用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株棘孢曲霉及其制备方法
阅读：728发布：2020-05-11
专利汇可以提供用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株棘孢曲霉及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种新的突变株棘孢曲霉E14-292(Aspergillus aculeatus E14-292)和所述菌株的一种基因修饰方法，其中，本发明所述的突变株比BCC199(野生型)能产生更多的 纤维 素酶和木聚糖酶。而且，所获得的酶能用于消化预处理的 甘蔗 渣以进一步有效地产生糖。，下面是用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株棘孢曲霉及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种用于产生纤维素酶和木聚糖酶的突变株棘孢曲霉E14-292(Aspergillus aculeatus E14-292)，保藏登录号为NITE ABP-02391，其中所述突变株由化学诱变基因修饰产生。
2.一种产生权利要求1所述的突变株棘孢曲霉E14-292的基因修饰方法，其中，所述方法包括以下步骤：
a)以20-30mM每107个孢子的甲基磺酸乙酯(EMS)与真菌的比例范围，使棘孢曲霉BCC199(野生型)与甲基磺酸乙酯接触1至3个小时；
b)培育从a)产生的突变株棘孢曲霉；和
c)分离从步骤b)中培育的突变株棘孢曲霉。
3.根据权利要求2所述的基因修饰方法，其中步骤a)甲基磺酸乙酯与真菌的比例在25-
26mM每107个孢子的范围内。
4.根据权利要求2或3所述的基因修饰方法，其中步骤a)进行3小时。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的基因修饰方法，其中步骤a)还包括添加选自氢氧化钠或硫代硫酸钠的解毒剂的步骤。
6.根据权利要求5所述的基因修饰方法，其中所述解毒剂为硫代硫酸钠(Na2S2O3)。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的基因修饰方法，其中，所述方法进行两次。
8.一种通过固态发酵法生产纤维素酶和木聚糖酶的方法，所述方法包括培养权利要求
1所述的突变株棘孢曲霉E14-292的步骤，其中突变株棘孢曲霉E14-292与培养基以109-1011孢子/kg的比例范围在25-32℃的温度下72-120小时。
9.根据权利要求8所述的通过固态发酵法生产纤维素酶和木聚糖酶的方法，其中突变株棘孢曲霉E14-292与培养基的比例在1x1010–5x1010孢子/kg的范围内。
10.根据权利要求8所述的通过固态发酵法生产纤维素酶和木聚糖酶的方法，其中，所述方法在30℃的温度下进行。
11.根据权利要求8所述的通过固态发酵法生产纤维素酶和木聚糖酶的方法，其中，所述方法进行96小时。
12.通过深层发酵法生产纤维素酶和木聚糖酶的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过在培养基中培养突变株棘孢曲霉E14-292来制备种子接种物，其中，突变株棘孢曲霉E14-292与培养基以107–109孢子/L的比例范围在25–32℃温度下36–60小时；和b)将从a)获得的种子接种物转移到培养基中以达到10–15％(w/v)的浓度，并在25–32℃的温度下发酵96–144小时。
13.根据权利要求12所述的通过深层发酵法生产纤维素酶和木聚糖酶的方法，其中，步骤a)中突变株棘孢曲霉E14-292与培养基的比例在1x108–5x108孢子/L的范围内。
14.根据权利要求12所述的通过深层发酵法生产纤维素酶和木聚糖酶的方法，其中，步骤a)在30℃的温度下进行。
15.根据权利要求12所述的通过深层发酵法生产纤维素酶和木聚糖酶的方法，其中，步骤a)进行48小时。
16.根据权利要求12所述的通过深层发酵法生产纤维素酶和木聚糖酶的方法，其中，步骤b)中的种子接种物的浓度在12–13％(w/v)的范围内。
17.根据权利要求12所述的通过深层发酵法生产纤维素酶和木聚糖酶的方法，其中，步骤b)在30℃的温度下进行。
18.根据权利要求12所述的通过深层发酵法生产纤维素酶和木聚糖酶的方法，其中，步骤b)进行120小时。
19.根据权利要求8至18中任一项所述的通过深层发酵法生产纤维素酶和木聚糖酶的方法，其中碳源选自纤维素粉或木质纤维素材料，例如稻草、甘蔗渣、玉米芯、玉米茎。
20.根据权利要求19所述的纤维素酶和木聚糖酶的生产方法，其中所述碳源是玉米芯。
21.权利要求8-20中任一项所述的方法产生的酶用于生物质的糖化的用途。
22.根据权利要求21所述的酶用于甘蔗渣糖化中的用途。
用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株棘孢曲霉及其制备
方法
技术领域
背景技术
[0002] 目前，从木质纤维素生物质生产生物燃料和基础化学品作为石油产品的替代越来越引起人们的兴趣，因为有效的生物精炼工业(biorefinery industrials)是燃料、化学品、材料和来自生物质化学组成成分的能源的整合，包括来自接近零废物处理过程的它们的副产品，以最大化原材料的价值。这在技术和经济两方面都是非常有趣的方式。因此，在通过合适的生物和化学过程生产生物燃料中的糖化过程引起了更多的兴趣。
[0004] 生物质的酶糖化是在生产燃料和其他生化物质的过程中，为了从生物质中生产糖而获得许多利益的消化过程之一，因为该过程需要较少的极端化学品、温度或能量，在催化中不需要辅因子或其他金属。因此，生物质的酶糖化引起了许多兴趣。
[0005] 糖化过程使用2个主要的酶组：纤维素酶组和半纤维素酶组。纤维素酶组包含3种类型的酶：1)内切葡聚糖酶，2)外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶，以及3)β-葡萄糖苷酶，可将纤维素消化为葡萄糖。半纤维素酶组包括木聚糖内切酶和β-木糖苷酶，它们消化作为半纤维素的主要成分的木聚糖。此外，还有其他消化半纤维素的酶，例如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和β-甘露聚糖酶。
[0006] 纤维素酶和半纤维素酶的协同作用是有效糖化过程中的重要因素。这些酶可以分为两种主要形式：游离酶和含有几种酶的纤维小体(cellulosome)。纤维素体可以由不同属的细菌和真菌产生，例如梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)、或木霉属(Trichoderma)、枝顶孢属(Acremonium)和曲霉属(Aspergillus)。
[0007] 目前，有很多种改进真菌菌株的方法，例如突变体诱导、重组和基因克隆等。化学诱导的突变是用于菌株改良的流行方法之一，因为它简便且高效的。关于使用化学诱变剂来增加真菌的蛋白质或酶产量的真菌的基因修饰，存在一些报道和专利文献如下。
[0008] EP 2150615B1公开了可以大量生产纤维素酶的纤维素枝顶孢CF-2612(Acremonium cellulolyticus CF-2612)，以及从所述菌株制备纤维素酶和/或半纤维素酶的方法，包括从获得的酶的糖化方法。
[0009] WO 2013/028927 A1公开了木霉属宿主细胞和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的多核苷酸的重组基因修饰方法，以大量生产纤维素酶并改善生物质的糖化作用。
[0010] JP 2016015894A公开了从突变株棘孢曲霉获得的β-葡萄糖苷酶，其具有在基因编码68、69、98、99、200、201、204、248、305、358、436、437和511的核苷酸序列的氨基酸取代。
[0011] EP 1479765A3公开了通过重组方法从突变株棘孢曲霉CBS 101.43获得的有效木聚糖酶，其用于植物细胞壁的糖化。
[0012] JP 2012200184A公开了通过重组方法从突变株棘孢曲霉制备纤维素酶。为了增加蛋白质的生产率，将与纤维素酶和半纤维素酶的产生相关的基因添加到棘孢曲霉的壁宿主中，并且JP 2011223962A也公开了通过突变方法由突变株棘孢曲霉产生的纤维素酶。
[0013] 然而，酶糖化过程的一个问题是由微生物生产酶的高成本。已经尝试研究和开发能够产生更多酶的微生物。由于上述原因，需要能够大量生产纤维素酶和木聚糖酶的微生物用于大规模工业，并且将酶用于从农业原料进一步生产糖。
[0014] 而且，根据以上公开的信息，尚未对棘孢曲霉进行化学诱导基因修饰，以产生更高的纤维素酶和木聚糖酶。因此，本发明旨在通过化学诱导来制备突变株棘孢曲霉，化学诱导简单且廉价，使得所述菌株能够产生大量的纤维素酶和木聚糖酶。
发明内容
[0015] 本发明涉及一种新的突变株棘孢曲霉E14-292(Aspergillus aculeatus E14-292)和所述真菌的基因修饰方法，其中所述新型突变株以保藏登录号NITE ABP-02391保藏在日本国家技术评估学会专利微生物保藏中心(NITE Patent Microorganisms Depositary，NPMD)。
[0017] 图1显示了突变株棘孢曲霉E14-292与BCC199(野生型)对比的形态。
[0018] 图2显示了在第10代后突变株棘孢曲霉E14-292产生纤维素酶和木聚糖酶的稳定性。
[0019] 图3显示了突变株棘孢曲霉E14-292和BCC199(野生型)之间的遗传分析。
具体实施方式
[0020] 定义
[0021] 除非另有说明，否则本文使用的技术术语或科学术语具有本领域普通技术人员理解的定义。
[0022] 本文提及的任何工具、设备、方法或化学物质是指本领域技术人员通常操作或使用的工具、设备、方法或化学物质，除非另外说明它们是特定用于本发明的工具、设备、方法或化学物质。
[0024] 在本发明中公开和要求保护的所有组合物和/或方法旨在涵盖来自任何行为、性能、修改或调整的实施方案，而不进行与本发明显著不同的实验，以根据本领域普通技术人员获得与本实施方案相同的结果，即使在权利要求中没有具体说明。因此，本实施方案的可替代或相似的客体，包括本领域普通技术人员显而易见的任何小的修改或调整，都应被认为是所附属权利要求中所显示的本发明的精神、范围和概念的其余部分。
[0025] 在整个申请中，术语“约”用于表示在本文中提出或显示的任何数值可能会变化或有偏差。这种变化或偏差可能是由设备、方法或使用所述设备或方法的个人的误差引起的。
[0026] 以下，所示出的本发明实施方案无任何意图限制本发明的范围。
[0027] 本发明涉及棘孢曲霉E14-292(Aspergillus aculeatus E14-292)，其通过化学诱导进行基因修饰，以产生能够生产大量纤维素酶和木聚糖酶的新菌株，包括基因修饰的方法和所得酶在生物质糖化中的用途。
[0028] 本发明的棘孢曲霉E14-292按布达佩斯条约的规定保存在日本的国家技术评估学会专利微生物保藏中心(NPMD)，其中所述菌株于2016年12月19日保藏，保藏登录号为NITE ABP-02391。
[0029] 本发明中使用的术语“培养”是指包括液体培养或固体培养，但不限于所述方法，只要能培养根据本发明的菌株即可。
[0030] 术语“糖化”表示包括生物质中纤维素和/或半纤维素的糖化为寡糖、二糖、单糖或它们的混合物。同样，生物质的糖化表示包括通过纤维素酶和/或半纤维素酶水解多糖的糖苷键。
[0031] 在一个实施方案中，突变株棘孢曲霉是从化学诱导棘孢曲霉BCC199(野生型)的基因修饰获得的，其中所述突变株是棘孢曲霉E14-292。
[0032] 在本发明的一个方面，为了获得突变株棘孢曲霉的基因修饰方法包括以下步骤：
[0033] a)以20-30mM每107个孢子的甲基磺酸乙酯(methylethanesulfonate，EMS)与真菌的比例范围，使棘孢曲霉BCC199(野生型)与甲基磺酸乙酯接触1至3个小时；
[0034] b)培育从a)获得的突变株棘孢曲霉；和
[0035] c)分离从步骤b)中培育的突变株棘孢曲霉。
[0036] 优选地，以甲基磺酸乙酯与棘孢曲霉BCC199(野生型)在25–26mM每107个孢子之间的比例接触3小时。
[0038] 优选地，所述解毒剂是硫代硫酸钠(Na2S2O3)，并被添加至最终浓度为3.33％(w/v)。
[0039] 在本发明的一方面，在基因修饰方法的步骤b)中获得的用于生产突变株棘孢曲霉的培养过程在20至40℃，优选30℃的温度下进行12至24小时，优选20至24小时。
[0041] 在本发明的一方面,可以通过在根据曼德斯(Mandels)的固体培养基中将步骤b)中获得的真菌在20–40℃，优选30℃的温度下培养100–130小时，优选120小时，来进行分离步骤c)中的突变株棘孢曲霉。将获得的真菌用刚果红染色以测量透明区和菌落直径以进行分离。与野生型相比，突变株的透明区与菌落的直径比更高。
[0042] 根据曼德斯(Mandels)固体培养基包含0.3g/L尿素、1.4g/L硫酸二铵、2.0g/L磷酸二氢钾、0.4g/L氯化钙、0.3g/L七水硫酸镁、1.0g/L蛋白胨、0.2g/L吐温80、5.0mg/L七水硫酸铁、1.6mg/L一水锰(manganese monohydrate)、1.4mg/L七水硫酸锌、2.0mg/L六水氯化钴、10g/L微晶纤维素和17.5g/L明胶。
[0043] 在本发明的一方面，优选地为了获得突变株棘孢曲霉的基因修饰方法进行两次。
[0044] 在本发明的一方面，由上述方法产生的突变株棘孢曲霉E14-292具有在其突变之前，在1000个碱基对处具有与蛋白质分泌相关的基因，例如3个基因的t-SNARE蛋白，与Rho型小GTPase 5基因的产生有关的基因，以及与Rab11/YPT3小GTPase的产生有关的基因的核苷酸序列。
[0045] 在本发明的一方面，由突变株棘孢曲霉E14-292产生纤维素酶和木聚糖酶的方法可以在固态发酵(solid state fermentation，SSF)和深层发酵(submerged fermentation，SmF)条件下进行发酵。
[0046] 在本发明的一方面，用于深层发酵的培养基选自含有35–40g/L玉米芯、10–15g/L大豆废料、0.1–0.2g/L氯化钾、0.01–0.04g/L七水硫酸锌、0.0001–0.0011g/L六水氯化镍、0.005-0.020g/L七水硫酸铁和0.5-1.5g/L吐温20的培养基。
[0047] 在本发明的一方面，用于固态发酵的培养基选自包含700-800g/kg固体培养基的玉米芯、200-300g/kg固体培养基的大豆废料、1-2g/kg固体培养基的氯化钾、0.05-0.2g/kg固体培养基的七水硫酸锌、5-7mg/kg固体培养基的六水氯化镍、0.05-0.2g/kg固体培养基的七水合硫酸铁和5-12g/kg固体培养基的吐温20的培养基。
[0048] 在本发明的一方面，包括培养根据权利要求1的棘孢曲霉E14-292的步骤的固态发酵，其中突变株棘孢曲霉E14-292与培养基在109-1011孢子/kg的比例范围内在25-32℃的温度范围下72-120小时。
[0049] 优选地，突变株棘孢曲霉E14-292与培养基的比例为1x1010–5x1010孢子/kg的范围内，并在30℃的温度下进行96小时。
[0050] 在本发明的一方面，深层发酵过程从通过在培养基中培养突变株棘孢曲霉E14-292来制备种子接种物开始，其中突变株棘孢曲霉E14-292与培养基以107–109孢子/L的比例范围在25–32℃的温度范围下36–60小时。然后，将获得的种子接种物转移到培养基中达到
10–15％(w/v)的浓度，并在25–32℃的温度范围内发酵96–144小时。
10–15％(w/v)的浓度，并在25–32℃的温度范围内发酵96–144小时。
[0051] 优选地，种子接种物的制备步骤是通过在30℃的温度下以1x108-5x108孢子/L的突变株棘孢曲霉E14-292与培养基的比例在培养基中培养突变株棘孢曲霉E14-292持续48小时来完成。
[0052] 优选地，酶的发酵步骤可以通过将种子接种物转移到培养基中直至浓度达到12-13％(w/v)，并在30℃的温度下发酵120小时来完成。
[0054] 在本发明的一方面，可以通过本领域普通技术人员已知的一般分离方法，例如离心、过滤或相关方法，从含有所述由真菌产生的酶的培养基中分离真菌。含纤维素酶和木聚糖酶的培养液可以直接用作粗酶。
[0055] 在本发明的一方面，含有纤维素酶和木聚糖酶的上清液可以通过本领域普通技术人员已知的方法进一步纯化，其中可以将两种以上的纯化方法一起使用。
[0056] 在本发明的一方面，由突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶包括：1)纤维素分解酶(cellulolytic enzyme)，例如纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶；以及2)半纤维素分解酶，例如木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶和果胶酯酶(pectinesterase)。
[0057] 在本发明的一方面，由突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶能用于生物质的糖化，其中优选的生物质是甘蔗渣。
[0058] 在本发明的一方面，用于糖化的生物质可以是湿的或干的两种形式使用。
[0059] 在本发明的一方面，用于糖化的生物质可以进行选自以下的预处理过程：1)使用碱催化剂方法进行蒸汽闪爆(steam explosion)；2)有机溶剂分离方法；3)丙酮中的氢氧化钠法(sodium hydroxide in acetone method)；和4)甲醇中的甲醇钠方法(sodium methoxide in methanol method)，或者可以在酶促糖化之前使用两种或更多种预处理方法。
[0060] 在本发明的一方面，由突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶可以与其他酶一起用作混合酶或与表面活性剂一起使用，以提高生物质的糖化性能。
[0061] 以下部分仅旨在描述本发明的实施方案，而不以任何方式限制本发明的范围。
[0062] 实施例1：化学诱导棘孢曲霉的基因修饰及产生大量纤维素酶和木聚糖酶的突变株的选择
[0063] 浓度约1x107孢子/mL的棘孢曲霉BCC199(野生型)通过加入甲基磺酸乙酯(EMS)进行化学诱导的基因修饰，直至达到25.4mM的最终浓度并保持约3小时。然后，加入硫代硫酸钠(Na2S2O3)直至达到3.33％(w/v)的最终浓度。然后，将突变株在温度为30℃的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)中培养24小时。然后，将获得的菌株分离为单个菌落以便通过在根据曼德斯(Mandels)的固体培养基中培养来选择其菌株，根据曼德斯(Mandels)的固体培养基包含0.3g/L尿素、1.4g/L硫酸二铵、2.0g/L磷酸二氢钾、0.4g/L氯化钙、0.3g/L七水硫酸镁、
1.0g/L蛋白胨、0.2g/L吐温80、5.0mg/L七水硫酸铁、1.6mg/L一水锰(manganese monohydrate)、1.4mg/L七水硫酸锌、2.0mg/L六水氯化钴、10g/L微晶纤维素和17.5g/L明胶。然后，将其在30℃的温度下温育120小时。将获得的真菌用刚果红染色，并测量透明区和菌落的直径以进行分离。突变株比野生型具有更高的透明区与菌落的直径比，以用于进一步的实验。
1.0g/L蛋白胨、0.2g/L吐温80、5.0mg/L七水硫酸铁、1.6mg/L一水锰(manganese monohydrate)、1.4mg/L七水硫酸锌、2.0mg/L六水氯化钴、10g/L微晶纤维素和17.5g/L明胶。然后，将其在30℃的温度下温育120小时。将获得的真菌用刚果红染色，并测量透明区和菌落的直径以进行分离。突变株比野生型具有更高的透明区与菌落的直径比，以用于进一步的实验。
[0064] 实施例2：突变株棘孢曲霉E14-292的物理特征
[0065] 在PDA培养基中培养突变株棘孢曲霉E14-292和野生型，并在30℃的温度下温育约170小时。使用显微镜研究获得的真菌的形态。从图1中发现，突变株的菌落直径小于野生型。突变株的直径和野生株的直径分别约为27–30cm和80–83cm。两种真菌均产生黄灰色闭囊壳(cleitothecia)和褐色分生孢子头(conidial head)排列成单列。条纹很光滑，没有壁。囊泡(vesicle)为椭圆形，大小为27.5–30微米。瓶梗(phialide)宽10微米，长7.5微米。
分生孢子(conidia)是圆形的，刺(thorn)直径为4–7微米。浅黄色菌核(sclerotina)直径为
0.4–0.5mm。
分生孢子(conidia)是圆形的，刺(thorn)直径为4–7微米。浅黄色菌核(sclerotina)直径为
0.4–0.5mm。
[0066] 实施例3：突变株棘孢曲霉E14-292的纤维素酶和木聚糖酶生产率研究
[0067] 通过分别包含玉米芯和大豆废料的固态发酵(SSF)在约700和300g/kg的固体培养基上研究了突变株棘孢曲霉E14-292和野生型的酶生产力。基本培养基包含20g/kg固体培养基的酵母提取物、10g/kg固体培养基的磷酸氢钾、22g/kg固体培养基的磷酸氢二钠、1.5g/kg固体培养基的氯化钾和微量元素。将混合物在30℃的温度下温育约120小时。通过添加50mL的pH为约5.0的50mM乙酸钠(包含约0.1体积％的吐温20)来保持获得的酶。然后，将得到的混合物在200rpm下振荡60分钟。通过以9,000rpm离心分离固体部分。分离的酶溶液经受以下测试。
[0069] 2.使用1x6 cm滤纸作为底物分析滤纸酶(FPase)，并在标准条件下进行反应(50mM柠檬酸盐缓冲剂，pH 4.8，50℃)。通过在标准条件下测量60分钟，将1FPU(滤纸纤维素酶单位)设置为等于催化1μM/min葡萄糖的酶含量，使用二硝基水杨酸(DNS)分析还原糖含量。
[0070] 3.使用1.25％(w/v)的微晶纤维素酶溶液作为底物分析微晶纤维素酶，并在标准条件下(50mM柠檬酸盐缓冲剂，pH 4.8，50℃)进行反应，当在标准条件测量时将1个酶活性单位设置为等于催化1μM/min葡萄糖的酶含量。
[0071] 4.使用羧甲基纤维素(CMC)作为内切葡聚糖酶的底物，来自沙滩木(beach wood)的1％(w/v)木聚糖作为木聚糖酶的底物，分析了羧甲基纤维素酶和木聚糖酶。将所述底物溶解在pH 5.0的50mM乙酸钠缓冲液中。反应在50℃的温度下持续10分钟。然后，使用二硝基水杨酸测量获得的还原糖，设定为1单位的内切葡聚糖酶或木聚糖酶等于在标准条件下测量时催化1μM/min的还原糖的酶含量。
[0072] 5.使用5mM 4-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷和4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷分别作为β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶的底物，对β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶进行了分析。反应在含有pH为5.0的10mM乙酸钠缓冲液的条件下在50℃的温度下进行10分钟。加入碳酸钠以达到100mM的最终浓度以终止反应。分析获得的物质在405nm处的对硝基苯酚，设定1个单位的β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶等于在标准条件下测量时催化1μM/min对硝基苯酚的酶含量。
[0073] 表1：突变株棘孢曲霉E14-292与野生型产生的纤维素酶和半纤维素酶含量比较[0074]
[0075] 从表1中可以发现突变株棘孢曲霉E14-292比野生型棘孢曲霉的纤维素酶和木聚糖酶的产量要高。此外，当测试产品的酶稳定性时，发现如图2所示，突变株棘孢曲霉E14-292直至第10代都具有很高的生产率。
[0076] 实施例4：突变株棘孢曲霉E14-292在深层发酵和固态发酵下酶产量的比较[0077] 对深层发酵和固态发酵下酶的产量进行了研究，以优化酶生产的经济条件。
[0078] 通过向装有SB1.2培养基的培养瓶(flask)中添加1x1010孢子/kg固体培养基的棘孢曲霉野生型来完成固态发酵(SSF)，该SB1.2培养基包含760g/kg固体培养基的玉米芯、240g/kg固体培养基的大豆废料、1.5g/kg固体培养基的氯化钾、0.144g/kg固体培养基的七水硫酸锌、6mg/kg固体培养基的六水氯化镍、0.138g/kg固体培养基的七水硫酸铁和10g/kg固体培养基的吐温20。调节所得混合物的初始水分含量为65％，并在30℃的温度下温育约
96小时。通过加入水或0.25重量％的Lutensol AO8溶液以固液比为1:10来保存所获得的酶。将获得的混合物在200rpm下振荡1小时，并且在4℃的温度下以9,000rpm离心5分钟。分离含有酶的上清液以进一步研究。
96小时。通过加入水或0.25重量％的Lutensol AO8溶液以固液比为1:10来保存所获得的酶。将获得的混合物在200rpm下振荡1小时，并且在4℃的温度下以9,000rpm离心5分钟。分离含有酶的上清液以进一步研究。
[0079] 通过将1x105孢子/mL棘孢曲霉转移到装有50％SB1.2培养基的培养瓶(flask)中制备种子接种物来进行深层发酵(SmF)，该培养基含有38g/L的玉米芯、12g/L的大豆废料、0.15g/L的氯化钾、0.0144g/L的七水硫酸锌、0.0006g/L的六水氯化镍、0.0138g/L七水硫酸铁和1g/L吐温20。将获得的混合物在30℃下温育并以200rpm振荡48小时。将获得的种子接种物转移到在培养瓶中制备好的50mL相同培养基中，并在30℃的温度下以129rpm振荡120分钟。通过在4℃的温度下以9,000rpm离心5分钟来分离发酵后获得的酶。分离含有酶的上清液以进一步研究。
[0080] 对从液体(SmF)和固体(SSF)培养基获得的酶的酶活性和蛋白质含量进行了测试。结果如表2所示。
[0081] 研究发现，在固态发酵后加水或Lutensol AO8溶液，突变株棘孢曲霉E14-292能产生比野生型高约1.33–1.50倍的纤维素酶。此外，当分析总蛋白含量时，发现突变型棘孢曲霉E14-292所获得的酶溶液的蛋白含量比野生型高约1.17–1.29倍。
[0082] 对于深层发酵，发现突变株棘孢曲霉E14-292能产生比野生型高约1.75倍的纤维素酶。此外，在分析蛋白质总含量时，发现从突变株棘孢曲霉E14-292的获得的蛋白质含量比野生型高约1.76倍。
[0083] 这些结果表明，突变株棘孢曲霉E14-292的纤维素酶生产潜力比野生型更高，并且在深层发酵和固态发酵中均可以产生酶。
[0084] 表2：当在SSF和SmF下培养时，突变株棘孢曲霉E14-292和BCC199产生的纤维素酶和蛋白质产量
[0085]
[0086] 实施例5：突变株棘孢曲霉E14-292的遗传物质的核苷酸序列比较
[0087] 通过改良CTAB法分离两种真菌的遗传物质，能完成突变株棘孢曲霉E14-292的遗传物质的核苷酸序列的比较。然后，使用离子个人化操作基因组测序仪(PGM)，通过离子激流测序法(ion torrent sequencing method)搜索约5μg提取的遗传物质进行碱基测序。以野生曲霉ATCC16872菌株的信息为参考遗传材料，通过生物信息学方法对获得的野生型和突变型棘孢曲霉E14-292的碱基序列进行了差异分析。通过生物信息学方法分析了突变株棘孢曲霉E14-292和野生型菌株基因组中碱基序列的差异分析细节，且如图3所示。
[0088] 比较突变株棘孢曲霉E14-292和野生型的碱基序列时，发现与24个位置的蛋白质分泌有关的碱基序列或突变基因存在差异，其中启动子基因前1000个碱基对的碱基序列差异响应对基因表达的控制。这可以算作9个基因，即3个t-SNARE蛋白基因(蛋白编码21025、43579、63670)，5个Rho型小GTPase生产基因(蛋白编码27973、38545、42185、51378、51654)和1个Rab11/YPT3小GTPase生产基因(蛋白编码58898)，如表3所示，这估计可能影响纤维素酶和半纤维素酶的较高分泌。总蛋白含量比野生型高1.76倍。
[0089] 表3：突变株棘孢曲霉产生的与纤维素分解酶和木聚糖分解酶的产生有关的基因以及与蛋白质和酶转运至其细胞外有关的蛋白质
[0090]
[0091] 实施例6：突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶在甘蔗渣糖化中的应用
[0092] 研究了蔗渣酶促糖化的条件，包括合适的酶含量和其他化学物质(例如表面活性剂)的使用，包括深层发酵和固态发酵二者产生的酶的类型。
[0093] 将5％(w/v)的经预处理的蒸汽闪爆的甘蔗渣添加到突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶中，直至达到2.5–20mg蛋白质/g底物。然后，添加磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液直到达到50mM的浓度，pH 5.0并且将叠氮化钠添加到所述混合物中直到达到0.1％的浓度。为了研究表面活性剂，将Lutensol表面活性剂加入到所述混合物中，直至达到底物的浓度为0.175(v/w)％。将得到的混合物在45℃的温度下温育72小时，同时以200rpm振荡。结果如表4所示。
[0094] 表4：在有或没有表面活性剂的突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶的不同条件下，用蒸汽闪爆法预处理的甘蔗渣糖化得到的葡萄糖含量
[0095]
[0096] 从表4中发现，将酶含量从2.5mg/g底物增加至5mg/g显然能产生更多的糖，并且在反应中添加表面活性剂使得酶产生了更多的糖。
[0097] 此外，通过用蒸汽爆炸法将突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶添加到5％(w/v)预处理的蔗渣中，直至达到5-20mg蛋白/g底物，对深层发酵和固态发酵产生的酶的性能进行了研究。然后，加入磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液直至达到50mM pH 5.0的浓度。将叠氮化钠(sodium azide)添加到所述混合物中直至达到0.1％的浓度。将获得的混合物在45℃的温度下温育72小时，同时以200rpm振荡。结果如表5所示。
[0098] 表5：从用不同量的酶的蒸汽闪爆法进行预处理的甘蔗渣的糖化获得葡萄糖含量，所述酶由深层发酵和固态发酵制备的突变株棘孢曲霉E14-292产生
[0099]
[0100] 从表5中可以发现，通过深层发酵和固态发酵进行酶促糖化得到的糖含量相似。这意味着由深层发酵和固态发酵制备的突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶具有相似的效率。
[0101] 不同的预处理方法处理的甘蔗渣用于研究从采用不同方法预处理的浓度为5％(w/v)的蔗渣开始的糖化作用。所述预处理的方法是：1)使用碱催化剂进行蒸汽闪爆法；2)有机溶剂分离方法；3)丙酮中的氢氧化钠法；4)甲醇中甲醇钠法。甘蔗渣加入由突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶直至达到5mg蛋白/g底物。然后，加入磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液直至达到50mM pH 5.0的浓度。加入叠氮化钠直至在所述混合物中达到0.1％的浓度。然后，加入Lutensol表面活性剂直至混合物中底物的浓度达到0.175％(v/w)。然后，将混合物在45℃的温度下温育72小时，同时以200rpm振荡。结果如表6所示。
[0102] 从表6中可以发现，突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶能有效地糖化经过不同预处理方法的蔗渣。
[0103] 表6：使用由突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶从经过不同的预处理方法的甘蔗渣中获得的葡萄糖含量
[0104]
[0105] 与商业酶Cellic CTEC 2(丹麦诺维信)，Celluclast 1.5L(丹麦诺维信)和Accelerase 1500(美国杜邦)相比，突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶的功效也被用于研究。将经过不同预处理方法的甘蔗渣(5％(w/v))加入由突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶或商业酶，直至达到5mg蛋白/g底物。然后，加入磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液直到达到50mM pH 5.0的浓度。加入叠氮化钠直至在所述混合物中达到0.1％的浓度。加入Lutensol表面活性剂直至达到混合物中每重量底物0.175体积％的浓度。然后将混合物在45℃的温度下温育
72小时，同时以200rpm振荡。结果如表7所示。
72小时，同时以200rpm振荡。结果如表7所示。
[0106] 从表7中可以发现，突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶能有效地对不同预处理方法下的甘蔗渣进行糖化，这与商业酶Cellic CTEC 2相似，且优于商业酶Celluclast 1.5L和Accelerase 1500。
[0107] 表7：突变株棘孢曲霉E14-292产生的酶与商业酶在糖化使用碱催化剂进行蒸汽闪爆预处理的甘蔗渣时的效果比较
[0108]
[0109] 本发明的优选实施方案
[0110] 本发明的优选实施方式如本发明的说明书中所述。
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