普陀水仙多倍体植株的培育方法
阅读：15发布：2020-05-13
专利汇可以提供普陀水仙多倍体植株的培育方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供普陀 水 仙 多倍体 植株的培育方法，属于 生物 技术领域，该多倍体植株通过同基因的三倍体祖代的鳞茎片中的基因组倍增获得，基因组倍增步骤为：将鳞茎片进行应激预培养，再将 磁场 作用于鳞茎片，在磁场下用诱变剂 接触 鳞茎片，产生多倍体鳞茎片，将多倍体鳞茎片培育生根并培养成多倍体植株；培养所得多倍体植株的生长速度至少相同于同基因的三倍体祖代。本发明提供的培育方法能打破细胞耐受性引起的多倍体诱导抑制作用，缓解诱变剂对 染色 体的凝缩作用以降低非整倍 体细胞 生成率，降低嵌合体生成几率以提高嵌合体分离及纯化速率，提升内源生长素生成量和积累量，增加多倍体植株中脯 氨 酸及可溶性 蛋白质 积累量以提升生存能 力 ，且不出现晚熟性状。，下面是普陀水仙多倍体植株的培育方法专利的具体信息内容。
1.普陀水仙多倍体植株的培育方法，所述多倍体植株通过同基因的三倍体普陀水仙祖代的鳞茎片中的基因组倍增获得，其特征在于：所述基因组倍增通过以下方式实施：
a，将鳞茎片进行应激预培养；
b，将磁场作用于所述预培养后的鳞茎片；
c，在所述磁场下用诱变剂接触所述鳞茎片，从而产生多倍体鳞茎片；
d，将所述多倍体鳞茎片培育生根并培养成多倍体普陀水仙植株；
所述培养所得多倍体普陀水仙植株的生长速度至少相同于所述同基因的三倍体普陀水仙祖代。
2.根据权利要求1所述的普陀水仙多倍体植株的培育方法，其特征在于：所述多倍体普陀水仙植株是六倍体；所述多倍体普陀水仙植株经至少5次传代能保持基因组稳定性，且具有：
1)平均花序数超过三倍体普陀水仙祖代25-40％；
2)花期较三倍体普陀水仙祖代延长4-10天；
3)叶片面积较三倍体普陀水仙祖代增加20-35％。
3.根据权利要求1所述的普陀水仙多倍体植株的培育方法，其特征在于：所述应激预培养为热应激或渗透压应激；所述应激预培养在诱变剂接触鳞茎片前1-2d进行。
4.根据权利要求3所述的普陀水仙多倍体植株的培育方法，其特征在于：所述热应激操作条件为：水浴温度为35-50℃，周期为1-2d，单次水浴时间为1-2h，间隔时间为6-8h。
5.根据权利要求3所述的普陀水仙多倍体植株的培育方法，其特征在于：所述渗透压应激操作条件为：高渗透压溶液糖浓度为5-7％，周期为1-2d，单次使用高渗透压溶液的时间为10-30min，间隔时间为6-8h。
6.根据权利要求1所述的普陀水仙多倍体植株的培育方法，其特征在于：所述作用于鳞茎片的磁场的强度为0.15-0.5T，所述磁场作用时间为诱导产生多倍体鳞茎片的整个周期内。
7.根据权利要求1所述的普陀水仙多倍体植株的培育方法，其特征在于：所述诱变剂中包括2-5wt％的秋水仙素、0.3-0.5wt％的维甲酸和0.05-0.2wt％的2-羟基苯乙酮；所述诱变剂在诱变培养基中的重量占比为5-15％。
8.根据权利要求1所述的普陀水仙多倍体植株的培育方法，其特征在于：所述产生多倍体鳞茎片的培养条件为：温度为20-25℃，摇床震荡培养转速为100-300r/min，光照时间为
12-16h/d，光照强度为600-1000Lx，培养周期为2-3d。
9.根据权利要求1所述的普陀水仙多倍体植株的培育方法，其特征在于：所述培育生根所用培养基中包括浓度分别为1-2mg/L的6-BA、0.1-0.5mg/L的NAA和2-4wt％的蔗糖。
10.权利要求1-9任一项所述的普陀水仙多倍体植株的培育方法在多倍体水仙培育中的用途。
普陀水仙多倍体植株的培育方法
技术领域
背景技术
[0002] 普陀水仙，别名观音水仙、凌波仙子等，属石蒜科水仙属的多年生球根花卉，是我国十大名花之一，也是中国水仙优良品种之一，盛产于我国舟山群岛，是舟山市的市花。普陀水仙皆具有花色淡雅、绿叶挺拔、花期较长、花枝较多、香气浓郁、养护方便等特点，且具有较强的抗寒性、抗病性、花量多、花期长、花香浓郁、叶绿挺拔、姿态优美。其品种以单瓣(金盏银台)、重瓣(玉玲珑)为主，并有全黄色和全白色花朵的稀有品种，宜盆栽，也可水养，可赏性强。
[0003] 植物染色体组的多倍化是植物进化变异的自然现象，也是促进植物发生进化改变的重要力量。多倍体因其自身具备的巨大性、低孕型、抗逆性及克服远缘杂交的不育性等特点而被园艺育种专家所青睐。多倍体是指具有三套或者三套以上完整染色体组的所有个体。染色体组加倍使植物体可用的遗传物质增加，重复的基因可能会发生功能分化，从而使多倍体物种在自然选择中具有更大环境适应优势，如更强的抗旱能力、抗病虫害能力、无融合生殖等，使植物可以适应更广泛的自然环境。自然而生的多倍体数量是有限的，必须进行人工诱导创制多倍体。在人工多倍体的诱导中，最常用的方法是化学诱导，即采用诱变剂处理植物体内最旺盛、最活跃的组织器官，如对萌动状态或刚发芽的种子、幼苗或嫩枝的生长点、芽、花蕾或愈伤组织等进行处理，从而诱导产生多倍体。这种方法最大的优点就是诱导作用的高度专一性，从而使诱导效果显著，较易获得多倍体种质。
[0004] 因此对普陀水仙进行多倍体培育，在离体快速繁殖技术下对普陀水仙进行多倍体诱导，不仅保护现有资源，同时创新了种质资源，对普陀水仙的遗传改良和新品种培育具有重要意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种能增加植株中脯氨酸及可溶性蛋白质积累量以提升高温干旱环境下生存能力，打破细胞耐受性引起的多倍体诱导抑制作用，缓解诱变剂对染色体的凝缩作用以降低非整倍体细胞生成率，避免和降低嵌合体生成几率以提高嵌合体分离及纯化速率，内源生长素生成量和积累量增多的普陀水仙多倍体植株的培育方法，所得多倍体植株生长速度基本相同或略高于祖代的生长速度，不会表现出晚熟性状，且表现出显著的抗逆性增强的效果。
[0006] 本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
[0007] 普陀水仙多倍体植株的培育方法，该多倍体植株通过同基因的三倍体普陀水仙祖代的鳞茎片中的基因组倍增获得，上述基因组倍增通过以下方式实施：
[0008] a，将鳞茎片进行应激预培养；
[0010] c，在磁场下用诱变剂接触鳞茎片，从而产生多倍体鳞茎片；
[0011] d，将多倍体鳞茎片培育生根并培养成多倍体普陀水仙植株；
[0012] 上述培养所得多倍体普陀水仙植株的生长速度至少相同于同基因的三倍体普陀水仙祖代。该方法通过对鳞茎片进行了应激预培养，再采用磁场和诱变剂处理相结合的方法，进行多倍体诱导，有效降低了多倍体离体诱导过程嵌合体及非整倍体细胞的生成率，提升了多倍体诱导成功率，所得多倍体植株经过5次以上传代皆能保持倍性稳定，栽培所得多倍体植株，能获得鳞茎球变大、花序数增多、花期延长、叶片面积增大、叶片气孔变大、单位面积内气孔个数明显减少的多倍体普陀水仙，该多倍体植株的生长发育速度与三倍体祖代基本相同，且表现出显著的抗逆性增强的效果。
[0013] 对本发明而言，多倍体普陀水仙植株是六倍体；上述多倍体普陀水仙植株经至少5次传代能保持基因组稳定性，且具有：
[0014] 1)平均花序数超过三倍体普陀水仙祖代25-40％；
[0015] 2)花期较三倍体普陀水仙祖代延长4-10天；
[0016] 3)叶片面积较三倍体普陀水仙祖代增加20-35％。诱导所得倍性稳定的多倍体植株经染色体鉴定得到其染色体数为2n＝6x＝60，而三倍体普陀水仙祖代的染色体条数为2n＝3x＝30，达到了诱导并产生多倍体植株的目的，为普陀水仙提供了新品种，多倍体植株平均花序数增多、花器官增大、花期延长、叶片面积增大，显著增加了其观赏价值和经济价值。
[0017] 对本发明而言，应激预培养为热应激或渗透压应激；应激预培养在诱变剂接触鳞茎片前1-2d进行。对诱导前的鳞茎片进行预培养，通过预培养环境中热量或渗透压的改变，能使得鳞茎片的细胞产生应激反应以对抗外界不良环境的负面影响，尤其是应激预培养后期，鳞茎片细胞内脯氨酸含量、可溶性蛋白质含量显著上升以减缓应激对细胞的伤害，在抗逆境胁迫物质含量较高的情况下，对鳞茎片进行多倍体诱导，能借助诱导剂增加多倍体细胞中关于脯氨酸和蛋白质合成的基因表达，使得多倍体细胞中脯氨酸及可溶性蛋白质积累量较三倍体祖代中显著提升，进而使得多倍体植株抗逆境胁迫能力显著增强，尤其是在高温、干旱等非生物胁迫环境下，多倍体植株抵抗能力显著高于三倍体祖代，增加了普陀水仙在高温干旱环境下的生存能力，降低了养护难度和养殖户生产损失。
[0018] 进一步优选的，热应激操作条件为：水浴温度为35-50℃，周期为1-2d，单次水浴时间为1-2h，间隔时间为6-8h。更优选的，水浴温度为35-45℃。该热应激处理后，优选迅速地将鳞茎片放回20-28℃水浴中。
[0019] 进一步优选的，渗透压应激操作条件为：高渗透压溶液糖浓度为5-7％，周期为1-2d，单次使用高渗透压溶液的时间为10-30min，间隔时间为6-8h。更优选的，糖浓度由蔗糖提供，该渗透压应激处理后，优选迅速地将鳞茎片放回糖浓度为2-5％的培养基中。
[0020] 对本发明而言，作用于鳞茎片的磁场的强度为0.15-0.5T，磁场作用时间为诱导产生多倍体鳞茎片的整个周期内。在诱导多倍体产生的周期内，添加磁场与诱变剂协同作用于鳞茎片，主要是利用磁场完成诱变剂向染色质丝的靶向递送，能加速诱变剂的作用，且在磁场环境下，植物细胞内物质的分子受磁场影响，排列有序程度更高，因而诱变剂对染色体的凝缩作用被缓解，染色体分散性好，有效降低了诱导过程中因凝缩形成的非整倍体细胞的生成率，提升了多倍体诱导成功率。
[0021] 对本发明而言，诱变剂中包括2-5wt％的秋水仙素、0.3-0.5wt％的维甲酸和0.05-0.2wt％的2-羟基苯乙酮；诱变剂在诱变培养基中的重量占比为5-15％。诱变剂中秋水仙素能中断细胞的有丝分裂进程，促使细胞中染色体数目成倍增加，诱变结束后，细胞恢复正常的分裂功能，从而形成染色体加倍的细胞，达到产生多倍体细胞及植株的目的。在本发明中普陀水仙的鳞茎片表现出对秋水仙素的耐受性，虽然避免了秋水仙素对细胞的毒害作用，但也表现出对诱导过程的抑制作用，维甲酸和2-羟基苯乙酮借助磁场发挥协同作用，能刺激植物细胞外基质蛋白合成，提高细胞膜张力强度，促进秋水仙素渗透并在细胞中沉积，从而打破细胞的耐受性对多倍体诱导的抑制作用，加速多倍体细胞的产生，另一方面两者能促使胞内鸟嘌呤核苷三磷酸上的磷酰基转移，产生抑制细胞质分化的作用，在细胞组织分化时能分解引起结构形态异常的有害因素，避免和降低了嵌合体的生成几率，提高了多倍体纯合体的比率，既提升多倍体植株的产量，又能提高嵌合体分离及纯化速率，降低生产成本。
[0022] 对本发明而言，产生多倍体鳞茎片的培养条件为：温度为20-25℃，摇床震荡培养转速为100-300r/min，光照时间为12-16h/d，光照强度为600-1000Lx，培养周期为2-3d。
[0023] 对本发明而言，培育生根所用培养基中包括浓度分别为1-2mg/L的6-BA、0.1-0.5mg/L的NAA和2-4wt％的蔗糖。对诱导后的多倍体细胞进行诱导不定芽和丛生芽培育，并进行至少5次继代培育，并分离出嵌合体及非整倍体芽体，选取倍性稳定的多倍体丛生芽进行生根培育，得到多倍体幼苗，进行扩大培养即得多倍体植株，该多倍体植株的生长速度基本相同于三倍体祖代的生长速度。
[0024] 本发明中提供的普陀水仙多倍体植株的培育方法在多倍体水仙培育中的用途。上述多倍体普陀水仙的培育方法适用于水仙的多倍体培育，能获得水仙的多倍体植株，增加水仙新品种，获得既保持原品种优良性状，又表现出花器官增大、观赏价值升高、抗逆性增强的水仙品种。
[0025] 本发明的有益效果为：
[0026] 1)本发明培育得多倍体植株经5次以上传代皆保持倍性稳定，获得鳞茎球变大、花序数增多、花期延长、叶片面积增大、叶片气孔变大、单位面积内气孔个数明显减少的多倍体普陀水仙；
[0027] 2)本发明中利用应激预培养和多倍体诱导相结合的方式，增加多倍体细胞中关于脯氨酸和蛋白质合成的基因表达，使得多倍体细胞中脯氨酸及可溶性蛋白质积累量较三倍体祖代中显著提升，增加了普陀水仙在高温干旱环境下的生存能力，降低了养护难度和养殖户生产损失；
[0028] 3)本发明采用磁场与诱变剂相结合的方式完成多倍体诱变，打破细胞对诱变剂的耐受性引起的多倍体诱导抑制作用，缓解了诱变剂对染色体的凝缩作用，染色体分散性好，有效降低了诱导过程中因凝缩形成的非整倍体细胞的生成率，避免和降低了嵌合体的生成几率，提高了多倍体纯合体的比率，既提升多倍体植株的产量，又能提高嵌合体分离及纯化速率，降低生产成本；
[0029] 4)本发明中生根培育并扩大化培养所得多倍体植株中，内源生长素吲哚乙酸在培育过程中生成量和积累量增多，使得多倍体植株生长速度加快，且至少相同于三倍体祖代的生长速度，使得多倍体植株不会表现出晚熟性状，且表现出显著的抗逆性增强的效果。
[0031] 图1为多倍体诱导完成后鳞茎片中染色体数目的变化示意图；
[0032] 图2为不同处理方法对多倍体植株中脯氨酸及可溶性蛋白含量的影响示意图；
[0033] 图3为不同处理方法对多倍体植株中生长素吲哚乙酸含量的影响示意图。
具体实施方式
[0034] 以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
[0035] 实施例1：
[0036] 普陀水仙多倍体植株的培育方法，该多倍体植株通过同基因的三倍体普陀水仙祖代的鳞茎片中的基因组倍增获得，上述基因组倍增通过以下方式实施：
[0037] a，将鳞茎片进行应激预培养；
[0038] b，将磁场作用于预培养后的鳞茎片；
[0039] c，在磁场下用诱变剂接触鳞茎片，从而产生多倍体鳞茎片；
[0040] d，将多倍体鳞茎片培育生根并培养成多倍体普陀水仙植株；
[0041] 上述培养所得多倍体普陀水仙植株的生长速度至少相同于同基因的三倍体普陀水仙祖代。该方法通过对鳞茎片进行了应激预培养，再采用磁场和诱变剂处理相结合的方法，进行多倍体诱导，有效降低了多倍体离体诱导过程嵌合体及非整倍体细胞的生成率，提升了多倍体诱导成功率，所得多倍体植株经过5次以上传代皆能保持倍性稳定，栽培所得多倍体植株，能获得鳞茎球变大、花序数增多、花期延长、叶片面积增大、叶片气孔变大、单位面积内气孔个数明显减少的多倍体普陀水仙，该多倍体植株的生长发育速度与三倍体祖代基本相同，且表现出显著的抗逆性增强的效果。
[0042] 上述多倍体普陀水仙植株是六倍体；上述多倍体普陀水仙植株经至少5次传代能保持基因组稳定性，且具有：1)平均花序数超过三倍体普陀水仙祖代；2)花期较三倍体普陀水仙祖代延长；3)叶片面积较三倍体普陀水仙祖代增加。诱导所得倍性稳定的多倍体植株经染色体鉴定得到其染色体数为2n＝6x＝60，而三倍体普陀水仙祖代的染色体条数为2n＝3x＝30，达到了诱导并产生多倍体植株的目的，为普陀水仙提供了新品种，多倍体植株平均花序数增多、花器官增大、花期延长、叶片面积增大，显著增加了其观赏价值和经济价值。
[0043] 上述应激预培养为热应激或渗透压应激；应激预培养在诱变剂接触鳞茎片前1d进行。对诱导前的鳞茎片进行预培养，通过预培养环境中热量或渗透压的改变，能使得鳞茎片的细胞产生应激反应以对抗外界不良环境的负面影响，尤其是应激预培养后期，鳞茎片细胞内脯氨酸含量、可溶性蛋白质含量显著上升以减缓应激对细胞的伤害，在抗逆境胁迫物质含量较高的情况下，对鳞茎片进行多倍体诱导，能借助诱导剂增加多倍体细胞中关于脯氨酸和蛋白质合成的基因表达，使得多倍体细胞中脯氨酸及可溶性蛋白质积累量较三倍体祖代中显著提升，进而使得多倍体植株抗逆境胁迫能力显著增强，尤其是在高温、干旱等非生物胁迫环境下，多倍体植株抵抗能力显著高于三倍体祖代，增加了普陀水仙在高温干旱环境下的生存能力，降低了养护难度和养殖户生产损失。
[0044] 本实施例中采用热应激，热应激操作条件为：水浴温度为40℃，周期为1d，单次水浴时间为1.5h，间隔时间为8h。该热应激处理后，优选迅速地将鳞茎片放回25℃水浴中。
[0045] 上述作用于鳞茎片的磁场的强度为0.25T，磁场作用时间为诱导产生多倍体鳞茎片的整个周期内。在诱导多倍体产生的周期内，添加磁场与诱变剂协同作用于鳞茎片，主要是利用磁场完成诱变剂向染色质丝的靶向递送，能加速诱变剂的作用，且在磁场环境下，植物细胞内物质的分子受磁场影响，排列有序程度更高，因而诱变剂对染色体的凝缩作用被缓解，染色体分散性好，有效降低了诱导过程中因凝缩形成的非整倍体细胞的生成率，提升了多倍体诱导成功率。
[0046] 上述诱变剂中包括2.5wt％的秋水仙素、0.35wt％的维甲酸和0.15wt％的2-羟基苯乙酮；诱变剂在诱变培养基中的重量占比为10.5％。诱变剂中秋水仙素能中断细胞的有丝分裂进程，促使细胞中染色体数目成倍增加，诱变结束后，细胞恢复正常的分裂功能，从而形成染色体加倍的细胞，达到产生多倍体细胞及植株的目的。在本发明中普陀水仙的鳞茎片表现出对秋水仙素的耐受性，虽然避免了秋水仙素对细胞的毒害作用，但也表现出对诱导过程的抑制作用，维甲酸和2-羟基苯乙酮借助磁场发挥协同作用，能刺激植物细胞外基质蛋白合成，提高细胞膜张力强度，促进秋水仙素渗透并在细胞中沉积，从而打破细胞的耐受性对多倍体诱导的抑制作用，加速多倍体细胞的产生，另一方面两者能促使胞内鸟嘌呤核苷三磷酸上的磷酰基转移，产生抑制细胞质分化的作用，在细胞组织分化时能分解引起结构形态异常的有害因素，避免和降低了嵌合体的生成几率，提高了多倍体纯合体的比率，既提升多倍体植株的产量，又能提高嵌合体分离及纯化速率，降低生产成本。
[0047] 上述产生多倍体鳞茎片的培养条件为：温度为22℃，摇床震荡培养转速为150r/min，光照时间为14h/d，光照强度为800Lx，培养周期为2.5d。
[0048] 上述培育生根所用培养基中包括浓度分别为2mg/L的6-BA、0.4mg/L的NAA和3.5wt％的蔗糖。对诱导后的多倍体细胞进行诱导不定芽和丛生芽培育，并进行至少5次继代培育，并分离出嵌合体及非整倍体芽体，选取倍性稳定的多倍体丛生芽进行生根培育，得到多倍体幼苗，进行扩大培养即得多倍体植株，该多倍体植株的生长速度基本相同于三倍体祖代的生长速度。
[0049] 本实施例中提供的普陀水仙多倍体植株的培育方法在多倍体水仙培育中的用途。上述多倍体普陀水仙的培育方法适用于水仙的多倍体培育，能获得水仙的多倍体植株，增加水仙新品种，获得既保持原品种优良性状，又表现出花器官增大、观赏价值升高、抗逆性增强的水仙品种。
[0050] 实施例2：
[0051] 普陀水仙多倍体植株的培育方法，具体步骤如下：
[0052] 1)预培养：将普陀水仙鳞茎片的鳞片切成宽10mm的切片，接种到糖浓度为3％的MS培养基上，于温度25℃、光照12h/d、光照强度1000Lx的条件下预培养7天，得到预培养后的鳞片切片；
[0053] 2)应激预培养：在预培养最后2d时间内，将鳞茎片切片置于糖浓度为5.5％的高渗透压溶液中15min，然后取出放回糖浓度为3％的MS培养基中，间隔7h后，再次将切片放入高渗透压溶液中再取出，循环进行应激培养，得到应激培养后的鳞茎片，上述过程中除培养基糖浓度不同外的其他培养条件相同；
[0054] 3)多倍体诱导：取秋水仙素、维甲酸和2-羟基苯乙酮分散于二甲基亚砜中，配制成含有3.5wt％的秋水仙素、0.4wt％的维甲酸和0.1wt％的2-羟基苯乙酮的诱变剂，然后将诱变剂按重量占比为8％的比例加入MS培养基中，获得诱变培养基，然后将切片放入诱变培养基中，于磁场强度为0.35T、温度为23℃、摇床震荡转速为200r/min、光照时间为16h/d、光照强度为1000Lx的条件下培养2.5d，得到诱导后的鳞茎片；
[0055] 4)继代培养：将诱导后的鳞茎片取出后，用无菌水冲洗3次，然后放入以MS培养基为基本培养基、6-BA浓度为1.5mg/L、NAA浓度为0.1mg/L、蔗糖含量为3wt％的芽诱导培养基中，进行5个循环的继代培养，将嵌合体及非整倍体加以分离，得到多倍体纯合体的芽体；
[0056] 5)生根培养：将纯合体的芽体置于以MS培养基为基本培养基、6-BA浓度为2mg/L、NAA浓度为0.3mg/L、蔗糖含量为2.7wt％的生根培养基中，于温度为22℃、光照时间为15h/d、光照强度为900Lx的条件下培养45d，得到多倍体幼苗；
[0057] 6)扩大化培养：将多倍体幼苗进行常规扩繁培养后，得到叶片面积增大、鳞茎球变大、花期延长、花序数繁多的普陀水仙花六倍体植株。
[0058] 实施例3：
[0059] 本实施例与实施例2不同之处在于：
[0060] 步骤5)中所用生根培养基中还含有0.15mg/L的3-羟基-2-丁酮和0.07mg/L的吡啶二羧酸，两者加入生根培养基中能诱导丛生芽生根，有利于植株的扩大化培养，另外两者协同生长素进入根部或丛生芽体后，能促进吲哚乙醛氧化酶的活性提高，使其向吲哚乙酸转变，同时还能降低或抑制吲哚乙酸氧化酶的活性，使得吲哚乙酸的生成量和积累量增多，使得丛生芽发根速率加快，培养所得幼苗中内源生长素含量较高，不仅促进了幼苗生长发育，同时也使得多倍体植株生长速度加快，且高于三倍体祖代的生长速度，使得多倍体植株不会表现出晚熟性状，提高可推广价值；
[0061] 其他步骤与实施例2中一致，获得普陀水仙花六倍体植株。
[0062] 实施例4：
[0063] 本实施例与实施例2不同之处在于：
[0064] 未进行步骤2)的应激预培养，即进行步骤1)的正常预培养后，直接进行步骤3)的多倍体诱导；
[0065] 其他步骤与实施例2中一致，获得普陀水仙花六倍体植株。
[0066] 实施例5：
[0067] 本实施例与实施例2不同之处在于：
[0068] 步骤3)多倍体诱变未添加磁场辅助，仅使用了诱变剂；
[0069] 其他步骤与实施例2中一致，获得普陀水仙花六倍体植株。
[0070] 实施例6：
[0071] 本实施例与实施例2不同之处在于：
[0072] 步骤3)中诱变剂仅为秋水仙素，未添加维甲酸和2-羟基苯乙酮；
[0073] 其他步骤与实施例2中一致，获得普陀水仙花六倍体植株。
[0074] 试验例1：
[0075] 多倍体植株的形态鉴定
[0076] 试验样品：实施例1、2所得普陀水仙花六倍体植株。
[0077] 试验方法：选取栽培5月龄的多倍体植株50株，平均分组，以25株4月龄的三倍体祖代植株为对照组，比较植株的平均花序数、花期、叶片面积以及气孔的差异；叶片面积：选取祖代植株和多倍体植株，每株从外向内的7片鲜叶片为测量对象，量取长宽并计算面积；气孔观察：取同一时间的鲜叶撕取叶片的下表皮，制成临时压片，在显微镜下观察气孔的大小，并统计同一视野(40倍镜下)气孔的数目及面积。所得结果经处理及分析如下表1所示。
[0078] 表1多倍体植株的形态鉴定结果
[0079]
[0080]
[0081] 由上表可知，实施例1和2所得多倍体植株的形态各参数间差异不明显，且与对照组之间存在显著差异，说明多倍体植株与祖代植株间在细胞学上存在显著的变异；实施例的平均花序数较对照组增多，花期延长，有利于增加植株的观赏价值，叶片面积增大，单位面积内的气孔个数较对照组祖代减少45-50％，单个气孔面积增加了42-46.9％，有利于叶片进行光合作用和蒸腾作用。
[0082] 试验例2：
[0083] 不同处理方法对多倍体植株形成过程中染色体数目及形态的影响[0084] 试验样品：实施例2、5及6的植株。
[0085] 试验方法：分别平均随机取不同实施例中芽诱导培养基中的植株芽尖端，每隔实施例取50份，放入卡诺固定液中于常温下固定24h，然后用双蒸水冲洗2次，再转入1mol/L的盐酸溶液中，于60℃的水浴中解离15min，取出后用双蒸水冲洗2次，然后置于载玻片上捣碎材料，并滴1滴铁矾-苏木精染色剂，盖上盖玻片，染色1min后，吸取多余的染色液，再轻敲盖玻片，使待观察的芽尖组织充分离散。将制作好的染色体压片放置在显微镜下进行观察，记录每个视野中观察到的中期分裂相数目并加以分析，分析结果如下表2、附图1所示。
[0086] 表2不同诱变剂对染色体形态的影响
[0087] 染色体形态
实施例2 短粗形，清晰，分散性好
实施例5 短粗形，黏连，不分散
实施例6 短粗形，黏连较少，分散性较好
实施例2 短粗形，清晰，分散性好
实施例5 短粗形，黏连，不分散
实施例6 短粗形，黏连较少，分散性较好
[0088] 由上表可知，实施例5相较实施例2而言，其中的染色体有明显的黏连现象，分散性差，会给染色体计数带来较大的不便，在判断多倍体及嵌合体或非整倍体时容易造成较大的不良影响；实施例6出现少部分黏连现象，是因为磁场与诱变剂之间存在相互协同作用，而磁场在缓解染色体凝缩、提高染色体分散性上的效果更为突出。
[0089] 图1为多倍体诱导完成后鳞茎片中染色体数目的变化示意图。由图可知，实施例2中六倍体数目的植株最多，而非整倍体或嵌合体的数目较少，仍保持祖代的数目最少；相较而言，实施例5和实施例6中，保持祖代的数目也是最少，说明诱导率较高，但是其中非整倍体或嵌合体的数目较实施例2有显著性差异，说明磁场或诱变剂的差异明显影响了诱导过程中非整倍体或嵌合体的生成几率，且实施例2的多倍体纯合体比例最高，多倍体诱导完成度和完成效果最佳。
[0090] 试验例3：
[0091] 不同处理方法对多倍体植株生理活性的影响
[0092] 试验样品：实施例1、2、3、4的多倍体植株。
[0093] 试验方法：分别测定同一时期的4月龄植株的叶片中含有的脯氨酸和蛋白质含量及内源生长素吲哚乙酸含量，以4月龄的三倍体祖代植株为对照组；脯氨酸含量测定：酸性茚三酮比色法；可溶性蛋白含量测定：考马斯亮蓝法；生长素测定：固相萃取反相高效液相色谱荧光检测法。分析及结果如附图2、3所示。
[0094] 图2为不同处理方法对多倍体植株中脯氨酸及可溶性蛋白含量的影响示意图，图3为不同处理方法对多倍体植株中生长素吲哚乙酸含量的影响示意图。
[0095] 由图2可知，实施例1和2中不同的应激方式间对植株中脯氨酸和可溶性蛋白质含量的影响差异不明显，且含量均显著高于实施例4，而实施例4与对照组间差异较小，说明应激预培养能使得多倍体细胞中脯氨酸及可溶性蛋白质积累量显著提升，增加了普陀水仙在高温干旱环境下的生存能力，降低了养护难度和养殖户生产损失；由图3可知，实施例2与对照组生长素含量差异不显著，说明实施例2和祖代植株的生长速度在相同培养条件下基本相同，而实施例3相较而言，生长素含量最高，其生长速度较其它两组略快，说明实施例3的培育方法能使得吲哚乙酸的生成量和积累量增多，使得多倍体植株不会表现出晚熟性状。
[0096] 上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
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