用来自兔4.3和4.4的血清。血清在4℃平衡，保存 在4℃直到试验。将脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌在5％CO2、巧克力 琼脂上生长24-48小时，将细菌混悬在含有0.5％葡萄糖、9mM CaCl2和 4.9mM MgCl2·6H2O和1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS中(Lifeblood Medical, Freehold,NJ)＝PBS++,pH 7.4。将细菌混悬液从由巧克力琼脂悬液制备的OD650nm悬液在PBS++中稀释至1.5-2X 104CFU/ml。试验包括将80μl 血清稀释液和20μl奈瑟菌细胞混合，随后将混合物在37℃温育1小时。 将试管置于37℃，轻微振荡(可能的话采用轨道)。在Muller-Hinton培养 基中制备10μl 1:2和10-1的稀释液，随后在巧克力琼脂上铺板。将培养物 在5％CO2和37℃温育过夜。第二天计数菌落。结果示于图16和17。
[0243] 在具有或不具有特异性抗原抑制的兔抗9GlcNH2-TT血清存在下对脑 膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌的杀菌试验如下进行：
[0244] 缓冲液：缓冲液-PBS含有0.5％葡萄糖，9mM CaCl2和4.9mM MgCl2·6H2O和1％(w/v)牛血清白蛋白(Lifeblood Medical,Freehold,NJ)＝ PBS++，pH 7.4。
[0245] 使用的菌株和制剂：将菌株再悬浮于含有0.5％葡萄糖、9mM CaCl2和4.9mM MgCl2·6H2O和1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS(Lifeblood Medical, Freehold,NJ)＝PBS++,pH 7.4。将细菌混悬液从由巧克力琼脂悬液制备的 OD650nm悬液在PBS++中稀释至1.5-2X 104CFU/ml。
[0246] 抑制抗原：溶解至PBS++中，最终浓度为200ug/ml。
[0247] 使用的PNAG抗原：批号27。使用来自菌株2192，Pk 3(运行1)的藻 酸盐抗原。
[0248] 使用的抗血清：正常兔血清(NRS取自-20°库,Accurate Chemical)。兔 抗9GlcNH2-TT缀合疫苗的抗体存储在-20℃，使用来自兔4.3和4.4的血 清。
[0249] 试验：混合40μl血清源(根据直接杀菌试验中需要获得>80-90％杀伤 的最高稀释度进行稀释，除非在1:2血清稀释时最大杀伤下降，此时使用 1:2最终稀释度的血清)、40μl抗原和20μl奈瑟菌细胞(不含抗原的试管加 入80μl适当稀释的抗血清)。将试管置于37C，轻微振荡(可能的话采用 轨道)。将培养物在巧克力琼脂上铺板，5％CO2和37℃温育过夜。第二天 计数菌落。
[0250] 结果示于图18和19。
[0251] 等同方案
[0252] 认为前述说明足以使本领域技术人员实施本发明。此处提供的具体实 施例并不是限制本发明范围，因为实施例仅用于说明本发明的一个方面的 单个例证，其他功能等同的实施方案也包括在本发明的范围之内。对于本 领域技术人员而言，除了此处描述和显示的内容以外，根据前文描述进行 多种对本发明的修饰显而易见，且都落入所附权利要求的范围内。本发明 的优点和对象不是必须被本发明的每一实施方案所涵盖。
[0253] 除非另外说明，在本申请中引用的所有参考文献、专利以及专利出版 物均在此处完整引入作为参考。
[0254] 实施方案：
[0255] 1.一种方法，包括：
[0256] 向具有或有风险发生非ica/pga的PNAG阳性的病原体感染的个体施 用能诱导针对病原体的免疫应答的有效量的具有下式的分离多糖
[0257]
[0258] 其中n至少是5，R选自-NH-CO-CH3和-NH2，条件是低于50％的R 基团是-NH-CO-CH3。
[0259] 2.一种方法，包括向具有或有风险发生非ica/pga的PNAG阳性的病 原体感染的个体施用能诱导针对病原体的免疫应答的有效量的与载体缀合 的分离多糖，其中所述多糖具有下式结构
[0260]
[0261] 其中n是5或更多，R选自基团-NH-CO-CH3和-NH2，条件是低于50％ 的R基团是-NH-CO-CH3。
[0262] 3.实施方案2的方法，其中分离的多糖与载体通过接头缀合。
[0263] 4.实施方案2或3的方法，其中载体是肽载体。
[0264] 5.前述任一项实施方案的方法，其中低于30％、低于20％、低于10％ 或低于5％的R基团是–NH-CO-CH3。
[0265] 6.前述任一项实施方案的方法，其中没有R基团是–NH-CO-CH3。
[0266] 7.实施方案1-6任一项的方法，其中n至少是15、至少是20，至少是 50，至少是100，至少100，至少200，至少300，至少400或至少500。
[0267] 8.实施方案1-6任一项的方法，其中分离的多糖的分子量为100-500 kDa。
[0268] 9.实施方案1-8任一项的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病 原体是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性球菌。
[0269] 10.实施方案9的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏 阳性球菌是肺炎链球菌、A组链球菌、B组链球菌或肠球菌属。
[0270] 11.实施方案1-8任一项的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性 的病原体是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性杆菌。
[0271] 12.实施方案11的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的革兰 氏阳性杆菌是利斯特菌属、难辨梭菌、枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌或耻 垢分枝杆菌。
[0272] 13.实施方案1-8任一项的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性 的病原体是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性球菌或球杆菌。
[0273] 14.实施方案13的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的革兰 氏阴性球菌或球杆菌是脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、非典型流感嗜血 杆菌、螺杆菌属或弯曲杆菌属。
[0274] 15.实施方案1-8任一项的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性 的病原体是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性杆菌。
[0275] 16.实施方案15的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的革兰 氏阴性杆菌是脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、B.vulgatis、啮齿类柠檬酸杆菌、 霍乱弧菌、伤寒杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
[0276] 17.实施方案1-8任一项的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性 的病原体是非ica/pga的PNAG阳性的真菌。
[0277] 18.实施方案17的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的真菌 是白色念珠菌(酵母)、白色念珠菌(菌丝)、曲霉属、镰刀菌属或隐球菌属。
[0278] 19.实施方案1-8任一项的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性 的病原体是非ica/pga的PNAG阳性的寄生虫。
[0279] 20.实施方案19的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的寄生 虫是伯氏疟原虫或恶性疟原虫。
[0280] 21.任一前述实施方案的方法，其中所述个体是人。
[0281] 22.任一前述实施方案的方法，其中所述个体是灵长类、马、牛、猪、 山羊、绵羊、狗或猫。
[0282] 23.实施方案1-22任一项的方法，其中所述个体感染非ica/pga的 PNAG阳性的病原体。
[0283] 24.实施方案1-22任一项的方法，其中所述个体具有感染非ica/pga 的PNAG阳性的病原体的风险。
[0284] 25.任一前述实施方案的方法，其中分离的多糖与佐剂一起施用。
[0285] 26.任一前述实施方案的方法，其中分离的多糖进行全身性施用。
[0286] 27.任一前述实施方案的方法，其中分离的多糖经局部施用。
[0287] 28.药物组合物，其包含具有下式结构的分离的多糖
[0288]
[0289] 其中n至少是5，R选自基团-NH-CO-CH3和-NH2，条件是低于50％ 的R基团是-NH-CO-CH3，用于预防或治疗个体中非ica/pga的PNAG阳 性病原体的感染。
[0290] 29.药物组合物，其包含与载体缀合的分离多糖，其中所述多糖具有 下式结构[0291]
[0292] 其中n是5或更多，R选自基团-NH-CO-CH3和-NH2，条件是低于50％ 的R基团是-NH-CO-CH3，用于预防或治疗个体中非ica/pga的PNAG阳 性病原体的感染。
[0293] 30.实施方案29的药物组合物，其中分离的多糖与载体通过接头缀 合。
[0294] 31.实施方案29或30的药物组合物，其中所述载体是肽载体。
[0295] 32.实施方案28-31任一项的药物组合物，其中低于30％、低于20％、 低于10％或低于5％的R基团是-NH-CO-CH3。
[0296] 33.实施方案28-32任一项的药物组合物，其中没有R基团是 –NH-CO-CH3。
[0297] 34.实施方案28-33任一项的药物组合物，其中n至少是15、至少是 20，至少是50，至少是100，至少200，至少300，至少400或至少500。
[0298] 35.实施方案28-33任一项的药物组合物，其中分离的多糖的分子量 为100-500kDa。
[0299] 36.实施方案28-35任一项的药物组合物，其中所述非ica/pga的 PNAG阳性的病原体是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性球菌。
[0300] 37.实施方案36的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 革兰氏阳性球菌是肺炎链球菌、A组链球菌、B组链球菌或肠球菌属。
[0301] 38.实施方案28-35任一项的药物组合物，其中所述非ica/pga的 PNAG阳性的病原体是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性杆菌。
[0302] 39.实施方案38的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 革兰氏阳性杆菌是利斯特菌属、难辨梭菌、枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌 或耻垢分枝杆菌。
[0303] 40.实施方案28-35任一项的药物组合物，其中所述非ica/pga的 PNAG阳性的病原体是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性球菌或球杆 菌。
[0304] 41.实施方案40的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 革兰氏阴性球菌或球杆菌是脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、非典型流感 嗜血杆菌、螺杆菌属或弯曲杆菌属。
[0305] 42.实施方案28-35任一项的药物组合物，其中所述非ica/pga的 PNAG阳性的病原体是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性杆菌。
[0306] 43.实施方案42的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 革兰氏阴性杆菌是脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、B.vulgatis、啮齿类柠檬酸杆 菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
[0307] 44.实施方案28-35任一项的药物组合物，其中所述非ica/pga的 PNAG阳性的病原体是非ica/pga的PNAG阳性的真菌。
[0308] 45.实施方案44的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 真菌是白色念珠菌(酵母)、白色念珠菌(菌丝)、曲霉属、镰刀菌属或隐球菌 属。
[0309] 46.实施方案28-35任一项的药物组合物，其中所述非ica/pga的 PNAG阳性的病原体是非ica/pga的PNAG阳性的寄生虫。
[0310] 47.实施方案46的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 寄生虫是伯氏疟原虫或恶性疟原虫。
[0311] 48.实施方案28-47任一项的药物组合物，其中所述个体是人。
[0312] 49.任一前述实施方案的药物组合物，其中所述个体是灵长类、马、 牛、猪、山羊、绵羊、狗或猫。
[0313] 50.实施方案28-49任一项的药物组合物，其中所述个体感染非 ica/pga的PNAG阳性的病原体。
[0314] 51.实施方案28-49任一项的药物组合物，其中所述个体具有感染非 ica/pga的PNAG阳性的病原体的风险。
[0315] 52.实施方案28-51任一项的药物组合物，其中分离的多糖与佐剂一 起施用。
[0316] 53.实施方案28-52任一项的药物组合物，其中分离的多糖配制用于 全身性施用。
[0317] 54.实施方案28-52任一项的药物组合物，其中分离的多糖配制用于 局部施用。
[0318] 55.一种方法，包括
[0319] 向具有或有风险发生非ica/pga但PNAG阳性的病原体感染的个体 施用有效量的PNAG-特异性抗体或PNAG-特异性抗体片段。
[0320] 56.实施方案55的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体 是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性球菌。
[0321] 57.实施方案56的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏 阳性球菌是肺炎链球菌、A组链球菌、B组链球菌或肠球菌属。
[0322] 58.实施方案55的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体 是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性杆菌。
[0323] 59.实施方案58的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏 阳性杆菌是利斯特菌属、难辨梭菌、枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌或耻垢 分枝杆菌。
[0324] 60.实施方案55的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体 是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性球菌或球杆菌。
[0325] 61.实施方案60的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏 阴性球菌或球杆菌是脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、非典型流感嗜血杆 菌、螺杆菌属或弯曲杆菌属。
[0326] 62.实施方案55的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体 是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性杆菌。
[0327] 63.实施方案62的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏 阴性杆菌是脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、B.vulgatis、啮齿类柠檬酸杆菌、霍 乱弧菌、伤寒杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
[0328] 64.实施方案55的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体 是非ica/pga的PNAG阳性的真菌。
[0329] 65.实施方案64的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的真菌是 白色念珠菌(酵母)、白色念珠菌(菌丝)、曲霉属、镰刀菌属或隐球菌属。
[0330] 66.实施方案55的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的病原体 是非ica/pga的PNAG阳性的寄生虫。
[0331] 67.实施方案66的方法，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的寄生虫 是伯氏疟原虫或恶性疟原虫。
[0332] 68.实施方案55-67任一项的方法，其中所述个体是人。
[0333] 69.实施方案55-67任一项的方法，其中所述个体是灵长类、马、牛、 猪、山羊、绵羊、狗或猫。
[0334] 70.实施方案55-69任一项的方法，其中所述个体感染非ica/pga的 PNAG阳性的病原体。
[0335] 71.实施方案55-69任一项的方法，其中所述个体具有感染非ica/pga 的PNAG阳性的病原体的风险。
[0336] 72.实施方案55-71任一项的方法，其中所述抗体或抗体片段通过全 身施用。
[0337] 73.实施方案55-71任一项的方法，其中所述抗体或抗体片段通过局 部施用。
[0338] 74.实施方案55-73任一项的方法，其中所述抗体或抗体片段是 F598(ATCC PTA-5931)抗体或其片段。
[0339] 75.实施方案55-73任一项的方法，其中所述抗体或抗体片段是 F628(ATCC PTA-5932)抗体或其片段。
[0340] 76.实施方案55-73任一项的方法，其中所述抗体或抗体片段是 F630(ATCC PTA-5933)抗体或其片段。
[0341] 77.实施方案55-74任一项的方法，其中所述抗体或抗体片段与试剂 缀合。
[0342] 78.实施方案77的方法，其中所述试剂是细胞毒性剂。
[0343] 79.药物组合物，其包含PNAG特异性的抗体或PNAG特异性的抗 体片段，用于预防或治疗个体的非ica/pga的PNAG阳性的病原体的感染。
[0344] 80.实施方案79的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 病原体是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性球菌。
[0345] 81.实施方案80的药物组合物，所述非ica/pga的PNAG阳性的革兰 氏阳性球菌是肺炎链球菌、A组链球菌、B组链球菌或肠球菌属。
[0346] 82.实施方案79的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 病原体是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阳性杆菌。
[0347] 83.实施方案82的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 革兰氏阳性杆菌是利斯特菌属、难辨梭菌、枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌 或耻垢分枝杆菌。
[0348] 84.实施方案79的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 病原体是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性球菌或球杆菌。
[0349] 85.实施方案84的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 革兰氏阴性球菌或球杆菌是脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、非典型流感 嗜血杆菌、螺杆菌属或弯曲杆菌属。
[0350] 86.实施方案79的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 病原体是非ica/pga的PNAG阳性的革兰氏阴性杆菌。
[0351] 87.实施方案86的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 革兰氏阴性杆菌是脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、B.vulgatis、啮齿类柠檬酸杆 菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
[0352] 88.实施方案79的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 病原体是非ica/pga的PNAG阳性的真菌。
[0353] 89.实施方案88的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 真菌是白色念珠菌(酵母)、白色念珠菌(菌丝)、曲霉属、镰刀菌属或隐球菌 属。
[0354] 90.实施方案79的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 病原体是非ica/pga的PNAG阳性的寄生虫。
[0355] 91.实施方案90的药物组合物，其中所述非ica/pga的PNAG阳性的 寄生虫是伯氏疟原虫或恶性疟原虫。
[0356] 92.实施方案79-91任一项的药物组合物，其中所述个体是人。
[0357] 93.实施方案79-91任一项的药物组合物，其中所述个体是灵长类、 马、牛、猪、山羊、绵羊、狗或猫。
[0358] 94.实施方案79-93任一项的药物组合物，其中所述个体感染非 ica/pga的PNAG阳性的病原体。
[0359] 95.实施方案79-93任一项的药物组合物，其中所述个体具有感染非 ica/pga的PNAG阳性的病原体的风险。
[0360] 96.实施方案79-95任一项的药物组合物，其中所述抗体或抗体片段 配制用于全身施用。
[0361] 97.实施方案79-95任一项的药物组合物，其中所述抗体或抗体片段 配制用于局部施用。
[0362] 98.实施方案79-97任一项的药物组合物，其中所述抗体或抗体片段 是F598(ATCC PTA-5931)抗体或其片段。
[0363] 99.实施方案79-97任一项的药物组合物，其中所述抗体或抗体片段 是F628(ATCC PTA-5932)抗体或其片段。
[0364] 100.实施方案79-97任一项的药物组合物，其中所述抗体或抗体片段 是F630(ATCC PTA-5933)抗体或其片段。
[0365] 101.实施方案79-98任一项的药物组合物，其中所述抗体或抗体片段 与试剂缀合。
[0366] 102.实施方案101的药物组合物，其中所述试剂是细胞毒性剂。
[0367] 103.一种方法，包括：
[0368] 从浓缩的微生物细胞体制品中用乙醇沉淀多糖粗制品；
[0369] 用溶菌酶和溶葡萄球菌酶共同消化粗制多糖，随后依次用核酸酶和 蛋白酶K消化，形成消化的多糖制品；
[0370] 对所述消化的多糖制品进行尺寸分离；
[0371] 分离乙酰化的多糖组分；以及
[0372] 将乙酰化的多糖组分去乙酰化，产生具有低于50％的乙酸盐取代的 PNAG多糖，[0373] 其中微生物细胞体制品来自非-ica/pga的PNAG阳性的微生物。
[0374] 104.一种方法，包括：
[0375] 从微生物培养物制备不纯的多糖；
[0376] 将不纯的多糖与酸或碱温育，产生半纯的多糖制品；
[0377] 中和所述制品；
[0378] 将中和的制品在氢氟酸中温育；
[0379] 从制品中分离乙酰化的多糖；以及
[0380] 将乙酰化的多糖去乙酰化，产生具有低于50％的乙酸盐取代的 PNAG多糖，[0381] 其中所述微生物培养物是非-ica/pga的PNAG阳性的微生物培养物。
[0382] 105.一种方法，包括：
[0383] 从微生物培养物制备不纯的多糖；
[0384] 将不纯的多糖与酸或碱温育，产生半纯的多糖制品；
[0385] 中和所述制品；
[0386] 将中和的制品在氢氟酸中温育；以及
[0387] 从所述制品分离具有低于50％的乙酸盐取代的PNAG多糖，
[0388] 其中所述微生物培养物是非-ica/pga的PNAG阳性的微生物培养物。
[0389] 106.实施方案103-105任一项的方法，还包括将载体缀合到所述分离 的多糖上。
[0390] 107.实施方案106的方法，其中所述载体是肽载体。
[0391] 108.实施方案103或104的方法，其中所述乙酰化的多糖通过化学方 法去乙酰化。
[0392] 109.实施方案108的方法，其中所述乙酰化的多糖与碱溶液温育进行 去乙酰化。
[0393] 110.实施方案103或104的方法，其中所述乙酰化的多糖经酶促去乙 酰化。
[0394] 111.一种生产抗体的方法，包括:
[0395] 向个体施用有效量的分离自非ica/pga的PNAG阳性的病原体的 PNAG多糖和佐剂以产生抗体，以及
[0396] 从个体中分离抗体。
[0397] 112.实施方案111的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
[0398] 113.一种生产单克隆抗体的方法，包括：
[0399] 向个体施用有效量的分离自非ica/pga的PNAG阳性的病原体的 PNAG多糖和佐剂以产生抗体，
[0400] 从个体中收集脾细胞，
[0401] 将来自个体的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，和
[0402] 收集从融合的亚克隆中产生的抗体。
[0403] 114.实施方案111-113任一项的方法，其中PNAG多糖是低于50％ 乙酰化的。
[0404] 115.实施方案111-114任一项的方法，还包括分离抗体。
[0405] 116.实施方案111-115任一项的方法，其中所述个体是兔子。
[0406] 117.实施方案111-116任一项的方法，其中所述个体是人。
[0407] 118.检测非ica/pga的PNAG阳性的病原体的方法，包括：
[0408] 使疑似含有非ica/pga的PNAG阳性的病原体的样品与PNAG特异性 抗体或抗体片段接触，以及
[0409] 检测所述抗体或抗体片段与样品的结合，
[0410] 其中所述抗体或抗体片段的结合表明样品中存在所述非ica/pga的 PNAG阳性的病原体。
[0411] 119.实施方案118的方法，其中所述样品是葡萄球菌阴性的。
[0412] 120.实施方案118或119的方法，其中所述样品是来自个体的生物样 品。
[0413] 121.实施方案120的方法，其中所述生物样品是尿、血、脓、皮肤、 唾液、关节液、淋巴液或乳。
[0414] 122.实施方案118-121任一项的方法，其中抗体或抗体片段与可检测 的标记缀合。
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