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细胞表面修饰的方法

阅读：745发布：2020-05-11

专利汇可以提供细胞表面修饰的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种细胞表面修饰的方法，该方法包括以下步骤：获得细胞悬液；将所述悬液离心以成团块化细胞；用ClO2溶液对所得团块化细胞进行重悬；在室温下培养0.1-120分钟；用ddH2O洗涤以得到修饰细胞。通过所述修饰方法得到的细胞具有高金属离子吸附能力，高力学稳定性，以及很强的对NaOH裂解的抗性。，下面是细胞表面修饰的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种细胞表面修饰的方法，其特征在于，所述方法包括：
在细胞悬液中加入ClO2溶液；
在室温下培养0.1-120分钟；
用ddH2O洗涤以得到修饰细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞表面修饰的方法，其特征在于，包括：
在加入ClO2溶液之前，通过液体培养获得细胞悬液；或者，悬浮细胞以获得细胞悬液。
3.根据权利要求1所述的细胞表面修饰的方法，其特征在于：
在获得细胞悬液之后，将细胞悬液离心成团块化细胞；
用ClO2溶液重悬所得团块化细胞；
在室温下培养0.1-120分钟；
用ddH2O洗涤以得到修饰细胞。
4.根据权利要求1所述的细胞表面修饰的方法，其特征在于，细胞为经NaOH溶液处理后再生的生物吸附剂。
5.根据权利要求1所述的细胞表面修饰的方法，其特征在于，ClO2溶液的浓度是0.1～
2000mg/L，优选1～500mg/L，优选10～300mg/L。
6.根据权利要求1所述的细胞表面修饰的方法，其特征在于，细胞选自革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌和动物细胞。
7.根据权利要求3所述的细胞表面修饰的方法，其特征在于，细胞选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、鲁氏毛霉菌和红细胞。
8.根据权利要求1所述的细胞表面修饰的方法，其特征在于，细胞被修饰以提高金属吸附力，力学稳定性以及在碱性溶液中的稳定性。
9.根据权利要求1所述的细胞表面修饰的方法，其特征在于，通过悬浮得到浓度为1×
104～1×109CFU/mL的细胞悬液。
10.根据权利要求1～9任一项所述的细胞表面修饰的方法，其特征在于，修饰细胞用于需要耐碱液处理的工艺过程中。
11.根据权利要求1～9任一项所述的细胞表面修饰的方法，其特征在于，修饰细胞用作生物吸附剂吸附重金属离子。

说明书全文

细胞表面修饰的方法

技术领域

[0001] 本申请涉及细胞表面修饰技术领域，尤其涉及一种细胞表面修饰的方法。

背景技术

[0002] 染料和重金属是工业废水中常见的污染物，其中很多都是有毒并且致癌的。因此，迫切需要采取有效和彻底的方法来修复被染料和金属污染的废水。在众多用于处理工业染料和金属污染废水的技术中，生物吸附由于其环保、性能好、成本低并且含有大量有效生物质，已经成为一种有利的生物处理方法。

[0003] 据报道，许多原生微生物能够累积染料或金属。然而，进一步研究表明可以通过采用表面基团修饰的方法对细胞生物质进行预处理来提高细胞的吸附能力。(V ijayaraghavan ,K .；Yun ,Y .S .Bacterial biosorbents and biosorption.Biotechnol.Adv.2008,26,266)细胞壁修饰的方法有很多，其中NaOH处理方法由于具有良好的提供生物吸附作用而被广泛应用。(Fadel,M.，Biosorption of manganese from groundwater by biomass of Saccharomyces cerevisiae，HBRC Journal 2017,13,106； Y.，Biosorption of cadmium and lead ions by ethanol treated waste baker's yeast biomass，.Bioresour.Technol.2005,96,103；
Rincon,J.，Biosorption of heavy metals by chemically-activated alga Fucus vesiculosus，J.Chem.Technol.Biotechnol.2005,80,1403；Yan,G.，Effect of pretreatment on the bioadsorption of heavy metals on Mucor rouxii，WATER SA-PRETORIA.2000，26，119)NaOH还可以用于生物吸附剂再生的脱附和预处理，因此对生物吸附剂的再生在进一步工业应用中有重要作用。

[0004] 然而，NaOH对许多生物细胞具有强烈的细胞溶解作用。严(Yan)通过蒸压生物量控制方法进行对比发现NaOH预处理可以极大提高鲁氏毛霉菌的金属吸附能力但显著降低生物量。其他处理试剂如NaCO3、CaCl2、HCl和H3PO4也示出了对鲁氏毛霉菌细胞有显著的裂解作用。陶(Dow)和鲁伯里(Rubery)发现NaOH可以破裂鲁氏毛霉菌的细胞壁。弗洛斯特(Fourest)和沃莱斯基(Volesky)在报道中指出通过对马尾藻类海草进行NaOH预处理可以产生39％的生物损失量。预处理过程中生物量的大量损失可能导致对生物吸附性能的定量评估出现一些混乱。此外，微生物的力学稳定性能差可能会限制它们在实际应用中的进一步发展。因此，在进一步工业应用之前提高微生物的力学稳定性非常重要。据目前所知，固定化是提高微生物力学稳定性的唯一方法。发明内容

[0005] 本发明公开提供了一种细胞表面的修饰方法，包括：在细胞悬液中加入ClO2溶液；

[0006] 在室温下培养0.1-120分钟；

[0007] 用ddH2O洗涤以得到修饰细胞。

[0008] 在进一步实施中，在加入ClO2溶液之前，通过液体培养获得细胞悬液；或者，悬浮细胞以获得细胞悬液。

[0009] 在进一步实施中，获得细胞悬液之后，将细胞悬液离心成团块化细胞；

[0010] 用ClO2溶液重悬所得团块化细胞；

[0011] 在室温下培养0.1-120分钟；

[0012] 用ddH2O洗涤以得到修饰细胞。

[0013] 在进一步实施中，细胞为经NaOH溶液处理后再生的生物吸附剂。

[0014] 在进一步实施中，ClO2溶液的浓度是1～2000mg/L，优选为1～500mg/L，优选为10～300mg/L。

[0015] 在进一步实施中，细胞选自革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌和动物细胞。

[0016] 在进一步实施中，细胞选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、鲁氏毛霉菌和红细胞。

[0017] 在进一步实施中，细胞被修饰以减少细胞空泡化。细胞被修饰以提高细胞的金属吸附能力、力学稳定性和在碱性溶液中的稳定性。

[0018] 在进一步实施中，通过悬浮获得浓度为1×104～1×109CFU/mL的细胞悬液。

[0019] 本发明公开还提供了通过上述任一细胞表面的修饰方法所获得的细胞的用途。修饰后的细胞可以用于需要耐碱液处理的工艺过程中。

[0020] 在进一步实施中，细胞被用于生物吸附剂来吸附工业废水中的重金属离子。

[0021] 在进一步实施中，重金属离子选自Pb2+、UO22+和Cu2+。

[0022] 本发明公开提供了一种细胞表面的修饰方法，具有以下优点:

[0023] 本发明所述方法可以提高细胞的金属吸附力、力学稳定性，因此能够用于修饰那些用作生物吸附剂吸附重金属离子的细胞。

[0024] 本发明所述方法可以提高细胞在碱性溶液中的稳定性，例如在NaOH溶液中的稳定性，减少碱性溶液对细胞的溶解作用。修饰后的细胞可以用于需要耐碱液处理的工艺过程中。附图说明

[0025] 图1示出了ClO2处理对不同微生物吸附金属的影响，芽孢杆菌：UO22+；铜绿假单胞菌:Cu2+；鲁氏毛霉菌：Fe3+。

[0026] 图2示出了NaOH对不同细胞的溶解作用(误差条代表标准差)。

[0027] 图3示出了经ClO2处理的细胞对NaOH裂解抗性的作用(NaOH为100mmol/L)，其中，A：大肠杆菌；B：鲁氏毛霉菌；C：红细胞。

[0028] 图4示出了经ClO2处理的细胞对NaOH的耐受性，其中，在下述处理后离心红细胞沉淀物：A)没有处理；B)ClO2处理(130mg/L)；C)ClO2处理(130mg/L)和NaOH处理(100mmol/L)；D)NaOH处理(100mmol/L)。

[0029] 图5示出了红细胞形态(1000倍率)，其中，A：没有处理；B：ClO2处理(130mg/L)；C：ClO2处理((30mg/L)和NaOH处理(100mmol/L)；D：ClO2处理(130mg/L)和NaOH处理(100mmol/L)。

[0030] 图6示出了红细胞的FS-SS点阵图，其中，A：没有处理；B：ClO2处理(30mg/L)；C：ClO2处理(130mg/L)。

[0031] 图7示出了两个分子反应路径。

具体实施方式

[0032] 本公开一实施例提供了一种细胞表面修饰的方法，包括：

[0033] 在细胞悬液中加入ClO2溶液；

[0034] 在室温下培养0.1-120分钟；

[0035] 用ddH2O洗涤以得到修饰细胞。

[0036] 据报道，许多原生微生物能够吸附染料或金属。然而，原生微生物细胞的机械稳定性较差，限制了其在工业上的进一步应用。本实施例提供了一种细胞表面修饰的方法，通过ClO2溶液对细胞壁和细胞膜进行修饰，不仅提高了细胞的机械性能，而且提高了细胞对重金属离子的吸附能力。

[0037] 此外，NaOH处理方法由于具有良好的生物吸附作用而被广泛应用。然而，NaOH对许多生物细胞具有强烈的细胞溶解作用。在本实施例的方法中，使用高效、低毒、环保的ClO2对微生物表面细胞进行修饰，以增强其在NaOH溶液中的稳定性，从而提高这些细胞对NaOH裂解的抗性。

[0038] 在进一步的实施例中，在加入ClO2溶液之前，可以通过液体培养获得细胞悬液；或者，悬浮细胞以获得细胞悬液。

[0039] 在进一步实施中例，获得细胞悬液之后，将细胞悬液离心成团块化(pelleted)细胞；用ClO2溶液重悬所得团块化细胞；然后在室温下培养0.1-120分钟；而后用ddH2O洗涤以得到修饰细胞。在进行ClO2处理之前，可以用蒸馏水悬浮细胞，然后离心得到团块化细胞。然后，用ClO2溶液重悬该团块化细胞而后培养10分钟。

[0040] ClO2溶液的浓度可以是1～2000mg/L，优选1～500mg/L，优选10～300mg/L，例如可以是10～30mg/L，10～150mg/L，30～200mg/L，50～150mg/L。

[0041] 在进一步实施例中，细胞可以选自革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌和动物细胞。具体地，这些细胞也可以选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、鲁氏毛霉菌和红细胞。本实施例中的方法可以对不同种类的细胞进行表面修饰以增强细胞的稳定性，可以广泛应用于修饰那些用于吸附重金属离子的细胞。

[0042] 在进一步实施例中，通过此修饰方法对细胞壁和细胞膜进行修饰减少了细胞空泡化。

[0043] 在进一步实施例中，修饰细胞在碱性溶液中具有很强的稳定性，例如在NaOH溶液中具有很强的稳定性。修饰细胞可以用于需要耐碱液处理的工艺过程中。

[0044] 在进一步实施例中，该方法可以用来处理那些经NaOH处理后再生的生物吸附剂。

[0045] 本实施例中的方法可以提高微生物细胞吸附重金属的能力，同时可以显著提高这些细胞对NaOH裂解的抗性。换句话说，待处理的细胞可以是用NaOH溶液处理后再生的生物吸附剂材料。

[0046] 在进一步实施例中，本实施例所述方法可以被用于修饰生物吸附剂。修饰后的细2+ 2+ 2+
胞可以用作生物吸附剂，用于吸附如Pb ，UO2 ，Cu 等重金属离子。

[0047] 下文将结合具体实施例进一步详细阐述本发明实施例所述方法。

[0048] 实施例1

[0049] 1.1实验

[0050] 培养基和收集技术

[0051] 芽孢杆菌(革兰氏阳性菌)、大肠杆菌(革兰氏阴性菌)、铜绿假单胞菌(革兰氏阴性菌)、鲁氏毛霉菌(真菌)购自广东微生物培养收集中心(GMCCC，中国)。芽孢杆菌的生长培养基中含有麦芽糖10.0g/L、酪蛋白胨10.0g/L、牛肉提取物5.0g/L、NaCl 2.0g/L，在旋转振荡器中保持pH7.2和32℃，搅拌速度为200r/min。鲁氏毛霉菌的生长培养基中含有50.0g/L 葡萄糖、20.0g/L酪蛋白胨、2.0g/L 酵母提取物、4.0g/L KH2PO4、2.0g/L MgSO4，在旋转振振荡器中保持pH 4.5和28℃，搅拌速度为300r/min。大肠杆菌和铜绿假单胞菌的生长培养基中含有10.0g/L酪蛋白胨、5.0g/L酵母提取物和10.0g/L NaCl，在旋转振荡器中保持pH 7.0和37℃，搅拌速度为120r/min.细胞在4℃、6000×g离心10分钟，用双蒸馏水(ddH2O)洗涤3次，再用浓度为109CFU/mL的ddH2O重悬，在合适的时间收集用于后续实验。将5ml血液加入0.4ml EDTA-Na2(15g/L)中，红细胞从兔子血液中收集。新鲜红细胞用生理盐水冲洗3次，调整至浓度2％(v/v)备用。

[0052] ClO2处理后细胞的金属离子吸附实验

[0053] 用ClO2处理细胞时，将1ml的细菌悬液转移到离心管中。然后离心试管，使细胞团块化沉淀(pellet)，并完全丢弃上清。用1ml的ClO2溶液(150mg/L)重悬细胞，室温培育10分钟。之后，用ddH2O冲洗细胞，去除残留的ClO2。

[0054] 铀因其高毒性和一定的放射性，是危害最严重的重金属之一。大量的铀通过与核工业有关的活动进入到环境中。在含有UO22+(300mg/L，芽孢杆菌)、Cu2+(300mg/L，铜绿假单胞菌)和Fe3+(300mg/L，鲁氏毛霉菌)的30ml溶液中加入潮湿的湿生物质(0.01g或等量的细胞固定化基质)悬液在25℃、pH 6.0、180r/min的振动速度下振荡培养，并定期取样。收集的样品以6000×g离心10分钟，上清液通过0.45微米的纤维素膜过滤。采用微量铀分析仪(MUA)测定过滤器上残留铀，检测范围为3.0×10-11-2.0×10-5g/mL，相对标准偏差(RSD)小于或等于8％。采用原子吸收光谱法测定Cu2+和Fe3+。

[0055] NaOH细胞溶解实验

[0056] 将芽孢杆菌、大肠杆菌、鲁氏毛霉菌和红细胞的细胞沉积物加入终浓度不同的NaOH加成物中，浓度范围为0-100mmol/L，悬浮振荡10分钟。氢氧化钠处理后的细胞在离心和蒸馏水重悬(红细胞用生理盐水重悬)后被收集，然后对芽孢杆菌、大肠杆菌通过检测OD600值(使用紫外可见分光光度法在600nm下进行测定，北京Puxi TU-1810)进行细胞浓度测定，对鲁氏毛霉菌和红细胞则使用血球计数器进行细胞浓度测定。

[0057] ClO2处理后细胞对NaOH的抗性

[0058] 将大肠杆菌、鲁氏毛霉菌和红细胞的细胞沉积物加入终浓度不同的ClO2加成物中，浓度范围为0-150mg/L，悬浮振荡10分钟。将悬液离心去除残留的ClO2。所得细胞沉积物如前所述用NaOH(100mmol/L)处理。

[0059] 通过实验观察ClO2处理后细胞对NaOH裂解的抗性：分别用ClO2、ClO2和NaOH、NaOH处理红细胞，然后将悬液离心观察沉积物的体积。对照组的红细胞仅用普通的生理盐水进行悬浮，此处ClO2和NaOH的浓度依次为130mg/L、100mmol/L(以普通生理盐水为溶剂)。

[0060] 1.2实验结果

[0061] ClO2处理对不同微生物吸附金属的作用

[0062] 对于采用和未采用ClO2处理的细胞吸附金属时的实验结果如图1所示。芽孢杆菌在前30分钟对处理后细胞和未处理细胞均表现出相当大的UO22+吸附性。在第120分钟达到最大吸附，未处理组最大吸附量为大约316.0mg/L，ClO2处理组的最大吸附量为大约422.0g/L。结果表明，与未处理组相比，经ClO2修饰的芽孢杆菌对UO22+离子的吸附能力提高了33.5％。处理组与未处理组相比，鲁氏毛霉菌对Fe3+的吸附能力在第180分钟时提高
18.7％。对于铜绿假单胞菌对Cu2+的吸附量，处理组和未处理组无明显差异。因此，选择芽孢杆菌为代表菌株，通过红外光谱分析研究其细胞壁修饰机理。

[0063] 基于所用的真菌菌株和处理过程不同，修饰结果可能示出了增强或降低金属生物吸附。如加热、无机处理(如酸或烧碱)和有机处理(如甲醇或甲醛)是最广泛使用的修饰方法。然而，二氧化氯目前还未有研究。通常二氧化氯还仅被作为一种高生物杀灭效果和低毒性的具有良好前景的消毒剂，与其它处理试剂相比，二氧化氯更经济、更环保。

[0064] 氢氧化钠溶液对红细胞、大肠杆菌、鲁氏毛霉霉和芽孢杆菌的溶解作用[0065] 选择这四种细胞类型进行溶解实验，因为它们代表了四种不同的细胞表面结构。芽孢杆菌是由厚肽聚糖层组成的革兰氏阳性菌，大肠杆菌是由更薄的肽聚糖层组成的革兰氏阴性菌。鲁氏毛霉菌属于真菌。图2显示细胞对NaOH溶解的敏感性降低顺序如下：红细胞>大肠杆菌>鲁氏毛霉菌>芽孢杆菌。下述实验选择红细胞、大肠杆菌和鲁氏毛霉菌作为研究对象。

[0066] ClO2处理后细胞对NaOH裂解的耐受性

[0067] 如图3所示，ClO2处理后这三种被测细胞的浓度均无显著变化。在所有情况中，ClO2处理剂浓度与细胞对NaOH裂解的抗性成正相关。在红细胞组(图3C)，当ClO2浓度达到30mg/L时，细胞对NaOH裂解表现出明显的耐受性。而大肠杆菌(图3A)和鲁氏毛霉菌(图3B)分别在ClO2浓度为60mg/L和90mg/L时显示出对NaOH抗性的初步影响。当用浓度为130mg/L的ClO2处理时，大约80％的大肠杆菌和红细胞具有对NaOH裂解的抗性，而鲁氏毛霉菌细胞则100％具有对NaOH裂解的抗性。

[0068] 图4为不同试剂处理的离心后的红细胞沉积物样品图像。对照组(图4A)与ClO2处理组(图4B)无明显差异，均显示白色透明上清，没有明显差别。图4D无沉积物，说明所有细胞均被NaOH裂解。图4C上清液颜色较淡，可能是由于ClO2和NaOH处理后细胞部分裂解或血红蛋白渗漏所致。

[0069] 令人惊讶的是，经过ClO2处理的细胞在对NaOH解的抗性上没有表现出细胞物种的特异性。

[0070] 图5为不同试剂处理后红细胞的相衬显微镜形态。经过ClO2处理后，红细胞表面光泽度发生较大变化(图5A-B)。先用30mg/L ClO2处理，再用100mmol/L NaOH处理后，可以观察到出现许多裂解的细胞(图5C)，这也说明了细胞形态变化的一个方面，高pH值可能导致细胞膜结构由双层结构向微胶囊结构转变。如图5D所示，高浓度ClO2(130mg/L)处理后细胞空泡程度明显下降。

[0071] 采用流式细胞技术对红细胞进行研究和检测，两种探测器对准了光束通过的地方：一个与光束成一条直线的前向散射(FS)探测器和几个与光束垂直的的侧向散射(SS)探测器。通过分析每个探测器的亮度波动，就有可能得到每个粒子的物理和化学结构信息。FS亮度一般与细胞体积正相关，SS亮度取决于粒子的复杂程度，如细胞膜的粗糙度。如图6所示，随着ClO2剂量的增加，红细胞的平均SS亮度显著增加，这在一定程度上表明了细胞膜粗糙度发生了变化。经ClO2处理的红细胞的FS平均亮度相对于对照组有所下降，表明经ClO2处理后细胞膜发生了收缩。

[0072] 在ClO2氧化过程中，消除反应和电荷转移络合物发生后，立即形成自由基阳离子中间体，在这过程中，生成氯酸和次氯酸。图7给出了两个反应路径。在这两个路径中，交联反应都是由氢消除反应(hydrogen abstraction)引发的。在反应路径A中，氨基酸残基的α-碳原子与酰胺键的碳连接。在反应路径B中，过氧化脂肪酸通过C-O键与另一个含有脂肪酸的自由基交联。因此，与-NH3或-COOH等其他官能团相比，交联不会导致吸附损失，反而提高细胞膜的吸附能力。

[0073] 本发明首次将ClO2用于微生物表面修饰。当用NaOH处理时，NaOH对红细胞和大肠杆菌有强烈的溶解作用，对鲁氏毛霉菌有一定的溶解作用，对芽孢杆菌没有溶解作用。但在所有情况下，ClO2处理剂均可以增强细胞对NaOH溶解的抗性，其剂量与抑制细胞溶解性正相关。显微镜观察表明，ClO2处理可以阻止细胞膜在NaOH溶液中形成小泡。流式细胞技术分析表明，ClO2处理后红细胞的细胞膜发生收缩。这些实验表明，ClO2处理可提高细胞对氢氧化钠溶解的抗性。这些结果证明，ClO2在微生物修饰方面具有很大的应用潜力，它不仅可以提高其对染料和金属的吸附能力，而且可以提高其稳定性。

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