甘露聚糖酶变体
阅读：1003发布：2020-05-11
专利汇可以提供甘露聚糖酶变体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本描述涉及甘露聚糖酶的变体、包含所述变体的组合物、其产生方法以及使用所述变体降解和修饰含有甘露聚糖的材料的方法。，下面是甘露聚糖酶变体专利的具体信息内容。
1.一种具有甘露聚糖酶活性和在283位的非糖基化氨基酸的甘露聚糖酶变体，其中所述变体选自
1) 与SEQ ID NO: 2的残基27-331具有至少85%序列同一性的多肽；
2) 由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高度严格条件下与以下核苷酸杂交：
a) SEQ ID NO: 1 (man7)的核苷酸79-993
b) a)的全长互补序列；和
3) 由多核苷酸编码的变体，所述多核苷酸与SEQ ID NO: 1或其基因组DNA序列具有至少95%序列同一性；
并且其中所述氨基酸编号对应于包含信号序列的SEQ ID NO: 2 (Man7)全长氨基酸序列的氨基酸编号。
2.权利要求1的变体，其中至少N283、T285或S285位，优选T285或S285位，最优选T285位，被当在能够进行N-连接的糖基化的宿主细胞中表达时阻止残基283的N-连接的糖基化的残基替换。
3. 权利要求1或2的任一项的变体，其中T285或S285位被替换为T或S以外的残基。
4.一种酶组合物，其包含权利要求1-3的任一项的甘露聚糖酶变体和
a. 至少一种防腐剂，例如选自有机酸、柠檬酸、抗坏血酸、苯甲酸及其盐和衍生物、苯甲酸钠、苯甲酸盐/酯、羟基苯甲酸盐/酯和衍生物、山梨酸、山梨酸钠、山梨酸盐/酯、盐例如氯化钠或氯化钾、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)或其组合；
b. 任选地，至少一种稳定剂，选自多元醇、丙二醇、聚乙二醇、己二醇、甘油、糖、糖醇、多糖、乳酸、硼酸、硼酸衍生物、芳族硼酸酯、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸衍生物、肽、表面活性剂或其组合；
c. 任选地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质，或其组合；和
d. 任选地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
5.权利要求4的酶组合物，其呈液体组合物或固体组合物的形式，例如溶液、分散体、糊剂、粉末、微粒、颗粒、包衣颗粒、片剂、饼、结晶、晶浆、凝胶或小球。
6.一种洗涤剂组合物，其包含权利要求1-3的任一项的甘露聚糖酶变体或权利要求4-5的酶组合物。
7.权利要求6的洗涤剂组合物，其呈液体洗涤剂或固体洗涤剂的形式，优选呈条、均质片剂、具有两层或更多层的片剂、具有一个或多个隔室的袋、普通或致密粉末、微粒、颗粒、糊剂、凝胶或普通、致密或浓缩液体的形式。
8.权利要求6或7的洗涤剂组合物，其还包含选自以下的一种或多种另外的酶：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、酯酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、DNA酶和/或过氧化物酶，优选选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。
9.一种包含遗传元件的重组宿主细胞，所述遗传元件允许至少产生包含权利要求1-3的甘露聚糖酶变体的重组多肽。
10.权利要求9的重组宿主细胞，其中宿主细胞选自：
真菌细胞，
来自子囊菌门(Division Ascomycota)，盘菌亚门(Subdivision Pezizomycotina)的丝状真菌细胞；优选来自粪壳菌纲(Class Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Subclass Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)和小囊菌目(Microascales)以及曲霉属(Aspergillus)、金孢属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属(Humicola)的成员；
更优选来自肉座菌科(Hypocreacea)、丛赤壳科(Nectriaceae)、麦角菌科
(Clavicipitaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma) (无性型肉座菌属(anamorph of Hypocrea))、镰孢霉属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、丛赤壳属(Nectria)、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属
(Metarhizium)、Villosiclava、蛇形虫草属(Ophiocordyceps)、头孢霉属
(Cephalosporium)和足放线病菌属(Scedosporium)；
更优选来自里氏木霉(Trichoderma reesei) (红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、柠檬绿木霉(T. citrinoviridae)、长枝木霉(T. longibrachiatum)、绿木霉(T. virens)、哈茨木霉(T. harzianum)、棘孢木霉(T. asperellum)、深绿木霉(T. atroviridae)、近里氏木霉(T. parareesei)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、禾本镰孢霉(F. gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F. pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F. venenatum)、藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、串珠赤霉(G. moniliformis)、玉蜀黍赤霉(G. zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(Nectria (Haematonectria) haematococca)、纸葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、S. chlorohalonata、黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)、黄绿绿僵菌(Metarhizium acridum)、金龟子绿僵菌(M. anisopliae)、稻绿核菌(Villosiclava virens)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(头孢霉菌)(Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum)和尖端足放线病菌(Scedosporium apiospermum)和黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、鲁克文金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)，
细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌例如枯草芽胞杆菌(B. Subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. Licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B.
amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)，革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli)，放线菌目例如链霉菌属(Streptomyces sp.)，和
酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia
pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，
最优选里氏木霉。
11.权利要求9-10的任一项的重组宿主细胞，其中重组多肽是融合蛋白，其还包含以下至少一种：
提供分泌信号序列的氨基酸序列；
便于纯化的氨基酸序列，例如亲和标记或His-标记；
促进生产的氨基酸序列，例如作为载体的氨基酸序列，如CBM；
具有酶活性的氨基酸序列；和
提供具有结合亲和力的融合蛋白的氨基酸序列，例如碳水化合物结合部分。
12. 一种生产具有甘露聚糖酶活性的重组多肽的方法，其包括：
a. 培养权利要求9-11的任一项的重组宿主细胞，其中
遗传元件包含至少一个控制序列，其控制重组宿主细胞中重组多肽的产生；
遗传元件任选地包含至少一个编码信号序列的序列，用于将重组多肽运出宿主细胞；
和
培养在允许重组多肽生产的条件下进行；和
b. 回收重组多肽。
13.一种降解或修饰含甘露聚糖的材料的方法，其包括用有效量的权利要求4-5的任一项的酶组合物或权利要求1-3的任一项的变体处理所述含甘露聚糖的材料。
14. 权利要求13的方法，其中含甘露聚糖的材料是基于植物的材料、纺织品、废水、污水、石油或其组合。
15. 一种动物饲料，其包含权利要求4-5的任一项的酶组合物或权利要求1-3的任一项的甘露聚糖酶变体，和至少一种植物来源的蛋白来源或含甘露聚糖的产物或副产物，和a. 任选地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚醣酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
b. 任选地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
16. 一种饲料添加剂，其包含权利要求4-5的任一项的酶组合物或权利要求1-3的任一项的甘露聚糖酶变体；和
a. 任选地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚醣酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
b. 任选地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
17.权利要求1-3的变体或权利要求4-5的酶组合物在石油钻井或水力压裂中的用途。
18.权利要求1-3的变体或权利要求4-5的酶组合物在加工咖啡提取物、果汁、菠萝汁或豆奶中的用途。
甘露聚糖酶变体
发明领域
[0001] 本发明涉及甘露聚糖酶的变体。这些变体在需要降解或修饰甘露聚糖的工业应用中是有用的，例如在洗衣和清洁应用方面，在饲料、食品、纸浆和纸张以及石油工业中。本发明还提供了有用的甘露聚糖酶、编码这些酶的多核苷酸、酶组合物及其生产和使用方法。
[0002] 背景甘露聚糖是在多种植物中发现的含有甘露糖的多糖。甘露聚糖在水环境中溶解性差，
其理化性质引起粘性分散。此外，甘露聚糖具有高的水结合能力。所有这些特性在若干行业(包括酿造、烘焙、动物营养以及洗衣和清洁应用)中造成问题。
其理化性质引起粘性分散。此外，甘露聚糖具有高的水结合能力。所有这些特性在若干行业(包括酿造、烘焙、动物营养以及洗衣和清洁应用)中造成问题。
[0003] 在基于植物的饮食中，存在不同的β-甘露聚糖，根据它们的量和性质，它们会损害营养物质的消化、微生物的定植和生长性能。甘露聚糖的酶降解降低了高水溶性甘露聚糖的消化粘度，并导致甘露寡糖的产生，而甘露寡糖可形成豆科植物中存在的不溶于水的线
性甘露聚糖。甘露聚糖酶提高了所有单胃动物的平均日增重、饲料效率、体重均匀度和存活率。
性甘露聚糖。甘露聚糖酶提高了所有单胃动物的平均日增重、饲料效率、体重均匀度和存活率。
[0004] 对于动物饲料应用(例如含谷类饮食的单胃动物饲料)，甘露聚糖是肠内容物粘度的促进因素，从而它对饲料消化率和动物生长速率有不利影响。对于反刍动物来说，甘露聚糖代表了纤维摄入的主要成分，并且甘露聚糖的较完全消化将有助于较高的饲料转化效
率。
率。
[0005] 对于洗衣和清洁应用，包含甘露聚糖酶的酶组合物可用于降解甘露聚糖。然而，提供在变化的储存和使用条件下是稳定的，同时仍然显示出良好的甘露聚糖降解活性的甘露聚糖酶是困难的。
[0007] 本发明的一个目的是提供甘露聚糖酶的变体，其在应用于不同的工业过程中时具有改进的稳定性并表现出甘露聚糖酶活性，以及用于甘露聚糖降解或修饰的酶组合物。
[0008] 概述根据第一方面，提供一种具有甘露聚糖酶活性和在283位的非糖基化氨基酸的甘露聚
糖酶变体，其中变体选自
1) 与SEQ ID NO: 2的残基27-331具有至少85%序列同一性的多肽；
2) 由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高度严格条件下与以下核苷酸杂交：
a) SEQ ID NO: 1 (man7)的核苷酸79-993
b) a)的全长互补序列；和
3) 由多核苷酸编码的变体，所述多核苷酸与SEQ ID NO: 1或其基因组DNA序列具有至
少95%序列同一性；
且其中氨基酸编号对应于包含信号序列的SEQ ID NO: 2 (Man7)全长氨基酸序列的氨
基酸编号。
糖酶变体，其中变体选自
1) 与SEQ ID NO: 2的残基27-331具有至少85%序列同一性的多肽；
2) 由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高度严格条件下与以下核苷酸杂交：
a) SEQ ID NO: 1 (man7)的核苷酸79-993
b) a)的全长互补序列；和
3) 由多核苷酸编码的变体，所述多核苷酸与SEQ ID NO: 1或其基因组DNA序列具有至
少95%序列同一性；
且其中氨基酸编号对应于包含信号序列的SEQ ID NO: 2 (Man7)全长氨基酸序列的氨
基酸编号。
[0009] 本发明的甘露聚糖酶变体在具有良好的稳定性和甘露聚糖酶活性方面是有利的。与野生型甘露聚糖酶相比，该变体具有不同的糖基化模式，当在宿主细胞中产生时，其可提供改进的比活性、稳定性和产率。因此，本发明的甘露聚糖酶变体可提供改进的产量和更好的使用性能。该变体在洗涤剂中和在通常用于其中利用甘露聚糖降解的应用(例如在洗衣
洗涤剂中)的温度下的稳定性特别好。
洗涤剂中)的温度下的稳定性特别好。
[0010] 根据本发明的第二方面，提供一种酶组合物，其包含第一方面的甘露聚糖酶变体和
a. 至少一种防腐剂，例如选自有机酸、柠檬酸、抗坏血酸、苯甲酸及其盐和衍生物、苯
甲酸钠、苯甲酸盐/酯、羟基苯甲酸盐/酯和衍生物、山梨酸、山梨酸钠、山梨酸盐/酯、盐如氯化钠或氯化钾、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)或其组合；
b. 任选地，至少一种稳定剂，选自多元醇、丙二醇、聚乙二醇、己二醇、甘油、糖、糖醇、多糖、乳酸、硼酸、硼酸衍生物、芳族硼酸酯、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸衍生物、肽、表面活性剂或其组合；
c. 任选地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质，或其组合；和
d. 任选地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
a. 至少一种防腐剂，例如选自有机酸、柠檬酸、抗坏血酸、苯甲酸及其盐和衍生物、苯
甲酸钠、苯甲酸盐/酯、羟基苯甲酸盐/酯和衍生物、山梨酸、山梨酸钠、山梨酸盐/酯、盐如氯化钠或氯化钾、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)或其组合；
b. 任选地，至少一种稳定剂，选自多元醇、丙二醇、聚乙二醇、己二醇、甘油、糖、糖醇、多糖、乳酸、硼酸、硼酸衍生物、芳族硼酸酯、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸衍生物、肽、表面活性剂或其组合；
c. 任选地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质，或其组合；和
d. 任选地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
[0011] 如实施例所示，根据本发明的酶组合物中包含的变体具有允许在重组宿主细胞中产生并使它们可用于工业应用的酶组合物的结构和性质。酶组合物特别适合洗涤剂制剂，
因为甘露聚糖酶变体在洗衣和洗涤应用中用来降解甘露聚糖时具有良好的稳定性、洗涤性
能和比活性。
因为甘露聚糖酶变体在洗衣和洗涤应用中用来降解甘露聚糖时具有良好的稳定性、洗涤性
能和比活性。
[0012] 根据第三方面，提供一种包含第一方面的甘露聚糖酶变体或第二方面的酶组合物的洗涤剂组合物。
[0013] 本发明的洗涤剂组合物的优点在于，它在去除含甘露聚糖的污点方面是有效且经济的。
[0014] 根据另一个方面，提供本发明的酶组合物或本发明的甘露聚糖酶变体在洗涤剂中的用途和使用方法。
[0015] 根据第四方面，提供一种包含遗传元件的重组宿主细胞，所述遗传元件允许生产至少一种包含第一方面的甘露聚糖酶变体的重组多肽。
[0016] 根据第五方面，提供一种生产具有甘露聚糖酶活性的重组多肽的方法，该方法包括：
a. 培养第四方面的重组宿主细胞，其中
遗传元件包含至少一个控制序列，其控制重组宿主细胞中重组多肽的产生；
遗传元件任选地包含至少一个编码信号序列的序列，用于将重组多肽运出宿主细胞；
和
培养是在允许生产重组多肽的条件下进行的；和
b. 回收重组多肽。
a. 培养第四方面的重组宿主细胞，其中
遗传元件包含至少一个控制序列，其控制重组宿主细胞中重组多肽的产生；
遗传元件任选地包含至少一个编码信号序列的序列，用于将重组多肽运出宿主细胞；
和
培养是在允许生产重组多肽的条件下进行的；和
b. 回收重组多肽。
[0017] 该方法提供一种生产包含甘露聚糖酶变体的重组多肽的有效方法。由于甘露聚糖酶变体是在重组宿主细胞中产生的，因此提供了一种生产系统，该系统可以以期望的方式
进行优化、定制和控制。由该方法生产的甘露聚糖酶变体可能与天然甘露聚糖酶在结构和
功能水平上不同。由该方法生产的甘露聚糖酶变体具有糖基化模式，或其他翻译后修饰，与天然甘露聚糖酶(例如具有类似氨基酸序列的甘露聚糖酶)相比，或与具有相同氨基酸序列
但在另一宿主细胞中生产的甘露聚糖酶相比，其导致结构和/或功能的差异。特别地，当变体在能够N-连接糖基化的宿主细胞中产生时，变体有利地具有非糖基化残基Asn283，从而
改进了性质。由本发明方法生产的甘露聚糖酶变体可原样使用或配制成选定的制剂。
进行优化、定制和控制。由该方法生产的甘露聚糖酶变体可能与天然甘露聚糖酶在结构和
功能水平上不同。由该方法生产的甘露聚糖酶变体具有糖基化模式，或其他翻译后修饰，与天然甘露聚糖酶(例如具有类似氨基酸序列的甘露聚糖酶)相比，或与具有相同氨基酸序列
但在另一宿主细胞中生产的甘露聚糖酶相比，其导致结构和/或功能的差异。特别地，当变体在能够N-连接糖基化的宿主细胞中产生时，变体有利地具有非糖基化残基Asn283，从而
改进了性质。由本发明方法生产的甘露聚糖酶变体可原样使用或配制成选定的制剂。
[0018] 根据另一个方面，提供一种包含具有甘露聚糖酶活性并可通过使用本发明的宿主细胞获得的重组多肽的酶制剂。
[0019] 酶制剂或酶组合物还可包含选自以下的其它酶：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质，以及选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、漂白剂、介质、抗腐蚀剂、促净剂、抗再沉积剂、光学增白剂、染料、颜料、香料、腐蚀剂、磨料和防腐剂的合适的添加剂。
[0020] 根据第六方面，提供一种降解或修饰含甘露聚糖的材料的方法，其包括用有效量的本发明的酶组合物或本发明的甘露聚糖酶变体处理所述含甘露聚糖的材料。
[0021] 根据第七方面，提供一种动物饲料，其包含本发明的酶组合物或本发明的甘露聚糖酶变体，和至少一种植物来源的蛋白来源或含甘露聚糖的产物或副产物，和
a. 任选地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚醣酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
b. 任选地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
a. 任选地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚醣酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
b. 任选地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
[0022] 根据第八方面，提供一种饲料添加剂，其包含本发明的酶组合物或本发明的甘露聚糖酶变体；和
a. 任选地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚醣酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
b. 任选地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
a. 任选地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚醣酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
b. 任选地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
[0023] 与无所述变体的饲料相比，所述饲料和饲料添加剂提高了饲料的营养价值。本发明的酶组合物包含甘露聚糖酶变体，其具有改进的稳定性。本发明的酶组合物和本发明的
变体降解饲料中存在的甘露聚糖，从而使其更易被动物消化。特别是对于含有大豆粉的饲
料，由酶消化产生的甘露寡糖对肠道微生物具有有益的影响，因此对动物的性能具有有益
的影响。通过加入木聚糖酶来消化基于玉米大豆的饮食中存在的阿拉伯木聚糖，可以增强
甘露聚糖酶变体的作用。本发明的变体还可用于改变湿饲料的流变性质。
变体降解饲料中存在的甘露聚糖，从而使其更易被动物消化。特别是对于含有大豆粉的饲
料，由酶消化产生的甘露寡糖对肠道微生物具有有益的影响，因此对动物的性能具有有益
的影响。通过加入木聚糖酶来消化基于玉米大豆的饮食中存在的阿拉伯木聚糖，可以增强
甘露聚糖酶变体的作用。本发明的变体还可用于改变湿饲料的流变性质。
[0024] 在一个实施方案中，饲料可包含动物蛋白，例如肉粉或骨粉。
[0025] 根据另一个方面，提供了本发明的动物饲料或本发明的饲料添加剂在以下方面的用途和使用方法：
a. 喂食动物；
b. 改进动物的增重。
a. 喂食动物；
b. 改进动物的增重。
[0026] 在一个实施方案中，动物是单胃动物或反刍动物。在另一个实施方案中，所述动物是肉鸡、蛋鸡、猪、火鸡或水产养殖生物例如鱼。在另一个实施方案中，所述动物是反刍动物。
[0027] 根据第九方面，提供本发明的变体或本发明的酶组合物在石油钻井或水力压裂中的用途和使用方法。
[0028] 本发明的酶组合物和本发明的变体在改变石油钻井流体和水力压裂流体的流变性质和改进石油回收方面是有利的。
[0029] 根据第十方面，提供了本发明的变体或本发明的酶组合物在加工咖啡提取物、果汁、菠萝汁或豆奶中的用途和使用方法。
[0030] 使用本发明的变体和本发明的酶组合物在加工咖啡提取物方面是有利的，因为它降低了咖啡提取物的粘度。
[0031] 使用本发明的变体和本发明的酶组合物在加工和制造果汁方面是有利的，因为它降低了粘度并提高了过滤速率、稳定性并有助于提取水果成分。
[0033] 在另一个方面，提供了一种编码本发明的甘露聚糖酶变体的核酸分子。
[0034] 在另一个方面，提供了一种包含本发明的核酸分子的载体。
[0035] 在另一个方面，提供了本发明的甘露聚糖酶变体的功能片段，和编码它的多核苷酸。
[0036] 在另一个方面，本文公开的与编码本发明的甘露聚糖酶的多核苷酸序列有关的序列信息可用作鉴定其它同源甘露聚糖酶的工具。例如，聚合酶链反应(PCR)可用于从多种生物来源扩增编码其它同源甘露聚糖酶的序列。此外，基因组挖掘方法可用于从基因组数据
库鉴定编码其它同源甘露聚糖酶的序列。
库鉴定编码其它同源甘露聚糖酶的序列。
[0037] 在一个实施方案中，本发明的产物、方法和用途是在工业规模上实施的。
[0039] 图2显示了与野生型Man7甘露聚糖酶(在木霉属(Trichoderma)中产生)相比，变体(TBH5、TBH6、TBH9、TBH10、TB11和TBH17)的相对比活性。
[0040] 图3A-B描述在40℃、16°dH、60min、pH约8.3和作为每洗液中的活性单位(MNU)给予的酶下，在4.4 g/l的市售重型液体洗涤剂A的存在下，变体和野生型Man7 (在木霉属中产生)作为亮度增加(3个污点的ΔL*合计)的污点去除性能。
[0041] 图3A显示了变体TBH1、TBH2、TBH3、TBH4、TBH5、TBH6、TBH7、TBH8、TBH9和野生型。
[0042] 图3B显示了变体TBH6、TBH10、TBH11和野生型。
[0043] 图4A-B描述了在40℃、16°dH、60 min、pH约10和作为每洗液中的活性单位(MNU)给予的酶下，在3.8 g/l的市售彩色洗涤剂粉末的存在下，变体和野生型Man7 (在木霉属中产生)作为亮度增加(3个污点的ΔL*合计)的污点去除性能。
[0044] 图4A显示了变体TBH1、TBH2、TBH3、TBH4、TBH5、TBH6、TBH7、TBH8、TBH9和野生型Man7。
[0045] 图4B显示了变体TBH6、TBH10、TBH11和野生型Man7。
[0046] 图5描述了在40℃、16°dH、60min、pH约9.5和作为每洗液中的活性单位(MNU)给予的酶下，在4.2g/L的市售漂白洗涤剂粉末的存在下，变体TBH1、TBH2、TBH3、TBH4、TBH5、TBH6、TBH7、TBH8、TBH9和野生型Man7 (在木霉属中产生)作为亮度增加(3个污点的ΔL*合计)的污点去除性能。
[0047] 图6显示了涉及使用本发明的甘露聚糖酶变体的速溶咖啡生产的流程图。
[0048] 保藏根据关于国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约，进行以下菌株保藏：
大肠杆菌菌株RF12379 (包括质粒pALK4434)于2017年3月2日保藏在Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32425。
大肠杆菌菌株RF12379 (包括质粒pALK4434)于2017年3月2日保藏在Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32425。
[0049] 大肠杆菌菌株RF12380 (包括质粒pALK4435)于2017年3月2日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32426。
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32426。
[0050] 大肠杆菌菌株RF12381 (包括质粒pALK4436)于2017年3月2日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32427。
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32427。
[0051] 大肠杆菌菌株RF12382 (包括质粒pALK4437)于2017年3月2日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32428。
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32428。
[0052] 大肠杆菌菌株RF12383 (包括质粒pALK4438)于2017年3月2日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32429。
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32429。
[0053] 大肠杆菌菌株RF12384 (包括质粒pALK4439)于2017年3月2日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32430。
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32430。
[0054] 大肠杆菌菌株RF12385 (包括质粒pALK4440)于2017年3月2日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32431。
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32431。
[0055] 大肠杆菌菌株RF12386 (包括质粒pALK4441)于2017年3月2日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32432。
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32432。
[0056] 大肠杆菌菌株RF12387 (包括质粒pALK4442)于2017年3月2日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32433。
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32433。
[0057] 大肠杆菌菌株RF12456 (包括质粒pALK4432)于2017年5月18日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32518。
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32518。
[0058] 大肠杆菌菌株RF12457 (包括质粒pALK4433)于2017年5月18日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32519。
b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配保藏号DSM 32519。
[0059] 序列表SEQ ID NO: 1 man7的DNA序列
SEQ ID NO: 2 Man7的全长氨基酸序列
SEQ ID NO: 3 Man7的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 4 Man7的核心氨基酸序列，无CBM
SEQ ID NO: 5 变体tbh1的合成基因序列
SEQ ID NO: 6 变体TBH1的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 7 变体tbh2的合成基因序列
SEQ ID NO: 8 变体TBH2的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 9 变体tbh3的合成基因序列
SEQ ID NO: 10 变体TBH3的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 11 变体tbh4的合成基因序列
SEQ ID NO: 12 变体TBH4的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 13 变体tbh5的合成基因序列
SEQ ID NO: 14 变体TBH5的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 15 变体tbh6的合成基因序列
SEQ ID NO: 16 变体TBH6的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 17 变体tbh7的合成基因序列
SEQ ID NO: 18 变体TBH7的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 19 变体tbh8的合成基因序列
SEQ ID NO: 20 变体TBH8的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 21 变体tbh9的合成基因序列
SEQ ID NO: 22 变体TBH9的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 23 变体tbh10的合成基因序列
SEQ ID NO: 24 变体TBH10的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 25 变体tbh11的合成基因序列
SEQ ID NO: 26 变体TBH11的推导的氨基酸序列(成熟)
详细描述
甘露聚糖指由甘露糖骨架组成的多糖，该骨架通过β-1,4-连键与半乳糖(其通过α-1,
6-连键连接到骨架)的侧链连接在一起。甘露聚糖包括基于植物的材料，如瓜尔胶和刺槐豆胶。葡甘露聚糖是具有差不过规律交替的β-1,4连接的甘露糖和葡萄糖的骨架的多糖，半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖是具有α-1,6连接的半乳糖侧分支的甘露聚糖和葡甘露聚糖。
SEQ ID NO: 2 Man7的全长氨基酸序列
SEQ ID NO: 3 Man7的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 4 Man7的核心氨基酸序列，无CBM
SEQ ID NO: 5 变体tbh1的合成基因序列
SEQ ID NO: 6 变体TBH1的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 7 变体tbh2的合成基因序列
SEQ ID NO: 8 变体TBH2的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 9 变体tbh3的合成基因序列
SEQ ID NO: 10 变体TBH3的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 11 变体tbh4的合成基因序列
SEQ ID NO: 12 变体TBH4的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 13 变体tbh5的合成基因序列
SEQ ID NO: 14 变体TBH5的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 15 变体tbh6的合成基因序列
SEQ ID NO: 16 变体TBH6的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 17 变体tbh7的合成基因序列
SEQ ID NO: 18 变体TBH7的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 19 变体tbh8的合成基因序列
SEQ ID NO: 20 变体TBH8的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 21 变体tbh9的合成基因序列
SEQ ID NO: 22 变体TBH9的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 23 变体tbh10的合成基因序列
SEQ ID NO: 24 变体TBH10的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 25 变体tbh11的合成基因序列
SEQ ID NO: 26 变体TBH11的推导的氨基酸序列(成熟)
详细描述
甘露聚糖指由甘露糖骨架组成的多糖，该骨架通过β-1,4-连键与半乳糖(其通过α-1,
6-连键连接到骨架)的侧链连接在一起。甘露聚糖包括基于植物的材料，如瓜尔胶和刺槐豆胶。葡甘露聚糖是具有差不过规律交替的β-1,4连接的甘露糖和葡萄糖的骨架的多糖，半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖是具有α-1,6连接的半乳糖侧分支的甘露聚糖和葡甘露聚糖。
[0060] 术语"功能片段"或"有效片段"意指SEQ ID NO: 2 (Man7)变体的片段或部分，其保留大约相同的酶功能或作用。
[0061] 术语"甘露聚糖酶变体"和“甘露聚糖酶的变体”意指通过定点或随机诱变、插入、替换、缺失、重组和/或任何其它蛋白工程方法(导致甘露聚糖酶的氨基酸序列与亲本甘露聚糖酶(即野生型甘露聚糖酶)不同)获得的任何甘露聚糖酶分子。根据本公开内容的术语"
野生型甘露聚糖酶"、"野生型酶"、"野生型"或“wt”描述了具有自然界中发现的氨基酸序列或其片段的甘露聚糖酶。
野生型甘露聚糖酶"、"野生型酶"、"野生型"或“wt”描述了具有自然界中发现的氨基酸序列或其片段的甘露聚糖酶。
[0062] 术语"催化活性"或"活性"定量地描述了给定底物在规定的反应条件下的转化。术语"残留活性"被定义为酶在某一组条件下的催化活性与在一组不同的条件下的催化活性
的比率。因此，残留活性ai由ai=vi/v0给出，其中v表示催化活性的任何量度，而ai *100是按百分比的相对活性。术语"比活性"定量地描述了在规定的反应条件下每酶量的催化活性。
的比率。因此，残留活性ai由ai=vi/v0给出，其中v表示催化活性的任何量度，而ai *100是按百分比的相对活性。术语"比活性"定量地描述了在规定的反应条件下每酶量的催化活性。
[0064] 如本文所用的，术语"甘露聚糖酶"或"半乳甘露聚糖酶"表示一种甘露聚糖酶，其根据本领域已知的，被定义为甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶，并具有备选名称β-甘露聚糖酶和内切-1,4-甘露聚糖酶，和催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷键的水解。根据酶命名，将甘露聚糖酶分类为EC 3.2.1.78。
[0065] 如本文所用的，“分离的”意指一种在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性例子包括(1) 任何非天然存在的物质，(2) 任何物质，包括任何酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅因子，其至少部分地从自然界中与之相关的一个或多个或所有天然存在的成分中移除；(3) 相对于自然界中发现的物质，由人工修饰的任何物质，例如变体；或(4) 通过增加或减少物质相对于与之天然关联的其它组分的量(例如，在宿主细胞中重
组生产；编码该物质的基因的一个或多个拷贝；以及将替代启动子用于与编码该物质的基
因自然相关的启动子)而修饰的任何物质。在一个实施方案中，分离本发明的多肽、酶、变体、多核苷酸、宿主细胞或组合物。
组生产；编码该物质的基因的一个或多个拷贝；以及将替代启动子用于与编码该物质的基
因自然相关的启动子)而修饰的任何物质。在一个实施方案中，分离本发明的多肽、酶、变体、多核苷酸、宿主细胞或组合物。
[0066] 如本文所用的，术语“包含(comprising)”包括”包括”、”含有”和”包含(comprehending)"的更广泛含义，以及较窄的表达"由...组成"和"仅由...组成"。
[0067] 如本文所用的，"变体"意指由一个或多个核苷酸/氨基酸插入、替换或缺失的序列或序列片段(核苷酸或氨基酸)，或经化学修饰的序列或序列片段。在一个实施方案中，术语变体也包括重组甘露聚糖酶。
[0068] 如本文所用的，"保守氨基酸替换"是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸替换。本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。在一个实施方案
中，本描述中的保守氨基酸是指以下分组内的氨基酸：疏水的(F W Y H K M I L V A G
C)；芳族的(F W Y H)；脂族的(I L V)；极性的(W Y H K R E D C S T N Q)；荷电的(H K R E D)；带正电荷的(H K R)；带负电荷的(E D)；小的(V C A G S P T N D)；微小的(A G S)。
因此，当氨基酸被同一组内的氨基酸替换时，发生保守的替换。
中，本描述中的保守氨基酸是指以下分组内的氨基酸：疏水的(F W Y H K M I L V A G
C)；芳族的(F W Y H)；脂族的(I L V)；极性的(W Y H K R E D C S T N Q)；荷电的(H K R E D)；带正电荷的(H K R)；带负电荷的(E D)；小的(V C A G S P T N D)；微小的(A G S)。
因此，当氨基酸被同一组内的氨基酸替换时，发生保守的替换。
[0069] 在一个实施方案中，替换是用至少一种氨基酸残基的替换。在进一步的实施方案中，至少氨基酸是Ala。
[0070] 如本文所用的，“非-保守氨基酸替换”是其中氨基酸被如以上所定义的不同组中的氨基酸替换的氨基酸替换。非-保守替换可能导致一个氨基酸转变为另一个具有不同生
化性质(如电荷、疏水性和/或大小)的氨基酸。在一个实施方案中，非-保守替换改变变体的至少一种特性，例如稳定性、糖基化模式、折叠、结构、活性或亲和性。
化性质(如电荷、疏水性和/或大小)的氨基酸。在一个实施方案中，非-保守替换改变变体的至少一种特性，例如稳定性、糖基化模式、折叠、结构、活性或亲和性。
[0071] 在真核生物中发生N-连接糖基化过程，但很少发生在细菌中。聚糖残基与蛋白质的连接要求识别共有序列。N-连接的聚糖几乎总是连接至作为Asn-X-Ser/Thr共有序列的
一部分存在的天冬酰胺(Asn)侧链，其中X是除脯氨酸(Pro)外的任何氨基酸。本发明人已经发现，在结构上接近甘露聚糖酶的活性位点的非-糖基化Asn侧链对于获得具有良好的甘露
聚糖降解性能的变体是重要的。不受任何理论的束缚，聚糖是极性分子，当连接至Asn时，它们位于蛋白表面上，导致糖基化的Asn和其附近的结构变化。可以使用在Asn-Xaa-Thr(Ser)共有序列中的Asn或Ser/Thr残基的定点诱变，以在本发明的第一方面的变体中防止所需的
N-连接糖基化位点的糖基化。
一部分存在的天冬酰胺(Asn)侧链，其中X是除脯氨酸(Pro)外的任何氨基酸。本发明人已经发现，在结构上接近甘露聚糖酶的活性位点的非-糖基化Asn侧链对于获得具有良好的甘露
聚糖降解性能的变体是重要的。不受任何理论的束缚，聚糖是极性分子，当连接至Asn时，它们位于蛋白表面上，导致糖基化的Asn和其附近的结构变化。可以使用在Asn-Xaa-Thr(Ser)共有序列中的Asn或Ser/Thr残基的定点诱变，以在本发明的第一方面的变体中防止所需的
N-连接糖基化位点的糖基化。
[0072] 在一个实施方案中，变体具有氨基酸被残基的替换，当在能够进行N-连接的糖基化的宿主细胞中表达时，该残基阻止残基283的N-连接的糖基化。
[0073] 在一个实施方案中，本发明的变体包含至少一种Asn-X-Ser/Thr共有序列。
[0074] 在一个实施方案中，本发明的变体包含至少一种Asn-X-Ser/Thr共有序列的位置X的Pro残基。
[0075] 在一个实施方案中，替换是保守的或者非-保守的替换。
[0076] 如本文所用的，"肽"和"多肽"是包括多个连续聚合的氨基酸残基的氨基酸序列。为了本发明的目的，肽是包含至多20个氨基酸残基的分子，多肽包含20个以上的氨基酸残
基。肽或多肽可包括修饰的氨基酸残基、未被密码子编码的天然存在的氨基酸残基和非天
然存在的氨基酸残基。如本文所用的，"蛋白"可指任何大小的肽或多肽。蛋白可以是酶、蛋白、抗体、膜蛋白、肽激素、调节剂或任何其它蛋白。
基。肽或多肽可包括修饰的氨基酸残基、未被密码子编码的天然存在的氨基酸残基和非天
然存在的氨基酸残基。如本文所用的，"蛋白"可指任何大小的肽或多肽。蛋白可以是酶、蛋白、抗体、膜蛋白、肽激素、调节剂或任何其它蛋白。
[0078] 如本文所用的，在多聚核酸的上下文中的“修饰”、“修饰的”和类似的术语指的是在多核苷酸的编码或非编码区中的修饰，例如调控序列、5’非翻译区、3’非翻译区、上调遗传元件、下调遗传元件、增强子、抑制基因、启动子、外显子或内含子区。在一些实施方案中，修饰可以是仅结构的，对多核苷酸的生物效应、作用或功能没有影响。在其它实施方案中，修饰是结构的修饰，其提供了多核苷酸的生物学效应、作用或功能的变化。这样的修饰可以增强、抑制或改变多核苷酸的生物学功能。
[0079] 如本文所用的，“同一性”意指两个比对序列之间氨基酸残基的精确匹配相对于两个序列中存在的残基的位置数的百分比。当一个序列具有在另一个序列中没有对应残基的残基时，比对程序允许在比对中的空位，并且该位置不被计算在同一性计算的分母中。同一性是用EMBL-EBI网站(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)上的成对序列比对工
具EMBOSS Needle确定的值。
具EMBOSS Needle确定的值。
[0080] 如本文所用的，低严格条件意味着对于长度至少100个核苷酸的探针，对应于遵循标准的DNA印迹程序，于55℃，在5× SSC、0.1 % N-月桂酰肌氨酸、0.02 % SDS、1%阻断试剂(Roche 11 096 176 001)中，在预杂交和杂交下杂交12-24小时的条件。于55℃，使用2X
SSC, 0.1% SDS将载体材料最终洗涤2-3次，每次15分钟。
SSC, 0.1% SDS将载体材料最终洗涤2-3次，每次15分钟。
[0081] 如本文所用的，高度严格条件意味着对于长度至少100个核苷酸的探针，对应于遵循标准的DNA印迹程序，于65℃，在5× SSC、0.1% N-月桂酰肌氨酸、0.02% SDS、1%阻断试剂(Roche 11 096 176 001)中，在预杂交和杂交下杂交12-24小时的条件。于65℃，使用0.1X SSC, 0.1% SDS将载体材料最终洗涤2-3次，每次15分钟。
[0082] 如本文所用的，"宿主细胞"意指易于用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导、交配、杂交等的任何细胞类型。术语"宿主细胞"包括由于复制过程中发生的突变而不相同的任何后代。宿主细胞的非-选择性例子是真菌细胞，来自子囊菌门
(Division Ascomycota)，盘菌亚门(Subdivision Pezizomycotina)的丝状真菌细胞；优选来自粪壳菌纲(Class Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Subclass Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)和小囊菌目(Microascales)以及曲霉属(Aspergillus)、金孢属
(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属(Humicola)的成员；更优选来自肉座菌科(Hypocreacea)、丛赤壳科(Nectriaceae)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma) (无性型肉座菌属(anamorph of
Hypocrea))、镰孢霉属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、丛赤壳属(Nectria)、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属(Metarhizium)、Villosiclava、蛇形虫草属(Ophiocordyceps)、头孢霉属(Cephalosporium)和足放线病菌属
(Scedosporium)；更优选来自里氏木霉(Trichoderma reesei) (红褐肉座菌(Hypocrea
jecorina))、柠檬绿木霉(T. citrinoviridae)、长枝木霉(T. longibrachiatum)、绿木霉(T. virens)、哈茨木霉(T. harzianum)、棘孢木霉(T. asperellum)、深绿木霉(T.
atroviridae)、近里氏木霉(T. parareesei)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、禾本镰孢霉(F. gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F. pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F.
venenatum)、藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、串珠赤霉(G. moniliformis)、玉蜀黍赤霉(G. zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(Nectria (Haematonectria) haematococca)、纸葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、S. chlorohalonata、黑麦麦角菌(Claviceps
purpurea)、黄绿绿僵菌(Metarhizium acridum)、金龟子绿僵菌(M. anisopliae)、稻绿核菌(Villosiclava virens)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(头孢霉菌)
(Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum)和尖端足放线病菌(Scedosporium
apiospermum)和黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉
(Aspergillus oryzae)、鲁克文金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉
(Myceliophthora thermophila)、特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)，最优选里氏木霉。宿主细胞的非限制性实例是细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌(例如枯草芽胞杆菌(B. Subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. Licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B. pumilus))、革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli))、放线菌目(例如链霉菌属
(Streptomyces sp.))和酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵
母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))。
(Division Ascomycota)，盘菌亚门(Subdivision Pezizomycotina)的丝状真菌细胞；优选来自粪壳菌纲(Class Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Subclass Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)和小囊菌目(Microascales)以及曲霉属(Aspergillus)、金孢属
(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属(Humicola)的成员；更优选来自肉座菌科(Hypocreacea)、丛赤壳科(Nectriaceae)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma) (无性型肉座菌属(anamorph of
Hypocrea))、镰孢霉属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、丛赤壳属(Nectria)、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属(Metarhizium)、Villosiclava、蛇形虫草属(Ophiocordyceps)、头孢霉属(Cephalosporium)和足放线病菌属
(Scedosporium)；更优选来自里氏木霉(Trichoderma reesei) (红褐肉座菌(Hypocrea
jecorina))、柠檬绿木霉(T. citrinoviridae)、长枝木霉(T. longibrachiatum)、绿木霉(T. virens)、哈茨木霉(T. harzianum)、棘孢木霉(T. asperellum)、深绿木霉(T.
atroviridae)、近里氏木霉(T. parareesei)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、禾本镰孢霉(F. gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F. pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F.
venenatum)、藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、串珠赤霉(G. moniliformis)、玉蜀黍赤霉(G. zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(Nectria (Haematonectria) haematococca)、纸葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、S. chlorohalonata、黑麦麦角菌(Claviceps
purpurea)、黄绿绿僵菌(Metarhizium acridum)、金龟子绿僵菌(M. anisopliae)、稻绿核菌(Villosiclava virens)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(头孢霉菌)
(Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum)和尖端足放线病菌(Scedosporium
apiospermum)和黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉
(Aspergillus oryzae)、鲁克文金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉
(Myceliophthora thermophila)、特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)，最优选里氏木霉。宿主细胞的非限制性实例是细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌(例如枯草芽胞杆菌(B. Subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. Licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B. pumilus))、革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli))、放线菌目(例如链霉菌属
(Streptomyces sp.))和酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵
母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))。
[0083] 在一个实施方案中，宿主细胞是真菌细胞，优选丝状真菌细胞，例如木霉属或里氏木霉。在一个实施方案中，宿主细胞是细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌细胞，例如枯草芽胞杆菌(B. Subtilis)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌。
[0084] 在一个实施方案中，宿主细胞是能够N-连接糖基化的。
[0085] "重组细胞"或"重组宿主细胞"指一种细胞或宿主细胞，其已被遗传修饰或改变以包含一个核酸序列，该核酸序列不是所述细胞或宿主细胞所固有的。遗传修饰可以包括在
宿主细胞基因组中整合多核苷酸。在宿主细胞中多核苷酸也可以是外源性的。在一个实施
方案中，本发明的宿主细胞是重组宿主细胞。
宿主细胞基因组中整合多核苷酸。在宿主细胞中多核苷酸也可以是外源性的。在一个实施
方案中，本发明的宿主细胞是重组宿主细胞。
[0087] 术语"表达载体"表示线性或圆形的DNA分子，其包含编码感兴趣的多肽的片段，所述多肽可操作地连接到提供其转录的附加片段。这样的附加片段可包括启动子和终止子序
列，并且可任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个可选择标记、增强子、多腺苷酸化信号、载体等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或可含有两者的元件。表达载体可以是方便地进行重组DNA程序的任何表达载体，并且载体的选择通常取决于要导入载体的宿主
细胞。因此，载体可以是自主复制的载体，即以染色体外实体的形式存在的载体，其复制与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可以是在引入宿主细胞时，整合到宿主细胞基因组中并与其已整合进入的染色体一起复制的载体。在一个实施方案中，本发明的载体是表达
载体。
列，并且可任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个可选择标记、增强子、多腺苷酸化信号、载体等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或可含有两者的元件。表达载体可以是方便地进行重组DNA程序的任何表达载体，并且载体的选择通常取决于要导入载体的宿主
细胞。因此，载体可以是自主复制的载体，即以染色体外实体的形式存在的载体，其复制与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可以是在引入宿主细胞时，整合到宿主细胞基因组中并与其已整合进入的染色体一起复制的载体。在一个实施方案中，本发明的载体是表达
载体。
[0088] 本文结合生产多肽或蛋白质使用的术语"重组生产的"或"重组地生产的"是根据本领域的标准定义来定义的。
[0089] 本文所用的与特定微生物源相关的术语"得自"和“可获得的”意指多核苷酸由特定来源表达(同源表达)或由已插入来自来源的基因的细胞表达(异源表达)。
[0090] 术语"酶组合物"意指传统的酶发酵产物，可能从单一物种的微生物中分离和纯化，这样的制剂通常包含多种不同的酶活性；或者单成分酶的混合物，优选通过使用常规的重组技术从细菌或真菌物种衍生的酶，所述酶已经发酵并可能单独分离和纯化，并且所述
酶可以源自不同物种，优选真菌或细菌物种或微生物的发酵产物，所述微生物起宿主细胞
的作用，用于生产重组甘露聚糖酶，但所述微生物同时产生其它酶。
酶可以源自不同物种，优选真菌或细菌物种或微生物的发酵产物，所述微生物起宿主细胞
的作用，用于生产重组甘露聚糖酶，但所述微生物同时产生其它酶。
[0091] 术语"可操作地连接"，在指DNA片段时，表示这些片段的排列使它们为其预期的目的协调发挥功能，例如启动子中的转录启动，并通过编码片段继续到终止子。
[0092] 术语"启动子"表示含有DNA序列的部分基因，这些序列提供了RNA聚合酶的结合和转录的启动。启动子序列通常存在于基因的5'非编码区，但并不总是如此。
[0093] 术语"分泌信号序列"或“信号序列”表示编码多肽("分泌肽")的DNA序列，所述多肽作为较大多肽的组分，引导较大多肽通过产生它的宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列
可以是天然的，或者它可以用来自另一来源的分泌信号序列或载体序列替代。取决于宿主
细胞，在通过分泌途径转移时，较大的肽可被切割以除去分泌肽。
可以是天然的，或者它可以用来自另一来源的分泌信号序列或载体序列替代。取决于宿主
细胞，在通过分泌途径转移时，较大的肽可被切割以除去分泌肽。
[0094] 术语"核心区"或“催化结构域”表示酶的结构域，其可能已经或可能没有被修饰或改变，但至少已保留其原始活性的一部分。根据本发明的甘露聚糖酶的核心区对应于与Man7 SEQ ID NO: 2的氨基酸27-331对齐的氨基酸。
[0095] 所谓术语"接头"或"间隔区"指的是至少包含两个氨基酸的多肽，其可存在于多结构域蛋白(例如，包含酶核心和结合结构域(如碳水化合物结合模块(CBM))的酶或任何其它
酶杂合体)的结构域之间，或者作为融合多肽(例如包含两种核心酶的融合蛋白)产生的两
种蛋白或多肽之间。例如，通过将编码酶核心的DNA序列、编码所述接头的DNA序列和编码
CBM的DNA序列依次融合至一个开放阅读框中并表达该构建体，提供具有CBM的酶核心的融
合蛋白。
酶杂合体)的结构域之间，或者作为融合多肽(例如包含两种核心酶的融合蛋白)产生的两
种蛋白或多肽之间。例如，通过将编码酶核心的DNA序列、编码所述接头的DNA序列和编码
CBM的DNA序列依次融合至一个开放阅读框中并表达该构建体，提供具有CBM的酶核心的融
合蛋白。
[0096] 有效量意指在选定的应用中足以降解甘露糖的量。
[0097] 以下缩写被用于表示氨基酸：A Ala 丙氨酸
C Cys 半胱氨酸
D Asp 天冬氨酸
E Glu 谷氨酸
F Phe 苯丙氨酸
G Gly 甘氨酸
H His 组氨酸
I Ile 异亮氨酸
K Lys 赖氨酸
L Leu 亮氨酸
M Met 甲硫氨酸
N Asn 天冬酰胺
P Pro 脯氨酸
Q Gln 谷氨酰胺
R Arg精氨酸
S Ser 丝氨酸
T Thr苏氨酸
V Val 缬氨酸
W Trp色氨酸
Y Tyr 酪氨酸
使用以下命名来描述替换：蛋白支架中的氨基酸残基；位置；替换的氨基酸残基。根据
这个命名，例如，在第20位用丝氨酸残基替换甘氨酸残基，表示为Ser20Gly或S20G。
C Cys 半胱氨酸
D Asp 天冬氨酸
E Glu 谷氨酸
F Phe 苯丙氨酸
G Gly 甘氨酸
H His 组氨酸
I Ile 异亮氨酸
K Lys 赖氨酸
L Leu 亮氨酸
M Met 甲硫氨酸
N Asn 天冬酰胺
P Pro 脯氨酸
Q Gln 谷氨酰胺
R Arg精氨酸
S Ser 丝氨酸
T Thr苏氨酸
V Val 缬氨酸
W Trp色氨酸
Y Tyr 酪氨酸
使用以下命名来描述替换：蛋白支架中的氨基酸残基；位置；替换的氨基酸残基。根据
这个命名，例如，在第20位用丝氨酸残基替换甘氨酸残基，表示为Ser20Gly或S20G。
[0098] 术语"洗涤剂组合物"和“洗涤剂”，除非另有说明，包括固体、颗粒或粉末形式的通用或重型清洗剂，特别是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊剂形式的通用洗涤剂，特别是所谓的重型液体(HDL)类型；液体细织物洗涤剂；手动洗碗剂或轻型洗碗剂，特别是高发泡型的那些；机器洗碗剂，包括各种家用和机构使用的片剂、颗粒、液体和冲洗-助剂类型；液体清洁和消毒剂、汽车或地毯清洗剂、浴室清洁剂；金属清洁剂；以及清洗助剂例如漂白添加剂和"染色棒(stain-stick)"或预处理类型。术语"洗涤剂”、"洗涤剂组合物"和"洗涤剂制剂"用于指混合物，其被打算用于清洗被污染物体的清洗介质。在一些实施方案中，该术语被用于指清洗织物和/或服装(例如，"洗衣洗涤剂")。在备选的实施方案中，该术语指其它洗涤剂，例如用于清洗碗碟、餐具等的洗涤剂(例如，"洗碗洗涤剂")。本发明并不打算限于任何特定的洗涤剂制剂或组合物。除了根据本发明的甘露聚糖酶外，该术语意欲涵盖洗涤剂，其可含有例如表面活性剂、促净剂、螯合剂(chelators)或螯合剂(chelating agents)、漂白系统或漂白成分、聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、肥皂泡抑制剂、染料、香料、鞣质抑制剂、光学增白剂、杀细菌剂、杀真菌剂、土壤悬浮剂、防腐剂、助水溶剂、织物染色剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、土壤释放聚合物、抗再沉积剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填料、泡沫调节剂、香料、颜料、sod抑制剂、溶剂和用于液体洗涤剂的结构剂、结构弹性剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、蓝化剂和荧光染料、抗氧化剂和增溶剂。
[0099] 术语“纺织品”意指任何纺织材料，包括纱线、纱线中间物、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料，以及任何其它纺织材料、由这些材料制成的织物和由织物制成的产品(如服装、亚麻布和其它物品)。纺织品或织物可以是针织物、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毡、纱线和毛巾布的形式。纺织品可以是基于纤维素的，如天然纤维素材料，包括棉花、胡麻/亚麻、黄麻、苎麻、剑麻或椰棕或人造纤维素材料(如原自木浆)，包括粘胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(tricell)、lyocell或其混合物。纺织品或织物也可以是基于非-纤维素的，例如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛(rabit)和丝绸或合成聚合物，如尼龙、芳纶、聚酯、丙烯酸、聚丙烯(polypropylen)和spandex/elastane，或其混合物，以及基于纤维素和基于非-纤维素的纤维的混合物。混合物的例子是棉和/或人造丝/粘胶与一种或多种伴随材料如羊毛、合成纤维(如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳纶纤维)和含纤维素纤维(如人造丝/粘胶、苎麻、胡麻/亚麻、黄麻、醋酸纤维素纤维、lyocell)的混合物。织物可以是传统的可洗衣服，例如染色的家用衣服。当使用术语织物或服装时，意图也包括更广泛的术语纺织品。
[0100] 术语“稳定性”包括储存稳定性和在使用过程中，例如在洗涤过程(洗涤稳定性)中的稳定性，并且反映了作为时间函数的根据本发明的甘露聚糖酶的稳定性，例如，当甘露聚糖酶保持在溶液中，特别是在洗涤剂溶液中时，保留了多少活性。稳定性受多种因素的影响，例如pH、温度、洗涤剂组成，例如蛋白酶、稳定剂、促净剂、表面活性剂等。甘露聚糖酶稳定性可使用如在实施例中描述的“活性测定”来测量。
[0101] 如本文所用的“甘露聚糖酶活性”指多肽的甘露聚糖降解活性。如本文所用的降解或修饰意味着甘露糖单元被甘露聚糖酶从甘露聚糖多糖中水解。根据本发明的多肽的甘露聚糖降解活性可以根据本领域已知的标准试验程序测试。实施例4提供了测定甘露聚糖酶
活性的标准方法的例子。
活性的标准方法的例子。
[0102] 在一个实施方案中，本发明的变体至少具有N283、T285或S285位；优选T285或S285；最优选T285位被残基替换，当在能够进行N-连接的糖基化的宿主细胞中表达时，该残基将阻止残基283的N-连接的糖基化。
[0103] 在一个实施方案中，本发明的变体在对应于以下位置的位置至少还有一个替换：229、283、285、300、340、400、419、433或446；或
S229、N283、T285、S285、N300、N340、S400、N419、S433或N446。
S229、N283、T285、S285、N300、N340、S400、N419、S433或N446。
[0104] 在一个实施方案中，替换包括在所述位置替换为选自以下的氨基酸：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。优选地，所述替换是替换为并非Ser或Thr的氨基酸。
[0105] 在一个实施方案中，变体包含在位置284和/或286的P残基。在上述位置的任一个或两个中替换为P残基可引起变体中的结构改变，其防止N-连接的糖基化。
[0106] 在本发明的变体的一个实施方案中，T285或S285位被替换为T或S以外的残基。
[0107] 在本发明的变体的一个实施方案中，T285或S285位被替换为丙氨酸。
[0108] 在一个实施方案中，替换是保守的或非保守的替换，当在能够糖基化(优选N-连接的糖基化)的宿主细胞中产生时，导致变体的糖基化改变。
[0109] 在一个实施方案中，提供了一种甘露聚糖酶变体，其包含在能够N-连接的糖基化的宿主细胞中产生时与SEQ ID NO: 2的残基27-331具有85%序列同一性的多肽和在位置
283的非-糖基化Asn残基。
283的非-糖基化Asn残基。
[0110] 在一个实施方案中，本发明的变体包含至少一个额外的糖基化N位点，其中对应于N283的位置未被糖基化。这样一种变体可通过在能够进行N-糖基化的宿主细胞中产生变体
而获得，导致其它N-糖基化位点的至少部分糖基化，但其中N283的N-糖基化被抑制。
而获得，导致其它N-糖基化位点的至少部分糖基化，但其中N283的N-糖基化被抑制。
[0111] 在进一步的实施方案中，本发明的变体不包含任何糖基化N位点。这样的变体可通过在不能进行N-糖基化的宿主细胞中产生变体而获得，或通过在能够进行N-糖基化的宿主
细胞中产生变体而获得，但其中变体被改造以使其它N-糖基化位点不是糖基化的，导致变
体的糖基化被抑制。
细胞中产生变体而获得，但其中变体被改造以使其它N-糖基化位点不是糖基化的，导致变
体的糖基化被抑制。
[0112] 在一个实施方案中，变体的预测分子量在50000和51000之间，优选在50750和50970之间，不包括信号序列。
[0113] 在一个实施方案中，变体的预测pI在4.5和4.8之间，优选在4.6和4.75之间。
[0114] 变体的pI或分子量的预测可如在表3中所述进行。
[0115] 在本发明的进一步的实施方案中，变体具有甘露聚糖酶活性。在一个实施方案中，与野生型甘露聚糖酶相比，当在真核宿主细胞中生产时，变体具有增加的比活性。本发明的酶组合物中包含的甘露聚糖酶适用于各种化学环境(优选洗涤剂组合物)中对含甘露聚糖材料的降解和修饰。
[0116] 在第一方面的一个实施方案中，本发明的酶组合物以液体组合物或固体组合物的形式存在，例如溶液、分散体、糊剂、粉末、微粒、颗粒、包衣颗粒、片剂、饼、结晶、晶浆、凝胶或小球。
[0117] 本发明还涉及本发明的酶组合物的不同用途，例如用于降解甘露聚糖和用于洗衣过程。
[0118] 本发明的酶组合物还可用于清洗剂或助洗剂，其在洗涤过程中或洗涤前添加在洗涤剂上，并且其以例如液体、凝胶、粉末、颗粒或片剂的形式存在。酶组合物和洗涤剂组分也可以浸渍在载体(例如纺织品)中。
[0119] 在本发明的一个实施方案中，酶组合物还包含一种或多种额外的酶，其选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、酯酶、植酸酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、DNA酶、漆酶和/或过氧化物酶，优选选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。
[0120] 包含甘露聚糖酶和额外的酶的本发明酶组合物在提供协同作用方面是有利的。当包含甘露聚糖酶的本发明的酶组合物被用于洗涤剂时，例如当洗涤污点时，这样的额外的
酶是合乎需要的。在洗涤剂中与甘露聚糖酶一起作用的特别有利的协同酶是淀粉酶、蛋白
酶和纤维素酶，或其组合，例如包含甘露聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶的组合物。
酶是合乎需要的。在洗涤剂中与甘露聚糖酶一起作用的特别有利的协同酶是淀粉酶、蛋白
酶和纤维素酶，或其组合，例如包含甘露聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶的组合物。
[0121] 在一个实施方案中，本发明的洗涤剂组合物以条、均质片剂、具有两层或更多层的片剂、具有一个或多个隔室的袋、常规或致密粉末、条、片剂、微粒、颗粒、液体、颗粒、糊剂、凝胶或常规、致密或浓缩的液体的形式存在。在一个实施方案中，洗涤剂组合物可以是洗衣洗涤剂组合物，优选液体或固体洗衣洗涤剂组合物。
[0122] 在本发明的一个实施方案中，本发明的洗涤剂组合物还包含一种或多种额外的酶，其选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、酯酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、DNA酶和/或过氧化物酶，优选地选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。
[0123] 本发明还涉及在此公开的酶组合物或洗涤剂组合物降解甘露聚糖的用途和使用方法。
[0124] 在进一步的实施方案中，本发明涉及在此公开的酶组合物或洗涤剂组合物在洗衣过程中的用途和使用方法。
[0125] 本发明还涉及一种从表面去除污点的方法，包括用如在此公开的酶组合物或洗涤剂组合物接触表面。
[0126] 本发明还涉及一种降解甘露聚糖的方法，该方法包括将如在此公开的酶组合物或洗涤剂组合物应用于甘露聚糖，优选地其中甘露聚糖在纺织品的表面上，或者至少部分嵌
入在纺织品中。
入在纺织品中。
[0127] 通常，所选择的酶的性质应当与所选择的洗涤剂相容(即，pH-最佳，与其它酶和非酶成分的相容等)，且酶应以有效量存在。
[0128] 例如，用于固体衣物洗涤剂的组合物可包含占组合物的0.000001%-5%，例如0.000005-2%，例如0.00001%-1%，例如0.00001%-0.1%重量的酶蛋白。
[0129] 例如，用于洗衣液体的组合物可包含占组合物的0.000001%-3%，例如0.000005%-1%，例如0.00001%-0.1%重量的酶蛋白。
[0130] 例如，用于自动洗碗机的组合物可包含占组合物的0.000001%-5%，例如0.000005%-2%，例如0.00001%-1%，例如0.00001%-0.1%重量的酶蛋白。
[0131] 本发明的第二方面的额外组分a-d为本发明的酶组合物提供改进的特性。酶组合物与额外的组分相容并提高了酶组合物在各种用途中的适用性。
[0132] 盐，例如氯化钠和硫酸钠作为干燥助剂发挥功能。
[0133] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶变体包含核心区。
[0134] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶变体包含CBM。
[0135] 提供在高于环境温度的温度下保持活性的甘露聚糖酶对于在这样的条件下需要甘露聚糖降解的应用是有利的。此外，根据本发明的甘露聚糖酶在碱性条件下可具有良好
的稳定性和活性，这有利于洗涤剂的使用和生物质处理。
的稳定性和活性，这有利于洗涤剂的使用和生物质处理。
[0136] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶变体具有与SEQ ID NO:2至少或约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。
[0137] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶变体具有与SEQ ID NO:2至少90%序列同一性的氨基酸序列。
[0138] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶具有与SEQ ID NO:2没有100%同一性的氨基酸序列。
[0139] 在一个实施方案中，遗传元件包括至少一个控制序列，其控制重组宿主细胞中重组多肽的产生。
[0140] 在第三方面的一个实施方案中，宿主细胞选自：真菌细胞，
来自子囊菌门(Division Ascomycota)，盘菌亚门(Subdivision Pezizomycotina)的
丝状真菌细胞；优选来自粪壳菌纲(Class Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Subclass
Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)和小囊菌目(Microascales)以及曲霉属
(Aspergillus)、金孢属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属
(Humicola)的成员；
更优选来自肉座菌科(Hypocreacea)、丛赤壳科(Nectriaceae)、麦角菌科
(Clavicipitaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma) (无性型肉座菌
属(anamorph of Hypocrea))、镰孢霉属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、丛赤壳属
(Nectria)、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属
(Metarhizium)、Villosiclava、蛇形虫草属(Ophiocordyceps)、头孢霉属
(Cephalosporium)和足放线病菌属(Scedosporium)；
更优选来自里氏木霉(Trichoderma reesei) (红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、柠
檬绿木霉(T. citrinoviridae)、长枝木霉(T. longibrachiatum)、绿木霉(T. virens)、哈茨木霉(T. harzianum)、棘孢木霉(T. asperellum)、深绿木霉(T. atroviridae)、近里氏木霉(T. parareesei)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、禾本镰孢霉(F. gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F. pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F. venenatum)、藤仓赤霉
(Gibberella fujikuroi)、串珠赤霉(G. moniliformis)、玉蜀黍赤霉(G. zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(Nectria (Haematonectria) haematococca)、纸葡萄穗霉
(Stachybotrys chartarum)、S. chlorohalonata、黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)、黄绿绿僵菌(Metarhizium acridum)、金龟子绿僵菌(M. anisopliae)、稻绿核菌
(Villosiclava virens)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(头孢霉菌)
(Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum)和尖端足放线病菌(Scedosporium
apiospermum)和黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉
(Aspergillus oryzae)、鲁克文金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉
(Myceliophthora thermophila)、特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)，
细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌例如枯草芽胞杆菌(B. Subtilis)、地衣芽孢杆菌
(B. Licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B.
amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)，革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌
(Escherichia coli)，放线菌目例如链霉菌属(Streptomyces sp.)，和
酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia
pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，
最优选里氏木霉。
来自子囊菌门(Division Ascomycota)，盘菌亚门(Subdivision Pezizomycotina)的
丝状真菌细胞；优选来自粪壳菌纲(Class Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Subclass
Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)和小囊菌目(Microascales)以及曲霉属
(Aspergillus)、金孢属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属
(Humicola)的成员；
更优选来自肉座菌科(Hypocreacea)、丛赤壳科(Nectriaceae)、麦角菌科
(Clavicipitaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma) (无性型肉座菌
属(anamorph of Hypocrea))、镰孢霉属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、丛赤壳属
(Nectria)、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属
(Metarhizium)、Villosiclava、蛇形虫草属(Ophiocordyceps)、头孢霉属
(Cephalosporium)和足放线病菌属(Scedosporium)；
更优选来自里氏木霉(Trichoderma reesei) (红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、柠
檬绿木霉(T. citrinoviridae)、长枝木霉(T. longibrachiatum)、绿木霉(T. virens)、哈茨木霉(T. harzianum)、棘孢木霉(T. asperellum)、深绿木霉(T. atroviridae)、近里氏木霉(T. parareesei)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、禾本镰孢霉(F. gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F. pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F. venenatum)、藤仓赤霉
(Gibberella fujikuroi)、串珠赤霉(G. moniliformis)、玉蜀黍赤霉(G. zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(Nectria (Haematonectria) haematococca)、纸葡萄穗霉
(Stachybotrys chartarum)、S. chlorohalonata、黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)、黄绿绿僵菌(Metarhizium acridum)、金龟子绿僵菌(M. anisopliae)、稻绿核菌
(Villosiclava virens)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(头孢霉菌)
(Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum)和尖端足放线病菌(Scedosporium
apiospermum)和黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉
(Aspergillus oryzae)、鲁克文金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉
(Myceliophthora thermophila)、特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)，
细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌例如枯草芽胞杆菌(B. Subtilis)、地衣芽孢杆菌
(B. Licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B.
amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)，革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌
(Escherichia coli)，放线菌目例如链霉菌属(Streptomyces sp.)，和
酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia
pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，
最优选里氏木霉。
[0141] 在一个实施方案中，宿主细胞是能够N-连接糖基化的真核宿主细胞。在一个优选的实施方案中，宿主细胞是里氏木霉。
[0142] 重组宿主细胞可被用来生产甘露聚糖酶变体和携带编码它的多核苷酸。重组宿主细胞在制备具有不同性质的甘露聚糖酶变体中也是有用的。例如，可以选择宿主细胞，其提供有利于稳定性或活性的翻译后修饰，或其有利于在宿主细胞中产生的甘露聚糖酶变体的
后处理和配制。
后处理和配制。
[0143] 在一个实施方案中，本发明的酶组合物包含第二方面的重组宿主细胞。
[0144] 在一个实施方案中，本发明的甘露聚糖酶变体是重组多肽，其是融合蛋白。
[0145] 在一个实施方案中，本发明的重组多肽是融合蛋白，其还包含以下的至少一种：提供分泌信号序列的氨基酸序列；
便于纯化的氨基酸序列，例如亲和标记、His-标记；
促进生产的氨基酸序列，例如作为载体的氨基酸序列，如CBM；
具有酶活性的氨基酸序列；和
提供具有结合亲和力的融合蛋白的氨基酸序列，例如碳水化合物结合部分。
便于纯化的氨基酸序列，例如亲和标记、His-标记；
促进生产的氨基酸序列，例如作为载体的氨基酸序列，如CBM；
具有酶活性的氨基酸序列；和
提供具有结合亲和力的融合蛋白的氨基酸序列，例如碳水化合物结合部分。
[0146] CBM，碳水化合物结合部分，作为载体例如在木霉属生产中是有利的。
[0147] 在一个实施方案中，宿主细胞是非-致病的。这对于在饲料中，和在洗涤剂应用中，例如在家用洗衣洗涤剂中使用宿主细胞是特别有用的。
[0148] 在第五方面的一个实施方案中，含甘露聚糖的材料选自基于植物的材料、纺织品、废水、污水、石油或其组合。
[0149] 在一个实施方案中，含甘露聚糖的材料是纺织材料或织物。
[0151] 在另一个实施方案中，降解或修饰在其中甘露聚糖酶显示活性的水环境中进行。
[0152] 在一个优选的实施方案中，在该方法中降解或修饰的含有甘露聚糖的材料，在任选具有甘露聚糖污点的纺织品或织物上。通过降解附着在纺织品或织物上的甘露聚糖，与
甘露聚糖结合的污垢或污迹被释放，并且不能再次结合到甘露聚糖或甘露聚糖污点上。纺
织品或织物可以是任何材料的纺织品或织物，例如棉、胡麻/亚麻、黄麻、苎麻、剑麻或椰棕或人造纤维素材料(例如源自木浆)，包括粘胶/人造丝、modal、醋酸纤维素纤维(tricell)、lyocell、cupro或其混合物。
甘露聚糖结合的污垢或污迹被释放，并且不能再次结合到甘露聚糖或甘露聚糖污点上。纺
织品或织物可以是任何材料的纺织品或织物，例如棉、胡麻/亚麻、黄麻、苎麻、剑麻或椰棕或人造纤维素材料(例如源自木浆)，包括粘胶/人造丝、modal、醋酸纤维素纤维(tricell)、lyocell、cupro或其混合物。
[0153] 在一个实施方案中，本发明的饲料包含或由玉米和大豆粉组成。
[0154] 在一个实施方案中，植物来源的蛋白来源包含或由大豆、谷物例如大麦、小麦、黑麦、燕麦或玉米组成。
[0155] 在一个实施方案中，包含甘露聚糖的产物或副产物包含或由棕榈仁、瓜尔豆粉或椰子核粉组成。
[0156] 在一个实施方案中，本发明的动物饲料或本发明的饲料添加剂以湿组合物或干组合物的形式配制。
[0159] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶变体随机地水解内切-β-1,4-甘露糖苷键。
[0160] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶变体，或编码相应野生型甘露聚糖酶的核苷酸序列可从细菌来源获得或衍生。
[0161] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶变体与至少一种其它多肽融合，从而形成融合多肽。除了甘露聚糖酶的那些之外，融合多肽或其它多肽还可具有其它催化或结合活性。在一个实施方案中，其他多肽包括或由碳水化合物结合模块组成，它任选地是来自与甘露聚糖
酶相同或不同生物的另一种蛋白质或酶的片段。
酶相同或不同生物的另一种蛋白质或酶的片段。
[0162] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶变体用接头与其它多肽连接在一起。
[0163] 在一个实施方案中，提供了一种织物的机械处理方法，该方法包括在机器清洗过程的洗涤周期中用含有第一方面的甘露聚糖酶变体或第二方面的酶组合物的洗液处理织
物。
物。
[0164] 在一个实施方案中，提供了第二方面的酶组合物或第一方面的甘露聚糖酶变体与酶一起在用于清洗织物和/或去除织物污点的清洁组合物中的用途，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质。
[0165] 在一个实施方案中，提供了第一方面的甘露聚糖酶变体或第二方面的酶组合物与酶一起在用于清洁硬表面，如地板、墙壁、浴室瓷砖等的清洁组合物中的用途，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质。
[0166] 在一个实施方案中，提供了第一方面的甘露聚糖酶变体或第二方面的酶组合物与酶一起在用于手工和机器洗碗的清洁组合物中的用途，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质。
实施例
实施例
[0168] 实施例1. 变体设计为了提高野生型Man7甘露聚糖酶的稳定性和比活性，在野生型酶结构分析的基础上，
设计了变体组。使用Bioluminate软件(Schrödinger LCC)，用来自杆菌属(Bacillus sp.)
内切-β-D-1,4-甘露聚糖酶(1WKY)的坐标，创建Man7的结构模型。该设计包括每个变体中的两个或更多个特定突变。表1显示了变体的列表。氨基酸编号对应于含有信号序列的SEQ ID NO: 2 (Man7)全长氨基酸序列的氨基酸编号。
设计了变体组。使用Bioluminate软件(Schrödinger LCC)，用来自杆菌属(Bacillus sp.)
内切-β-D-1,4-甘露聚糖酶(1WKY)的坐标，创建Man7的结构模型。该设计包括每个变体中的两个或更多个特定突变。表1显示了变体的列表。氨基酸编号对应于含有信号序列的SEQ ID NO: 2 (Man7)全长氨基酸序列的氨基酸编号。
[0169] 表1. Man7变体的列表变体：突变
TBH1: M123I, S229A, G272Q, T285A
TBH2: A158S, S229A, T285A, T307R
TBH3: S229A, T285A, L316K
TBH4: M123I, A158S, S229A, G272Q, T285A, T307R
TBH5: M123I, S229A, G272Q, T285A, L316K
TBH6: A158S, S229A, T285A, T307R, L316K
TBH7: F180L, S229A, T285A, L316K
TBH8: S229A, T285A
TBH9: S229A, T285A, N300Q, N340Q, S400A, N419A, S433A, N446Q
TBH10: A158S, S229A, T307R, L316K
TBH11: A158S, T285A, T307R, L316K
TBH17: A158S, N283S, T307R, L316K
实施例2. 合成甘露聚糖酶变体基因的克隆
标准分子生物学方法被用于DNA的分离和酶处理(如质粒DNA的分离、DNA的消化产生
DNA片段)、大肠杆菌的转化、测序等。所用的基本方法如酶、试剂或试剂盒制造商所述。
TBH1: M123I, S229A, G272Q, T285A
TBH2: A158S, S229A, T285A, T307R
TBH3: S229A, T285A, L316K
TBH4: M123I, A158S, S229A, G272Q, T285A, T307R
TBH5: M123I, S229A, G272Q, T285A, L316K
TBH6: A158S, S229A, T285A, T307R, L316K
TBH7: F180L, S229A, T285A, L316K
TBH8: S229A, T285A
TBH9: S229A, T285A, N300Q, N340Q, S400A, N419A, S433A, N446Q
TBH10: A158S, S229A, T307R, L316K
TBH11: A158S, T285A, T307R, L316K
TBH17: A158S, N283S, T307R, L316K
实施例2. 合成甘露聚糖酶变体基因的克隆
标准分子生物学方法被用于DNA的分离和酶处理(如质粒DNA的分离、DNA的消化产生
DNA片段)、大肠杆菌的转化、测序等。所用的基本方法如酶、试剂或试剂盒制造商所述。
[0170] 变体tbh1-tbh11从GenScript作为合成构建体定制，没有它们自己的信号肽编码序列，并具有用于里氏木霉的密码子优化。使从GenScript获得的包括基因tbh1-tbh11的质粒DNA重新悬浮在无菌水中，根据制造商的指示，用NruI和BamHI限制性内切酶(Thermo
Fisher Scientific)消化并克隆到用NruI和BamHI切割的表达载体中。将连接混合物转化
至大肠杆菌XL1-Blue或XL10-Gold细胞(AH Diagnostics)，并在含有50-100 µg/ml氨苄西
林的LB (Luria-Bertani)平板上平铺。从平板收集几个大肠杆菌菌落，并用GenJet
Plasmid Miniprep试剂盒(Thermo Fisher Scientific)分离DNA。使用限制性消化筛选阳
性克隆，它们显示含有预期大小的插入物。对tbh1- tbh11甘露聚糖酶基因的表达质粒的融合位点测序，质粒被分别命名为pALK4415 - pALK4423、pALK4430和pALK4431 (有关细节参见实施例4)。由GenScript传递的包括tbh基因的质粒DNA还被转化到XL10-Gold大肠杆菌细
胞(Agilent)中，并保藏至DSMZ菌株收集中心。有关基因和推导的氨基酸序列(SEQ ID NOs:
5-26)的相关信息分别概述于表2和表3。大肠杆菌菌株RF12379-RF12387、RF12456和
RF12457，分别包括质粒pALK4434-pALK4442、pALK4432和pALK4433，分别以保藏号DSM
32425、DSM 32426、DSM 32427、DSM 32428、DSM 32429、DSM 32430、DSM 32431、DSM 32432、DSM32433、DSM 32518和DSM 32519保藏至DSMZ收集中心。
Fisher Scientific)消化并克隆到用NruI和BamHI切割的表达载体中。将连接混合物转化
至大肠杆菌XL1-Blue或XL10-Gold细胞(AH Diagnostics)，并在含有50-100 µg/ml氨苄西
林的LB (Luria-Bertani)平板上平铺。从平板收集几个大肠杆菌菌落，并用GenJet
Plasmid Miniprep试剂盒(Thermo Fisher Scientific)分离DNA。使用限制性消化筛选阳
性克隆，它们显示含有预期大小的插入物。对tbh1- tbh11甘露聚糖酶基因的表达质粒的融合位点测序，质粒被分别命名为pALK4415 - pALK4423、pALK4430和pALK4431 (有关细节参见实施例4)。由GenScript传递的包括tbh基因的质粒DNA还被转化到XL10-Gold大肠杆菌细
胞(Agilent)中，并保藏至DSMZ菌株收集中心。有关基因和推导的氨基酸序列(SEQ ID NOs:
5-26)的相关信息分别概述于表2和表3。大肠杆菌菌株RF12379-RF12387、RF12456和
RF12457，分别包括质粒pALK4434-pALK4442、pALK4432和pALK4433，分别以保藏号DSM
32425、DSM 32426、DSM 32427、DSM 32428、DSM 32429、DSM 32430、DSM 32431、DSM 32432、DSM32433、DSM 32518和DSM 32519保藏至DSMZ收集中心。
[0171] 表2. 关于甘露聚糖酶变体编码合成基因tbh1-tbh11的概述基因 长度(bp)(a SEQ ID NO
tbh1 1395 5
tbh2 1395 7
tbh3 1395 9
tbh4 1395 11
tbh5 1395 13
tbh6 1395 15
tbh7 1395 17
tbh8 1395 19
tbh9 1395 21
tbh10 1395 23
tbh11 1395 25
(a STOP密码子包括在内
表3. 从甘露聚糖酶变体编码基因序列推导的氨基酸序列的概述
Man蛋白 aas的编号(b ss的长度(a CBM 核心(aa-aa) 预测的(Da)，不包括ss(b 预测的pI，不包括ss (b SEQ ID NOTBH1 464 26 是 27-331 50886 4.62 6
TBH2 464 26 是 27-331 50904 4.67 8
TBH3 464 26 是 27-331 50848 4.67 10
TBH4 464 26 是 27-331 50957 4.67 12
TBH5 464 26 是 27-331 50901 4.67 14
TBH6 464 26 是 27-331 50919 4.72 16
TBH7 464 26 是 27-331 50814 4.67 18
TBH8 464 26 是 27-331 50833 4.62 20
TBH9 464 26 是 27-331 50800 4.62 22
TBH10 464 26 是 27-331 50949 4.72 24
TBH11 464 26 是 27-331 50935 4.72 26
(a使用程序SignalP v3.0, NN/HMM (Nielsen et al., 1997; Nielsen & Krogh,
1998; Bendtsen et al., 2004)对信号序列进行预测。
tbh1 1395 5
tbh2 1395 7
tbh3 1395 9
tbh4 1395 11
tbh5 1395 13
tbh6 1395 15
tbh7 1395 17
tbh8 1395 19
tbh9 1395 21
tbh10 1395 23
tbh11 1395 25
(a STOP密码子包括在内
表3. 从甘露聚糖酶变体编码基因序列推导的氨基酸序列的概述
Man蛋白 aas的编号(b ss的长度(a CBM 核心(aa-aa) 预测的(Da)，不包括ss(b 预测的pI，不包括ss (b SEQ ID NOTBH1 464 26 是 27-331 50886 4.62 6
TBH2 464 26 是 27-331 50904 4.67 8
TBH3 464 26 是 27-331 50848 4.67 10
TBH4 464 26 是 27-331 50957 4.67 12
TBH5 464 26 是 27-331 50901 4.67 14
TBH6 464 26 是 27-331 50919 4.72 16
TBH7 464 26 是 27-331 50814 4.67 18
TBH8 464 26 是 27-331 50833 4.62 20
TBH9 464 26 是 27-331 50800 4.62 22
TBH10 464 26 是 27-331 50949 4.72 24
TBH11 464 26 是 27-331 50935 4.72 26
(a使用程序SignalP v3.0, NN/HMM (Nielsen et al., 1997; Nielsen & Krogh,
1998; Bendtsen et al., 2004)对信号序列进行预测。
[0172] (b预测的信号序列不包括在内。使用Windows, Sci-Ed软件的Clone Manager Professional版本9进行预测。
[0173] 实施例3. 重组甘露聚糖酶变体蛋白在里氏木霉中的生产构建用于重组甘露聚糖酶TBH1-TBH11 (SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,
20, 22, 24和26)蛋白在里氏木霉中生产的表达质粒。构建的表达质粒列于表4中。用里氏
木霉cel6A/cbh2 CBM载体和接头(之后是Kex2蛋白酶识别位点)，将重组甘露聚糖酶基因
(无其自身信号序列)融合于里氏木霉cel7A/cbh1启动子。转录终止由里氏木霉cel7A/cbh1
终止子确保，构巢曲菌(A. Nidulans) amdS标记基因用于转化子的筛选，如Paloheimo et al. (2003)描述的。线性表达盒(图1)在NotI消化后与载体骨架分离，并转化至里氏木霉原生质体。所使用的宿主菌株，不产生四种主要的里氏木霉纤维素酶(CBHI、CBHII、EGI、EGII)中的任何一种。所述转化如Penttilä et al. (1987)所述进行，但具有Karhunen et al.
(1993)所述的修改，选择乙酰胺酶作为唯一氮源(amdS标记基因)。转化子经单分生孢子在
筛选板上纯化后，在PD上将它们进行孢子化。
20, 22, 24和26)蛋白在里氏木霉中生产的表达质粒。构建的表达质粒列于表4中。用里氏
木霉cel6A/cbh2 CBM载体和接头(之后是Kex2蛋白酶识别位点)，将重组甘露聚糖酶基因
(无其自身信号序列)融合于里氏木霉cel7A/cbh1启动子。转录终止由里氏木霉cel7A/cbh1
终止子确保，构巢曲菌(A. Nidulans) amdS标记基因用于转化子的筛选，如Paloheimo et al. (2003)描述的。线性表达盒(图1)在NotI消化后与载体骨架分离，并转化至里氏木霉原生质体。所使用的宿主菌株，不产生四种主要的里氏木霉纤维素酶(CBHI、CBHII、EGI、EGII)中的任何一种。所述转化如Penttilä et al. (1987)所述进行，但具有Karhunen et al.
(1993)所述的修改，选择乙酰胺酶作为唯一氮源(amdS标记基因)。转化子经单分生孢子在
筛选板上纯化后，在PD上将它们进行孢子化。
[0174] 表4. 构建在里氏木霉中生产TBH1-TBH11 (SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24和26)重组蛋白的表达盒。表达盒的总体结构如在图1中所述。
甘露聚糖酶蛋白 表达质粒 表达盒(a
TBH1 pALK4415 7.5 kb NotI
TBH2 pALK4416 7.5 kb NotI
TBH3 pALK4417 7.5 kb NotI
TBH4 pALK4418 7.5 kb NotI
TBH5 pALK4419 7.5 kb NotI
TBH6 pALK4420 7.5 kb NotI
TBH7 pALK4421 7.5 kb NotI
TBH8 pALK4422 7.5 kb NotI
TBH9 pALK4423 7.5 kb NotI
TBH10 pALK4430 7.5 kb NotI
TBH11 pALK4431 7.5 kb NotI
甘露聚糖酶蛋白 表达质粒 表达盒(a
TBH1 pALK4415 7.5 kb NotI
TBH2 pALK4416 7.5 kb NotI
TBH3 pALK4417 7.5 kb NotI
TBH4 pALK4418 7.5 kb NotI
TBH5 pALK4419 7.5 kb NotI
TBH6 pALK4420 7.5 kb NotI
TBH7 pALK4421 7.5 kb NotI
TBH8 pALK4422 7.5 kb NotI
TBH9 pALK4423 7.5 kb NotI
TBH10 pALK4430 7.5 kb NotI
TBH11 pALK4431 7.5 kb NotI
[0175] (a 用于里氏木霉转化的表达盒使用NotI消化从载体骨架分离。
[0176] 从摇瓶培养的培养上清液分析转化子的甘露聚糖酶生产。将转化子从PD斜面接种到含有50 ml用5% KH2PO4缓冲的复合乳糖基纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki at al.
1993)的摇瓶中。在30℃、250 rpm下生长7天后，从培养上清液分析转化子的甘露聚糖酶蛋白生产。用SDS-PAGE和随后的Coomassie染色分析重组蛋白的异源生产。上清液还经离心回收，用于应用试验。
1993)的摇瓶中。在30℃、250 rpm下生长7天后，从培养上清液分析转化子的甘露聚糖酶蛋白生产。用SDS-PAGE和随后的Coomassie染色分析重组蛋白的异源生产。上清液还经离心回收，用于应用试验。
[0177] 实施例4. 用DNS-方法分析半乳甘露聚糖酶活性于50℃和pH 7.0下5 min，测定作为从半乳甘露聚糖(0.3 w/w-%)释放还原糖的甘露聚
糖酶活性(MNU)。用二硝基水杨酸经分光光度法测定释放的还原糖的量。
糖酶活性(MNU)。用二硝基水杨酸经分光光度法测定释放的还原糖的量。
[0178] 如下制备测定法所用的底物(0.3 w/w-%)：将在50 mM柠檬酸钠缓冲液pH 7 (或柠檬酸盐磷酸盐缓冲液pH 7)中的0.6g刺槐豆胶(Sigma G-0753)于约80℃，使用加热磁搅拌
器加热到沸点。在冷室(2-8℃)内冷却溶液，在连续搅拌下溶解过夜并通过离心除去不溶性残渣。之后用缓冲液将溶液填充达到200 ml。底物以冷冻形式储存，在使用前通过在沸水浴中加热至约80℃融化，冷却至室温，并小心混合。
器加热到沸点。在冷室(2-8℃)内冷却溶液，在连续搅拌下溶解过夜并通过离心除去不溶性残渣。之后用缓冲液将溶液填充达到200 ml。底物以冷冻形式储存，在使用前通过在沸水浴中加热至约80℃融化，冷却至室温，并小心混合。
[0179] 通过将50g 3.5-二硝基水杨酸(Sigma D-550)在约4升水中溶解，制备了在该测定法所用的DNS试剂。在连续磁力搅拌下，逐渐加入80.0 g NaOH并让其溶解。在连续搅拌下，分小份加入1500 g量的Rochelle盐(K-Na-酒石酸盐, Merck 8087)。将小心升温至最高温
度45℃的该溶液冷却至室温并填充达到5000 ml。之后，通过Whatman 1滤纸过滤，并在室温下存放在黑色瓶子里。
度45℃的该溶液冷却至室温并填充达到5000 ml。之后，通过Whatman 1滤纸过滤，并在室温下存放在黑色瓶子里。
[0180] 首先在两个试管的每一个中加入1.8 ml底物溶液开始反应，并在50℃下平衡5分钟，然后将200 μl的适当稀释的酶溶液加入其中一个试管中，用涡流混合器充分混合，在50℃下准确孵育5 min。酶空白不需要平衡或孵育。在两管中加入3.0 ml DNS试剂来停止反应并混合。在酶空白管中加入200 μl样品溶液。两根试管都放在沸水浴中。煮沸准确5分钟后，将试管放入冷水浴中，使其冷却至室温。在540 nm处测定样品对酶空白的吸光度，并从校准曲线中读出活性，乘以稀释系数。合适的稀释样品产生0.15-0.4的吸光度差异。
[0181] 通过将360 mg甘露糖(SigmaM-6020, 储存在干燥器中)溶于试验缓冲液中制备20 mM甘露糖储备液，并将其稀释至含有3、6、10和14 μmol/ml甘露糖的溶液，准备标准曲线。除了在50℃下孵育以外，对标准品进行类似于样品的处理。在540 nm针对试剂空白(含缓冲液而不是甘露糖的标准稀释液)测量吸光度。为每个系列的测定构建校准曲线。
[0182] 一个甘露聚糖酶单位(MNU)被定义为在测定条件下在一秒钟内从半乳甘露聚糖中产生还原碳水化合物(其还原力相当于1 nmol甘露糖)的酶的量(1 MNU = 1nkat)。
[0183] 实施例5. 纯化的甘露聚糖酶变体的比活性通过在4℃，以4000 g离心10 min，将细胞和固体从发酵培养基中除去。用10 ml的上清
液纯化蛋白质。使样品通过0.44 µm PVDF膜(Millex-HV, Merck Millipore Ltd,
Carrigtwohill, IRL)过滤。将滤液上样到在20mM HEPES pH 7中平衡的HiPrep 26/10脱盐
柱(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)上。然后将脱盐样品上样到用20 mM HEPES pH 7预
平衡的5 ml HiTrap Q HP柱(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)上。样品加载后，用相同
缓冲液20 ml洗涤柱。用线性盐梯度20 mM HEPES、500 mM NaCl pH 7在15个CV中洗脱蛋白。
在SDS-PAGE上收集5 ml的流分并分析。使用Vivaspin 20，10 kDa MWCO超滤装置(GE
Healthcare)，将含靶蛋白的流分合并并浓缩至2 ml。使用用20 mM MES、200 mM NaCl pH
6.5平衡的Superdex 75 26/60凝胶过滤柱对浓缩样品进一步分级分离。收集2 ml流分，并
用SDS-PAGE进行分析。合并包含纯甘露聚糖酶的流分。
液纯化蛋白质。使样品通过0.44 µm PVDF膜(Millex-HV, Merck Millipore Ltd,
Carrigtwohill, IRL)过滤。将滤液上样到在20mM HEPES pH 7中平衡的HiPrep 26/10脱盐
柱(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)上。然后将脱盐样品上样到用20 mM HEPES pH 7预
平衡的5 ml HiTrap Q HP柱(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)上。样品加载后，用相同
缓冲液20 ml洗涤柱。用线性盐梯度20 mM HEPES、500 mM NaCl pH 7在15个CV中洗脱蛋白。
在SDS-PAGE上收集5 ml的流分并分析。使用Vivaspin 20，10 kDa MWCO超滤装置(GE
Healthcare)，将含靶蛋白的流分合并并浓缩至2 ml。使用用20 mM MES、200 mM NaCl pH
6.5平衡的Superdex 75 26/60凝胶过滤柱对浓缩样品进一步分级分离。收集2 ml流分，并
用SDS-PAGE进行分析。合并包含纯甘露聚糖酶的流分。
[0184] 纯化的样品为大于95%的纯度。
[0185] 使用UV吸光度280 nm测定法测定纯化样品中酶含量。每种甘露聚糖酶的激发系数使用ExPASy (服务器http://web.expasy.org/protparam/) (Gasteiger et al. 2005)根
据酶的氨基酸序列计算。
据酶的氨基酸序列计算。
[0186] 如实施例4中所述，将纯化的样品的酶活性(MNU)测量为还原糖的释放。
[0187] 通过将纯化样品的MNU活性除以纯化酶的量，计算甘露聚糖酶的比活性(MNU/mg)。通过将变体甘露聚糖酶的比活性除以野生型Man7甘露聚糖酶的比活性，计算相对比活性
(%)。
(%)。
[0188] 根据野生型Man7的3D模型，潜在的糖基化位点天冬酰胺283位于酶催化中心附近。天冬酰胺283的糖基化可能导致酶的催化活性降低。为提高甘露聚糖酶的比活性，苏氨酸
285被突变为丙氨酸。这种突变防止了天冬酰胺283的N-糖基化。
285被突变为丙氨酸。这种突变防止了天冬酰胺283的N-糖基化。
[0189] 结果表明，当T285突变为丙氨酸(TBH5、TBH6、TBH9和TBH11)时，木霉属产生的野生型Man7酶的比活性提高了10倍以上(图2)。通过改变N283S (TBH17)收到相同的结果(图2)。另一方面，TBH10变体的比活性(其中除N283外的糖基化位点被消除)没有得到改善(图2)。
[0190] 结果清楚地表明，阻止N283糖基化的突变提高了甘露聚糖酶变体的比活性，而消除其它糖基化位点对比活性未显示显著影响。与野生型Man7相比，使用TBH5、TBH6、TBH9和TBH11 (数据未显示)的产量(以甘露聚糖酶活性衡量)更高。
[0191] 具有较高比活性的甘露聚糖酶变体导致生产成本降低，因此在商业上是更可行的。
[0192] 实施例6. 在木霉属中生产的甘露聚糖酶变体与市售洗涤剂的污点去除性能在木霉属中产生的TBH1-TBH11变体的培养上清液(如实施例3中所述)，与市售洗涤剂
一起，对其在40℃和16°dH的水硬度下去除甘露聚糖酶敏感标准污点的能力进行了测试，并与野生型Man7酶进行了比较。使用来自试验材料中心B.V. (荷兰)的以下人工污染的试验
布：棉花上敏感的巧克力布丁甘露聚糖酶(E-165)、棉花上刺槐豆胶与色素(C-S-73)和棉花上瓜尔胶与炭黑(C-S-43)。将织物切成6cm x 6 cm的样品，并在试验中各使用2片。
一起，对其在40℃和16°dH的水硬度下去除甘露聚糖酶敏感标准污点的能力进行了测试，并与野生型Man7酶进行了比较。使用来自试验材料中心B.V. (荷兰)的以下人工污染的试验
布：棉花上敏感的巧克力布丁甘露聚糖酶(E-165)、棉花上刺槐豆胶与色素(C-S-73)和棉花上瓜尔胶与炭黑(C-S-43)。将织物切成6cm x 6 cm的样品，并在试验中各使用2片。
[0193] 包含除甘露聚糖酶外的所有其它酶的市售重型液体洗涤剂A以每升洗液4.4 g的浓度使用，无酶的市售彩色洗涤剂粉末以3.8 g/l的浓度使用，无酶的市售漂白洗涤剂粉末以4.2 g/l使用。含洗涤剂的洗液在硬度为16°dH的合成自来水中配制。将蛋白酶Savinase
® 16 L (0.5 w/w %)和淀粉酶Stainzyme® 12 L (0.4 w/w %)与市售染料和漂白洗涤剂
粉末一起加入到所用的硬水中，液体洗涤剂已包含淀粉酶和蛋白酶。液体洗涤剂的洗液的
pH为大约8.3，而彩色洗涤剂粉末的pH为大约10和漂白洗涤剂的pH为大约9.5。
® 16 L (0.5 w/w %)和淀粉酶Stainzyme® 12 L (0.4 w/w %)与市售染料和漂白洗涤剂
粉末一起加入到所用的硬水中，液体洗涤剂已包含淀粉酶和蛋白酶。液体洗涤剂的洗液的
pH为大约8.3，而彩色洗涤剂粉末的pH为大约10和漂白洗涤剂的pH为大约9.5。
[0194] 甘露聚糖酶用量为每ml洗液0.025和/或0.05 MNU活性。如实施例4中所述测量活性。对照样品含有洗涤剂溶液，但不含甘露聚糖酶。
[0195] 对于具有16°dH硬度的合成自来水，在去离子水(Milli-Q或等效物)中制备以下储备液：
具有1000°d钙硬度的储备液：CaCl2 x 2 H2O (1.02382.1000, Merck KGaA, 德国)
26.22 g/l
具有200°d镁硬度的储备液：MgSO4 x 7 H2O (1.05886.1000, Merck KGaA, 德国)
8.79 g/l H2O
NaHCO3储备液：NaHCO3 (1.06329.1000 Merck KGaA, 德国) 29.6 g/l
将13.3 ml CaCl2溶液、13.3 ml MgSO4溶液和10.0 ml新鲜制备的NaHCO3溶液按给定
的顺序加入容量瓶中，用去离子水达到1升并混合。用配位滴定法测定水的硬度，发现结果正确。
具有1000°d钙硬度的储备液：CaCl2 x 2 H2O (1.02382.1000, Merck KGaA, 德国)
26.22 g/l
具有200°d镁硬度的储备液：MgSO4 x 7 H2O (1.05886.1000, Merck KGaA, 德国)
8.79 g/l H2O
NaHCO3储备液：NaHCO3 (1.06329.1000 Merck KGaA, 德国) 29.6 g/l
将13.3 ml CaCl2溶液、13.3 ml MgSO4溶液和10.0 ml新鲜制备的NaHCO3溶液按给定
的顺序加入容量瓶中，用去离子水达到1升并混合。用配位滴定法测定水的硬度，发现结果正确。
[0196] 如下在Atlas LP-2 Launder-Ometer上进行污点去除处理。将Launder-Ometer首先预热到40℃。然后在1.2升容器中加入洗涤剂、硬度为16°dH的250 ml合成自来水和稀释
的酶(<1.0 ml)。加入污迹后，Launder-Ometer在40℃下以42 rpm的转速运行60 min。在此之后，在流水下仔细冲洗样品，并在室内空气中，在防日光的栅格上干燥过夜。
的酶(<1.0 ml)。加入污迹后，Launder-Ometer在40℃下以42 rpm的转速运行60 min。在此之后，在流水下仔细冲洗样品，并在室内空气中，在防日光的栅格上干燥过夜。
[0197] 通过用Konica Minolta CM-3610A分光光度计，使用L*a*b*颜色空间坐标(光源D65/10°, 420 nm切割)测量作为反射值的颜色，评价污点去除效果。污点褪色，其指示甘露聚糖酶性能(污点去除效率)，经计算为ΔL* (delta L*)，其意指酶处理织物的光度值L*减去用无甘露聚糖酶的洗液处理的织物(对照)的光度值L*。最终结果(总污点去除效果)显示
为各污点的ΔL*总和。各污点的颜色值为2个样品的平均值。
为各污点的ΔL*总和。各污点的颜色值为2个样品的平均值。
[0198] 用市售液体洗涤剂获得的结果显示于图3 A和B中，市售彩色洗涤剂粉末的结果显示于图4A和B中，而市售漂白洗涤剂的结果显示于图5中。所有的变体(TBH1-TBH11)与不同
类型的市售洗涤剂一起，均显示优异的污点去除性能。变体的性能类似于野生型。
类型的市售洗涤剂一起，均显示优异的污点去除性能。变体的性能类似于野生型。
[0199] 实施例7. 甘露聚糖酶单独和与非-淀粉多糖(NSP)降解酶组合在肉鸡中的效率研究
本发明的重组甘露聚糖酶变体对肉鸡生长的影响被研究。包括重组甘露聚糖酶变体的
发酵液的超滤液被干燥，且目标水平单独应用于颗粒肉鸡饲料，或与市售可获得的木聚糖
酶基产品联合使用。
本发明的重组甘露聚糖酶变体对肉鸡生长的影响被研究。包括重组甘露聚糖酶变体的
发酵液的超滤液被干燥，且目标水平单独应用于颗粒肉鸡饲料，或与市售可获得的木聚糖
酶基产品联合使用。
[0200] 饲喂以玉米和脱壳溶剂提取的大豆粉为基础的对照饲料，其不含酶，或添加有单独或与标准剂量的市售木聚糖酶联合的不同水平的本发明的重组甘露聚糖酶变体。
[0201] 肉鸡的初始重量在30g和50 g之间。试验持续3周-5周。每个处理至少有6次重复，各10只肉鸡。在每一种情况下，对饮食中的水分、粗蛋白、粗纤维、脂肪、灰分和酶蛋白进行分析。
[0202] 准备了五种饮食：1) 未补充的对照(BD)
2) BD + 甘露聚糖酶1-500 mg/kg
3) BD + 甘露聚糖酶1-1000 mg/kg
4) BD + 甘露聚糖酶1-500 mg/kg + 木聚糖酶1-10 mg/kg
5) BD + 木聚糖酶1-10 mg/kg
动物的健康状况和死亡率每天通过视觉查验进行检查。在第0、14和35天测量体重增加
(BW)、采食量(FI)和饲料-转换率(FCR)。FCR被计算为在同一期间消费的总饲料量除以体重增量。重组甘露聚糖酶变体的作用根据与饲喂相同的饮食或相同饮食但添加有木聚糖酶的
那些动物比较而确定。
2) BD + 甘露聚糖酶1-500 mg/kg
3) BD + 甘露聚糖酶1-1000 mg/kg
4) BD + 甘露聚糖酶1-500 mg/kg + 木聚糖酶1-10 mg/kg
5) BD + 木聚糖酶1-10 mg/kg
动物的健康状况和死亡率每天通过视觉查验进行检查。在第0、14和35天测量体重增加
(BW)、采食量(FI)和饲料-转换率(FCR)。FCR被计算为在同一期间消费的总饲料量除以体重增量。重组甘露聚糖酶变体的作用根据与饲喂相同的饮食或相同饮食但添加有木聚糖酶的
那些动物比较而确定。
[0203] 实施例8. 速溶咖啡生产纯甘露聚糖是咖啡胚乳的主要贮藏多糖组分，并导致其高粘度，这对速溶咖啡的加工
工艺产生不利影响，增加了干燥过程中的能量消耗。这些效应归因于形成硬的、不溶的晶体结构的甘露聚糖。β-甘露聚糖酶，通常与其它酶例如果胶酶和纤维素酶一起，在速溶咖啡生产的浓缩步骤中添加，以降低咖啡提取物的粘度。甘露聚糖酶也可用于水解液体咖啡提取
物中存在的半乳甘露聚糖，以便在速溶咖啡的冷冻干燥过程中抑制凝胶形成。此外，由于使用酶处理，咖啡豆提取物可以通过低成本程序如蒸发来浓缩。
工艺产生不利影响，增加了干燥过程中的能量消耗。这些效应归因于形成硬的、不溶的晶体结构的甘露聚糖。β-甘露聚糖酶，通常与其它酶例如果胶酶和纤维素酶一起，在速溶咖啡生产的浓缩步骤中添加，以降低咖啡提取物的粘度。甘露聚糖酶也可用于水解液体咖啡提取
物中存在的半乳甘露聚糖，以便在速溶咖啡的冷冻干燥过程中抑制凝胶形成。此外，由于使用酶处理，咖啡豆提取物可以通过低成本程序如蒸发来浓缩。
[0204] 测试根据图6的以下流程图，在10℃的温度下进行，酶用量为0.15% d.s.。
[0205] 本发明的甘露聚糖酶变体在由不同的酶，例如果胶酶和纤维素酶组成的混合物中进行测试。
[0206] 在标准工艺条件下，咖啡提取物的粘度随时间的推移显著增加。然而，使用含有本发明的甘露聚糖酶变体的酶混合物显著降低粘度，得到改进的下游加工，例如喷雾干燥或冷冻干燥。
[0208] 甘露聚糖酶有助于提高有价值的水果成分的提取，降低浓缩前果汁的粘度，并提高过滤速度和最终产品的稳定性。
[0209] 菠萝被碾碎在绞肉机里，然后在1000 ml的烧杯中装入500 g糊状物。于21℃应用酶，反应时间为60分钟。然后根据以下压制方案，用小型Hafico压机压制该糊状物：0巴2 min - 50巴2 min - 100巴2 min - 150巴2 min - 200巴1 min - 300巴1 min - 400巴
1min。得到的果汁然后以4500 rpm离心5分钟，并对其浊度和粘度进行分析。
1min。得到的果汁然后以4500 rpm离心5分钟，并对其浊度和粘度进行分析。
[0210] 本发明的甘露聚糖酶变体在酶混合物A、B和C中进行测试(表5)。
[0211] 在将酶添加到菠萝糊状物中之前先用自来水稀释酶。
[0212] 表5. 酶混合物应用本发明的甘露聚糖酶变体导致菠萝加工过程中果汁的产量提高和浊度降低。
[0213] 实施例10. 用于豆奶生产的大豆的甘露聚糖酶处理为了酶法处理大豆以获得豆奶，通常采用“热处理”。对于热豆奶处理，将干燥的大豆与
沸腾的自来水按1:7的比例(浸泡的大豆:水)在搅拌机中混合并粉碎。在加入酶之前，将整
个大豆浆冷却到50-55℃。大豆浆的pH值应在pH 6.5左右并可用NaHCO3调节。将甘露聚糖酶以1 kg/t干大豆的剂量加入浆料中并搅拌30 min。在反应时间结束后，用实验室压力机压
制浆液，得到最终产品：豆奶。为确保相同的压制分布，指定压力以及相应的压制时间，如表
6所示。除了酶促反应的样品外，还制备了没有任何酶的对照样品，其中酶溶液被水代替。
沸腾的自来水按1:7的比例(浸泡的大豆:水)在搅拌机中混合并粉碎。在加入酶之前，将整
个大豆浆冷却到50-55℃。大豆浆的pH值应在pH 6.5左右并可用NaHCO3调节。将甘露聚糖酶以1 kg/t干大豆的剂量加入浆料中并搅拌30 min。在反应时间结束后，用实验室压力机压
制浆液，得到最终产品：豆奶。为确保相同的压制分布，指定压力以及相应的压制时间，如表
6所示。除了酶促反应的样品外，还制备了没有任何酶的对照样品，其中酶溶液被水代替。
[0214] 表6. 压制方案压力[巴] 0 50 100 300
时间[min] 2 2 2 1
压制后，豆奶在微波中加热，直到沸腾以停止酶的反应。豆奶分析：
产量(克/时间)
利用折射计测定白利糖度(Brix)，其给出豆奶中的糖量的直接相关关系
用测量浊度的NTU-光度计测量汁液的浊度
使用LAB-测量法测量亮度
蛋白含量用CN-分析仪测定(燃烧法)
风味
用本发明的甘露聚糖酶变体处理的豆奶显示出产量增加、更亮的颜色、白利糖度增加、
浊度更低、蛋白质含量更高和味道更好(无需除味)。
时间[min] 2 2 2 1
压制后，豆奶在微波中加热，直到沸腾以停止酶的反应。豆奶分析：
产量(克/时间)
利用折射计测定白利糖度(Brix)，其给出豆奶中的糖量的直接相关关系
用测量浊度的NTU-光度计测量汁液的浊度
使用LAB-测量法测量亮度
蛋白含量用CN-分析仪测定(燃烧法)
风味
用本发明的甘露聚糖酶变体处理的豆奶显示出产量增加、更亮的颜色、白利糖度增加、
浊度更低、蛋白质含量更高和味道更好(无需除味)。
[0215] 在不限制专利权利要求的范围和解释的情况下，本文公开的一个或多个方面或实施方案的某些技术效果列于下面：一个技术效果是对甘露聚糖的降解或修饰。另一个技术
效果是提供具有良好储存稳定性的甘露聚糖酶。
效果是提供具有良好储存稳定性的甘露聚糖酶。
[0216] 上文的描述通过本发明的具体实现和实施方案的非限制性实例，提供了发明人目前为实施本发明所设想的最佳模式的完整而翔实的描述。然而，对于本领域的技术人员来
说清楚的是，本发明不局限于上述实施方案的细节，而是在不偏离本发明的特点的情况下
可以在其它实施方案中使用等同方式来实现。
说清楚的是，本发明不局限于上述实施方案的细节，而是在不偏离本发明的特点的情况下
可以在其它实施方案中使用等同方式来实现。
[0217] 此外，本发明的上文公开的方面和实施方案的一些特征可以用于发挥益处，而不需要相应地使用其它特征。因此，上面的描述应被视为只是说明本发明的原理，而不是局限于此。因此，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
[0218] 在一个实施方案中，与相应的自然组分相比，本发明的组合物的至少一种组分具有不同化学、结构或物理特性，所述至少一种组分源自所述自然组分。在一个实施方案中，所述特征是均匀大小、均匀分散、不同异构体、不同密码子简并、不同翻译后修饰、不同甲基化、不同三级或四级结构、不同酶活性、不同亲和力、不同结合活性和不同免疫原性的至少一种。
[0219] 参考文献Bendtsen JD, Nielsen H, von Heijne G, and Brunak S. (2004) Improved
prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol.Biol. 340:783-795.
Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel
R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy
Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana
Press (2005). pp. 571-607.
Joutsjoki VV, Torkkeli TK, and Nevalainen KMH. (1993) Transformation of
Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P (gamP) gene:
production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei. Curr. Genet.
24: 223-228.
Karhunen T, Mäntylä M, Nevalainen KMH, and Suominen PL. (1993) High
frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglucanase I
overproduction. Mol. Gen. Genet. 241: 515-522.
Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S, and von Heijne G. (1997)
Identification of prokaryotic and eykaryotic signal peptides and prediction
of their cleavage sites. Protein. Eng. 10: 1-6.
Nielsen H, and Krogh A. (1998) Prediction of signal peptides and signal
anchors by a hidden Markov model. In: Proceedings of the Sixth International
Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press,
Menlo Park, California, p. 122-130.
Paloheimo M, Mäntylä A, Kallio J, and Suominen P. (2003) Highyield
production of a bacterial xylanase in the filamentous fungus Trichoderma
reesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure. Appl.
Env. Microbiol. 69: 7073-7082.
Penttilä M, Nevalainen H, Rättö M, Salminen E, and Knowles J. (1987) A
versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus
Trichoderma reesei. Gene 61: 155-164。
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versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus
Trichoderma reesei. Gene 61: 155-164。
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