用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养基、方法和及其应用
专利汇可以提供用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养基、方法和及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种用于诱导东方梨离体 叶片 再生不定梢的培养基、方法和及其应用，包含有具有MS、BA、TDZ、IBA和 蔗糖 的继代增殖培养基和具有NN69、BA、NAA和山梨糖醇或NN69、TDZ、IBA和蔗糖或NN69、TDZ、IBA和山梨糖醇的不定梢诱导培养基，通过继代增殖培养基和不定梢诱导培养基，实现了东方梨栖霞大香 水 梨的离体叶片再生不定梢，因此，建立了东方梨离体叶片不定梢再生技术体系，为 体细胞 诱变 多倍体 育种和外源基因转化改良品种提供了 实施例 。，下面是用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养基、方法和及其应用专利的具体信息内容。
1.一种用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养基，其特征是：包含有具有MS 、 BA 、TDZ 、IBA和蔗糖的继代增殖培养基和具有NN69、BA、NAA和山梨糖醇或NN69、TDZ、IBA和蔗糖或NN69、TDZ、IBA和山梨糖醇的不定梢诱导培养基。
2.根据权利要求1所述的用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养基，其特征是：还包含有试管苗建立培养基、试管苗继代增殖培养基和生根培养基。
3.根据权利要求2所述的用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养基，其特征是：试管苗建立培养基设置为1/2MS + 0.5-2 mg/L BA + 0.1-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖，继代增殖培养基设置为MS + 0.5-1.0 mg/L BA + 0.01-0.1 mg/L TDZ + 0.01-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖，
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 3.0-7.0 mg/L BA + 0.1-0.5mg/L NAA + 10g/L-
50g/L 山梨糖醇或 NN69 + 1-4 mg/L TDZ + 0.1-0.5 mg/L IBA + 20 g/L-50 g/L蔗糖或NN69 + 1-4 mg/L TDZ + 0.1-0.5 mg/LIBA + 20 g/L-50 g/L山梨糖醇，
生根培养基设置为1/4MS + 1.0-2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
4.根据权利要求3所述的用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养基，其特征是：
一、 基本培养基
（1）MS培养基组成如下（表1）：
表1 MS基本培养基组成
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 1650
KNO3 1900
KH2PO4 170
MgSO4·7H2O 370
CaCl2·2H2O 440
无机成分 微量元素
FeSO4·7H2O 27.8
EDTA 37.3
H3BO3 6.2
KI 0.83
MnSO4·4H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·2H2O 0.025
有机成分
烟酸 0.5
VB1 0.5
VB6 0.5
甘氨酸 2.0
肌醇 100
(2) NN69培养基, 组成如下（表2）：
表2 NN69 基本培养基组成
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 720
KNO3 950
KH2PO4 68
MgSO4·7H2O 185
CaCl2·2H2O 166
无机成分 微量元素
FeSO4·7H2O 27.8
EDTA 37.3
H3BO3 3
MnSO4·4H2O 25
ZnSO4·7H2O 10
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.08
有机成分
烟酸 5
VB1 0.5
VB6 0.5
甘氨酸 2.0
肌醇 100
生物素 0.05
二、 植物生长调节物质：6－苄基氨基嘌呤（BA），噻苯隆（TDZ）, 吲哚丁酸（IBA），萘乙酸（NAA），
三、碳源：蔗糖，山梨糖醇
四、 无离子水
五、琼脂粉。
5.一种用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养方法，其步骤是：
把当年的枝条在具有1/2MS、BA 、IBA和蔗糖的试管苗建立培养基上得到无菌试管苗，在具有MS 、BA 、TDZ 、IBA和蔗糖的继代增殖培养基上得到试管苗健壮嫩叶，把具有割口的健壮嫩叶在有NN69、BA、NAA和山梨糖醇或NN69、TDZ、IBA和蔗糖或NN69、TDZ、IBA和山梨糖醇的不定梢诱导培养基进行诱导产生不定芽处理。
6.根据权利要求5所述的用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养方法，其特征是：
其步骤是：实验处理所用的所有培养基在灭菌前调pH值到5.8，然后在121℃，1个大气压下高压灭菌20分钟，培养室培养温度为25 ± 2℃，光培养的光照周期为16小时/天，选取品种为‘栖霞大香水’的东方梨，
一、试管苗的建立：
在当年的四至五月份，在梨树萌发新芽生长季，从成年结果大树上剪取当年生半木质化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体经常规杀菌流程：洗衣粉水洗 → 流水冲冼30 min → 70%酒精杀菌1min → 用有效氯为5%的次氯酸钠杀菌8 min → 无菌水洗5－7次，把经过杀菌处理的芽段接种到腋芽启动培养基1/2MS +
0.5-2 mg/L BA + 0.1-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上进行培养，其技术目的在于：诱导腋芽萌发获得无菌试管苗，
二、试管苗的增殖：
腋芽萌发获得的无菌试管苗转移到继代增殖培养基MS + 0.5-1.0 mg/L BA + 0.01-
0.1 mg/L TDZ + 0.01-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上进行试管苗增殖培养，其技术目的在于：繁殖足够数量的试管苗材料，便于叶片培养时有足够的健壮嫩叶可用，三、叶片培养诱导产生不定芽：
试管苗在继代增殖培养基上生长4－5周时，切取健壮绿苗顶部展开幼嫩叶片，用无菌刀片垂直于叶片中脉进行横切伤，根据叶片大小切2－5刀，至少一边的叶边缘不切断，使叶片呈现为一个带有多个伤口的完整叶片，把切伤的叶片接种在不定梢诱导培养基，不定梢诱导培养基设置为NN69 + 3.0-7.0 mg/L BA + 0.1-0.5mg/L NAA + 10g/L-50g/L 山梨糖醇，
不定梢诱导培养基包括基本培养基、植物生长调节剂和碳水化合物，基本培养基主要包括具有营养元素和微量营养元素的无机营养物质和有机添加物，植物生长调节剂设置为包括有细胞分裂素类物质和生长素类物质，碳水化合物的作用主要是作为培养基内的碳源和能源，并对维持培养基内渗透压起重要作用，植物生长调节剂其作用是调控植物生长和发育，促进细胞分裂、扩大、伸长、诱导芽的分化及促进苗的生根，其技术目的在于：把切伤的叶片进行培养获得叶片不定梢，
四、不定梢增殖和生根
把叶片培养诱导产生的叶片不定梢转移到继代增殖培养基MS + 0.5-1.0 mg/L BA +
0.01-0.1 mg/L TDZ + 0.01-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上继代生长4周，选取生长高度在1.5 cm以上的健壮绿梢转移到适宜的生根培养基进行生根诱导，生根培养基设置为1/
4MS + 1.0-2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖，其技术目的在于：获得不定梢绿苗在试管内的生根小植株，把这些生根小植株从瓶内移栽到瓶外，获得育种的新材料或无性繁殖的优质种苗。
7.根据权利要求5所述的用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养方法，其特征是：
试管苗建立培养基设置为1/2MS + 0.5-2 mg/L BA + 0.1-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖，继代增殖培养基设置为MS + 0.5-1.0 mg/L BA + 0.01-0.1 mg/L TDZ + 0.01-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖，
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 3.0-7.0 mg/L BA + 0.1-0.5mg/L NAA + 10g/L-
50g/L 山梨糖醇或不定梢诱导培养基设置为NN69 + 1-4 mg/L TDZ + 0.1-0.5 mg/L IBA + 20 g/L-50 g/L蔗糖或不定梢诱导培养基设置为NN69 + 1-4 mg/L TDZ + 0.1-0.5 mg/LIBA + 20 g/L-50 g/L山梨糖醇，
生根培养基设置为1/4MS + 1.0-2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
8.根据权利要求5所述的用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养方法，其特征是：
不定梢诱导培养基包括基本培养基、植物生长调节剂和碳水化合物，
基本培养基主要包括具有大量元素和微量营养元素的无机营养物质和有机添加物，植物生长调节剂设置为包括有细胞分裂素类物质和生长素类物质，
碳水化合物包括蔗糖和山梨糖醇。
9.根据权利要求5所述的用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养方法，其特征是：
其步骤是：
一、试管苗的获得与增殖：
‘栖霞大香水’梨的腋芽半木质化茎段经过系列消毒后，在培养基1/2MS + 0.5-2 mg/L BA + 0.1-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上获得腋芽萌发的无菌试管苗，试管苗在增殖培养基MS + 0.5-1.0 mg/L BA + 0.01-0.1 mg/L TDZ + 0.01-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上实现快速增殖，试管苗生长良好，苗绿苗壮，叶片伸展，易于叶片培养操作，二、离体叶片不定梢诱导培养：
试管苗继代增殖培养生长至4-5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤2-5刀，把切好的叶片接种在不定梢诱导培养基，不定梢诱导培养基为NN69 + 3.0-7.0 mg/L BA + 0.1-0.5mg/L NAA + 10g/L-50g/L 山梨糖醇，
三、不定梢生根：
切取生长高度在1.5 cm以上的不定梢健壮绿苗转移到生根培养基:1/4MS + 1.0-2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养5天，然后转到16小时/天光周期的光培养条件下培养。
10.一种用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养基和方法在品种为栖霞大香水的梨上的应用。
用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养基、方法和及其
应用
技术领域
背景技术
本发明旨在研究影响东方梨白梨离体叶片不定梢再生的因素，建立白梨离体叶片不定
梢再生技术体系，为体细胞诱变多倍体育种和外源基因转化改良品种奠定基础。
发明内容
本发明的客体是一种用于诱导东方梨离体叶片再生不定梢的培养基和方法的应用。
mg/L IBA + 30 g/L蔗糖，
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 3.0-7.0 mg/L BA + 0.1-0.5mg/L NAA + 10g/L-
50g/L 山梨糖醇或 NN69 + 1-4 mg/L TDZ + 0.1-0.5 mg/L IBA + 20 g/L-50 g/L蔗糖或NN69 + 1-4 mg/L TDZ + 0.1-0.5 mg/LIBA + 20 g/L-50 g/L山梨糖醇，
生根培养基设置为1/4MS + 1.0-2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
（1）MS培养基组成如下（表1）：
表1 MS基本培养基组成
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 1650
KNO3 1900
KH2PO4 170
MgSO4·7H2O 370
CaCl2·2H2O 440
无机成分 微量元素
FeSO4·7H2O 27.8
EDTA 37.3
H3BO3 6.2
KI 0.83
MnSO4·4H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·2H2O 0.025
有机成分
烟酸 0.5
VB1 0.5
VB6 0.5
甘氨酸 2.0
肌醇 100
(2) NN69培养基, 组成如下（表2）：
表2 NN69 基本培养基组成
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 720
KNO3 950
KH2PO4 68
MgSO4·7H2O 185
CaCl2·2H2O 166
无机成分 微量元素
FeSO4·7H2O 27.8
EDTA 37.3
H3BO3 3
MnSO4·4H2O 25
ZnSO4·7H2O 10
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.08
有机成分
烟酸 5
VB1 0.5
VB6 0.5
甘氨酸 2.0
肌醇 100
生物素 0.05
二、 植物生长调节物质：6－苄基氨基嘌呤（BA），噻苯隆（TDZ）, 吲哚丁酸（IBA），萘乙酸（NAA）。
在当年的四至五月份，在梨树萌发新芽生长季，从成年结果大树上剪取当年生半木质
化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体经常规杀菌流程：洗衣粉水洗 → 流水冲冼30 min → 70%酒精杀菌1min → 用有效氯为5%的次氯酸钠杀菌8 min → 无菌水洗5－7次，把经过杀菌处理的芽段接种到腋芽启动培养基1/2MS +
0.5-2 mg/L BA + 0.1-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上进行培养，其技术目的在于：诱导腋芽萌发获得无菌试管苗。
0.1 mg/L TDZ + 0.01-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上进行试管苗增殖培养，其技术目的在于：繁殖足够数量的试管苗材料，便于叶片培养时有足够的健壮嫩叶可用，
三、叶片培养诱导产生不定芽：
试管苗在继代增殖培养基上生长4－5周时，切取健壮绿苗顶部展开幼嫩叶片，用无菌
刀片垂直于叶片中脉进行横切伤，根据叶片大小切2－5刀，至少一边的叶边缘不切断，使叶片呈现为一个带有多个伤口的完整叶片，把切伤的叶片接种在不定梢诱导培养基，不定梢诱导培养基设置为NN69 + 3.0-7.0 mg/L BA + 0.1-0.5mg/L NAA + 10g/L-50g/L 山梨糖醇，
不定梢诱导培养基包括基本培养基、植物生长调节剂和碳水化合物，基本培养基主要
包括具有营养元素和微量营养元素的无机营养物质和有机添加物，植物生长调节剂设置为包括有细胞分裂素类物质和生长素类物质，碳水化合物的作用主要是作为培养基内的碳源和能源，并对维持培养基内渗透压起重要作用，植物生长调节剂其作用是调控植物生长和发育，促进细胞分裂、扩大、伸长、诱导芽的分化及促进苗的生根，其技术目的在于：把切伤的叶片进行培养获得叶片不定梢，
四、不定梢增殖和生根；
把叶片培养诱导产生的叶片不定梢转移到继代增殖培养基MS + 0.5-1.0 mg/L BA +
0.01-0.1 mg/L TDZ + 0.01-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上继代生长4周，选取生长高度在1.5 cm以上的健壮绿梢转移到适宜的生根培养基进行生根诱导，生根培养基设置为1/
4MS + 1.0-2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖，其技术目的在于：获得不定梢绿苗在试管内的生根小植株，把这些生根小植株从瓶内移栽到瓶外，获得育种的新材料或无性繁殖的优质种苗。
mg/L IBA + 30 g/L蔗糖，
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 3.0-7.0 mg/L BA + 0.1-0.5mg/L NAA + 10g/L-
50g/L 山梨糖醇，
生根培养基设置为1/4MS + 1.0-2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
植物生长调节剂设置为包括有细胞分裂素类物质和生长素类物质。
‘栖霞大香水’梨的腋芽半木质化茎段经过系列消毒后，在培养基1/2MS + 0.5-2 mg/L BA + 0.1-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上获得腋芽萌发的无菌试管苗，试管苗在增殖培养基MS + 0.5-1.0 mg/L BA + 0.01-0.1 mg/L TDZ + 0.01-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上实现快速增殖，试管苗生长良好，苗绿苗壮，叶片伸展，易于叶片培养操作，
二、离体叶片不定梢诱导培养。试管苗继代增殖培养生长至4-5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤2-5刀，把切好的叶片接种在不定梢诱导培养基。不定梢诱导培养基为NN69 + 3.0-7.0 mg/L BA + 0.1-0.5mg/L NAA +
10g/L-50g/L 山梨糖醇，
三、不定梢生根。切取生长高度在1.5 cm以上的不定梢绿苗转移到生根培养基:1/4MS + 1.0-2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养5天，然后转到16小时/天光周期的光培养条件下培养。
图2为本发明的东方梨‘栖霞大香水’梨离体叶片不定梢再生和不定梢生根的效果图，A：NN69 + 3-7 mg/L BA + 0.1-0.5 mg/L NAAA + 20 g/L-50 g/L 山梨糖醇；B：NN69 + 1-4 mg/L TDZ + 0.1-0.5 mg/L IBA + 20 g/L-50 g/L蔗糖；C：NN69 + 1-4 mg/L TDZ +
0.1-0.5 mg/LIBA + 20 g/L-50 g/L山梨糖醇；D：不定梢生根。
具体实施方式
mg/L IBA + 30 g/L蔗糖，
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 3.0-7.0 mg/L BA + 0.1-0.5mg/L NAA + 10g/L-
50g/L 山梨糖醇或 NN69 + 1-4 mg/L TDZ + 0.1-0.5 mg/L IBA + 20 g/L-50 g/L蔗糖或NN69 + 1-4 mg/L TDZ + 0.1-0.5 mg/LIBA + 20 g/L-50 g/L山梨糖醇，
生根培养基设置为1/4MS + 1.0-2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
（1）MS培养基组成如下（表1）：
表1 MS基本培养基组成
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 1650
KNO3 1900
KH2PO4 170
MgSO4·7H2O 370
CaCl2·2H2O 440
无机成分 微量元素
FeSO4·7H2O 27.8
EDTA 37.3
H3BO3 6.2
KI 0.83
MnSO4·4H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·2H2O 0.025
有机成分
烟酸 0.5
VB1 0.5
VB6 0.5
甘氨酸 2.0
肌醇 100
(2) NN69培养基, 组成如下（表2）：
表2 NN69 基本培养基组成
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L）
NH4NO3 720
KNO3 950
KH2PO4 68
MgSO4·7H2O 185
CaCl2·2H2O 166
无机成分 微量元素
FeSO4·7H2O 27.8
EDTA 37.3
H3BO3 3
MnSO4·4H2O 25
ZnSO4·7H2O 10
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.08
有机成分
烟酸 5
VB1 0.5
VB6 0.5
甘氨酸 2.0
肌醇 100
生物素 0.05
二、 植物生长调节物质：6－苄基氨基嘌呤（BA），噻苯隆（TDZ）, 吲哚丁酸（IBA），萘乙酸（NAA）。
五、琼脂粉。
继代增殖培养基设置为MS + 0.5 mg/L BA + 0.01 mg/L TDZ + 0.01 mg/L IBA + 30
g/L蔗糖，
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 3.0 mg/L BA + 0.1mg/L NAA + 10g/L山梨糖醇，
生根培养基设置为1/4MS + 1.0mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
继代增殖培养基设置为MS + 1.0 mg/L BA + 0.1 mg/L TDZ + 0.5 mg/L IBA + 30
g/L蔗糖，
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 7.0 mg/L BA + 0.5mg/L NAA + 50g/L 山梨糖醇，
生根培养基设置为1/4MS + 2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
继代增殖培养基设置为MS + 0.75 mg/L BA + 0.05 mg/L TDZ + 0.25mg/L IBA + 30
g/L蔗糖，
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 5.0 mg/L BA + 0.3mg/L NAA + 30g/L 山梨糖醇，
生根培养基设置为1/4MS + 1.5 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
本发明的第一个实施例之六，不定梢诱导培养基设置为NN69 + 4 mg/L TDZ + 0.5
mg/L IBA + 50 g/L蔗糖，
本发明的第一个实施例之七，不定梢诱导培养基设置为NN69 + 2.5 mg/L TDZ + 0.3
mg/L IBA + 35 g/L蔗糖
本发明的第一个实施例之八至十，以本发明的第一个实施例之二、三和四为基础，
本发明的第一个实施例之八，不定梢诱导培养基设置为NN69 + 1 mg/L TDZ + 0.1
mg/LIBA + 20 g/L山梨糖醇，
本发明的第一个实施例之九，不定梢诱导培养基设置为NN69 +4 mg/L TDZ + 0.5 mg/
LIBA + 50 g/L山梨糖醇，
本发明的第一个实施例之十，不定梢诱导培养基设置为NN69 + 2.5 mg/L TDZ + 0.3
mg/LIBA + 35 g/L山梨糖醇，
下面结合实施例，对本发明进一步描述，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明
的进一步限定。
在当年的四至五月份，在梨树萌发新芽生长季，从成年结果大树上剪取当年生半木质
化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体经常规杀菌流程：洗衣粉水洗 → 流水冲冼30 min → 70%酒精杀菌1min → 用有效氯为5%的次氯酸钠杀菌8 min → 无菌水洗5－7次，把经过杀菌处理的芽段接种到腋芽启动培养基1/2MS +
0.5-2 mg/L BA + 0.1-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上进行培养，其技术目的在于：诱导腋芽萌发获得无菌试管苗。
0.1 mg/L TDZ + 0.01-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上进行试管苗增殖培养，其技术目的在于：繁殖足够数量的试管苗材料，便于叶片培养时有足够的健壮嫩叶可用，
三、叶片培养诱导产生不定芽：
试管苗在继代增殖培养基上生长4－5周时，切取健壮绿苗顶部展开幼嫩叶片，用无菌
刀片垂直于叶片中脉进行横切伤，根据叶片大小切2－5刀，至少一边的叶边缘不切断，使叶片呈现为一个带有多个伤口的完整叶片，把切伤的叶片接种在不定梢诱导培养基，不定梢诱导培养基设置为NN69 + 3.0-7.0 mg/L BA + 0.1-0.5mg/L NAA + 10g/L-50g/L 山梨糖醇，
不定梢诱导培养基包括基本培养基、植物生长调节剂和碳水化合物，基本培养基主要
包括具有营养元素和微量营养元素的无机营养物质和有机添加物，植物生长调节剂设置为包括有细胞分裂素类物质和生长素类物质，碳水化合物的作用主要是作为培养基内的碳源和能源，并对维持培养基内渗透压起重要作用，植物生长调节剂其作用是调控植物生长和发育，促进细胞分裂、扩大、伸长、诱导芽的分化及促进苗的生根，其技术目的在于：把切伤的叶片进行培养获得叶片不定梢，
四、不定梢增殖和生根；
把叶片培养诱导产生的叶片不定梢转移到继代增殖培养基MS + 0.5-1.0 mg/L BA +
0.01-0.1 mg/L TDZ + 0.01-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上继代生长4周，选取生长高度在1.5 cm以上的健壮绿梢转移到适宜的生根培养基进行生根诱导，生根培养基设置为1/
4MS + 1.0-2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖，其技术目的在于：获得不定梢绿苗在试管内的生根小植株，把这些生根小植株从瓶内移栽到瓶外，获得育种的新材料或无性繁殖的优质种苗。
继代增殖培养基设置为MS + 0.5-1.0 mg/L BA + 0.01-0.1 mg/L TDZ + 0.01-0.5
mg/L IBA + 30 g/L蔗糖，
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 3.0-7.0 mg/L BA + 0.1-0.5mg/L NAA + 10g/L-
50g/L 山梨糖醇，
生根培养基设置为1/4MS + 1.0-2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
植物生长调节剂设置为包括有细胞分裂素类物质和生长素类物质。
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 1-4 mg/L TDZ + 0.1-0.5 mg/L IBA + 20 g/L-50
g/L蔗糖，
本发明的第一个实施例之三，
在本发明的第一个实施例之一中的第三步骤中，
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 1-4 mg/L TDZ + 0.1-0.5 mg/LIBA + 20 g/L-50
g/L山梨糖醇，
本发明的第一个实施例之四，
一、试管苗的获得与增殖：
‘栖霞大香水’梨的腋芽半木质化茎段经过系列消毒后，在培养基1/2MS + 0.5-2 mg/L BA + 0.1-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上获得腋芽萌发的无菌试管苗，试管苗在增殖培养基MS + 0.5-1.0 mg/L BA + 0.01-0.1 mg/L TDZ + 0.01-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上实现快速增殖，试管苗生长良好，苗绿苗壮，叶片伸展，易于叶片培养操作，
二、离体叶片不定梢诱导培养。试管苗继代增殖培养生长至4-5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤2-5刀，把切好的叶片接种在不定梢诱导培养基。不定梢诱导培养基为NN69 + 3.0-7.0 mg/L BA + 0.1-0.5mg/L NAA +
10g/L-50g/L 山梨糖醇，
三、不定梢生根。切取生长高度在1.5 cm以上的不定梢绿苗转移到生根培养基:1/4MS + 1.0-2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养5天，然后转到16小时/天光周期的光培养条件下培养。
半木质化茎段在培养基1/2MS + 0.5-2 mg/L BA + 0.1-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖
上培养2周，腋芽开始萌发变绿（图1，A），培养至4周时，腋芽伸长生长获得无菌绿苗（图1，B），获得的无菌苗用做进一步实验的材料。
0.01-0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖上培养生长的苗虽表现苗绿且有较好的增高生长，但这两种培养基上的苗常产生顶端畸形的棒状现象（图1，D和E）,不是健壮绿苗，因此东方梨‘栖霞大香水’适宜的增殖培养基为MS + 0.5-1.0 mg/L BA + 0.01-0.1 mg/L TDZ + 0.01-
0.5 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖，
2. 叶片培养诱导产生不定梢
离体叶片再生不定梢的适宜培养基为NN69 + 3-7 mg/L BA + 0.1-0.5 mg/L NAAA +
20 g/L-50 g/L 山梨糖醇（图2，A），不定梢再生率为45%；在NN69 + 1-4 mg/L TDZ + 0.1-
0.5 mg/L IBA + 20 g/L-50 g/L蔗糖上，不定梢再生率很低，再生率在10%以下（图2，B）；在培养基NN69 + 1-4 mg/L TDZ + 0.1-0.5 mg/LIBA + 20 g/L-50 g/L山梨糖醇，不定梢再生率为5%-20%（图2，C）；在培养基NN69 +1-4 mg/L BA + 0.1-0.5 mg/L IBA + 20 g/L-50 g/L蔗糖上，没有获得不定梢再生，再生率为0，
3 不定梢生根
诱导培养基上产生的不定梢转移到继代培养基上增殖培养４周，选择健康绿梢转移到
生根培养基1/4MS + 1.0-2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上，经生根诱导培养20天,生根率在
85%以上（图2，D），说明所用生根培养基能有效诱导东方梨‘栖霞大香水’试管苗的生根。
继代增殖培养基设置为MS + 0.5 mg/L BA + 0.01 mg/L TDZ + 0.01 mg/L IBA + 30
g/L蔗糖，
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 3.0 mg/L BA + 0.1mg/L NAA + 10g/L山梨糖醇，
生根培养基设置为1/4MS + 1.0mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
继代增殖培养基设置为MS + 1.0 mg/L BA + 0.1 mg/L TDZ + 0.5 mg/L IBA + 30
g/L蔗糖，
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 7.0 mg/L BA + 0.5mg/L NAA + 50g/L 山梨糖醇，
生根培养基设置为1/4MS + 2.0 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
继代增殖培养基设置为MS + 0.75 mg/L BA + 0.05 mg/L TDZ + 0.25mg/L IBA + 30
g/L蔗糖，
不定梢诱导培养基设置为NN69 + 5.0 mg/L BA + 0.3mg/L NAA + 30g/L 山梨糖醇，
生根培养基设置为1/4MS + 1.5 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
本发明的第一个实施例之九，不定梢诱导培养基设置为NN69 + 4 mg/L TDZ + 0.5
mg/L IBA + 50 g/L蔗糖，
本发明的第一个实施例之十，不定梢诱导培养基设置为NN69 + 2.5 mg/L TDZ + 0.3
mg/L IBA + 35 g/L蔗糖
本发明的第一个实施例之十一至十三，以本发明的第一个实施例之五、六和七为基础，本发明的第一个实施例之十一，不定梢诱导培养基设置为NN69 + 1 mg/L TDZ + 0.1
mg/LIBA + 20 g/L山梨糖醇，
本发明的第一个实施例之十二，不定梢诱导培养基设置为NN69 +4 mg/L TDZ + 0.5
mg/LIBA + 50 g/L山梨糖醇，
本发明的第一个实施例之十三，不定梢诱导培养基设置为NN69 + 2.5 mg/L TDZ +
0.3 mg/LIBA + 35 g/L山梨糖醇。
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