表达葡糖淀粉酶的真菌菌株和产乙醇物的同时糖化和共发酵以由玉米产生醇专利检索-真菌生物学专利检索查询-专利查询网

表达葡糖 淀粉酶的真菌菌株和产乙醇物的同时糖化和共 发酵以由玉米产生醇

阅读：412发布：2024-02-28

专利汇可以提供表达葡糖淀粉酶的真菌菌株和产乙醇物的同时糖化和共发酵以由玉米产生醇专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明题为“表达葡糖淀粉酶的真菌菌株和产乙醇物的同时糖化和共发酵以由玉米产生醇”。本发明公开了一种转化方法，所述转化方法提供了用不同的共培养细胞系表达催化该转化方法的不同组的酶。例如，在同时糖化和共发酵(SSCF)过程中，通过使底物与酵母和黑曲霉细胞接触来使淀粉底物转化为醇。因为黑曲霉表达内源性葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，所以在SSCF过程期间中不需要添加这些酶。，下面是表达葡糖淀粉酶的真菌菌株和产乙醇物的同时糖化和共发酵以由玉米产生醇专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种将淀粉底物转化为醇的转化方法，所述转化方法包括：
使淀粉底物与酵母第一细胞和黑曲霉第二细胞接触，其中与在能与之相比的条件下所进行的对照方法完成时的醇收率相比，在所述转化方法完成时，所述转化方法在约32℃至约38℃的温度范围内产生至少90％的醇收率，
其中所述对照方法包括使所述淀粉底物与所述酵母第一细胞接触并添加外源性葡糖淀粉酶、真菌α-淀粉酶和真菌蛋白酶，并且
其中所述转化方法产生醇。
2.根据权利要求1所述的转化方法，其中所述醇是乙醇或丁醇。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的转化方法，其中与所述对照方法完成时的醇收率相比，在所述转化方法完成时，所述转化方法能够产生至少95％-99％的醇收率。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的转化方法，其中所述转化方法在约32℃至约38℃的温度范围内进行，并且其中与所述对照方法的醇收率相比，在所述转化方法完成时，所述转化方法产生至少90％的醇收率。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的转化方法，其中所述转化方法在约35℃至约38℃的温度范围内进行，并且其中与所述对照方法的醇收率相比，在所述转化方法完成时，所述转化方法产生至少90％的醇收率。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的转化方法，其中所述转化方法在约35℃的温度下进行，并且其中与所述对照方法的醇收率相比，在所述转化方法完成时，所述转化方法产生至少90％的醇收率。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的转化方法，所述转化方法还包括在使所述第二细胞和所述淀粉底物与所述第一细胞接触之前，对所述第二细胞与所述淀粉底物进行预温育。
8.根据权利要求7所述的转化方法，其中所述预温育进行6-12小时。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的转化方法，其中所述淀粉底物为液化物或颗粒状淀粉。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的转化方法，其中所述转化方法在不添加外源性葡糖淀粉酶、非淀粉水解酶、α-淀粉酶、植酸酶和/或蛋白酶的情况下进行。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的转化方法，其中在所述转化方法期间，所述酵母第一细胞表达外源性和/或内源性葡糖淀粉酶、非淀粉水解酶、α-淀粉酶、植酸酶和/或蛋白酶。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的转化方法，其中在所述转化方法期间，所述酵母第一细胞表达内源性葡糖淀粉酶、非淀粉水解酶、α-淀粉酶、植酸酶和/或蛋白酶。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的转化方法，其中在所述转化方法期间，所述酵母第一细胞表达外源性葡糖淀粉酶、非淀粉水解酶、α-淀粉酶、植酸酶和/或蛋白酶。

说明书全文

表达葡糖 淀粉酶的真菌菌株和产乙醇物的同时糖化和共 发酵

以由玉米产生醇

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2014年4月21日提交的美国临时申请USSN 61/982,199的优先权权益，并且全文以引用方式并入本文中。

背景技术

[0003] 生物质的生物转化相比于其它替代能源策略具有显著优势，因为生物质丰富且可再生。生物转化可通过在混合培养发酵中共培养两种或更多种真菌菌株进行。混合的真菌培养物相较于其单一培养物具有诸多优点，包括改善产率、适应性和底物利用率(Dashtban等人，Int.J.Biol.Sci.,5:578-595,2009.)。据报道，共-建立的稳定共培养物取决于培养基和生长需求，诸如温度、大气环境和碳源(Maki等人，Int.J.Biol.Sci.,5:500-516,2009.)。据报道，共培养物受到代谢相互作用(例如互养关系或者对底物的竞争)及其它相互作用(例如生长增强或生长抑制，诸如抗生素)的影响(参见例如Maki等人，
Int.J.Biol.Sci.,5:500-516,2009.)。

[0004] 已经报道了两种真菌菌株的固态共发酵(例如使用发酵盘)(参见例如Sun等人，Electronic J.Biotechnol.,12:1-13,2008；Pandey等人，Curr.Sci.,77:149–162,1999；Hu等人，Int’l Biodeterioration&Biodegradation 65:248-252,2011；Wang等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.73:533-540,2006)。然而，固态共发酵对于工业应用而言较为困难，成本过高，并因此不总是适用于酶的工业规模重组生产。深层发酵通常更灵活并且被认为是更可取的，其用于例如，用于生产酶混合物的青霉属物种(Penicillium sp.)CH-TE-001和土曲霉(Aspergillus terreus)CH-TE-013(Garcia-Kirchner等人，Applied Biochem.&Biotechnol.98:1105-1114,2002)。此外，微生物的混合培养物在不同的条件下发酵，以获得某些特性富集的培养微生物，然后共混以获得配制的复合培养物(参见例如EP 2292731)。

[0005] 用于产生燃料乙醇的主要方法包括使淀粉或谷物水解为葡萄糖，之后酵母发酵为最终产物乙醇。通常，在通常称为同时糖化和发酵(SSF)的过程中，玉米淀粉水解为葡萄糖以及发酵为乙醇同时发生。在酵母能够将葡萄糖发酵为乙醇之前，玉米淀粉必须经历若干过程。在整个玉米淀粉蒸煮过程中，淀粉暴露于数种类型的酶以催化长链淀粉分子转化为较小的可发酵糖。与高温组合的α-淀粉酶催化淀粉随机水解，能够在准备SSF时液化。在SSF期间，在协同反应中一起作用的葡糖淀粉酶和附加α-淀粉酶将可溶性淀粉链水解成可发酵TM TM的糖，诸如麦芽糖(DP2)和葡萄糖(DP1)。通常将产品诸如DISTILLASE SSF、DISTILLASE SSF+和 480乙醇(DuPont Industrial Biosciences)即曲霉属(Aspergillus)葡
糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)普鲁兰酶和木霉属(Trichoderma)蛋白酶的最优化共混物添加至发酵以催化淀粉水解为葡萄糖。在常规SSF过程，外源性地加入酶。
附图说明

[0006] 附图并入本说明书中并构成本说明书的一部分，并且例示了本文所公开的各种方法和组合物。在附图中：

[0007] 图1示出在32℃和常规发酵条件下，种子温育黑曲霉(A.niger)(共混物1)与里氏木霉(T.reesei)(共混物3)9小时之后的DP4+水解。

[0008] 图2示出在32℃和常规发酵条件下，种子温育黑曲霉(共混物1)与里氏木霉(共混物3)9小时之后的乙醇产量(％v/v)。

[0009] 图3示出用于实施例的发酵温度特征图。

[0010] 图4示出在各个实验温度条件下对照共混物的最终DP1收率。

[0011] 图5示出各个实验温度条件在SSF时间＝0时的DP4+水平。

[0012] 图6示出在32℃和常规发酵条件下，种子温育黑曲霉(共混物1)与里氏木霉(共混物3)9小时之后的DP1产量。

[0013] 图7示出在35℃和常规发酵条件下，种子温育黑曲霉(共混物5)与里氏木霉(共混物7)9小时之后的DP1产量。

[0014] 图8示出在32℃至38℃的分段温度分布和常规发酵条件下，种子温育黑曲霉(共混物10)与里氏木霉(共混物12)9小时之后的DP1产量。发明内容

[0015] 提供了将淀粉底物转化为产物的转化方法。转化方法可为通过同时糖化和共发酵(SSCF)转化淀粉底物的过程。转化方法包括在约在32℃至约38℃的温度下使淀粉底物与来自真菌的第一细胞如酵母细胞和来自丝状真菌的第二细胞如木霉属(Trichoderma)或曲霉属(Aspergillus)细胞接触。该方法可包括在使第二细胞和淀粉底物与第一细胞接触之前对第二细胞与淀粉底物进行预温育。淀粉底物可为液化物或未糊化淀粉。

[0016] 第二细胞可为能够表达内源性葡糖淀粉酶和酸稳定性α-淀粉酶两者的丝状真菌，例如黑曲霉细胞。转化方法可在不添加外源性葡糖淀粉酶、α-淀粉酶或蛋白酶的情况下进行。例如，转化方法可在不添加外源性葡糖淀粉酶、α-淀粉酶或蛋白酶中每一种的情况下进行。产物可为乙醇，并且乙醇收率在转化方法完成时可为约13％至约14％v/v乙醇。在第二细胞为里氏木霉细胞的情况下，转化方法可在不添加外源性葡糖淀粉酶和/或具有降低含量的其它添加物的情况下进行。在这种情况下，乙醇收率在转化方法完成时可为约4％至约8％v/v乙醇。第一细胞是不同于第二细胞的物种。例如，如果第二细胞为黑曲霉细胞，则酵母第一细胞将不为黑曲霉细胞。

[0017] 淀粉底物转化为产物的转化方法可包括使淀粉底物与酵母第一细胞和黑曲霉第二细胞接触，其中与在能与之相比的条件下所进行的对照方法完成时的醇收率相比，在转化方法完成时，所述转化方法在约32℃至约38℃的温度范围内产生或能够产生至少90％，例如至少93％、95％、97％、98％或99％的醇收率，其中对照方法包括使淀粉底物与酵母第一细胞接触并添加外源性葡糖淀粉酶、真菌α-淀粉酶以及任选的真菌蛋白酶和/或其它酶，并且其中该转化方法产生产物。

[0018] 产物可为醇，例如乙醇或丁醇。转化方法的产物可为有机酸，例如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、乙酰丙酸、谷氨酸一钠、葡糖酸盐，或氨基酸，例如赖氨酸、色氨酸或苏氨酸。

[0019] 与对照方法完成时的醇收率相比，该转化方法可在转化方法完成时产生至少95％-99％，例如97％-99％或95％-98％的醇收率。转化方法可在约32℃至约38℃的温度范围例如约34℃、35℃或36℃至约38℃进行，并且与在能与之相比的条件下所进行的对照方法的醇收率相比，在转化方法完成时可产生至少90％％，例如至少93％、95％、97％、98％或
99％的醇收率。转化方法可在约35℃的温度下进行，并且与对照方法的醇收率相比，在转化方法完成时可产生至少90％的醇收率。醇可例如为乙醇或丁醇。

[0020] 转化方法可包括在使第二细胞和淀粉底物与第一细胞接触之前对第二细胞与淀粉底物进行预温育。预温育可进行6-12小时，例如8-10小时，或约9小时。淀粉底物可为液化物或颗粒状淀粉。转化方法可在不添加外源性葡糖淀粉酶、非淀粉水解酶、α-淀粉酶、植酸酶和/或蛋白酶的情况下进行。例如，转化方法可在不添加部分或全部以上外源性酶的情况下进行。

[0021] 酵母第一细胞可在转化方法期间表达外源性和/或内源性葡糖淀粉酶、非淀粉水解酶、α-淀粉酶、植酸酶和/或蛋白酶。例如，酵母第一细胞可表达曲霉属的α-淀粉酶。

[0022] 定义

[0023] 对照方法在与转化方法“能与之相比的条件”下进行。例如，如果转化方法在32-38℃的温度范围内进行，则对照过程将在相同的温度范围内采用转化方法的相同温度分布进行。因此，转化方法与对照方法之间的差异在于在转化方法中存在黑曲霉第二细胞，并且在对照方法中添加了外源性葡糖淀粉酶、真菌α-淀粉酶和真菌蛋白酶。表I示出转化方法和对照方法的代表性的反应参数。当不再形成产物时该方法“完成”。

[0024] “约”是指在方法期间的平均温度。技术人员预期，转化方法的温度围绕设定温度稍有变化，例如设定值±1℃，诸如在图3中所示。在转化方法期间，“约32℃”的温度因此将涵盖32±1℃的温度。“约38℃”的温度涵盖38±1℃的温度并且还包括可在转化方法期间发生的温度瞬态峰值。例如，转化方法的温度可在数分钟内超过38℃几度。这些瞬态峰值可包括在“约38℃”之中。

[0025] 用于本发明方法的细胞可来自任何类型的生物体，如真核生物体、原核生物体和古细菌。优选地，细胞来自微生物(即，微生物细胞系)，意指细胞是原核生物、古细菌，或来自能够单细胞生长的真核生物，诸如真菌(如，丝状真菌或酵母)和藻类。不同生物体可通过域(如，真核生物域和原核生物域)分类。域再分为界，如细菌界(如，真细菌界)、古细菌界、原生生物界、真菌界、植物界和动物界。界进一步分为门、纲、亚纲、目、科和属。例如，来自真菌的属包括木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、皮肤癣菌属(Dermatophytes)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillum)和酵母属(Saccharomyces)。属进一步分为种。例如，来自木霉属的种包括里氏木霉、绿色木霉(Trichoderma viride)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和康宁木霉(Trichoderma koningii)。种分为菌株。

[0026] “投掷(Pitching)”意指将真菌菌株例如酵母加至发酵中。

[0027] 不同的菌株是相同种的独立分离体。不同的菌株具有不同的基因型和/或表型。

[0028] 细胞系在传统意义上用于表示一群基本上同基因的细胞，其能够连续(优选地无限)生长并在体外分裂，除DNA复制固有的偶然随机突变之外无任何变化。细胞系通常从单个菌落繁殖。

[0029] 深层发酵是其中细胞至少主要在液体培养基的表面下生长的过程。

[0030] 固态发酵是其中细胞在固体培养基上和内部生长的过程。

[0031] “外源性酶”意指通常不由细胞表达的酶(如，来自另一个菌株、种、属或界的异源性酶或通常由细胞表达的酶的重组修饰变体)或通常由细胞表达但由于受通常不存在于细胞中的遗传物质的控制在增高的水平上表达的酶。此类表达可因将编码此类酶的基因引入其通常不存在的位置或通过遗传操作细胞以增强酶的表达而产生。此类遗传操作可改变控制酶表达的调控元件，或可引入编码蛋白质的遗传物质，该蛋白质以反式起作用以增强酶的表达。

[0032] 经由“添加外源性酶”进行的转化方法意指将酶从外部源添加至转化反应；即，将对转化反应外源的酶溶液添加至转化反应。当将酶外源性地添加至转化反应时，酶本身并非必须是以上所用意义的“外源性酶”。例如，第一细胞可在转化过程中表达葡糖淀粉酶，并且可将相同的葡糖淀粉酶外源性地添加至同一转化过程。

[0033] 外源性核酸(如，DNA)意指通常不存在于细胞中(即，通过基因工程引入)的核酸。外源性核酸可来自不同的菌株、种、属或界(即，异源性)，可编码重组工程化的变体，或者通常可存在于细胞中但引入与通常存在的位置不同的位置。

[0034] 如果酶通常由细胞表达，则酶对细胞是内源性的，且无论是编码酶的核酸，还是调控酶的表达的任何其它核酸均不被引入细胞。内源性基因意指通常存在于细胞中其正常基因组位置的基因。例如，如果酶或编码酶的核酸通常不由细胞编码并且通过基因工程引入细胞，则其对细胞是异源性的。例如，如果内源性核酸已被修饰/工程改造并且/或者如果内源性未经修饰或修饰的核酸已插入细胞的不同位置中，则酶或编码酶的核酸对细胞是异源的。

[0035] 术语“丝状真菌”是指真菌亚门(Eumycotina)的所有丝状形式(参见Alexopoulos(1962)INTRODUCTORY MYCOLOGY,Wiley,New York)。这些真菌的特征在于其营养菌丝体的细胞壁由甲壳质、纤维素和其它复合多糖组成。丝状真菌在形态学上、生理学上和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长，且碳分解代谢是专性好氧的。

[0036] 如果细胞包括编码有效连接至一个或多个调控元件以允许DNA表达的酶的DNA，则细胞适于表达酶。酶可以是内源性的或外源性的。表达可以是组成型的或诱导型的。编码酶的DNA可以在细胞内的基因组或附加体位置。当两个酶被称为由不同的细胞系以不同的水平表达时，在蛋白质水平上各自表达水平的平均数标准误差(SEM)表示的范围不重叠。在相同密度的各自培养物和各自细胞系培养生长的阶段之间比较表达水平。当分泌表达的蛋白时，表达水平优选地根据培养基中分泌蛋白的浓度确定。表达水平可以摩尔单位、活性单位、OD或其它单位确定。

[0037] 术语“约”在用于修改参数时意指限定单位的参数可由本发明所公开的值变化±10％。

[0038] 如本文所用，术语“丁醇”是指丁醇异构体1-丁醇(1-BuOH)、2-丁醇(2-BuOH)、叔丁醇(t-BuOH)和/或异丁醇(iBuOH或i-BuOH，也称为2-甲基-1-丙醇)，单独地或作为它们的混合物。有时，如本文所用，术语“生化丁醇”和“生物产生的丁醇”可与“丁醇”同义使用。

[0039] 在某些实施方案中，可对微生物进行基因修饰以产生丁醇。由微生物产生丁醇公开于例如美国专利7,851,188；7,993,889；8,178,328；和8,206,970；以及美国专利申请公开2007/0292927；2008/0182308；2008/0274525；2009/0305363；2009/0305370；2011/0250610；2011/0313206；2011/0111472；2012/0258873；和2013/0071898中，其各自全部内容以引用方式并入本文。在某些实施方案中，将微生物基因修饰成包括丁醇生物合成途径或丁醇异构体诸如1-丁醇、2-丁醇或异丁醇的生物合成途径。在某些实施方案中，在丁醇生物合成途径中催化底物转化为产物的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种多肽在微生物中由异源多核苷酸编码。在某些实施方案中，所有催化丁醇生物合成途径的底物转化为产物的多肽在微生物中由异源多核苷酸编码。应当理解，包括丁醇生物合成途径的微生物可进一步包括一种或多种另外的基因修饰，如在美国专利申请公布2013/
0071898中所公开的，其以引用的方式全文并入本文中。

[0040] 可用的产生异丁醇的生物合成途径包括如Donaldson等人在美国专利7,851,188；美国专利7,993,388；和国际公布WO 2007/050671中所描述的那些，这些专利均以引用方式并入本文。可用的产生1-丁醇的生物合成途径包括在美国专利申请公布2008/0182308和WO2007/041269中所描述的那些，这些专利均以引用方式并入本文。可用的产生2-丁醇的生物合成途径包括Donaldson等人在美国专利8,206,970；美国专利申请公布2007/0292927和
2009/0155870；国际公布WO 2007/130518和WO 2007/130521中描述的那些，这些专利均以引用方式并入本文。

[0041] 使用下述缩写：

[0042] AA α-淀粉酶

[0043] ADY 活性干酵母

[0044] AFP 酸性真菌蛋白酶

[0045] AkAA 白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶

[0046] AnGA 黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶

[0047] AsAA 酸稳定性α-淀粉酶

[0048] C 摄氏度

[0049] DE 右旋糖当量

[0050] DP 葡萄糖聚合度

[0051] DS 干固体

[0052] EoF 发酵结束

[0053] g 克

[0054] GA 葡糖淀粉酶

[0055] GAU 葡糖淀粉酶单位

[0056] HPLC 高效液相色谱

[0057] mL/μL 毫升/微升

[0058] N 当量浓度

[0059] ppm 百万分之一

[0060] rpm 转/分钟

[0061] SSCF 同时糖化和共发酵

[0062] SSF 同时糖化和发酵

[0063] SSU 淀粉糖化单位

[0064] TrGA 里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶

[0065] v/v 体积比

[0066] w/v 重量/体积比

[0067] wt 野生型

具体实施方式

[0068] I.简介

[0069] 本发明提供了使用共培养的不同细胞系的转化方法。细胞系表达不同组的酶，以在单组限定条件下催化同一过程。相较于常规方法，共培养提供的灵活性和简单性更大、浪费更少、能量和水利用更低、以及成本更低。其允许各种酶混合物按需要制备，而无需为每个单独类型的底物和预处理方法构建新的生产菌株。其还允许所需的酶混合物在一个批次产生，消除共混多个单独发酵的输出物的需要。根据本发明方法制备酶混合物不需要每次发酵的完全回收过程，和/或单独储存每种酶组分。另外，其允许单独维护每个生产菌株，从而防止整个混合物(工程改造进入单独生产细胞系)同时损失。

[0070] II.转化方法

[0071] 转化方法是其中底物被两种或更多种酶转化为产物的过程。底物可以是复合物，诸如包含多个类型分子的植物材料。产物可以是单个产物或多个产物。转化方法可以是单步过程或涉及多个步骤。该过程可涉及多个连续和/或平行步骤。不同的酶可以以连续步骤、平行步骤或组合在相同步骤上起作用。示例性转化方法包括纤维素类生物质、糖原、淀粉及其各种形式向糖(如，葡萄糖、木糖、麦芽糖)和/或醇(如，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇)的转化。

[0072] 一些转化方法将淀粉，如玉米淀粉、小麦淀粉或大麦淀粉、玉米固体物、小麦固体以及来自谷物和块茎(如，甘薯、马铃薯、稻和木薯淀粉)的淀粉转化为乙醇，或富含用于发酵的糖类的糖浆，尤其是麦芽三糖、葡萄糖和/或麦芽糖，或仅仅转化为本身为可用产物的一种或多种形式的糖。

[0073] 一些转化方法作用于纤维素或木质纤维素材料，诸如包含纤维素和/或半纤维素，并且有时包含木质素、淀粉、寡糖和/或单糖的材料。纤维素或木质纤维素材料还可任选地包含另外的组分，诸如蛋白质和/或脂质。纤维素或木质纤维素材料包括生物能源作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的淤渣、庭院垃圾、木材废料和林业垃圾诸如玉米芯、作物残余物诸如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、芦竹、象草、芒草、日本柳杉、谷物研磨而成的组分、枝条、树枝、根、叶片、木片、锯屑、灌木和灌丛、蔬菜、果实、花以及动物粪肥。纤维素或木质纤维素材料可源自单个来源，或可包括源自多于一个来源的混合物。例如，纤维素或木质纤维素材料可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。纤维素或木质纤维素材料底物的酶转化的示例性产物是葡萄糖和乙醇。

[0074] 在其它转化方法中，底物是葡萄糖、果糖、右旋糖和蔗糖，和/或C5糖诸如木糖和阿拉伯糖，以及它们的混合物。蔗糖可源自多个来源，诸如甘蔗、糖用甜菜、木薯、甜高粱、以及它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过基于淀粉的原料包括谷物诸如玉米、小麦、裸麦、大麦、燕麦及其混合物的糖化而源自可再生的谷物来源。可发酵糖也可通过预处理和糖化过程而源自纤维素或木质纤维素生物质。此类转化方法的产物可以是醇诸如乙醇或丁醇。

[0075] 在一些转化方法中，底物是经过预处理的。预处理可以是机械、化学或生物化学过程或其组合。预处理可包括一种或多种技术，包括自动水解、蒸汽爆破、碾磨、切斩、球磨、压磨、辐射、流经液体热水处理、稀酸处理、浓酸处理、过乙酸处理、超临界二氧化碳处理、碱处理、有机溶剂处理以及用微生物例如真菌或细菌处理。碱处理可包括氢氧化钠处理、石灰处理、湿式氧化、氨气处理和氧化碱处理。预处理可涉及去除或改变木质素、去除半纤维素、纤维素去晶、从半纤维素去除乙酰基基团、减小纤维素的聚合度、增加木质纤维素生物质的孔隙体积、增加木质纤维素的表面积或它们的任何组合。

[0076] III.酶

[0077] 可制备酶的任何组合的混合物，所述酶选自包括但不限于六种主要酶分类的酶：水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、异构酶或连接酶(国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology，NC-IUBMB),Enzyme Nomenclature,Academic Press,San Diego,California,1992)。合适酶的示例包括纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、角质酶、植酸酶、漆酶、脂肪酶、异构酶、葡萄糖异构酶、酯酶、磷脂酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、普鲁兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦芽糖酶、甘露聚糖酶、葡糖苷酸酶、半乳聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、乳糖酶、聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶和软骨素酶，或密切相关和较不稳定同系物存在的任何酶。

[0078] 酶可以来自任何起源，如细菌或真菌。酶可以是杂交酶，即作为功能酶的融合蛋白，其中至少一份或部分来自第一物种，另一份或部分来自第二物种。酶可以是内源性酶的突变、截短或杂交形式。适于本发明方法的酶可以是分泌的、细胞质、细胞核或膜蛋白。胞外酶，如纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶或淀粉降解酶诸如淀粉酶，通常具有连接至其编码序列的N-端部分的信号序列以利于分泌。

[0079] 酶底物的示例包括木质纤维素材料、纤维素、半纤维素、淀粉或它们的组合。催化木质纤维素材料转化的示例性酶组包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。催化半纤维素转化的示例性酶组包括至少木聚糖酶、甘露聚糖酶、木糖苷酶、甘露糖苷酶、葡糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、葡糖苷酸酶和半乳糖苷酶。催化淀粉水解的示例性酶组包括至少α-淀粉酶、糖化α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、异淀粉酶和普鲁兰酶。取决于原材料和预处理方法，可选择另外的酶，如蛋白酶和植酸酶。

[0080] 纤维素酶是水解纤维素中β-D-糖苷键的酶。纤维水解酶通常分为三个主要类型：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶(Knowles,J.等人，TIBTECH
5:255-261(1987))。纤维素酶还包括辅助酶，包括GH61成员、膨胀因子、扩展蛋白(expansin)和CIP1。科学文献中描述了多种纤维素酶，其示例包括：得自里氏木霉的纤维素酶：Shoemaker,S.等人，Bio/Technology,1:691-696,1983，其公开了CBHI；Teeri,T.等人，Gene,51:43-52,1987，其公开了CBHII；Penttila,M.等人，Gene,45:253-263,1986，其公开了EGI；Saloheimo,M.等人，Gene,63:11-22,1988，其公开了EGII；Okada,M.等人，Appl.Environ.Microbiol.,64:555-563,1988其公开了EGIII；Saloheimo,M.等人，Eur.J.Biochem.,249:584-591,1997，其公开了EGIV；和Saloheimo,A.等人，Molecular Microbiology,13:219-228,1994，其公开了EGV。来自除木霉属之外的物种的外切纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶也有所描述，例如Ooi等人，1990，该文献公开了编码由棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)产生的内切葡聚糖酶F1-CMC的cDNA序列；Kawaguchi T.等人，
1996年，其公开了编码来自棘孢曲霉的β-葡糖苷酶1的cDNA的克隆和测序；Sakamoto等人，
1995年，其公开了编码来自白曲霉(Aspergillus kawachii)IFO 4308的内切葡聚糖酶CMCase-1的cDNA序列；以及Saarilahti等人，1990年，其公开了来自胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)的内切葡聚糖酶。

[0081] 半纤维素酶是催化半纤维素的降解和/或修饰的酶，包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、木糖苷酶、甘露糖苷酶、葡糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、葡糖苷酸酶和半乳糖苷酶。例如，半纤维素酶可以是木聚糖酶，即任何天然或重组生成的木聚糖降解酶。一般来讲，木聚糖降解酶是以内切或外切方式水解木聚糖的内切和外切木聚糖酶。示例性木聚糖降解酶包括内切-1,3-β-木糖苷酶、内切-β-1,4-木聚糖酶(1,4-β-木聚糖木聚糖水解酶；EC 3.2.1.8)、1,3-β-D-木聚糖木聚糖水解酶和β-1,4-木糖苷酶(1,4-β-木聚糖木聚糖水解酶；EC 3.2.1.37)(EC No.3.2.1.32、3.2.1.72、3.2.1.8、3.2.1.37)。优选的木聚糖酶是源自丝状真菌(如，曲霉属、Disportrichum、青霉属、腐质霉属(Humicola)、脉孢菌属(Neurospora)、镰刀菌属、木霉属和粘帚霉属(Gliocladium)的真菌)或细菌来源(如，芽孢杆菌属、栖热袍菌
(Thermotoga)、链霉菌属(Streptomyces)、小四孢菌属(Microtetraspora)、马杜拉放线菌属(Actinmadura)、高温单孢菌属(Thermomonospora)、放线菌(Actinomyctes)和头孢霉属(Cepholosporum))的那些。

[0082] 淀粉酶是分类为水解酶的淀粉降解酶，其裂解淀粉中的α-D-(1→4)O-糖苷键。一般来讲，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1，α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定义为以随机方式在淀粉分子内裂解α-D-(1→4)O-糖苷键的内切酶。外切淀粉分解酶诸如β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2，α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如产麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)从底物的非还原末端裂解淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.20，α-D-葡糖苷葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3，α-D-(1→4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和产物特异性淀粉酶可由淀粉生成特定长度的麦芽低聚糖。

[0083] 优选地，α-淀粉酶是源自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的那些，尤其是源自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)以及嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的那些，以及真菌α-淀粉酶诸如源自曲霉属(例如，土曲霉(A.terreus)、白曲霉(A.kawachi)、棒曲霉(A.clavatus)、米曲霉(A.oryzae)和黑曲霉(A.niger))的那些。任选地，α-淀粉酶可衍生自前体α-淀粉酶。前体α-淀粉酶由能够生成α-淀粉酶的任何来源生成。α-淀粉酶的合适来源是原核或真核生物体，包括真菌、细菌、植物或动物。优选地，前体α-淀粉酶由嗜热脂肪地芽孢杆菌或芽孢杆菌属生成；更优选地，由地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽胞杆菌生成；最优选地，前体α-淀粉酶源自地衣芽孢杆菌。α-淀粉酶也可来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

[0084] 葡糖淀粉酶是淀粉葡糖苷酶类的酶(E.C.3.2.1.3，葡糖淀粉酶，1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶)。这些酶从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原性末端释放葡糖基残基。

[0085] 普鲁兰酶是淀粉脱支酶。普鲁兰酶是分类为EC 3.2.1.41的酶，此类酶的特征在于其能够水解例如支链淀粉和普鲁兰多糖中的α-1,6-糖苷键。

[0086] 其它酶包括蛋白酶，诸如丝氨酸、金属、巯基或酸性蛋白酶。描述了丝氨酸蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(subtilisin))，例如Nedkov等人，Honne-Seylers Z.Physiol.Chem.364:1537-1540,1983；Drenth,J.等人Eur.J.Biochem.26:177-181,1972；
美国专利4,760,025(RE 34,606)、5,182,204和6,312,936；和EP 0 323,299。蛋白水解活性可以如Kalisz,“Microbial Proteinases”Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology,A.Fiecht编辑，1988所公开测定。

[0087] 植酸酶是催化肌醇六磷酸盐水解为(1)肌醇和/或(2)其单、二、三、四和/或五磷酸盐以及(3)无机磷酸盐的酶。例如，植酸酶包括EC编号3.1.3.8或EC编号3.1.3.26定义的酶。

[0088] IV.细胞系

[0089] 在选择转化方法并且从公开文献和/或通过实验鉴定预期增强转化方法的酶的一种或多种组合之后，鉴定或构建细胞系以表达不同组的酶。一些细胞系内源性表达的酶是熟知的。例如，里氏木霉是多种纤维素处理酶的来源，曲霉是淀粉酶的来源，并且芽孢杆菌是多种淀粉酶的来源。此类细胞系的使用有时无需修饰。然而，通常增强酶转化方法所需的一种或多种酶不是由已知的现有细胞系以足够水平内源性表达的。在这种情况下，现有细胞系可经基因工程改造来外源性表达酶。如果增强转化方法所需的多种酶不由已知的现有细胞系以足够水平表达，则现有细胞系可经基因工程改造以外源性表达每种酶。为了使模块化程度最大化，每个此类酶可在其自身细胞系中外源性表达。优选地，不同的酶经基因工程改造进入的细胞系代表相同基础细胞系的修饰。

[0090] 作为内源性表达、外源性表达或二者的结果，共培养的细胞系可表达不同组或平板的酶，所有酶均有助于增强酶致转化。对于不表达任何增强转化方法的内源性酶并且经基因工程改造为表达一个或多个外源性酶的细胞系，由细胞系生成的酶组或平板被认为包括外源性酶。在内源性表达酶增强转化方法并且经基因工程改造为表达一个或多个外源性酶的细胞系中，由细胞系生成的酶组或平板被认为包括内源性酶和外源性酶。在未经基因工程改造为表达外源性酶的细胞系中，由细胞系生成的酶组或平板被认为仅包括内源性酶。虽然一组外源性酶易于理解和认识，但对于以痕量水平表达的内源性酶的情况这是不一定的。因此，根据示例中所用的条件和/或方案，酶组或平板定义为仅包括以HPLC可测定的可检测水平表达的酶。优选地，一组中的每个酶以该组中最高表达的酶的水平的至少1/100或1/10的水平表达。例如，当分泌表达的酶时，可相对于分泌的酶量测定表达水平。不必通过本发明方法的实施来认识属于一组的所有酶的种类。相反，认识由给定细胞系生成的一组中的至少一个酶的种类即足够。

[0091] 一个细胞系编码的酶组可与第二细胞系编码的酶组的不重叠、部分重叠或完全重叠。存在于第一组的第一细胞系中的酶以及存在于第二组的第二细胞系中的酶可以以不同水平表达。如果该组中的酶的种类完全重叠，则至少一个酶以各组之间的不同水平表达(即，平均数标准误差(SEM)不重叠)。优选地，每组酶包括在来自共培养物中包括的其它细胞系的其它酶组中不表达或以低水平表达的至少一个酶。优选地，一组催化转化方法的酶(如，第一组)中的至少一个酶对于表达相同组酶的细胞系(如，第一细胞系)是外源性的。优选地，共培养的细胞系表达内源性酶，该内源性酶不由共培养物中包括的每个其它细胞系表达或以显著较低的水平表达。当一组酶包括外源性酶并且其它组酶中的所有酶为内源性时，表达其它组的细胞系可以是与第一细胞系的菌株、种或属不同的菌株、种或属。或者，一个细胞系可以是修饰为表达外源性酶的基础菌株或细胞系，另一个细胞系可以是无修饰的基础细胞系或菌株。虽然据认为修饰细胞系与基础细胞系的共表达会不期望地稀释外源性酶相对于由基础细胞系生成的内源性酶的相对浓度，但事实上，修饰可基本上抑制否则将增强转化方法的内源性酶的表达。在该情况下，修饰细胞系与基础菌株或细胞系的共培养可提供比任何一个细胞系单独培养更有效比例的外源性酶和内源性酶的共混物。

[0092] 通过共培养两个或更多个细胞系，不同组的酶可在一起表达，实现与每个细胞系单独的酶比率或酶活性比率不同的酶比率或酶活性比率。比率优选地以摩尔计，但也可使用活性单位、质量或其它单位。

[0093] 任何酶的比率可通过评估(1)来自共培养物的酶混合物中第一组酶和第二组酶以及(2)一个或两个单独细胞系之间的差异来比较。此类比较最容易根据第一组中最高表达的酶和第二组中最高表达的酶之间的配对示出(表达在蛋白质水平测量，优选地分泌蛋白)。任何一个单独细胞系中此类酶的比率优选地与酶混合物中相差至少2,3,4,5,10,15,20,25,30,35,40,45或50倍。例如，如果第一组中最高表达的酶和第二组中最高表达的酶在来自共培养物的混合物中以1:1的摩尔比，在第一细胞系中以10:1的比率，并且在第二细胞系中以1:10的比率表达，则混合物中摩尔比与任何一个细胞系中摩尔比相差10倍。配对或分组比较可在第一组或第二组中任何其它酶之间进行。用于比较的组可定义为，例如每组中的分泌酶，每组中的胞内酶，每组中的外源性酶，或每组中具有重组标签的酶。

[0094] 细胞系经工程改造为通过常规方法表达一个或多个外源性酶。用于表达外源性酶(例如葡糖淀粉酶或其变体)的代表性工程化宿主细胞(例如黑曲霉)、表达载体、启动子以及重组工程过程公开于例如美国专利8,426,183中。在一些此类方法中，编码有效连接至调控序列以确保其表达的酶的核酸被转化到细胞系中。任选地，酶可融合到重组标签(如，His-标签、FLAG-标签、GST、HA-标签、MBP、Myc-标签)，以增强共培养物中或混合物中来自共培养物的酶的检测和定量。编码酶的核酸优选地还融合到信号肽以允许分泌。可根据在宿主生物体中待表达和分泌的酶使用任何合适的信号肽。信号序列的示例包括来自链霉菌属纤维素酶基因的信号序列。优选的信号序列是变铅青链霉菌(S.lividans)纤维素酶celA(Bently等人，Nature 417:141-147,2002)。然后优选地由于在附加体上转化或通过整合到染色体，稳定维持该核酸。或者，酶的表达可通过顺式或反式活化染色体中编码酶的DNA来诱导。

[0095] 与工程改造细胞系以表达外源性基因一样，有时需要将细胞系工程改造以抑制或敲除编码作为转化方法抑制剂的产物的内源性基因的表达。抑制或敲除策略也可用于移除不必要的基因或替换内源性基因，并且将其替换为该基因的改进型式、变体和/或异源型式。此类抑制或敲除可通过siRNA、锌指蛋白、其它已知的用于敲除或减少特定内源性基因表达的分子生物学技术等等进行。

[0096] 共培养物的组合细胞系可来自不同或相同的域、界、门、纲、亚纲、目、科、属或种。它们也可来自不同种的不同菌株、相同种的不同菌株，或来自相同的菌株。

[0097] 示例性组合包括来自相同种的不同菌株的细胞系(如，里氏木霉RL-P37(Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46-53,1984)和里氏木霉QM-9414(ATCC No.26921)，由U.S.Army Natick Laboratory分离)。可使用来自相同界(如，真菌界)中不同种的不同菌株的细胞系(如，里氏木霉RL-P37和黑曲霉)。也可使用来自不同界/域中不同种的不同菌株的细胞系(如，细菌、酵母、真菌、藻类和高等真核细胞(植物或动物细胞))。示例性组合还包括细菌(如，枯草芽孢杆菌或大肠杆菌(E.coli))和真菌(如，里氏木霉或黑曲霉)；细菌和酵母(如，酵母属或毕赤酵母属(Pichia))；酵母和真菌；细菌和藻类、酵母和藻类、真菌和藻类等等。

[0098] 当两个或更多个细胞系由相同的基础菌株(如，里氏木霉RL-P37或枯草芽孢杆菌)经工程改造时，每个细胞系可编码一个或多个不同的外源性酶。任选地，一些细胞系也可经工程改造使得基础菌株中的基因正常表达水平的如至少50％、75％或90％受到抑制。

[0099] 适于本发明方法的细胞系包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞系，诸如植物或动物细胞系。微生物细胞系是优选的。

[0100] 细胞系可以是酵母细胞系。酵母细胞的示例包括酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)、毕赤酵母属、汉逊酵母属(Hansenula sp.)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)、法夫酵母属(Phaffia sp.)或假丝酵母属(Candida sp.)，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白假丝酵母(Candida albicans)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、加拿大毕赤酵母(P.canadensis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)。

[0101] 细胞系可以是真菌细胞系。真菌的示例包括曲霉菌种，诸如米曲霉和黑曲霉；酵母菌种，诸如酿酒酵母；裂殖酵母菌种，诸如粟酒裂殖酵母以及木霉属菌种，诸如里氏木霉。

[0102] 优选的真菌示例包括丝状真菌细胞。丝状真菌亲本细胞可以是以下各属(但不限于以下各属)的种的细胞：木霉属(如，里氏木霉(其为之前归类为长梗木霉(T.longibrachiatum)的红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性形式、绿色木霉、康宁木霉、哈茨木霉)(Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46-53,1984；ATCC No.56765和ATCC No.26921)；青霉菌属(Penicillium sp.)；腐质霉属(Humicola sp.)(如特异腐质霉(H.insolens)、柔毛腐质霉(H.lanuginose)或灰腐质霉(H.grisea))；金孢子菌属(Chrysosporium sp.)(例如C.lucknowense)；粘帚霉属(Gliocladium sp.)；曲霉属(如，米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)或泡盛曲霉(A.awamori))(Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39:7380743,1993以及Goedegebuur等人，Genet.41:89-98,2002)；镰孢属(Fusarium sp.)(例如玫瑰色镰孢(F.roseum)、禾赤镰孢(F.graminum)、谷类镰孢(F.cerealis)、尖孢镰刀菌(F.oxysporuim)或镰孢霉(F.venenatum))；脉孢菌属(Neurospora sp.)(例如粗糙链孢霉(N.crassa))；肉座菌属(Hypocrea sp.)；毛霉属(例如米赫毛霉(M.miehei))；根霉属；以及裸胞壳属(Emericella sp.)(参见Innis等人，Science 228:21-26,1985)。术语木霉属
(“Trichoderma”、“Trichoderma sp.”或“Trichoderma spp.”)是指之前或目前被归类为木霉的任何真菌属。真菌可以是构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖孢镰刀菌或茄腐皮镰刀菌(F.solani)。曲霉属菌株在Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39:738-743,1993和Goedegebuur等人，Curr.Gene 41:89-
98,2002中有所公开，它们均据此全文以引用方式并入，尤其是关于真菌的内容。优选地，真菌是木霉属菌株，诸如里氏木霉菌株。里氏木霉菌株是已知的，并且非限制性示例包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767和NRRL 15709，它们均据此全文以引用方式并入，尤其是关于里氏木霉菌株的内容。宿主菌株可以是RL-P37的衍生物(Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46-53,1984)。

[0103] 细胞系可以是细菌细胞系。适于本发明方法的细菌细胞的示例包括革兰氏阳性菌(如，链霉菌属和芽孢杆菌属)和革兰氏阴性菌(如，大肠杆菌和假单胞菌属(Pseudomonas sp.))。优选的示例包括：芽孢杆菌属菌株诸如地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，乳杆菌菌株，链球菌(Streptococcus)菌株，泛菌属(Pantoea)菌株诸如柠檬泛菌(P.citrea)，假单胞菌属菌株诸如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)，链霉菌属(Streptomyces)菌株诸如白色链霉菌(S.albus)、浅青紫链霉菌(S.lividans)、鼠灰链霉菌(S.murinus)、锈棕色链霉菌(S.rubiginosus)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)或灰色链霉菌(S.griseus)，或者埃希氏杆菌属(Escherichia)菌株诸如大肠杆菌。“芽孢杆菌”属包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽胞杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。已经认识到，芽孢杆菌属还在继续进行分类学整理。因此，该属包括已经重新分类的种，包括但不限于诸如现在命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌”的嗜热脂肪芽孢杆菌之类的生物体在氧存在下生成抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的限定性特征，但该特征也可适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、解脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。

[0104] 细胞系可以是植物细胞系。植物细胞的示例包括来自蝶形花科(Fabaceae)，诸如蝶形花亚科(Faboideae)的植物细胞。适于本发明方法的植物细胞的示例包括来自野葛(kudzu)、杨树(poplar)(诸如银白杨与欧洲山杨的杂种(Populus alba x tremula)CAC35696或银白杨(Populus alba))的植物细胞(Sasaki等人.,FEBS Letters 579(11):2514-2518,2005)、白杨(aspen)(诸如美洲山杨(Populus tremuloides))或英国栎(Quercus robur)的植物细胞。

[0105] 细胞系可以是藻类细胞，诸如绿藻、红藻、灰胞藻门(glaucophytes)、chlorarachniophytes、裸藻(euglenids)、色藻界(chromista)或沟鞭藻类(dinoflagellates)。

[0106] 细胞系可以是蓝细菌细胞，诸如根据形态分为任何如下组的蓝细菌：色球藻目、宽球藻目、颤藻目、念珠藻目或真枝藻目。

[0107] 细胞系可以是得自例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞或任何数量的其它无限增殖化细胞系。

[0108] 在一些方法中，第一细胞系是编码外源性β-木糖苷酶的里氏木霉菌株，并且第二细胞系是编码外源性β-葡糖苷酶的里氏木霉菌株。

[0109] 在一些方法中，第一细胞系是编码地衣芽孢杆菌淀粉酶的地衣芽孢杆菌菌株，并且第二细胞系是编码嗜热脂肪地芽孢杆菌淀粉酶的地衣芽孢杆菌菌株。

[0110] 在一些方法中，例如第一细胞系是编码外源性GH61酶的里氏木霉菌株，并且第二细胞系是编码外源性或内源性纤维素酶的里氏木霉菌株。

[0111] V.共培养方法

[0112] 在一些实施方案中待共培养的细胞系最初可以分开培养以形成初始培养物，其优选地在600nm 波长和1cm光程长度下具有至少约0.1、0.2、0.4、0.8、1.0或1.5的光密度。然后将初始培养物在新鲜培养基中以等体积或其它期望的比率混合(如在下文进一步讨论)以形成起始共培养物。任选地，分离物可直接接种到培养基用于蛋白质生产(如，不使用初始培养物)。

[0113] 一个细胞系生长超过另一个的潜在问题可通过如下步骤减少：选择具有本质上类似的生长特性的细胞系，如密切相关细胞系，当每个细胞系在单独培养基上生长时，选择不是最适于至少一个细胞系而是减少生长差异的培养基，和/或调整以体积计、以OD或细胞数量计的比率，培养物以该比率组合，以补偿不同的生长特性。

[0114] 密切相关细胞系可得自相同种(如，里氏木霉)或相同菌株，或更优选地相同基础菌株的细胞系，或以不同方式修饰为表达不同外源性酶的细胞系。例如，第一细胞系可为经基因工程改造为表达酶A的基础细胞系，并且第二细胞系可为经基因工程改造为表达酶B的基础细胞系。

[0115] 在组合细胞系用于共培养之前，可确定每个细胞系的生长曲线。然后根据所确定的生长曲线，可确定混合细胞系以优化第一组酶和第二组酶(或更多组酶)共表达的比率或比率范围，以便至少部分补偿生长曲线的差异。

[0116] 在任何细胞培养体系中，在接种后存在特征性生长模式，其包括延滞期、加速生长期、指数或“对数”期、负生长加速期和平台或稳定期。对数和平台期给出了关于细胞系、对数生长期间的群体倍增时间、生长速率以及平台期实现的最大细胞密度的信息。例如，在对数期中，随着生长的持续，细胞达到其最大细胞分裂速率，细胞数量与时间呈对数关系增加。通过在特定时间进行第一次计数，在对数期期间间隔之后第二次计数，并知道实耗时间单位的数量，可计算细胞分裂或倍增的总数、生长速率和世代时间。

[0117] 群体倍增时间测量可用于监测连续传代期间的培养物，并且计算传代培养所需的细胞产率和稀释因子。群体倍增时间是平均数字，并且描述了培养物内大范围细胞分裂速率的净结果。倍增时间随不同的细胞类型、培养瓶和条件而不同。预定生长曲线可用于确定共培养物所用的每个细胞系的群体倍增时间。优选地，共培养的细胞系指数级生长中的群体倍增时间在彼此的2或5倍内。例如，共培养所选的细胞系指数级生长中的群体倍增时间在彼此的2、3、4或5倍内。如果生长速率有更多的不同，则优选地改变培养基，以鉴定其中群体倍增时间更相似，优选地在彼此的2或5倍内的培养基。例如，培养基提供的组分和条件可调整，并且用于减少细胞系指数级生长中的群体倍增时间差异，以使得每个细胞系的群体倍增时间在彼此的2或5倍内。另外，细胞系可以首先根据其使用常规培养基的生长曲线的小差异选择，然后调整培养基/条件，以使得生长曲线差异变得更小。

[0118] 第一细胞系与第二细胞系编码的各组酶的最佳比率不必事先已知。细胞系以体积、OD或细胞数量计的不同比率的组合允许凭经验小规模比较不同的比率，此类分析确定的最佳比率用于后续大规模培养。

[0119] 为确保单个细胞系不会无法接受地胜过一个或多个其它细胞系，如生长更迅速并且抑制其它细胞系的生长，可调节细胞系的比率以使得每个细胞系在大约相同的时间达到生长曲线中的预定点。例如，可调整比率以使得每个细胞系在大约相同的时间达到对数中期。或者，每个细胞系可在大约相同的时间达到平台期(平台中期)。优选地，每个细胞系可在大约相同的时间达到对数中期和平台期二者。任选地，每个细胞系可在大约相同的时间达到稳定期。

[0120] 生长曲线也可用于确定实现收获细胞系之间的细胞密度的某些比率所需的收获时间和/或接种密度。例如，一种类型的底物/预处理方法可能希望不同组酶的等摩尔比。其它类型底物/预处理方法所需的酶的不同比率可通过改变一个或多个细胞系的接种密度以及收获时间实现。

[0121] 每个细胞系可具有在培养基中进行最佳生长的不同要求，尤其是来自不同生物体(如，不同域、界、属或种)或不同菌株的细胞系。然而，培养基虽然不是最适于任何单个细胞系，但如果所有细胞系在此类培养基中具有类似的生长曲线，则可以最适于所有细胞系的共发酵。因此，可确定每个细胞系在多个培养基中的生长曲线。然后比较这些生长曲线，以鉴定其中细胞系的生长曲线最相似的培养基。例如，在此类培养基中每个细胞系在大约相同的时间到达平台期(平台中期)、对数中期和/或稳定期。然后所选的培养基用于共培养。

[0122] 作为基于细胞密度的生长曲线的替代形式或与其组合，酶量和/或所表达酶的活性可沿着生长曲线测量。这些伴随生长曲线的变化提供了用于确定混合细胞系以优化酶的共表达的比率的指导。例如，一些酶的表达水平可低于其它酶。对于这些酶，表达酶的细胞系的较高接种密度对于实现所需量的这些低表达酶是优选的。

[0123] 来自相同菌株的细胞系通常具有类似的生长曲线并且需要类似的培养基。另一方面，来自不同菌株或不同生物体的细胞系通常具有不同的生长曲线并且需要不同的培养基。如上所讨论，可测定不同细胞系的生长曲线，以确定每个细胞系的接种密度。任选地，测定各种培养基中每个细胞系的生长曲线，以确定适于共培养的培养基。

[0124] 酶可直接释放至培养基。或者细胞可裂解释放细胞内的酶。另外，给定细胞系表达的一些酶可直接释放，而其它酶可通过细胞裂解释放。所释放的酶，无论是分泌还是裂解的结果，均可从培养基收获，或培养基可按原样使用，尽可能少地(如果有的话)以全发酵液形式进一步加工。如果需要，细胞碎片(如，宿主细胞、裂解片段)可任选地通过例如离心或超滤去除。任选地，可以例如使用商购获得的蛋白质浓缩过滤器浓缩酶混合物。酶混合物可通过一种或多种纯化步骤与其它杂质进一步分离，如免疫亲和色谱、离子交换柱分馏(如，在二乙基氨基乙基(DEAE)或包含羧甲基或磺丙基的基质上)、在蓝-琼脂糖(Blue-Sepharose)、CM蓝-琼脂糖(CM Blue-Sepharose)、MONO-Q、MONO-S、小扁豆凝集素-琼脂糖(lentil lectin-Sepharose)、WGA-琼脂糖(WGA-Sepharose)、Con A-琼脂糖(Con A-Sepharose)、醚Toyopearl(Ether Toyopearl)、丁基Toyopearl(Butyl Toyopearl)、苯基Toyopearl(Phenyl Toyopearl)或蛋白A琼脂糖(protein A Sepharose)上的色谱、SDS-PAGE色谱、二氧化硅色谱、层析聚焦、反相HPLC(RP-HPLC)、使用如Sephadex分子筛或尺寸排阻色谱的凝胶过滤、在选择性结合肽的柱上的色谱，以及乙醇、pH或硫酸铵沉淀、膜过滤和各种技术。在一些方法中，酶混合物用于下游应用中，只有极少的(如果有的话)进一步加工。

[0125] 从细胞分泌或裂解或最终产物中的酶量可使用常规技术测量，如反相高效液相色谱(RP-HPLC)或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。酶的活性也可使用本领域熟知的方法测量。

[0126] VI.细胞建库

[0127] 表达不同组酶的细胞系可存储在细胞库中，并且以不同的组合共培养。细胞库可使用想到的特定转化方法或特定的一组转化进行构建。增强转化方法的酶从已知或公布的来源、从实验或从二者鉴定。然后鉴定或构建编码并设置用于表达不同组的酶的细胞系。内源性或外源性表达一种或多种酶的细胞系可以是已知的。也可构建外源性表达一种或多种酶的细胞系，尤其是在如果以足够水平表达特定酶或特定酶的组合或平板的细胞系不可用的情况下。

[0128] 库中的细胞系可以在冷或冰冻条件下保存在固体或液体培养基中。在使用之前，通常单独繁殖一小瓶细胞，形成初始培养物，其也可在液体或固体培养基中进行。可繁殖细胞系并在不同选择压力下保存，以保持各组酶的表达，并且避免交叉污染的可能性。或者，可繁殖细胞系并且在允许营养缺陷型生长的条件下保存，从而保持基因型。

[0129] 可共培养细胞系并将其用于使用上述方法制备酶混合物。在组合之后，在使用组合细胞系的培养基上繁殖细胞系，这样可用于单独繁殖和保存细胞系的所选择条件或允许营养缺陷型生长的条件不一定用于共培养步骤。

[0130] 细胞库可允许选择不同的细胞系排列，以不同的组合或相对表达水平提供增强转化方法的酶。可比较不同的组合以确定哪一个给定酶混合物具有用于增强转化方法的最佳活性。此类比较可指出细胞库内细胞系的最佳组合，而无需事先确切知道哪个酶或酶的哪种比率是最佳的。在这个意义上，这允许根据特定转化方法的特定要求定制来自共培养物的所表达酶平板。

[0131] 可通过改变来自细胞库的细胞系初始培养物组合的比率来调整不同过程的底物或底物预处理的变化。例如，在纤维素制剂中半纤维素的量可变化。用于处理大量半纤维素的酶混合物可包含更高水平的木聚糖酶活性。一些淀粉制剂可包含已知抑制淀粉酶活性的物质(如，原材料或代谢物)，在该情况下需要更高的淀粉酶含量。取决于预处理底物中的组合物(如，不同的葡聚糖/木聚糖曲线)，不同的酶混合物可通过以不同的比率混合酶生产菌株的初始培养物来制备，从而生成具有不同的相对酶量的酶混合物。

[0132] 即使不考虑转化方法细胞建库也是有用的。通过建立编码多个常用工业用酶的不同细胞系库，细胞系可根据即将进行的转化方法，从共培养物库以不同的组合进行组合。因此本文提供的共发酵方法不仅提供所得组合物的灵活性，还提供各种其它优点，诸如例如与每个所需酶组分单独进行发酵然后共混相比降低了成本；降低保存酶的成本，因为共发酵生成具有所需比率的酶的组合物，而共混策略需要保存单独发酵或制备的每种酶。

[0133] VII.应用

[0134] 本发明方法生成的酶混合物具有利用此类转化方法的农业、工业、医药和营养的多种应用。此类转化方法的底物可包括木质纤维素材料、纤维素、半纤维素和淀粉。

[0135] 例如，纤维素酶和/或纤维素酶辅助酶的混合物可用于纤维素材料的水解，如将生物质发酵为生物燃料。混合物还用于从谷物生成葡萄糖，或作为动物饲料的补充剂，通过增加饲料的消化率而减少粪便的生成。纤维素酶也可用于通过将木质纤维素生物质转化为可发酵糖，而提高醇发酵(如，在啤酒酿造中)的效率。纤维素酶混合物可用于咖啡中的商业化食品加工，即豆干燥期间的纤维素水解。它们还用于纸浆造纸工业的多个目的。在制药应用中，纤维素酶用于植物胃石(存在于人胃中的一种纤维素胃石)的处理。

[0136] 纤维素酶、纤维素酶辅助酶和/或半纤维素酶的混合物广泛用于纺织工业和衣物洗涤剂。纤维素酶也可用于将纤维素或木质纤维素材料水解为可发酵糖。

[0137] 淀粉酶的混合物或α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和/或普鲁兰酶的混合物在食品行业中具有多种应用。例如，淀粉酶的混合物用于糖浆制造、右旋糖制造、烘焙、发酵麦芽浆的糖化、食品糊精和糖产物制造、干式早餐食物制造、巧克力糖浆制造以及从果汁去除淀粉。淀粉酶也可用于从谷物产物生成葡萄糖，用于乙醇生产。

[0138] 含植酸酶的酶混合物可用于谷物湿磨和清洁产物。它们也具有多个其它用途，用于个人护理产品、医药产品和食品和营养产品，以及各种工业应用，特别是清洁、纺织物、光刻和化学领域。

[0139] 实施例

[0140] 以下实施例描述了在各种条件下所进行的代表性同时糖化和共发酵(SSCF)反应。将全玉米粉液化物和玉米面用作示例性底物。

[0141] (A)材料：

[0142] 获得以下酶：

[0143] ·经纯化的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)(DuPont Industrial Biosciences，Palo Alto,CA)，0.054％w/w；

[0144] ·GC626(源于白曲霉的淀粉水解α-淀粉酶并表达于里氏木霉中)(DuPont Industrial Biosciences，Palo Alto，CA)，0.0053％w/w；以及

[0145] ·FERMGENTM 2.5x(真菌蛋白酶)(DuPont Industrial Biosciences，Palo Alto，CA)，0.00029％w/w。

[0146] 用于常规的同时糖化和发酵(SSF)的32.8％干固体(ds)的全玉米粉液化物可获自典型的干磨乙醇设施。所用酵母菌株为Ethanol 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Fermentis，France)。

[0147] 使用以下分泌葡糖淀粉酶的真菌菌株：

[0148] ·里氏木霉真菌菌株；以及

[0149] ·黑曲霉真菌菌株。

[0150] (B)常规发酵方法：

[0151] 如下进行100克常规发酵。在4℃下将冷冻的液化物温育过夜。在4℃温育之后，将液化物在60℃下温育2小时，之后在32℃下温育30分钟。对玉米液化物进行称重，并加入脲至百万分之600(ppm)的最终浓度。用6N硫酸和/或28％氢氧化铵调节液化物pH至4.8。用顶置式搅拌器在室温下充分混合溶液30分钟。称出100g+/-0.2g的液化物到分别标有标记的125mL锥形瓶中，一式三份。

[0152] 在适当的烧瓶中，采用来自黑曲霉或里氏木霉的合适真菌菌株接种100g的以上液化物，并在32℃下温育9小时，并在200rpm下混合。在种子温育之后，在SSF时间＝0时，在Milli-QTM(Millipore Corp.,Billerica,MA)水中制备20％酵母剂量的活性干酵母(ADY)的浆液。用0.5mL水化酵母浆液投掷(pitched)即接种烧瓶。第二真菌接种过程通过除去种子期并在SSF时间＝0时直接用酵母投掷黑曲霉或里氏木霉真菌菌株进行。

[0153] 在SSF时间＝0时，将适当体积的葡糖淀粉酶、GC626和FERMGENTM 2.5x添加至适当的烧瓶中。经纯化的葡糖淀粉酶的剂量为0.054％w/w。GC626的剂量为0.0053％w/w。FERMGENTM 2.5x的剂量为0.00029％w/w。混合各个烧瓶并用泡沫塞子塞住。将烧瓶在强制对流型培养箱中温育，并在三种独立的温度分布下以200rpm混合55小时。在SSF之前和期间，采集约1mL的时间点样品。将样品冷冻储存。

[0154] (C)样品制备方法：

[0155] 将各时间点样品于4℃解冻，并在15,000rpm下离心2至4分钟。在96孔深孔微量滴定板的各个孔中，使100μL样品上清液与10μL 1.1N硫酸混合并在100℃下温育5分钟。将1mL的Milli-QTM水添加至各个孔中，并将200μL的各样品转移到0.22μm滤板中。将各个样品过滤到独立的96孔微量滴定板中。用EZ-PierceTM密封板(Excel Scientific,Inc.,Victorville,CA)密封各个板。

[0156] 将20μL的各样品上样到Agilent 1200系列HPLC(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)并在85℃下采用RezexTM RFQ-Fast Acid H+(8％)柱(Phenomenex,Torrance,CA)进行分析，0.01N硫酸移动相为1mL/min，并且洗脱时间为9分钟，采用设定为55℃的RezexTM Organic Acid ROA保护柱(Phenomenex,Torrance,CA)和折光率检测器(RID)。

[0157] 采用合适的校准曲线使用ChemStation(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara CA)来计算DP1、DP2、DP3、DP4+、甘油、乙酸、乳酸和乙醇浓度(％w/v)。采用Supelco 燃料乙醇标准(Sigma Catalog#48468-U)以1:1、1:2、1:5、1:10和1:20稀释度得到以上组分的校准曲线。将100μL的各稀释液与10μL 1.1N硫酸和1mL Milli-QTM水混合并作为对照在ChemStation系统上运行。

[0158] 结果

[0159] 表1描述了所测试的各种共混物和实验条件，并且更详细地描述于以下：

[0160] 表1

[0161]

[0162] 表1示出使用酵母而不使用外源性酶作为三种阴性对照的共混物。在没有添加表达酶的丝状真菌例如黑曲霉或里氏木霉的情况下，有效地完成SSF运行需要添加外源性酶。在阴性对照中发酵为乙醇极为缓慢，仅平均产生由阳性对照所产生的总乙醇收率的18％(如表2所示)。第四阴性对照共混物(“GC626阴性对照”)仅使用外源性GC626和FERMGENTM
2.5x而不使用外源性GA来运行。虽然乙醇的产量在仅包含GC626和FERMGENTM 2.5x的共混物中更高，但GC626阴性对照的最终乙醇收率仅为传统SSF条件下总收率的30％(如表2所示)。

[0163] 不考虑用于反应的温度，在不添加外源性酶的情况下，在55小时之后留下相当多量的DP4+。在各种反应条件下，反应中留下的DP4+量和相对于对照反应的DP4+增加的倍数示出于表2中。

[0164] 表2

[0165]

[0166] 为了减少或消除对于添加外源性酶如葡糖淀粉酶的需求，表达GA和/或AA的真菌菌株与酵母的共发酵可提供所需要的酶来催化淀粉水解为葡萄糖。对表达GA和AA或GA的两种不同真菌菌株进行测试：黑曲霉和里氏木霉。黑曲霉能够共表达内源性GA和酸稳定性α-淀粉酶(AsAA)两者。里氏木霉表达其内源性GA而不表达显著水平的α-淀粉酶。

[0167] 向SSCF转化方法添加丝状真菌例如黑曲霉或里氏木霉相较于阴性对照降低了DP4+水平。在例如不具有外源性GA(共混物1和3)和具有外源性AA(共混物3)的情况下，在32℃下DP4+水解的时间进程示出于图1。在其它实验条件下观察到类似的时间进程。即使不添加外源性酶，向SSCF转化方法添加丝状真菌尤其是黑曲霉也增加乙醇产生量。图2例如示出了在32℃和常规发酵条件下，在9小时种子温育和黑曲霉(共混物1)的55小时SSCF之后相对于对照的总乙醇产量。

[0168] 在典型的工业操作条件下，在32℃(作为酵母生长的最佳温度条件)下运行SSF。然而，在发酵期间，温度可超过32℃并达到高至38℃。考虑到SSF温度的波动，在三种温度分布下进行实验：32℃、35℃、以及范围为32℃至38℃的斜坡式条件，最大温度峰值在发酵中约20小时并在发酵中约40小时返回至32℃。图3示出发酵期间所用代表性的温度条件。

[0169] 温度显著地影响酵母的生长和生活力并因此影响整个发酵中产生的总乙醇。随着温度升高，酵母开始经受胁迫并死亡或遭受较慢的代谢，从而导致较高水平的残留葡萄糖(DP1)和较低的乙醇收率。在发酵结束(EoF)时，采用外源性TrGA和GC626α-淀粉酶在最高胁迫38℃的分段式条件下的乙醇收率比在32℃下达到的收率低10％(如表2所示)。

[0170] 为了增加酶表达并由此促进SSF效率，在用酵母接种之前，可使真菌菌株在液化物底物中预温育一段时间。在该预温育期间或“种子期”，真菌菌株能够利用少量存在于起始液化物中的葡萄糖例如0.70％至1.0％w/v，以引发生长并开始蛋白质表达。为了接种液化物，用4.5ml黑曲霉或里氏木霉的甘油原液接种包含600ppm脲的100克全液化物(pH 4.8)。在32℃下温育这些种子瓶，并在200rpm下混合9小时。表1描述了所测试的条件，包括外源性GA、AA和酸性真菌蛋白酶(AFP)剂量。

[0171] 在SSF时间＝0时，将0.1％w/v Ethanol 活性干酵母(ADY)添加至所有发酵瓶中。对于包含黑曲霉菌株的烧瓶，在SSF时间＝0时不添加外源性GA或AA，原因是黑曲霉表达SSF所需的葡糖淀粉酶和α-淀粉酶两者。对于包含里氏木霉菌株的烧瓶，在SSF时间＝0时分别以0.0053％w/w剂量和0.00029％w/w剂量添加外源性GC626和FERMGENTM 2.5x。在常规SSF条件下运行具有0.054％w/w TrGA、0.0053％w/w GC626和0.00029％w/w FERMGENTM 2.5x的阳性对照。在三种温度下测试所有发酵条件：32℃、35℃、以及高温38℃分段式条件。在各个温度下另外运行仅包含酵母且不含外源性酶的阴性对照。在38℃分段式温度条件下，运行仅包含酵母、0.0053％w/w GC626和0.00029％w/w FERMGENTM 2.5x的另外阴性对照。

[0172] 在种子温育之后，从包含黑曲霉真菌菌株的液化物中释放出了高水平的葡萄糖，这表明显著水平的GA表达。在9小时接种之后，接种有黑曲霉菌株的烧瓶包含起始液化物的平均约7倍的葡萄糖。另外，因为黑曲霉可共表达GA和AsAA，所以DP4+收率在9小时种子温育之后显著降低。在SSF时间＝0时，包含黑曲霉的烧瓶具有比起始液化物低34％的DP4+水平。因为AsAA与GA协同作用来水解DP4+，所以包含黑曲霉(共混物1、5和10)的烧瓶中减少的DP4+相较于包含仅可表达GA的里氏木霉(共混物3、7和12)的烧瓶显著更高。相较于里氏木霉，表达的黑曲霉酶的协同增强效应在图4示为总DP4+水解百分比。

[0173] 另选地，通过在38℃分段式温度条件下，在SSF时间＝0时将酵母和黑曲霉或里氏木霉真菌菌株均直接投掷到全玉米粉液化物中进行真菌接种。如上所述，黑曲霉可表达其自身GA和AsAA并且不需要在SSF时间＝0时添加外源性酶。对于包含里氏木霉菌株的烧瓶，在SSF时间＝0时分别以0.0053％w/w剂量和0.00029％w/w剂量添加外源性GC626和FERMGENTM 2.5x。在常规SSF条件下运行具有0.054％w/w TrGA、0.0053％w/w GC626和0.00029％w/w FERMGENTM 2.5x的阳性对照。另外运行不包含外源性酶或仅含GC626和FERMGENTM 2.5x的阴性对照。表1描述了所测试的条件。

[0174] 下面将更详细地讨论用本文所公开的各种代表性共混物获得的具体结果。

[0175] 共混物1：在32℃下黑曲霉种子+Ethanol 活性干酵母(ADY)投掷

[0176] 在典型的操作温度32℃下，仅包含黑曲霉真菌菌株和Ethanol 酵母的共混物1产生由对照共混物所观测的总乙醇收率的86％，并且为阴性对照乙醇的4.6倍(表2)。使用共混物1在发酵结束时水解了起始DP4+浓度的94％，这表明在发酵期间产生了显著水平的GA和AA两者(表2)。

[0177] 共混物5：在35℃下黑曲霉种子+Ethanol ADY投掷

[0178] 在发酵温度上升到32℃之上时，酵母经受热胁迫。因此，35℃下的对照共混物产生的乙醇比32℃下的对照共混物少4％(96％对100％)(表2)。

[0179] 包含黑曲霉真菌菌株的共混物5在35℃下产生的乙醇比在32℃下(共混物1)多(92％对86％)，这表明在更高的温度下酶表达和活性增加(参见表2)。使用里氏木霉(36％对53％)(参见表2)观察到相反的效应。在35℃下，与对照共混物所产生的96％乙醇相比，共混物5产生92％乙醇(参见表2)。这些结果表明黑曲霉比里氏木霉能更好地耐受热胁迫并且可意料不到的用于与酵母共培养以与补充有添加的外源性GA、GC626和FERMGENTM 2.5x剂量的反应相比产生能与之相比的乙醇收率。在35℃下，共混物5的DP4+水解略微改善，原因是最终DP4+收率比在32℃下的共混物1低33％(表2)。共混物5水解96％的总DP4+，这再次表明在发酵期间显著的酶产生(表2)。

[0180] 共混物10：在32-38-32℃下黑曲霉种子+Ethanol ADY投掷

[0181] 共混物10仅包含黑曲霉真菌菌株和Ethanol 酵母并且采用在32℃至38℃之间以可控方式斜升的分段式温度条件发酵(参见图3)。该反应的对照即对照38℃斜坡包含Ethanol 酵母而不添加真菌菌株，并且其包含外源性添加的GA、GC626和FERMGENTM 2.5x剂量(参见表1)。令人惊奇地，共混物10产生相较于对照显著更多的乙醇(即99％相比于90％)(参见表2)。共混物10的DP4+水解与对照相当。这些结果示出黑曲霉在与酵母共培养时不仅可表达有效产生乙醇所需的所有酶，而且黑曲霉在热胁迫下也是如此。

[0182] 共混物13：在32-38-32℃下黑曲霉+Ethanol ADY投掷

[0183] 如同共混物10，在SSF时间＝0时将Ethanol 酵母和黑曲霉真菌菌株两者接种或投掷到全玉米粉中。采用在32℃至38℃之间以可控方式斜升的分段式温度条件(图3)，仅包含投掷的黑曲霉和Ethanol 酵母的共混物13与在相同温度条件下对照共混物产生的90％总乙醇收率相比令人惊奇地产生98％的总乙醇收率(表2，图5)。

[0184] 共混物13的DP4+水解与对照共混物所观测的水平也是相当的。共混物13在分段式温度条件下水解96％的总DP4+并且仅为该温度下的对照共混物的1.09倍(表2)。

[0185] 共混物3、7、12和14：里氏木霉+Ethanol ADY

[0186] 与包含黑曲霉的共混物和对照共混物相比，共混物3、7、12和14的乙醇产量降低(表2)。相较于平均产生阴性对照的5.2倍的乙醇(86％至99％的对照共混物)的黑曲霉菌株，平均而言，在所有温度条件下包含里氏木霉的共混物产生为阴性对照共混物的2.3倍的乙醇(36％至66％的对照共混物)(表2)。此种乙醇产量的增大可归因为外源性添加GC626，并且并非因为由里氏木霉产生葡糖淀粉酶。仅73％的总DP4+的DP4+水解也可由里氏木霉的较低葡糖淀粉酶产生而受到影响。在发酵结束时，共混物3、7和12均具有平均为对照共混物的9.9倍的DP4+水平(表2)。

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