技术领域
[0001] 本
发明涉及一种具有抗真菌活性的抗真菌肽、其制备方法及用途,属于
生物化学和生物医学领域。
背景技术
[0002] 抗菌肽是一类广泛存在于整个生物界中的双亲性小分子
碱性多肽,广泛存在于生物体内,包括细菌、真菌、
植物、昆虫、鱼类、
鸟类、甲壳动物、两栖动物和
哺乳动物等,已有超过750种之多,其中绝大部分为阳离子抗菌肽,也有少量阴离子抗菌肽。由于抗菌肽表现出广谱抗
微生物活性,并对细菌毒素有中和作用,其作用机制独特,不易产生耐药性,而且某些抗菌肽又只对原核生物和突变细胞起作用,对真核生物无害。因而在许多致病菌产生了明显耐药性的情况下,抗菌肽的发现和深入研究为开发全新的抗菌药物提供了可能。
[0003] 抗菌肽是
机体先天免疫的关键因子。抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同,它的靶位点主要是病原
体细胞膜,因此不易产生抗性,并且抗菌肽对真核细胞几乎没有毒
副作用,仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。抗菌肽不仅作用于
革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌,而且也作用于真菌、原虫、某些病毒和
肿瘤细胞,同时,还能
加速免疫和
伤口愈合过程。由于病原菌对抗生素逐步产生抗药性,抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。
[0004] 抗菌肽是由一个编码多肽的庞大的基因家族,原核生物、真核生物甚至人类都可以产生。目前,科学家已经获得了几百种天然和人工合成的抗菌肽,但是这些抗菌肽不论在大小、成分组成、电荷和二级结构上都存在很大差异。此外,抗菌肽有五种结构类型:线形结构,往往是螺旋结构;富含半胱
氨酸残基;形成β-
片层结构的多肽;富含脯氨酸的多肽;含有稀有或修饰氨基酸的多肽。这些特征对于识别微生物的靶结构是很重要的。
[0005] 关于抗真菌的蛋白和多肽,虽然近几年取得了很大进展。真菌细胞膜已经被证实作为防御素样多肽和植物防御素的理想靶位。但是,真菌细胞存在一些内部多肽和外部多肽,而抗菌肽与其外部多肽作用后通过调节细胞间
信号级联诱导真菌细胞死亡是完全可能的。
发明内容
[0006] 本发明基于对尖膀胱螺天然多肽的化学结构的分析,化学修饰和合成其有效结构,制备出一种新型的抗真菌肽,以期作为传统抗生素的替代物,来增强抗菌肽的多方面优势。
[0007] 因此,本发明的目的在于,提供一种新型的抗真菌肽。
[0008] 本发明的另一个目的在于,提供上述抗真菌肽的制备方法及用途。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面,本发明提供一种抗真菌肽,所述抗真菌肽为具有SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列的肽、其生物活性功能
片段、变体或衍生物。
[0010] 优选地,所述抗真菌肽的有效抗真菌的浓度为不低于1.3μM;优选地所述浓度为1.3-33μM。
[0011] 优选地,所述真菌选自尖孢镰刀菌、粗糙链孢菌和
水霉菌。
[0012] 另一方面,本发明还提供了所述抗真菌肽的制备方法,所述抗真菌肽可以通过生物或化学方法制备。
[0013] 本发明还提供了上述抗真菌肽在制备抗真菌的药物中的用途。优选地,所述真菌选自尖孢镰刀菌、粗糙链孢菌和水霉菌。
[0014] 此外,本发明还提供了一种抗真菌制剂,其包含有效抗真菌量的上述抗真菌肽。优选地,所述抗真菌肽的浓度为不低于1.3μM;优选地所述浓度为1.3-33μM。
[0015] 在一个优选的实施方案中,本发明提供的抗真菌肽的设计和合成方法包括以下步骤:
[0016] 1)从野外捕捉的野生尖膀胱螺于实验室饲养,
温度保持在15℃,
盐度保持在35‰。
[0017] 2)每只尖膀胱螺采集0.5ml的血液,并加入等体积的抗凝缓冲液混匀。
[0018] 3)血液样品的处理。
[0019] 4)按照常规的固相萃取和HPLC(高效液相色谱)方法提取和纯化蛋白。
[0020] 5)用反相HPLC进一步纯化蛋白。
[0021] 6)对上述纯化的蛋白进行
真空冷冻干燥,获得尖膀胱螺血细胞抗菌肽。
[0022] 7)用SDS-PAGE方法测定抗菌肽的分子量,用Edman测序法分析氨基酸的组成。
[0023] 8)用微球菌,表皮葡萄球菌,大肠杆菌,嗜水气单胞菌,副溶血性弧菌和霍乱弧菌进行抗细菌活性测定。
[0024] 9)用尖孢镰刀菌,粗糙链孢菌和水霉进行抗真菌活性的测定。
[0025] 10)采用CHSE-214细胞测定抗菌肽细胞毒性。
[0026] 11)新抗菌肽Apn的设计:为了提高抗菌肽的疏水性(从25%提高到38%)和阳离子表面活性(从+1提高到+5),从N-末端开始删除10个亲水性氨基酸:T-1,Y-2,Y-10,N-13,S-15,Y-16,Q-19,N-23,Q-31和Y-44。同时删除5个带负电荷的氨基酸:E-6,E-7,E-9,D-18和D-37。将形成的两性分子多肽命名为Apn,其是一个不同于AP的多肽,疏水性从25%提高到38%,阳离子表面活性从+1提高到+5。
[0027] 12)用标准的化学合成法合成并纯化多肽Ap和Apn。
[0028] 13)采用圆二色(CD)的
光谱法对多肽Ap和Apn进行分析,采用ClustalW生物
软件进行同源性分析,分析标准同源性高于30%。
[0029] 14)用生物信息学软件PSIPRED和SOPMA对多肽Ap和Apn进行二级结构预测。
[0030] 综上所述,本发明提供了一种基于尖膀胱螺的血细胞抗菌肽一级结构而设计的具有抗真菌活性的抗真菌肽,该抗真菌肽的设计方法包括以下几个步骤:首先从尖膀胱螺的血细胞中分离和纯化得到一个天然多肽,从其一级结构可见,这个多肽含有47个氨基酸残基,将其命名为AP;其次,通过人工合成得到一个分子量为5100.78Da的多肽;这个多肽含有25%的疏水氨基酸,并带有1个净正电荷,该多肽与已知的活性抗菌肽具有部分同源性,基于这个序列信息,设计和构建了一个具有30个氨基酸残基的新多肽并命名为Apn,它带有5个净正电荷,分子量为3028Da,具有38%的疏水分子,其具有较强的疏水性和阳离子表面活性;Apn的二级结构是采用圆二色法测定的,因此N-末端有一个疏水性表位,C-末端有一个亲水性表位,形成了一个两性分子。通过实验证明,Apn多肽比AP多肽更具活性,而且达到100μM时仍然对CHSE-214细胞为细胞毒作用。可见,对天然多肽的化学修饰和有效结构的化学合成也可以获得更具活性抗菌肽,同时还克服了天然多肽规模化生产和应用时的低比活度等
缺陷。
[0031] 本发明提供的抗真菌肽具有较为广泛的抗真菌谱,并且对细胞毒性低,可采用生物或化学方法制备,克服了天然多肽规模化生产和应用时的低比活度等缺陷,可应用于
水产养殖业,尤其用于控制水霉菌,可以有效地保护鱼类生长的各个阶段。
附图说明
[0032] 以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
[0033] 图1为
实施例1中馏分的多肽谱系图,其中,图上的
蛋白质电泳图中左侧为标准蛋白质分子量,右侧为具有抗真菌活性的馏分。
[0034] 图2为实施例4中抗菌肽的同源性分析图。
[0035] 图3为实施例4中圆二色谱法对多肽的分析结果。
[0036] 图4为实施例4中得到的抗菌肽二级结构模型,其中,左图为抗菌肽Ap,右侧为抗菌肽Apn。
具体实施方式
[0037] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解,这些实施例仅用于说明本发明,其不以任何方式限制本发明的范围。
[0038] 实施例1AP多肽的提取和纯化
[0039] 从野外捕捉自然生长的尖膀胱螺,于温度保持在15℃,盐度保持在35‰条件下实验室饲养。
[0040] 每只尖膀胱螺采集0.5ml的血液,并加入等体积的改良的Alsever’s溶液抗凝缓冲液(缓冲液配方如下:枸橼酸三钠2H2O 8.0g,枸橼酸0.5g,无水
葡萄糖20.8g,
氯化钠22.3g,EDTA3.36g,蒸馏水1000ml,溶解,过滤,分装,高压消毒,4℃
冰箱保存备用)混匀,于
800g,4℃下离心15min;血细胞沉淀反复冻融3次,然后加入5倍体积的50mM的Tris缓冲液(pH8.7,含有50mM NaCl),然后用玻璃匀浆器匀浆;于10000g,4℃下离心20min;将含有细胞器的沉淀用3倍体积的2M
醋酸重悬,并冷水浴,重复3次;于10000g,4℃下离心20min,以便去除细胞碎片,上清液4℃保存备用。
[0041] 按照常规的固相萃取和HPLC(高效液相色谱)方法提取和纯化蛋白。操作如下:将上述含有蛋白的上清液,加到Sep-Pak Plus C-18柱子上,分别用5%,40%和80%的乙腈
酸化水洗脱。收集洗脱液并检测抗菌活性,只有40%的乙腈酸化洗脱液具有活性。
[0042] 然后将40%的乙腈酸化洗脱液收集,并加到反相HPLC中进一步纯化。色谱柱的规格为:Sephasil C-18,250×4.1mm。然后再用0-60%线性梯度的酸化乙腈溶液洗脱,收集洗脱液,冻干并用0.2ml超纯水溶解,然后检测抗菌活性。
[0043] 具有抗真菌活性的馏分的多肽谱系分布在小于6.5kDa的范围内,如图1所示。
[0044] 采用常规的电泳方法,将上清液样品加到SDS-PAGE凝胶的样品槽中,采用Sigma公司的1-45kDa作为标准蛋白分子量。电泳采用的
电压是80V,电泳时间为3h。然后将蛋白转到PVDF膜上,用Edman测序法分析氨基酸的组成,结果如下:TYMPVEEGEYIVNISYADQPKKNSPFTAKKQPGPKVDLSGVKAYGPG(SEQ.ID.NO.1)。
[0045] 实施例2新抗菌肽Apn的设计
[0046] 为了提高抗菌肽的疏水性(从25%提高到38%)和阳离子表面活性(从+1提高到+5),从N-末端开始删除10个亲水性氨基酸:T-1,Y-2,Y-10,N-13,S-15,Y-16,Q-19,N-23,Q-31和Y-44。同时删除5个带负电荷的氨基酸:E-6,E-7,E-9,D-18和D-37。将形成的两性分子多肽命名为Apn,其是一个不同于AP的多肽,序列如下:MPVGIVIAPKKSPFTAKKPGPVLSGVKAGPG(SEQ.ID.NO.2)。
[0047] 实施例3抗菌肽的化学合成和纯化
[0048] 采用标准的化学合成法(陆莹瑾,王禾。抗菌肽的固相合成,分离纯化与构效关系的研究,
生物工程学报,1997,13(1):35-41)合成上述多肽Ap和Apn。
[0049] 合成后,用10%(v/v)乙酸双蒸馏水提取多肽,然后通过RP-HPLC纯化多肽,纯度大于95%。通过质谱方法确定纯化多肽Apn的分子量为3.028kDa。
[0050] 实施例4抗菌肽的同源性和结构特性分析
[0051] 通过在蛋白质
数据库选取大量蛋白,用ClustalW生物软件对上述抗菌肽进行同源性分析和比较,结果见表1和图2。
[0052] 表1抗菌肽的同源性比较结果
[0053]
[0054] 结果显示,Ap和Apn分析标准同源性高于30%。天然抗菌肽Ap与地中海果蝇Ceratotoxin C具有较高的同源性,而新型抗菌肽Apn则与地中海果蝇Ceratotoxin C的同源性达到39%。
[0055] 采用圆二色(CD)光谱法分析上述合成的多肽。每个样品重复三次,取平均值作为最终测定结果,如图3所示。用生物信息学软件PSIPRED和SOPMA(来源于
网站ExPASy web server,http://expasy.org)对Ap和Apn进行二级结构预测,结果见图4。
[0056] 实施例5抗细菌活性试验
[0057] 用微球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌进行上述抗菌肽的抗细菌活性测定。
[0058] 这些细菌在TSB培养基上于37℃培养,待生长到OD(620nm)值为0.2-0.3时,取100μl(1∶100)稀释菌液,加入10μl抗菌肽,继续培养24h,检测菌液的吸光度值(620nm)来决定细菌生长是否被抑制。抗菌肽的浓度范围为33μM。结果见表2。
[0059] 表2抗菌肽的抗细菌活性测定
[0060]
[0061] 上述抗细菌试验结果表明,两种抗菌肽均无明显的抗细菌活性。
[0062] 实施例6抗真菌活性试验
[0063] 用尖孢镰刀菌、粗糙链孢菌和水霉对上述抗菌肽进行抗真菌活性试验。
[0064] 将80μl的真菌孢子,浓度为1×104个孢子/ml,
四环素(10μg/ml),
链霉素(10μg/ml)和20μl抗菌肽共同加到微量板中,然后室温(22℃)培养30min,检测吸光度值(595nm)。然后再继续室温培养72h后,在测定吸光度值(595nm)。通过比较吸光度值的差来判定真菌生长的抑制情况。抗菌肽使用浓度1.3μM。结果示于表3。
[0065] 表3抗菌肽的抗真菌活性测定
[0066]
[0067] N表示没有活性。
[0068] 上述抗细菌试验结果表明,两种抗菌肽均有抗真菌活性,且Apn具有较为广泛的抗真菌谱。
[0069] 实施例7细胞毒性试验
[0070] 采用CHSE-214细胞测定上述抗菌肽的细胞毒性。
[0071] 当CHSE-214
单层细胞生长到铺满培养板孔底的70%时,用PBS洗3次,然后加入不同浓度的抗菌肽(浓度范围为1-100μM)作用3h,每个浓度设置3个孔。然后用PBS洗3次,再用含有0.1%胰蛋白酶的EDTA作用30-60s,消化细胞。然后用台盼兰
染色方法检测细胞活性。结果如表4所示,对照组细胞存活率大于90%。
[0072] 表4抗菌肽的细胞毒性测定结果
[0073]
[0074] 上述试验结果表明,在浓度小于10μM时,Ap和Apn无明显差异,而在浓度大于33μM时,Apn的毒性明显小于Ap。