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一种芜菁萝卜属间异源多倍体的诱导制备方法

阅读：1033发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种芜菁萝卜属间异源多倍体的诱导制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种芜菁萝卜属间异源多倍体的诱导制备方法，取芜菁萝卜属间远缘双单倍体杂种无性苗的幼芽接种于培养基中培养，得到扩繁的无性幼芽；取幼芽接种于含0.02wt％秋水仙碱的诱导培养基上进行培养，得到诱导后的幼芽；将诱导后的幼芽转入到分化培养基中进行后继培养，得到幼苗；对幼苗的幼嫩叶片进行流式细胞仪倍性分析，以芜菁萝卜双单倍体杂种的二倍体母本芜菁、父本萝卜，以及经过细胞学鉴定的芜菁萝卜双单倍体杂种为对照，峰值与对照相近的为二倍体，出现显著单个高峰的为整倍体，出现两个或多个高度相近分离峰的为混倍体。该方法操作方便，倍性鉴定效率高，解决了现有技术中芜菁萝卜属间双单倍体杂种不育，无法进行遗传和育种利用的问题。，下面是一种芜菁萝卜属间异源多倍体的诱导制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种芜菁萝卜属间异源多倍体的诱导制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取芜菁萝卜属间远缘双单倍体杂种无性苗的幼芽接种于培养基中，培养15-30d，得到扩繁的芜菁萝卜属间远缘双单倍体无性幼芽；
(2)将经过扩繁的芜菁萝卜属间远缘双单倍体无性幼芽，接种于含0.02wt％秋水仙碱的诱导培养基上，培养24-36小时后，得到诱导后的幼芽；
(3)将诱导后的幼芽转入分化培养基中进行后继培养，得到幼苗；
(4)取后继培养后的幼苗的幼嫩叶片进行流式细胞仪倍性分析，以芜菁萝卜双单倍体杂种的二倍体母本芜菁、父本萝卜，以及经过细胞学鉴定的芜菁萝卜双单倍体杂种为对照，峰值与对照相近的为二倍体，出现显著单个高峰的为整倍体，出现两个或多个高度相近分离峰的为混倍体；
步骤(1)中，所述培养基的配方为：MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2％蔗糖+0.7％琼脂；
步骤(2)中，所述诱导培养基配方为：0.02wt％秋水仙碱+MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2％蔗糖+0.7％琼脂；
步骤(3)中，所述分化培养基的配方为：MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+2％蔗糖+0.7％琼脂。
2.如权利要求1所述的芜菁萝卜属间异源多倍体的诱导制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述后继培养的时长为20-35d，温度为25℃，光照时间16h/d，光照强度为2000lx。

说明书全文

一种芜菁萝卜属间异源多倍体的诱导制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种芜菁萝卜属间异源多倍体的诱导制备方法，属于植物的多倍体育种领域。

背景技术

[0002] 芜菁是十字花科芸薹属芸薹种芜菁亚种，肥大肉质根供食用，肉质根柔嫩、致密，供炒食、煮食。对环境的适应性很强，产量较高，是具有较长食用历史的传统蔬菜之一。萝卜原产于我国，是十字花科萝卜属，以肉质根供食用，是主要的根茎类蔬菜之一，其营养丰富、管理简便、产量高、成本低，供应期长，产品耐贮运，用途广，不仅可以食用，还可加工，并且具有较高的食疗作用。以芜菁为母本，萝卜为父本创制的异源属间双单倍体，由于在减数分裂过程中染色体不能正常的配对和分离，远缘杂种往往表现高度不育；限制了其进一步的改良和育种利用。

[0003] 异源多倍体育种是植物创新育种的一种手段，通过染色体加倍技术，人工创造多倍体，是获得高生物质产量植物新品种的有效途径之一。已有研究表明，秋水仙素可应用于芸薹属植物的染色体加倍中，但在远缘杂交过程中利用秋水仙碱诱导染色体加倍仍然存在瓶颈现象，而且针对不同材料，采用不同的处理方式进行秋水仙碱诱导染色体加倍的具体效果不同。

发明内容

[0004] 本发明的目的是解决现有技术中芜菁萝卜属间双单倍体杂种不育，无法进行遗传和育种利用的问题，提供一种芜菁萝卜属间异源多倍体的诱导制备方法。

[0005] 本发明的另一个目的还在于提供一种芜菁萝卜属间异源多倍体的倍性鉴定方法。

[0006] 技术方案

[0007] 一种芜菁萝卜属间异源多倍体的诱导制备方法，包括如下步骤：

[0008] (1)取芜菁萝卜属间远缘双单倍体杂种无性苗的幼芽接种于培养基中，培养15-30d，得到扩繁的芜菁萝卜属间远缘双单倍体无性幼芽；

[0009] (2)将经过扩繁的芜菁萝卜属间远缘双单倍体无性幼芽，接种于含0.02wt％秋水仙碱的诱导培养基上，培养18-36小时后，得到诱导后的幼芽；

[0010] (3)将诱导后的幼芽转入分化培养基中进行后继培养，得到幼苗；

[0011] (4)取后继培养后的幼苗的幼嫩叶片进行流式细胞仪倍性分析，以芜菁萝卜双单倍体杂种的二倍体母本芜菁、父本萝卜，以及经过细胞学鉴定的芜菁萝卜双单倍体杂种为对照，峰值与对照相近的为二倍体，出现显著单个高峰的为整倍体，出现两个或多个高度相近分离峰的为混倍体。

[0012] 步骤(1)中，所述培养基的配方为：MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2％蔗糖+0.7％琼脂。

[0013] 步骤(2)中，所述诱导培养基配方为：0.02wt％秋水仙碱+MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2％蔗糖+0.7％琼脂。

[0014] 步骤(3)中，所述分化培养基的配方为：MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+2％蔗糖+0.7％琼脂。

[0015] 步骤(3)中，所述后继培养的时长为20-35d，温度为25℃，光照时间16h/d，光照强度为2000lx。

[0016] 上述方法制得的芜菁萝卜属间异源多倍体的倍性鉴定方法，包括如下步骤：

[0017] a.将幼苗置于超净工作台上，取最顶端的一片幼嫩叶片，保持叶片完整无损伤，放入取样袋中，标注好编号并记录前期秋水仙诱导处理的情况,放入4℃冰箱，保存备用；

[0018] b.切取5mm2待测样品的叶片置于培养皿中，加0.2ml萃取裂解液，在1分钟内，用刀沿垂直方向快速将小叶切碎，使碎片完全浸于萃取液中，静置萃取2-5min，使用50μm的滤网过滤，收集滤液于新的样品管中，加0.8ml染色液，静置30-60s，准备上机检测；

[0019] c.采用已知倍性的芜菁、萝卜亲本及远缘杂交双单倍体苗为对照材料，将对照样品单细胞悬浮液置于流式细胞仪上进行测定，其激发光源为20Mw、488nm的蓝宝石固体激光；测定时控制样品进样速度为0.1至20微升/秒，各通道的变异系数CV稳定且在0～3％，手动控制细胞流速在100～120个/秒以保持细胞分离纯度；通过与流式细胞仪相连的计算机分析软件，调整电压设置对照DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，即可进行待测样品的倍性鉴定；同对照相同的测试条件下，对比待测样品与对照产生的DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，判断待测样品的倍性水平。

[0020] 判断待测样品的倍性水平的具体方法：以已知的二倍体芜菁、萝卜亲本及远缘杂双单倍体苗为对照时，设置对照样品DNA含量荧光强度分离峰在横坐标100的位置，当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标100±5％的位置时，该待测样品为二倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标150±5％的位置时，该待测样品为异源三倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标200±5％的位置时，该待测样品为异源四倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标350±5％的位置时，该待测样品为异源七倍体；当待测样品的DNA含量直方图出现两个以上分离峰，且最高分离峰和最矮分离峰的高度相差不超过一半的为混倍体，混倍体的倍性组成由各分离峰所在横坐标的位置确定。

[0021] 本发明的有益效果在于：

[0022] (1)本发明提供了一种加秋水仙碱于培养基上，诱导芜菁萝卜异源多倍体的方法，操作简单，幼芽在含秋水仙碱的分化培养基中，处理足够长时间，可抑制细胞后期分裂时纺锤体的形成，根据处理时间的不同，导致不同倍性的整倍体和混倍体的产生。而且诱导形成的多倍体细胞能够在分化培养基的诱导下，大量繁殖，形成加倍的幼芽，细胞的分化和增殖速度高，多倍化的效率高；

[0023] (2)经秋水仙碱诱导形成的异源四倍体材料，由于染色体具有了可配对性，其育性得到恢复，对芜菁和萝卜属间的遗传改良以及新种质的创制具有重要的作用。

[0024] (3)本发明将流式细胞仪应用于芜菁萝卜的远缘属间杂种的倍性鉴定，制样简单，2
特别适用于组培的芽或者小苗，只使用5mm的样品就可以很容易的鉴定其材料的倍性；而且基于DNA含量水平的倍性鉴定，准确、灵敏度和分辨率高，可以实现快速批量的检测，节约人力和资源，为加速育种进程和新种质的利用，提供了良好的技术支撑。
附图说明

[0025] 图1为二倍体芜菁为对照叶片的DNA含量直方图；

[0026] 图2为二倍体萝卜为对照叶片的DNA含量直方图；

[0027] 图3为芜菁萝卜双单倍体叶片的DNA含量直方图；

[0028] 图4为芜菁萝卜双单倍体染色体加倍后形成的三倍体植株叶片的DNA含量直方图；

[0029] 图5为芜菁萝卜双单倍体染色体加倍后形成的四倍体植株叶片的DNA含量直方图；

[0030] 图6为芜菁萝卜双单倍体染色体加倍后形成的七倍体植株叶片的DNA含量直方图；

[0031] 图7为芜菁萝卜双单倍体染色体加倍后形成的1-2/3倍嵌合体植株叶片的DNA含量直方图；

[0032] 图8为芜菁萝卜双单倍体染色体加倍后形成的2/4倍嵌合体植株叶片的DNA含量直方图；

[0033] 图9为芜菁萝卜双单倍体染色体加倍后形成的3-4/7倍嵌合体植株叶片的DNA含量直方图；

[0034] 图10为芜菁萝卜双单倍体染色体加倍后形成的4/7倍嵌合体植株叶片的DNA含量直方图。

具体实施方式

[0035] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。下述实施例中，流式细胞仪型号为 Cube，为德国Partec公司生产。

[0036] 实施例1

[0037] (1)取芜菁萝卜属间远缘双单倍体杂种无性苗的幼芽接种于MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2％蔗糖+0.7％琼脂的培养基中，培养20d，得到扩繁的芜菁萝卜属间远缘双单倍体无性幼芽；

[0038] (2)将经过扩繁的芜菁萝卜属间远缘双单倍体无性幼芽，接种于0.02wt％秋水仙碱+MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2％蔗糖+0.7％琼脂的诱导培养基上培养18小时，得到诱导后的幼芽；

[0039] (3)将诱导后的幼芽转入MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+2％蔗糖+0.7％琼脂的分化培养基中，进行幼苗的继续生长。

[0040] (4)对幼苗进行流式细胞仪倍性分析，以芜菁萝卜双单倍体杂种的二倍体母本芜菁、父本萝卜，以及经过细胞学鉴定的芜菁萝卜双单倍体杂种为对照，峰值与对照相近的为二倍体，出现显著单个高峰的为整倍体，出现两个或多个高度相近分离峰的为混倍体。

[0041] 实施例2

[0042] 步骤(2)中，经过扩繁的芜菁萝卜属间远缘双单倍体无性幼芽在诱导培养基上的培养时间为24h，其余与实施例1相同。

[0043] 实施例3

[0044] 步骤(2)中，经过扩繁的芜菁萝卜属间远缘双单倍体无性幼芽在诱导培养基上的培养时间为30h，其余与实施例1相同。

[0045] 实施例4

[0046] 步骤(2)中，经过扩繁的芜菁萝卜属间远缘双单倍体无性幼芽在诱导培养基上的培养时间为36h，其余与实施例1相同。

[0047] 上述方法制得的芜菁萝卜属间异源多倍体的倍性鉴定方法，包括如下步骤：

[0048] a.将采用秋水仙碱诱导处理后的无菌苗置于超净工作台上，取最顶端的一片幼嫩叶片，保持叶片完整无损伤，放入取样袋中，放入4℃冰箱，保存备用；

[0049] b.切取5mm2待测样品的叶片置于培养皿中，加0.2ml萃取裂解液，在1分钟内，用刀沿垂直方向快速将小叶切碎，使碎片完全浸于萃取液中，静置萃取2-5min，使用50μm的滤网过滤，收集滤液于新的样品管中，加0.8ml染色液，静置30-60s，准备上机检测；

[0050] c.采用已知倍性的芜菁、萝卜亲本及远缘杂双单倍体苗为对照材料，将对照样品单细胞悬浮液置于流式细胞仪进行测定，其激发光源为20Mw、488nm的蓝宝石固体激光；测定时控制样品进样速度为0.1至20微升/秒，各通道的变异系数CV稳定且在0～3％，手动控制细胞流速在100～120个/秒以保持细胞分离纯度；通过与流式细胞仪相连的计算机分析软件，调整电压设置对照DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，即可进行待测样品的倍性鉴定；同对照相同的测试条件下，对比待测样品与对照产生的DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，判断待测样品的倍性水平。

[0051] 判断待测样品的倍性水平的具体方法：以已知的二倍体芜菁、萝卜亲本及远缘杂交，双单倍体苗为对照，设置对照样品DNA含量荧光强度分离峰在横坐标100的位置(如图1-3，图1为二倍体芜菁的DNA含量直方图，图2为二倍体萝卜的DNA含量直方图，图3为芜菁萝卜双单倍体叶片的DNA含量直方图)，当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标100±
5％的位置时，该待测样品为二倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标150±5％的位置时，该待测样品为异源三倍体(如图4)；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标200±5％的位置时，该待测样品为异源四倍体(如图5)；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标350±5％的位置时，该待测样品为异源七倍体(如图6)。当待测样品的DNA含量直方图出现两个以上分离峰，且最高分离峰和最矮分离峰的高度相差不超过一半的为混倍体，混倍体的倍性组成由各分离峰所在横坐标的位置确定：当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰有两个峰值，且分别处于横坐标约75，以及150的位置时，该待测样品可能为芜菁萝卜双单倍体染色体加倍后形成的1-2/3倍嵌合体(如图7)；而当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处分别在横坐标约100以及200时，则该待测样品为2/4倍嵌合体(如图8)；同理，当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处分别在横坐标约175以及350时，则该待测样品可能为3-4/7倍嵌合体(如图9)；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处分别在横坐标200以及350时，则该待测样品为4/7倍嵌合体(如图10)；

[0052] 采用实施例1-4的诱导制备方法得到的芜菁萝卜属间杂种染色体加倍情况见表1：

[0053] 表1

[0054]

[0055] 备注：2倍为染色体加倍未成功的植株；整倍体得率：是排除2倍体后的其他整倍体占处理总株数的百分比。

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