【技术领域】
[0001] 本
发明属于植物培育技术领域，具体涉及一种培育多倍体多肉植物的方法。【背景技术】
[0002] 多倍体育种是指利用人工诱变或自然变异等，通过细胞
染色体组加倍获得多倍体育种材料，用以选育符合人们需要的优良品种。多倍体是指由受精卵发育而来并且
体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体。最常用、最有效的多倍体育种方法是用秋
水仙素或低温诱导来处理萌发的
种子或
幼苗。现技术存在多倍体获得多倍体培育过程繁琐且耗时长，诱变剂对植物毒害作用大，嵌合体现象严重，纯多倍体得到率过低，多倍体植株虽然可育，但生长缓慢、发育迟缓。
[0003]
超声波在与细胞膜的共振
频率相同时，可使细胞膜发生共振，此时细胞膜的振动幅度最大，使声波
能量最大限度进入细胞，由于
超声波的机械作用、热作用、
空化产生的高温，使植物细胞膜分子水平被改变，增加DNA的导入率，从而产生一系列的
生物物理效应。通过细胞膜表面张
力和表面
密度，可得育种时超声波辐照的最佳频率。但超声波培育的缺点是，同时会给目标DNA细胞以外的细胞供给一定的能量，且超声波不能给植物细胞提供养分。
[0004]
电流具有促进细胞生长和引导细胞趋向的作用。对组织细胞进行刺激可以改变可兴奋细胞对Na+或Ca+通透性，从而产生动作电位，使其内部的Na+、K+离子通道发生变化引起内部环境的改变，最终改变细胞的状态。其缺点是，由于植物细胞壁和细胞膜的
电阻作用，电流强度小无法刺激植物细胞内部强度过大会损伤植物细胞。且电流作用植物的同时，会发生培养基
电解反应，产生污染物污染植物细胞膜。【发明内容】
[0005] 本发明在于克服
现有技术存在的缺点与不足，提供一种培育多倍体多肉植物的方法。本发明的方法既可以提高嵌合体筛选率，提高多倍体生根、发育速率，同时可让植株含养量更高，根系更为发达，且具有稳定遗传性的效果。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007] 一种培育多倍体多肉植物的方法，具体步骤如下：
[0008] 1)选取多肉植物
叶片，浸泡生根水2-3天，取长出0.5-1.2cm不定根的叶片；
[0009] 2)将叶片放入液体MS培养基内的纳滤膜中，将培养基放入4℃的冷藏室内，诱导培养36h；
[0010] 3)取步骤2)中诱导后所得叶片根细胞，观察筛选得到四倍体细胞，检测四倍体细胞膜共振频率，给液体MS培养基通电，同时用超声波共振照射叶片，筛选培养7-10天；
[0011] 4)将步骤3)中所得叶片平放入木质素培养基培育，叶片发育长出0.5-1cm的幼苗时，取植株幼苗叶片检测细胞膜共振频率，用超声波共振照射培养1-2个月；
[0012] 5)培育所得成熟一代植株群体为F1，筛选F1植株叶片叶插方法批量培育得第二代植株群体F2，选择纯四倍体F2为目标幼苗。
[0013] 进一步说明，所述步骤3)或步骤4)中用He—Ne激光
多普勒效应测振仪检测细胞膜的共振频率。
[0014] 进一步说明，所述纳滤膜为芳香族及聚酸氢类复合纳滤膜，其
位置置于液体MS培养基容器中部。
[0015] 进一步说明，所述步骤3)中通电的电流为交流电，其
电压为5-10V，电流为500-1000μ A，频率为40-60Hz。
[0016] 进一步说明，所述步骤3)中超声波频率与检测所得植物细胞膜频率相同，培养基通电与超声波照射的间隔频率和持续时间为每隔5h进行1h。
[0017] 进一步说明，所述木质素培养基的成分浓度为：成品木质素0.08-0.16g/L，
葡萄糖3-5g/L， KH2PO4 1-3g/L，MgSO4 0.22-0.28g/L，CaCl2 0.08-0.12g/L，MnSO4 0.005-0.008g/L，VB 10-12g/L，
酒石酸铵0.1-0.3g/L，微量元素溶液135-155mL/L。
[0018] 进一步说明，所述微量元素溶液的成分浓度为：NaCl 1.0-1.5g/L，FeSO4·7H2O 100-120mg/L，CoSO4·7H2O 100-120mg/L，ZnSO4·7H2O 100-120mg/L，CuSO4·5H2O 10-
12mg/L， KAl(SO4)2 100-120mg/L，H3BO3 10-12mg/L，Na2MoO4 10-12mg/L。
[0019] 进一步说明，所述步骤4)中，超声波频率与检测所得植物细胞膜频率相同，超声波照射时间和间隔频率为每隔1天照射2-3h。
[0020] 进一步说明，所述植物细胞膜频率的范围为30-65±2.33kHz，输出声波强度为20-150db。
[0021] 进一步说明，所述步骤1)中选取叶片为景天科，所述景天科为凝脂莲或黄丽或虹之玉或乙女心或桃美人，培养
温度为23-28℃，每日光照时间3h。
[0022] 综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
[0023] 本发明在景天科多肉植物细胞有丝分裂时，采用低温诱导的方式使染色体加倍，选择所需要的四倍体细胞，检测其细胞膜的共振频率，使用超声波共振照射诱导后植株，改变植物细胞分子水平结构，打开植物细胞吸收养分的通道。同时通过电流刺激液体MS培养基中养分离子在超声波的推送作用下通过细胞膜通道大量进入细胞内。给予目标四倍体细胞最大能量进行活动繁殖，使目标细胞繁殖速率加快且细胞内营养物质聚集增多。同时由于四倍体细胞所受能量值远大于二倍体细胞所受能量值，在利用四倍体细胞共振频率的超声波照射作用下，二倍体细胞膜稀疏，电流可进入细胞内对DNA分子进行切割，从而减少二倍体细胞分裂，增加嵌合体筛选效率。用纳滤膜可通过养分离子的同时减少电流作用培养基产生的污染物对植物细胞的侵害。木质素能与
纤维素酶产生非生产性
吸附，在超声波促进作用下，使大量
纤维素酶失去
水解能力。后期利用超声波配合木质素培养基坚固培育植株幼苗细胞膜，在第一次超声波作用细胞膜打开细胞膜吸收能量管道的作用下，保证细胞膜的坚固性同时继续加强植物吸收超声波带来的生物物理效应。达到植株增产、植株叶片营养含量更高、植株繁殖速率更高的效果。【具体实施方式】
[0024] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0025] 以下
实施例1-3，对比例1-5的景天科多肉植物叶片以黄丽的叶片为例。
[0026] 实施例1：
[0027] 1.选取景天科多肉植物叶片50片，
温室培养，培养期间温度为25℃，每天日光照射3h，浸泡生根水2.5天，取长出0.5-1.2cm不定根的叶片。
[0028] 2.将叶片放入液体MS培养基中部的芳香族及聚酸氢类复合纳滤膜中，将培养基放入4 ℃的冷藏室内，诱导培养36h；
[0029] 3.取步骤2)中诱导后所得叶片根细胞，观察筛选得到四倍体细胞，用He—Ne激光多普勒效应测振仪检测四倍体细胞膜共振频率，所得频率为45±2.33kHz，输出声波强度为70db。用电压为8V，电流为800μA，频率为50Hz的交流电给液体培养基通电，同时用超声波共振照射培养8天，通电与超声波照射的间隔频率和持续时间为每隔5h进行1h。
[0030] 4.调配成分浓度为成品木质素0.12g/L，葡萄糖4g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.25g/L， CaCl2 0.1g/L，MnSO4 0.007g/L，VB 11g/L，酒石酸铵0.2g/L，微量元素溶液145mL/L的木质素培养基。其中微量元素溶液成分浓度为NaCl 1.3g/L，FeSO4·7H2O 110mg/L，CoSO4·7H2O 110mg/L，ZnSO4·7H2O 110mg/L，CuSO4·5H2O 11mg/L，KAl(SO4)2 110mg/L，H3BO3
11mg/L， Na2MoO4 11mg/L。将步骤3)中所得叶片平放入木质素培养基培育，叶片发育长出
0.5-1cm的幼苗时，取植株幼苗叶片检测细胞膜共振频率，其频率为51±2.33kHz，输出声波强度为70db，用超声波共振照射培养1.5个月，超声波照射时间和间隔频率为每隔1天照射
2.5h；
[0031] 5.培育所得成熟一代植株群体为F1，F1为富含嵌合体细胞的植株，基因复制后的多倍体与原植株大小形态差异明显，通过观察植株状态，叶片形状，筛选F1植株叶片。通过叶插方法批量培育得第二代植株群体F2。通过活体细胞观察可筛选出纯四倍体F2为目标幼苗。
[0032] 实施例2：
[0033] 1.选取景天科多肉植物叶片50片，温室培养，培养期间温度为28℃，每天日光照射3h，浸泡生根水3天，取长出0.5-1.2cm不定根的叶片。
[0034] 2.将叶片放入液体MS培养基中部的芳香族及聚酸氢类复合纳滤膜中，将培养基放入4 ℃的冷藏室内，诱导培养36h；
[0035] 3.取步骤2)中诱导后所得叶片根细胞，观察筛选得到四倍体细胞，用He—Ne激光多普勒效应测振仪检测四倍体细胞膜共振频率，所得频率为48±2.33kHz，输出声波强度为150db。用电压为10V，电流为1000μA，频率为60Hz的交流电给液体培养基通电，同时用超声波共振照射培养10天，通电与超声波照射的间隔频率和持续时间为每隔5h进行1h。
[0036] 4.调配成分浓度为成品木质素0.16g/L，葡萄糖5g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4 0.28g/L， CaCl2 0.12g/L，MnSO4 0.008g/L，VB 12g/L，酒石酸铵0.3g/L，微量元素溶液155mL/L的木质素培养基。其中微量元素溶液成分浓度为NaCl 1.5g/L，FeSO4·7H2O 120mg/L，CoSO4·7H2O 120mg/L，ZnSO4·7H2O 120mg/L，CuSO4·5H2O 12mg/L，KAl(SO4)2 120mg/L，H3BO3
12mg/L， Na2MoO4 12mg/L。将步骤3)中所得叶片平放入木质素培养基培育，叶片发育长出
0.5-1cm 的幼苗时，取植株幼苗叶片检测细胞膜共振频率，其频率为53±2.33kHz，输出声波强度为 150db，用超声波共振照射培养2个月，超声波照射时间和间隔频率为每隔1天照射3h；
[0037] 5.培育所得成熟一代植株群体为F1，F1为富含嵌合体细胞的植株，基因复制后的多倍体与原植株大小形态差异明显，通过观察植株状态，叶片形状，筛选F1植株叶片。通过叶插方法批量培育得第二代植株群体F2。通过活体细胞观察可筛选出纯四倍体F2为目标幼苗。
[0038] 实施例3：
[0039] 1.选取景天科多肉植物叶片50片，温室培养，培养期间温度为23℃，每天日光照射3h，浸泡生根水2天，取长出0.5-1.2cm不定根的叶片。
[0040] 2.将叶片放入液体MS培养基中部的芳香族及聚酸氢类复合纳滤膜中，将培养基放入4 ℃的冷藏室内，诱导培养36h；
[0041] 3.取步骤2)中诱导后所得叶片根细胞，观察筛选得到四倍体细胞，用He—Ne激光多普勒效应测振仪检测四倍体细胞膜共振频率，所得频率为44±2.33kHz，输出声波强度为20db。用电压为5V，电流为500μA，频率为40Hz的交流电给液体培养基通电，同时用超声波共振照射培养7天，通电与超声波照射的间隔频率和持续时间为每隔5h进行1h。
[0042] 4.调配成分浓度为成品木质素0.08g/L，葡萄糖3g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.22g/L， CaCl2 0.08g/L，MnSO4 0.005g/L，VB 10g/L，酒石酸铵0.1g/L，微量元素溶液135mL/L的木质素培养基。其中微量元素溶液成分浓度为NaCl 1.0g/L，FeSO4·7H2O 100mg/L，CoSO4·7H2O 100mg/L，ZnSO4·7H2O 100mg/L，CuSO4·5H2O 10mg/L，KAl(SO4)2 100mg/L，H3BO3
10mg/L， Na2MoO4 10mg/L。将步骤3)中所得叶片平放入木质素培养基培育，叶片发育长出
0.5-1cm 的幼苗时，取植株幼苗叶片检测细胞膜共振频率，其频率为48±2.33kHz，输出声波强度为20db，用超声波共振照射培养1个月，超声波照射时间和间隔频率为每隔1天照射
2h；
[0043] 5.培育所得成熟一代植株群体为F1，F1为富含嵌合体细胞的植株，基因复制后的多倍体与原植株大小形态差异明显，通过观察植株状态，叶片形状，筛选F1植株叶片。通过叶插方法批量培育得第二代植株群体F2。通过活体细胞观察可筛选出纯四倍体F2为目标幼苗。
[0044] 对比例1：处理方案基本与实施例1相同，不同点是没有进行步骤3)中超声波共振照射的处理，叶片经低温诱导后直接培育至长出新幼苗。
[0045] 对比例2：处理方案基本与实施例1相同，不同点是没有进行步骤3)中培养基通电处理。
[0046] 对比例3：处理方案基本与实施例1相同，不同点是没有放置纳滤膜。
[0047] 对比例4：处理方案基本与实施例1相同，不同点是没有进行步骤4)中叶片放入木质素培养基，改为叶片放入无菌
土壤处理。
[0048] 对比例5：处理方案基本与实施例1相同，不同点是没有进行任何超声波共振照射和培养基通电处理。
[0049] 验证试验一：
[0050] 将实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、和对比例5中最后得到的F2纯四倍体植株的概率进行对比，得到如下表中数据：
[0051] 表1：
[0052]类别 F2中纯四倍体出现概率％
实施例1 62.5
实施例2 60.8
实施例3 61.6
对比例1 34.8
对比例2 35.2
对比例3 55.4
对比例4 50.6
对比例5 34.7
[0053] 将实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、和对比例 5中最后得到的F2纯四倍体植株，培育5个月后，进行如下表的参数检测：
[0054] 表2：
[0055]3
类别 存活率％ 细胞平均体积μm 根系平均长度cm 叶片平均长度cm
实施例1 98 35222 16.97 9.68
实施例2 94 35125 15.96 9.21
实施例3 96 34879 16.32 9.18
对比例1 79 27000 6.82 5.41
对比例2 80 27100 7.22 5.52
对比例3 69 28700 11.36 7.06
对比例4 72 31050 8.06 6.76
对比例5 80 26500 6.52 5.31
[0056] 将实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、和对比例 5中植株营养状态用TY-ZWY02植物营养诊断仪进行如下表的参数检测：
[0057] 表3：
[0058]
[0059] 将实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、和对比例 5中植株营养状态用TY-4N叶绿素测定仪进行如下表的参数检测：
[0060] 表4：
[0061]
[0062] 采用本
申请一种培育多倍体多肉植物的方法，先将植物根细胞进行低温诱导多倍体培养，免去化学
试剂对植物细胞造成的伤害。再用经诱导后的根细胞进行活体观察，得到所需要的四倍体细胞，检测其细胞膜共振频率。将植物放置入纳滤膜中，可通过养分离子同时可阻挡通电造成的污染物污染植物细胞。利用超声波共振照射，改变植物细胞膜分子水平，使植物细胞膜吸收养分和能量的入口通透。超声波照射的同时对液体培养基通电，其微电流在不伤害植株且电流频率极小不会对超声波共振造成影响。电流刺激液体MS培养基内养分离子通过超声波的推送作用大量导入植物细胞内，提高对四倍体细胞分裂繁殖的供能供养，从而提高四倍体细胞繁殖能力与繁殖速率。同时四倍体细胞比二倍体与三倍体细胞，细胞核体积明显较大，细胞膜较厚，二倍体与三倍体受到四倍体共振频率的超声波作用下细胞膜会稀薄通透，电流可进入细胞内对DNA分子进行切割，从而减少二倍体与三倍体的繁殖率，进而提高对嵌合体的筛选率。木质素可以与纤维素酶产生非生产性吸附，在超声波促进作用下，使大量纤维素酶失去水解能力。在植株幼苗成长初期持续使用超声波共振与木质素培养基作用培养可巩固植物细胞坚韧度和吸收养分的能力，可持续给植物细胞提供能量，加快植株发育速率，促进植物生根。
[0063] 试验证明：
[0064] 由上表可以得出，使用本方法平均提高F2中出现纯四倍体植株的概率45-51％；平均提高F2代纯四倍体存活率15-25％；平均增大植株体积32-21％；平均提高植物细胞养分含量47-85％。以上数据说明，植物细胞经低温诱导后，混倍体细胞繁殖在超声波共振照射与电流作用的条件下，可加强对比目标DNA含量低的细胞进行筛除，加强目标DNA含量细胞的繁殖率，细胞吸收养分多，细胞分裂繁殖速率快，
无性繁殖存活率提高，细胞平均体积增大。但通电造成污染物会对植物细胞的存活率造成很大影响，用纳滤膜能有效防护污染物侵害植物细胞。植物幼苗发育期间用超声波共振照射可加强植物养分吸收但易于破坏细胞膜
稳定性，在木质素的修复作用下，可使植物细胞保持吸收通道的同时细胞膜坚固不易
破碎。从而达到植株含养量更高，根系更为发达，存活率更高，且具有稳定遗传性的效果。
[0065] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干
变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附
权利要求为准。
