一种蒙桑多倍体种苗的培养方法
阅读：1032发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种蒙桑多倍体种苗的培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种蒙桑 多倍体 种苗的培养方法，该方法包括对蒙桑组培苗选取茎段后进行预培养，然后对开始产生愈伤组织的茎段采用秋 水 仙素诱导得到多倍体，经过增殖培养和生根培养得到蒙桑的多倍体 幼苗 。该方法能够克服蒙桑组织培养褐化现象严重、多倍体诱导率低、诱导后嵌合体较多的问题。，下面是一种蒙桑多倍体种苗的培养方法专利的具体信息内容。
1.一种蒙桑多倍体种苗的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从蒙桑组培苗上截取茎段，接种于预培养培养基中进行预培养，得到预培养茎段；
(2)将所述预培养茎段接种于含有秋水仙素的诱导培养基中进行诱导培养，得到诱导后的茎段；
(3)将所述诱导后的茎段接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到丛生芽；
(4)将所述丛生芽接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，从蒙桑组培苗上截取茎段的步骤包括：选取生长健壮的蒙桑组培苗，将其剪去叶片及叶柄后得到茎段，将茎段截为1～1.5cm长的小段，每小段留有1个腋芽，从小段一端进行纵切，得到长度为1mm的切口。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，将从蒙桑组培苗上截取的茎段横向插入培养基内，仅上表面露出培养基，然后进行预培养。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预培养培养基以MS为基础培养基，并添加KT、6-BA、NAA、PVP和活性炭得到，所述预培养培养基中KT的浓度为
2.0mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.5mg/L，PVP的浓度为0.5g/L，活性炭的浓度为1.0g/L；
优选地，所述预培养条件为：从蒙桑组培苗上截取茎段接种于预培养培养基中，在温度为25±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养72h以上。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述诱导培养基以不添加琼脂的MS为基础培养基，并添加KT、6-BA、NAA、PVP、秋水仙素和活性炭得到，所述诱导培养基中KT的浓度为2.0mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.5mg/L，PVP的浓度为0.5g/L，秋水仙素的浓度为30mg/L，活性炭的浓度为1.0g/L；
优选地，所述诱导培养条件为：将所述预培养茎段接种于诱导培养基中，在温度为20±
2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养72h以上。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述增殖培养基与预培养培养基的组成相同；
优选地，所述增殖培养条件为：将所述诱导后的茎段接种于增殖培养基中，在温度为25±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养20～30天，至诱导苗生长至30cm以上。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)结束后，对所述丛生芽的叶片进行染色体数目分析，分析仪器为流式细胞仪，确定其染色体数目，筛选出四倍体继续培养
20～30d后，进行生根培养。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述生根培养基以MS为基础培养基，并添加IBA得到，所述生根培养基中IBA的浓度为0.3mg/L；
优选地，所述生根培养条件为：将所述丛生芽接种于生根培养基中，在温度为25±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养15～25天。
9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(4)结束后，还包括步骤(5)：将所述生根苗洗净后，在基质中培养40～60d得到移栽苗。
10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述基质中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为3：3：2。
一种蒙桑多倍体种苗的培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及林木繁育技术领域，具体涉及一种蒙桑多倍体种苗的培养方法。
背景技术
[0002] 蒙桑(Morus mongolica)，别名岩桑，是理想的生态经济型树种，对北方地区的水土保持及生态修复可以起到十分积极的作用。主要分布在大青山山地、阴山南部黄土丘陵区、大兴安岭南部山地，以及科左后旗大青沟自然保护区。
[0003] 目前，国内对蒙桑的研究较少。刘玲等(2016)对其地理分布及来源进行了研究，认为蒙桑在第四纪冰期前即存在，在适应环境的过程中形成特定的特征，对寒冷具有较强的适应性。对于桑的组织培养及多倍体种质资源创制研究相对较多，但存在苗木组织培养易产生褐化现象，增殖系数较低，生长较慢、多倍体诱导率相对较低，易产生嵌合体等现象。高丽霞等(2013)对桂桑优62、粤桑11号和沙2×伦109材料的种子及实生苗采用秋水仙素诱导，成功获得四倍体，诱导率可达33.3％。李晓双等(2017)对长穗桑用秋水仙素进行诱导，最终仅获得3株多倍体材料。王茜龄(2009)采用不同诱导方法对桑树的不定芽进行诱导，仅适用滴液法获得四倍体材料两份，使用浸渍法仅获得2份嵌合体材料。
[0004] 鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0005] 本发明以植物离体组织培养方法为基础，经茎段愈伤组织诱导，采用秋水仙素浸渍法处理，以获得蒙桑多倍体材料。该方法成功解决了组织培养过程中严重的褐化现象，提高了多倍体的诱导率，减少了嵌合体的形成，节省了试验成本。
[0006] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0007] 本发明涉及一种蒙桑多倍体种苗的培养方法，包括以下步骤：
[0008] (1)从蒙桑组培苗上截取茎段，接种于预培养培养基中进行预培养，得到预培养茎段；
[0009] (2)将所述预培养茎段接种于含有秋水仙素的诱导培养基中进行诱导培养，得到诱导后的茎段；
[0010] (3)将所述诱导后的茎段接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到丛生芽；
[0011] (4)将所述丛生芽接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。
[0012] 优选地，步骤(1)中，从蒙桑组培苗上截取茎段的步骤包括：选取生长健壮的蒙桑组培苗，将其剪去叶片及叶柄后得到茎段，将茎段截为1～1.5cm长的小段，每小段留有1个腋芽，从小段一端进行纵切，得到长度为1mm的切口。
[0013] 优选地，步骤(1)中，将从蒙桑组培苗上截取的茎段横向插入培养基内，仅上表面露出培养基，然后进行预培养。
[0014] 优选地，步骤(1)中，所述预培养培养基以MS为基础培养基，并添加KT、6-BA、NAA、PVP和活性炭得到，所述预培养培养基中KT的浓度为2.0mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.5mg/L，PVP的浓度为0.5g/L，活性炭的浓度为1.0g/L。
[0015] 优选地，步骤(1)中，所述预培养条件为：从蒙桑组培苗上截取茎段接种于预培养培养基中，在温度为25±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养72h以上。
[0016] 优选地，步骤(2)中，所述诱导培养基以不添加琼脂的MS为基础培养基，并添加KT、6-BA、NAA、PVP、秋水仙素和活性炭得到，所述诱导培养基中KT的浓度为2.0mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.5mg/L，PVP的浓度为0.5g/L，秋水仙素的浓度为30mg/L，活性炭的浓度为1.0g/L。
[0017] 优选地，步骤(2)中，所述诱导培养条件为：将所述预培养茎段接种于诱导培养基中，在温度为20±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养72h以上。
[0018] 优选地，步骤(2)结束后，将所述诱导后的茎段取出，用无菌水冲洗3～4次，用无菌滤纸吸干表面水分后，转入增殖培养基进行培养。
[0019] 优选地，步骤(3)中，所述增殖培养基与预培养培养基的组成相同。
[0020] 优选地，步骤(3)中，所述增殖培养条件为：将所述诱导后的茎段接种于增殖培养基中，在温度为25±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养20～30天，至诱导苗生长至30cm以上。
[0021] 优选地，步骤(3)结束后，对所述丛生芽的叶片进行染色体数目分析，分析仪器为流式细胞仪，确定其染色体数目，筛选出四倍体继续培养20～30d后，进行生根培养。
[0022] 优选地，步骤(4)中，所述生根培养基以MS为基础培养基，并添加IBA得到，所述生根培养基中IBA的浓度为0.3mg/L。
[0023] 优选地，步骤(4)中，所述生根培养条件为：将所述丛生芽接种于生根培养基中，在温度为25±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养15～25天。
[0024] 优选地，步骤(4)结束后，还包括步骤(5)：将所述生根苗洗净后，在基质中培养40～60d得到移栽苗。
[0025] 优选地，所述基质中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为3：3：2。
[0026] 本发明的有益效果：
[0027] 蒙桑与桑是不同的品种，在组织培养及多倍体种质资源创制过程中存在较大差异。本发明提供了一种蒙桑多倍体种苗的培养方法，对蒙桑组培苗选取茎段后进行预培养，然后对开始产生愈伤组织的茎段采用秋水仙素诱导得到多倍体，经过增殖培养和生根培养后得到蒙桑的多倍体幼苗。该方法能够克服蒙桑组织培养褐化现象严重、多倍体诱导率低、诱导后嵌合体较多的问题。附图说明
[0028] 图1为用流式细胞仪鉴定二倍体中的DNA含量图。
[0029] 图2为用流式细胞仪鉴定四倍体中的DNA含量图。
具体实施方式
[0030] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
[0031] 本发明实施例涉及一种蒙桑多倍体种苗的培养方法，该方法包括以下步骤：
[0032] (1)从蒙桑组培苗上截取茎段，接种于预培养培养基中进行预培养，得到预培养茎段。
[0033] 在本发明的一个实施例中，蒙桑组培苗通过以下方式得到：5月中下旬选取生长健壮的蒙桑作为母株，于母株中上部剪取当年生嫩枝。去掉枝条上的叶片后，用洗洁精洗涤枝条表面，然后用自来水冲洗30min。将清洗后的枝条移入超净工作台内，将其剪为小段，每小段上含有芽的数目≥2。将上述小段置于75％体积分数的酒精内消毒1min，然后用无菌水冲洗3次以上，再用0.1％质量浓度的升汞溶液浸泡6min，最后用无菌水冲洗3～4次，用无菌滤纸吸附残留水分，得到灭菌后的茎段。
[0034] 将灭菌后的茎段接种于第一培养基中培养20d后，该茎段发生萌芽。将萌芽后的茎段接种于第二培养基中，获得蒙桑组培苗。其中，第一培养基为MS培养基。第二培养基以MS为基础培养基，并添加KT、6-BA、NAA、PVP和活性炭得到，其中KT的浓度为2.0mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.5mg/L，PVP的浓度为0.5g/L，活性炭的浓度为1.0g/L，第二培养基的成分及含量与后续步骤中预培养培养基相同。
[0035] 在本发明的一个实施例中，从蒙桑组培苗上截取茎段的步骤包括：选取生长健壮的组培苗，将其剪去叶片及叶柄后得到茎段，将茎段截为1～1.5cm长的小段，每小段留有1个腋芽，从小段一端进行纵切，得到长度为1mm的切口。
[0036] 其中，从小段茎段的一端进行纵切，是为了增加愈伤组织的生长面积，有利于愈伤组织形成。具体地，植物受伤后都有自动愈合的能力。造成切口后，切口附近的愈伤激素开始活跃，它激活了切口附近的薄壁细胞，薄壁细胞便加速分裂，很快在切口表面形成由薄壁细胞组成的愈伤组织。
[0037] 在本发明的一个实施例中，将蒙桑组培苗上截取的茎段接种于预培养培养基中的方式为：将茎段横向插入培养基内，仅上表面露出培养基，然后进行预培养。需要说明的是，预培养过程中，茎段可以横向插入培养基内，也可以纵向插入。由于在茎段端部的切口是纵向的，因此将茎段横向插入才能使切口尽可能多的与培养基接触，加快愈伤组织的分化过程。
[0038] 在本发明的一个实施例中，预培养培养基是以MS为基础培养基，并添加KT、6-BA、NAA、PVP和活性炭得到。预培养培养基中KT的浓度为2.0mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.5mg/L，PVP的浓度为0.5g/L，活性炭的浓度为1.0g/L。
[0039] 其中，MS培养基是目前使用最普遍的培养基，其配方为组培领域公知的。该培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。KT为激动素，属于植物细胞分裂素，化学名称为6-糠基氨基嘌呤(或N6-呋喃甲基腺嘌呤)，可促进细胞分化、分裂、生长；诱导愈伤组织长芽；解除顶端优势。6-BA为苄氨基腺嘌呤，为人工合成的细胞分裂素，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点，6-BA的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。NAA为萘乙酸，属于植物生长素，能促进细胞分裂与扩大。在组培中，生长素类的作用是诱导愈伤组织的形成，胚状体的产生以及试管苗的生根。通常将生长素与细胞分裂素配合使用，以诱导腋芽和不定芽的产生。IBA为吲哚丁酸，属于植物生长素，对植物抽枝或芽、苗等的顶部芽端形成有促进作用，也可以将其替换为吲哚乙酸。PVP为聚乙烯吡咯烷酮，能与特定多酚化合物(如单宁)形成络合物，改善组织培养中褐化的问题。如不加入会导致外植体褐化死亡。活性炭的作用为吸附离体培养中的抑制物(如酚类物质)，使多酚氧化酶与过氧化物酶失活，从而防止褐化。
[0040] 在本发明的一个实施例中，预培养的具体条件为：将从蒙桑组培苗上截取的茎段接种于预培养培养基中，在温度为25±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养72h以上，得到预培养茎段。
[0041] (2)预培养完成后，将预培养茎段接种于含有秋水仙素的诱导培养基中进行诱导培养，得到诱导后的茎段。
[0042] 在本发明的一个实施例中，诱导培养基以不添加琼脂的MS为基础培养基，并添加KT、6-BA、NAA、PVP、秋水仙素和活性炭得到。诱导培养基中KT的浓度为2.0mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.5mg/L，PVP的浓度为0.5g/L，秋水仙素的浓度为30mg/L，活性炭的浓度为1.0g/L。
[0043] 通常诱导培养基为液体培养基，因此其中不加入琼脂。秋水仙素是一种生物碱，又名秋水仙碱。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂。在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍。自1937年美国学者布莱克斯利(A.F.Blakeslee)等，用秋水仙素加倍曼陀罗等植物的染色体数获得成功以后，秋水仙素就被广泛应用于细胞学、遗传学的研究和植物育种中。在本发明中，加入秋水仙素是为了得到蒙桑四倍体。
[0044] 在本发明的一个实施例中，诱导培养的具体条件为：将预培养后的茎段接种于诱导培养基中，在温度为20±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养72h以上。
[0045] 在本发明的一个实施例中，诱导培养结束后，将诱导后的茎段取出，用无菌水冲洗3～4次，用无菌滤纸吸干表面水分后，转入增殖培养基进行培养。
[0046] (3)诱导培养完成后，将诱导后的茎段接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到丛生芽。
[0047] 在本发明的一个实施例中，增殖培养基与预培养培养基的成分和含量相同。
[0048] 在本发明的一个实施例中，增殖培养的具体条件为：将诱导后的茎段接种于增殖培养基中，在温度为25±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养20～30天，至诱导苗生长至30cm以上，得到丛生芽。
[0049] 由于诱导培养会产生四倍体、二倍体和嵌合体，因此增殖培养结束后，需要对丛生芽的叶片进行染色体数目分析，确定其染色体数目。然后筛选出四倍体继续培养20～30d后，进行生根培养。
[0050] 本发明采用流式细胞仪鉴定诱导后的倍性，具体方法为：在超净工作台内，从每株丛生芽上剪取1～2片叶子。标记后，用流式细胞仪鉴定倍性。在本发明的一个实施例中，当秋水仙素在诱导培养基中的的浓度为30～50mg/L时，丛生芽中四倍体的比例为12％～25％。
[0051] (4)增殖培养完成后，将得到的丛生芽接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。
[0052] 在本发明的一个实施例中，生根培养基是以MS为基础培养基，并添加IBA得到。生根培养基中IBA的浓度为0.3mg/L。IBA为吲哚丁酸，对植物抽枝或芽、苗等的顶部芽端形成有促进作用，也可以将其替换为吲哚乙酸。
[0053] 在本发明的一个实施例中，生根培养的具体条件为：将丛生芽接种于生根培养基中，在温度为25±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养15～25天，得到生根苗。
[0055] 在本发明的一个实施例中，生根苗先进行1周的瓶苗锻炼，具体步骤包括：先拧松瓶盖3d，再拧开瓶盖锻炼3～4d，然后取出幼苗在温水中洗去根部培养基，再用含有1％的多菌灵水溶液浸泡30s。然后将其栽植于基质内进行炼苗。基质中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为3：3：2。炼苗在温度为20～25℃之间，湿度为75％～85％的条件下进行。
[0056] 本发明通过对蒙桑组培苗选取茎段后进行预培养，然后对得到的愈伤组织采用秋水仙素诱导得到多倍体，然后经过增殖培养和生根培养，得到蒙桑的多倍体幼苗。具体地，本发明在诱导培养中通过添加PVP和活性炭降低了增殖过程的褐化率，并通过选择适宜的预培养时间，以及在愈伤组织分化期加入适宜的秋水仙素，减少了嵌合体的产生，提高了多倍体的诱导率。
[0057] 实施例1-1
[0058] (1)培育蒙桑组培苗：5月中下旬选取生长健壮的蒙桑作为母株，于母株中上部剪取当年生嫩枝。去掉枝条上的叶片后，用洗洁精洗涤枝条表面，然后用自来水冲洗30min。将清洗后的枝条移入超净工作台内，将其剪为小段，每小段上含有芽的数目≥2。将上述小段置于75％体积分数的酒精内消毒1min，然后用无菌水冲洗3次以上，再用1％质量浓度的升汞溶液浸泡6min，最后用无菌水冲洗3～4次，用无菌滤纸吸附残留水分，得到灭菌后的茎段。
[0059] 将灭菌后的茎段接种于第一培养基中培养20d后，该茎段发生萌芽。将萌芽后的茎段接种于第二培养基中，获得蒙桑组培苗。其中，第一培养基为MS培养基。第二培养基以MS为基础培养基，并添加KT、6-BA、NAA、PVP和活性炭得到，其中KT的浓度为2.0mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.5mg/L，PVP的浓度为0.5g/L，活性炭的浓度为1.0g/L。
[0060] (2)预培养：选取生长健壮的组培苗，将其剪去叶片及叶柄后得到茎段，将茎段截为1～1.5cm长的小段，每小段留有1个腋芽，从小段一端进行纵切，得到长度为1mm的切口。将茎段横向插入培养基内，仅上表面露出培养基。在温度为25±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养72h以上，得到预培养茎段。
[0061] 预培养培养基是以MS为基础培养基，并添加KT、6-BA、NAA、PVP和活性炭得到。预培养培养基中KT的浓度为2.0mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.5mg/L，PVP的浓度为0.5g/L，活性炭的浓度为1.0g/L。
[0062] (3)诱导培养：将预培养后的茎段接种于诱导培养基中，在温度为20±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养72h以上，得到诱导后的茎段。诱导培养结束后，将诱导后的茎段取出，用无菌水冲洗3～4次，用无菌滤纸吸干表面水分。
[0063] 诱导培养基以不添加琼脂的MS为基础培养基，并添加KT、6-BA、NAA、PVP、秋水仙素和活性炭得到。诱导培养基中KT的浓度为2.0mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.5mg/L，PVP的浓度为0.5g/L，秋水仙素的浓度为30mg/L，活性炭的浓度为1.0g/L。
[0064] (4)增殖培养：将诱导后的茎段接种于增殖培养基中，在温度为25±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养20～30天，至诱导苗生长至30cm以上，得到丛生芽。增殖培养基与预培养培养基的成分和含量相同。
[0065] (5)染色体数目分析：采用流式细胞仪确定丛生芽的染色体数目，然后筛选出四倍体继续培养20～30d后，进行生根培养。图1和图2分别是二倍体和四倍体中的DNA含量图，说明采用秋水仙素诱导能够得到四倍体，但也存在未发生染色体数目变化的二倍体。图中纵坐标为粒子数，横坐标为荧光强度。可通过峰图计算植株中的DNA含量，并判断细胞内染色体的倍性水平。
[0066] (6)生根培养：将丛生芽接种于生根培养基中，在温度为25±2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl，黑暗时间为16h的条件下培养15～25天，得到生根苗。
[0067] 生根培养基是以MS为基础培养基，并添加IBA得到。生根培养基中IBA的浓度为0.3mg/L。
[0068] (7)炼苗移栽：先拧松生根苗所在容器的瓶盖3d，再拧开瓶盖锻炼3～4d，然后取出幼苗在温水中洗去根部培养基，再用含有1％的多菌灵水溶液浸泡30s。将其栽植于基质内进行炼苗，40～60d得到移栽苗，待幼苗生长至10～15cm高度时移栽到大田定植。
[0069] 基质中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为3：3：2，炼苗在温度为20～25℃之间，湿度为75％～85％的条件下进行。
[0070] 实施例1-2至实施例1-5
[0071] 改变步骤(2)预培养培养基中的试剂种类与用量，观察不同添加剂组合对预培养茎段褐化率和生长情况的影响。各实施例采用的预培养培养基均以MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+2.0mg/L KT为基础，其它培养方法同实施例1-1，结果见表1。
[0072] 表1
[0073]
[0074] 从表1可看出，与实施例1-1相比，改变PVP和活性炭的加入量，蒙桑预培养茎段的褐化率均有所上升，正常茎段所占的比例下降。说明加入PVP和活性炭能够抑制褐化。
[0075] 实施例2-1至实施例2-27
[0076] 改变步骤(2)中的预培养时间，以及步骤(3)诱导培养基中的秋水仙素的用量和诱导培养时间。在诱导培养和增殖培养后进行染色体数目分析，采用流式细胞仪确定丛生芽的染色体数目，并计算得到丛生芽中的四倍体和嵌合体百分比。其它培养方法同实施例1-1，结果见表2。
[0077] 表2
[0078]
[0079] 从表2可看出，预培养时间和诱导培养时间过长或过短，均无法得到四倍体。同时，当秋水仙素的加入量在20～50mg/L变化时，也会影响四倍体所占比例。因此将预培养时间和诱导培养时间均控制在3天，并将秋水仙素浓度控制在30mg/L，在诱导后的茎段中可以得到比例较高的四倍体。
[0080] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
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