一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用
专利汇可以提供一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 纳米材料 制造领域，涉及一种利用 微波 辅助法制备 碳 点的方法及应用，特别是指一种 荧光 碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用：本发明同时能够检测细胞活性，区分正常细胞与癌细胞以及对肝癌细胞特异性的细胞膜靶向。该方法利用微波辅助法，以 柠檬酸 ，三亚乙基四胺和荧光素为原料，以 乙醇 为 溶剂 ，DMSO为共溶剂，100-140℃反应2-8小时，通过 透析 、旋蒸，得到荧光碳点。该方法操作简单、原料易得、绿色环保。本发明制备的碳点可同时用于细胞中检测细胞活性，区分正常细胞与癌细胞以及对肝癌细胞特异性的细胞膜靶向。在 生物 、医疗等领域具有潜在的应用价值。，下面是一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用专利的具体信息内容。
1.一种荧光碳点的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）将柠檬酸、三亚乙基四胺和荧光素混合溶于无水乙醇中，加入共溶剂DMSO，配制成前体溶液，放置于微波反应管中；
（2）将步骤（1）中的微波反应管放置于微波反应器中，使前体溶液在加热条件下进行反应，反应后的产品自然冷却至室温；
（3）经步骤（2）冷却后的产品用6000 r/min转速离心处理，去除大颗粒，然后用透析膜透析处理，得到纯化后的CDs溶液；
（4）将步骤（3）得到的CDs溶液旋蒸，得到荧光碳点。
2.根据权利要求1所述的荧光碳点的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中柠檬酸、三亚乙基四胺和荧光素的摩尔质量比为1：（1-5）：（1-5）。
3.根据权利要求1所述的荧光碳点的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中加热温度为100-140 ℃，反应时间为2-8 h。
4.根据权利要求1所述的荧光碳点的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中透析袋规格是1 KDa，透析时间为72 h。
5.权利要求1-4任一项制备的荧光碳点，其特征在于：所述碳点在460 nm条件下随着pH的增加，荧光强度减弱；520 nm条件下随着pH的增加，荧光强度增强。
6.权利要求5所述的荧光碳点在检测细胞活性中的应用，其特征在于步骤如下：
（1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h，得到培养液A，其中细胞为HeLa细胞、A549细胞、MCF-7细胞，4T1细胞和Raw264.7细胞中的任意一种；
（2）将荧光碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h，得到培养液B；
（3）将溶酶体染色剂LysoTrackerTM Deep Red加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育15 min，得到培养液C；
（4）将溶酶体染色剂MitoTrackerTM Deep Red加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育15 min，得到培养液D；
（5）将核染试剂NucRedTM Live 647加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育15min，得到混合液E；
（6）将将冰冷的甲醇加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育5 min，得到混合液F；
（7）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的磷酸盐缓冲液；用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。
7.权利要求5所述的荧光碳点在区分正常细胞与癌细胞中的应用，其特征在于步骤如下：
（1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h，得到培养液A，其中细胞为3t3细胞或7702细胞；
（2）将荧光碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h，得到培养液B；
（3）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的磷酸盐缓冲液；用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。
8.权利要求5所述的荧光碳点在肝癌细胞特异性的细胞膜靶向中的应用，其特征在于步骤如下：
（1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h，得到培养液A，其中细胞为HepG-2细胞或SMMC-7721细胞；
（2）将荧光碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h，得到培养液B；
（3）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的磷酸盐缓冲液；用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。
9.根据权利要求6、7或8所述的应用，其特征在于：共聚焦皿中的细胞培养液包括DMEM高糖培养基、10%体积百分数的胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。
10.根据权利要求6、7或8所述的应用，其特征在于：荧光碳点加入后的终浓度为50-100μg/mL。
一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用
技术领域
背景技术
溶酶体具有多种水解酶，包括蛋白降解的组织蛋白酶和高质子浓度(pH < 5.5)，其负责细胞和细胞外成分的受控循环。与正常细胞相比，癌细胞中的溶酶体数量更多、体积更大、组织蛋白酶活性更强。癌基因驱动的转化改变了癌细胞的溶酶体膜，使其对溶酶体膜渗透(LMP)敏感，LMP一方面通过向细胞外空间释放组织蛋白酶来促进肿瘤的侵袭和进展；而另一方面，癌细胞的溶酶体膜致敏增加了泄漏的易感性，而根据LMP的程度和向细胞质释放的活性组织蛋白酶的数量，可以触发从典型的凋亡到坏死的各种死亡形态。因此，溶酶体被认为是通过溶酶体细胞死亡(LCD)途径选择性杀伤癌细胞的药理靶点。这提示了LMP诱导的具体策略可能导致新的治疗途径。（参见: Tian M, Ma Yy, et al. Fluorescent Probes for the Visualization of Cell Viability[J]. American Chemical Society, 2019. Zhang H , Liu J , Liu C , et al. Imaging lysosomal highly reactive oxygen species and lighting up cancer cells and tumors enabled by a Si-rhodamine-based near-infrared fluorescent probe[J]. Biomaterials, 2017, 133:60-69.）癌症已被认为是一种绝症，每天都会有大量的人死于癌症。癌症的早期检查与诊断可以大大提高肿瘤的治愈率,减轻患者的痛苦。当癌症被确诊之后,对肿瘤进行及时的治疗非常重要。利用标记物诊断癌症是近年来获得早期诊断的重要研究课题（Javier Hernández, Thompson I M . Prostate-specific antigen: A review of the validation of the most commonly used cancer biomarker[J]. Cancer, 2004, 101(5):894-904.）。虽然大量的肿瘤标志物大大提高了诊断，但目前诊断程序的侵入性以及不方便的性质限制了其应用。而荧光碳点的技术因其高分辨率、易操作和非破坏性等特点而成为体内外生物医学研究的有力工具。其较弱的光漂白、较弱的背景荧光、较深的组织穿透，被认为是生物学研究的首选成像方法，促进了细胞生物学的进展。（Ohsaki Y , Shinohara Y , Suzuki M , et al. A pitfall in using BODIPY dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy[J]. Histochemistry & Cell Biology, 2010, 133(4):477-480.）专利CN201710432058.7公开了一种高荧光量子产率的聚合物碳点、制备方法及其在靶向肿瘤细胞检测方面的应用，该聚合物碳点虽然可用于生物成像，作为癌症诊断和治疗的荧光显像材料来使用，但对pH的变化并没有敏感的响应，并不能用于区分不同的癌细胞。本专利申请的碳点在区分正常细胞和癌细胞有着较明显的应用，这对癌细胞的生长、繁殖、转移和靶向治疗具有重要意义。此外，现有癌症的肿瘤细胞多种多样，每种癌细胞有其自己特有的致癌基因。但目前还没有一种方法能够直观的区分各种癌细胞或某一特定的癌细胞。本发明能够在肝癌细胞中特异性的靶向细胞膜。其在区分肝癌细胞和其他癌细胞中具有潜在的应用价值。
发明内容
（1）将柠檬酸、三亚乙基四胺和荧光素混合溶于无水乙醇中，加入共溶剂DMSO，配制成前体溶液，放置于微波反应管中；
（2）将步骤（1）中的微波反应管放置于微波反应器中，使前体溶液在加热条件下进行反应，反应后的产品自然冷却至室温；
（3）经步骤（2）冷却后的产品用6000 r/min转速离心处理，去除大颗粒，然后用透析膜透析处理，得到纯化后的CDs溶液；
（4）将步骤（3）得到的CDs溶液旋蒸，得到荧光碳点。
（2）将荧光碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h，得到培养液B；
（3）将溶酶体染色剂LysoTrackerTM Deep Red加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育15 min，得到培养液C；
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（4）将溶酶体染色剂MitoTracker Deep Red加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育15 min，得到培养液D；
（5）将核染试剂NucRedTM Live 647加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育15min，得到混合液E；
（6）将将冰冷的甲醇加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育5 min，得到混合液F；
（7）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的磷酸盐缓冲液；用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。
（2）将荧光碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h，得到培养液B；
（3）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的磷酸盐缓冲液；用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。
（2）将荧光碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h，得到培养液B；
（3）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的磷酸盐缓冲液；用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。
附图说明
具体实施方式
将30 mg柠檬酸，39 µL三亚乙基四胺和10.4 mg荧光素（摩尔比=1:1:5）混合溶于2 mL无水乙醇中，加入20 µLDMSO，配制成前体溶液，放置于微波反应管中；将微波反应管放置于微波反应器中，将该前体溶液加热到130oC，反应2 h；得到的产品自然冷却到室温；得到的产品以6000 r/min转速离心处理，去除大颗粒；用规格是1 KDa的透析膜透析处理72 h，得到纯化后的CDs溶液；将CDs溶液旋蒸，得到CDs固体粉末。CDs溶液的紫外-可见光吸收光谱、激发光谱和荧光发射光谱见附图2-3。由图2可知：本申请的碳点吸收在370 nm和490 nm。由图3可知：本申请的碳点发射在461和535 nm；其电镜图及粒径分布图见附图4-5，由图4可知本申请的碳点分散均匀；碳点的平均粒径为8 nm（图5）。其在不同激发下的荧光发射图见附图6，可得出本申请的碳点不具有激发依赖性。
将30 mg柠檬酸，78 µL三亚乙基四胺和4.16 mg荧光素（摩尔比=1:2:2）混合溶于2 mL无水乙醇中，配制成前体溶液，放置于微波反应管中；将微波反应管放置于微波反应器中，将该前体溶液加热到120 ℃，反应6 h；得到的产品自然冷却到室温；将得到的产品以6000 r/min转速离心处理，去除大颗粒；用规格是1 KDa的透析膜透析处理72 h，得到纯化后的CDs溶液；将CDs溶液旋蒸，得到CDs固体粉末。
将30 mg柠檬酸，195 µL三亚乙基四胺和2.08 mg荧光素（摩尔比=1:5:1），配制成前体溶液，放置于微波反应管中；将微波反应管放置于微波反应器中，将该前体溶液加热到140℃，反应0.5 h；得到的产品自然冷却到室温；将得到的产品以6000 r/min转速离心处理，去除大颗粒；用规格是1 KDa的透析膜透析处理72 h，得到纯化后的CDs溶液；将CDs溶液旋蒸，得到CDs固体粉末。
将HeLa细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h（细胞培养液包含DMEM高糖培养基、10%体积百分数的胎牛血清，100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）；将CDs配制成溶液加入共聚焦皿中，使终浓度为100 μg/mL ，在37℃，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h；为了考察CDs对活细胞溶酶体靶向识别功能的准确性，在共聚焦培养皿中加入商业化溶酶体染色剂LysTrackerTM Deep Red，终浓度为50 nM，孵育
15 min；与其做对照的培养皿加入商业化线粒体染色剂MtioTrackerTM Deep Redn，终浓度为50 nM，孵育15 mi，以及加入核染试剂NucRedTM Live 647 2 d/mL，孵育15min；移去上述的混合液，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3遍，加入新鲜的磷酸盐缓冲液。用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。用波长为488 nm的激光器照射，收取500-600 nm范围内的荧光图像，对应为商业化溶酶体染色剂LysTrackerTM DeepRed染色区域，商业化线粒体染色剂MtioTrackerTM Deep Red以及核染试剂NucRedTM Live 640，用波长为638 nm的激光器照射，收取650-750 nm范围内的荧光图像，对应为染色区域。结果图片见附图7, 本申请的碳点分别与溶酶体（a1），线粒体（b1）以及细胞核（c1）的商业化染料共染，与溶酶体染料（a2）的共染效果较好，有良好的溶酶体靶向功能；而与线粒体（b2）和细胞核（c2）染料共染效果较差；证明了本申请的碳点具有良好的溶酶体靶向性。为了考察CDs能够实现对细胞活性的检测，在共聚焦培养皿中加入1 mL冰冷甲醇，固定5 min，用波长为488 nm的激光器照射，收取500-600 nm范围内的荧光图像。结果图片见附图8，本申请的碳点从靶向活细胞的溶酶体移动到了固定细胞（死细胞）的细胞核核仁。
100 μg/mL链霉素）；将pH-CDs配制成溶液加入共聚焦皿中，使终浓度为100 μg/mL ，在37 ℃，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h；为了考察CDs对肝癌细胞细胞膜靶向识别功能的准确性，用波长为488 nm的激光器照射，收取500-600 nm范围内的荧光图像。结果图片见附图10，本申请的碳点染色肝癌细胞HepG-2细胞的细胞膜，这明显区别于靶向溶酶体的宫颈癌细胞HeLa细胞。
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