[0001] 本发明是在由美国农业部，食品和农业国家研究所，农业和食品研究计划(USDA-NIFA-AFRI)颁发的批准号No.2010-65116-20449和由美国国家科学基金会(NSF)颁发的批准号No.DBI-0115911的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权益。相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求在2013年10月21日提交的美国临时申请No.61/893,741和在2014年10月3日提交的美国临时申请No.62/059,842的优先权35U.S.C.§119(e)权益，其中每一个在此通过引用而整体并入本文。发明领域

[0003] 在此公开的本申请通常涉及参与植物繁殖的基因和使用它们的方法。

[0004] 无融合生殖是一种在开花植物中天然存在的无融合生殖方式；这一过程会导致没有涉及卵细胞的减数分裂或受精的种子形成。绕开减数分裂和受精的无融合生殖过程，其直接导致克隆胚胎的形成。无融合生殖杂种是纯种的杂种，因为无融合生殖植物的种子衍生子代在遗传上是与母本相同的。换而言之，无融合生殖杂种在起源上是克隆的。

[0005] 无融合生殖的特征是：1)不完全减数分裂，其指的是衍生自子房珠心细胞的未减数胚囊形成，和2)孤雌繁殖，其指的是未减数卵细胞发育成胚胎。许多类型的植物物种具有无融合生殖的特性和可以被无性繁殖。简要概述

[0006] 本发明的实施方案包括在缺乏卵细胞受精的情况下，从开花植物胚珠中的一个或多个配子体或孢子体细胞获得繁殖的方法，该方法包括：用能够编码具有与SEQ ID NO：4多肽至少75％序列同一性的多肽的ASGR-BBML基因构建体转化开花植物；在缺乏卵细胞受精的情况下，从转化植物胚珠中获得一个或多个配子体或孢子体细胞；以及从所述一个或多个配子体或孢子体细胞中获得子代植物，其中所述子代植物包含来自转化植物的一个或多个染色体集合，从而在缺乏卵细胞受精的情况下实现开花植物的繁殖。

[0007] 在一些实施方案中，ASGR-BBML基因构建体还包括一个或多个未编码区(UTR)。在一些实施方案中，ASGR-BBML基因构建体还包含一个或多个非编码区，其可以具有与SEQ ID NO：1至少70％的序列同一性或其完全互补链。在一些实施方案中，ASGR-BBML基因构建体还包含一个启动子。在一些实施方案中，启动子是能够调节具有与SEQ ID NO：4至少75％的序列同一性的多肽的表达。在一些实施例中，启动子包含具有与SEQ ID NO：5至少70％的序列同一性或其完全互补链的核苷酸。在一些实施方案中，ASGR-BBML基因构建体还包含一个或多个非编码区和启动子，其具有与SEQ ID NO：3至少70％的序列同一性或其完全互补链。

[0008] 在一些实施方案中，胚胎可以从未减数的卵细胞形成。在一些实施方案中，胚胎可以从减数的卵细胞形成。在一些实施方案中，胚胎可以从体细胞形成。

[0009] 在一些实施方案中，多倍体植物可以被转化以产生二倍体或双单倍体子代植物。在一些实施方案中，二倍体植物可以被转化以产生单倍体子代植物。在一些实施方案中，单倍体子代植物可以被进行处理以实现纯合植物的染色体加倍和生产。在一些实施方案中，可以通过培养而获得子代植物。

[0010] 在一些实施方案中，开花植物可以是单子叶植物。在一些实施方案中，开花植物可以是双子叶植物。

[0011] 在一些实施方案中，开花植物可以是草本植物或豆科植物。在一些实施方案中，草本植物可以是小米，水稻，玉米，小麦，高粱，或柳枝稷的物种。

[0012] 在一些实施方案中，开花植物可以是杂合的并且可以被转化以产生克隆的子代。在一些实施方案中，开花植物可以是杂合的并且可以被转化以产生单倍体子代。

[0013] 在一些实施方案中，本发明的方法可以被用于繁殖开花植物的一个或多个遗传性状。

[0014] 本发明还包括通过在缺乏卵细胞受精的情况下从开花植物胚珠中一个或多个配子体或孢子体细胞获得繁殖的方法而生产的植物或植物部分，该方法包括：用能够编码具有与SEQ ID NO：4多肽至少75％的序列同一性的多肽的ASGR-BBML基因构建体转化开花植物；在缺乏卵细胞受精的情况下，从转化植物胚珠中获得一个或多个配子体或孢子体细胞；以及从所述一个或多个配子体或孢子体细胞中获得子代植物，其中所述子代植物包含来自转化植物的一个或多个染色体集合，从而在缺乏卵细胞受精的情况下实现开花植物的繁殖。

[0015] 本发明还包括获得开花植物在缺乏卵细胞受精的情况下能够繁殖的方法，该方法包括：用能够编码具有与SEQ ID NO：4多肽至少85％的序列同一性的多肽的ASGR-BBML基因构建体转化开花植物，由此获得能够在缺乏卵细胞受精的情况下繁殖的开花植物。

[0016] 本发明还包括通过获得开花植物能够在缺乏卵细胞受精的情况下繁殖的方法而生产的植物或植物部分，该方法包括：用能够编码具有与SEQ ID NO：4多肽至少85％的序列同一性的多肽的ASGR-BBML基因构建体转化开花植物，由此获得能够在缺乏卵细胞受精的情况下繁殖的开花植物。

[0017] 本发明还包括在缺乏卵细胞受精的情况下产生开花植物种子的方法，该方法包括：用ASGR-BBML基因构建体转化开花植物；在缺乏卵细胞受精的情况下，从转化植物中获得一个或多个胚胎；和产生来自一个或多个胚胎的种子，所述胚胎含有一个或多个仅衍生自转化母株的染色体集合，从而在缺乏卵细胞受精的情况下从开花植物获得种子的繁殖。

[0018] 本发明还包括通过在缺乏卵细胞受精的情况下产生开花植物种子的方法而生产的种子，该方法包括：用ASGR-BBML基因构建体转化开花植物；在缺乏卵细胞受精的情况下，从转化植物胚珠中获得一个或多个配子体或孢子体细胞；和从所述一个或多个配子体或孢子体细胞中获得种子，其中所述种子包含来自转化植物的一个或多个染色体集合，从而在缺乏卵细胞受精的情况下产生开花植物的种子。

[0019] 本发明还包括能够编码具有与SEQ ID NO：4多肽至少75％的序列同一性的多肽的ASGR-BBML基因构建体，其中多肽是由ASGR-BBML基因构建体编码的，当在开花植物胚珠的一种或多种配子体或孢子体细胞中被表达时，其可以在缺乏卵细胞受精的情况下实现繁殖。在一些实施方案中，ASGR-BBML基因构建体还可以包括一个或多个非编码区和启动子，其中所述ASGR-BBML基因构建体具有与SEQ ID NO：3至少70％的序列同一性或其完全互补链。附图的简要说明

[0020] 本领域的技术人员将理解如下所述的附图是仅用于说明的目的。附图并不是意欲以任何方式限制本发明教导的范围。

[0021] 图1描述了用标记结构域的婴儿潮(BBM)，婴儿潮样(BBM-样)和无孢子生殖特异性基因组区域(ASGR)-BBM样蛋白质的一个子集的T-Coffee比对。

[0022] 图2描述了26个BBM样蛋白质的系统发育树。使用邻近法推测该进化史(N.Saitou,M.Nei,Molecular Biology and Evolution 4:406-425(1987))。使用JTT matrix-based法计算进化距离(D.T.Jones,W.R.Taylor,J.M.Thornton,Computer Applications in the Biosciences 8:275-282(1992))。显示的公共树步长是从1000次重复而推测的(J.Felsenstein,Evolution 39:783-791(1985))。对应于在低于50％>步长重复中所产生的分类的分枝倒塌。在步长测试中与相关类群聚集在一起的复制树的百分比显示在分枝附近。从每个序列对中去除所有的模糊位点。在最后的数据集中有总共1067个位点。进化分析是在MEGA6中进行的(K.Tamura et al.,Molecular Biology and Evolution 30:2725-2729(2013))。

[0023] 图3描述了在拟南芥中ASGR-BBML过表达的结果，包括如在图3A中描述的表皮毛突起的形成，如在图3B中描述的异位芽，和如在图3C中描述的鲜花。

[0024] 图4描述了在没有授粉的情况下BCs的胚胎发育。

[0025] 图5描述了使用设计为靶向ASGR-BBML的锁定核酸寡核苷酸探针，如在图5A中描述的在球形胚胎的原位杂交结果，和如在图5B和5C中描述的后期阶段的胚胎。图5A，5B和5C描述了使用反义探针的结果；图5D描述了使用对照探针的结果。

[0026] 图6描述了ASGR-BBML表达研究的结果。如图6A所示，在RNAi事件中ASGR-BBML表达的差异(S7>S4>S2>S5)是与具有多细胞胚胎的胚珠频率相关的，但是如图6B所示与每个胚珠的无孢子生殖胚囊数量是不相关的。

[0027] 图7描述了衍生自与葡萄糖苷酸酶(GUS)表达的转基因珍珠小米杂交的BC8的无融合生殖植物的清洁的胚珠。表达可见于卵细胞和幼胚中。图7A描述了具有两个单细胞胚胎的无孢子生殖胚囊。图7B描述了两个无孢子生殖胚囊，左边的是多细胞胚胎，右边的是在单细胞或双细胞阶段。

[0028] 图8描述了在性胚囊中PsASGR-BBML的表达。显示了衍生自PsASGR-BBMLpromoter-GUS品系的三个有性子代的子房(图8A-D)。图8A和图8B是聚焦于同一子房的不同平面，以显示完整助细胞(S)和极核(PN)。在开花当体的未受精性胚囊的卵细胞(E)中检测GUS的表达。有时可以检测到助细胞中较弱的GUS信号(图8C)。在成熟性胚囊的极核(PN)或反足细胞(AN)中没有检测到GUS信号。在受精三天后，在发育胚胎(EM)的细胞中检测到GUS染色，但是在发育胚乳(EN)的细胞中没有检测到(图8D)。在子房组织中没有其他的染色被识别。

[0029] 图9描述了cDNA对染色体组DNA的比对。比对序列显示在ATG起始。上行部分包含染色体组DNA序列，以及下行部分包含cDNA序列。

[0030] 图10描述了在具有极核的胚囊中胚胎形成的实例。图10A，10B，和10C描述了性发育的典型的胚囊结构，即，所有均具有反足细胞，所述反足细胞是在狼尾草(Pennisetum)中发育的无孢子生殖胚囊缺失。每个胚囊含有发育中的胚胎和未受精的中央细胞，如由持久极核所示。图10A，10B，和1OC描述了全胚囊结构。图10D，10E和10F描述了胚囊的胚胎(珠孔)末端的放大倍率。

[0031] 图11描述了在包含gPsASGR-BBML转基因性四倍体珍珠小米的子房中孤雌繁殖的胚胎发育。图像是来自开花后2天收集和固定的子房，用水杨酸甲酯清洁并且在20X光学对比下可视化。图11描述了一个衍生自非转化组织培养源的未受精的结构化成熟胚囊的对照子房。没有观察到胚胎发育。基于在胚囊孔端的胚胎样结构(EM)外观，在性转基因品系g11a(图11B)和g3f(图11C)中可以清楚看到未受精子房中的胚胎发育；极核(PN)和反足细胞(A)。图11D显示了当授粉被许可时，在开花后2天可以很容易的检测到胚乳形成(EN)。

[0032] 图12描述了在子房中gPsASGR-BBML表达的非定量RT-PCR分析。从开花当天的性(性别)和无融合生殖(apo-1，apo-2)BC8子房中和从开花后2天的品系g3f和g52子房中分离总RNA。3微克的总RNA被进行DNA酶处理，反转录并且用PsASGR-BBML特异性引物p779/80(Y.Akiyama et al,BMC Evolutionary Biology,11:289(2011))和ADF3引物pi 127/28扩增部分第一链cDNA。从一个无融合生殖的BCs植物中分离染色体组DNA样品。梯形图是HI-LO DNA标记(Minnesota Molecular,Minneapolis,MN)。标记和DNA通路源自于用于两个引物的相同凝胶，并且用RT-PCR通路合并以去除不必要的通路。

[0033] 图13描述了流式细胞仪分析以确定T0植物和子代的基因组大小。使用T0植物和g3f子代(Ti)的BD-Accuri流式细胞仪分析基因组大小的实例。图13A描述了高粱和T0品系g11a叶组织的峰分析。图13B描述了高粱和g3f子代108的峰分析。图13C描述了高粱和g3f子代101的峰分析。图13D描述了g3f子代105和107的峰分析。S2和S4分别表示高粱的2X/2C和2X/
4C峰。H2和H4分别表示具有2C和4C峰的Ti二倍体/双单倍体子代(图13C，13D)。T2和T4分别表示具有2C和4C峰的四倍体T0珍珠小米(图13A)或四倍体Ti子代(图13B，13D)。

[0034] 图14描述了种子的流式细胞仪，显示出减数子代的产生。图14A显示了基于与用作标准的高粱叶染色体组峰Sa(2n/2c)和Sb(2n/4c)相比较，来自具有染色体组峰Ma(4n/2c)和Mb(4n/4c)的未转化四倍体IA4X植物的5个种子。图14B显示了来自g3f-子代104的5个种子，其遗传了PsASGR-BBM转基因但是维持是四倍体植物。基于与用作标准的高粱叶染色体组峰Sa(2n/2c)和Sb(2n/4c)相比较，种子显示出来自受精胚胎的小米染色体组峰Ma(4n/2c)和Mb(4n/4c)伴随着来自未受精的减数胚胎的小米染色体组峰MC(2n/2c)和Md(2n/4c)。图14C显示了来自g3f-子代105的种子，其遗传了PsASGR-BBM转基因和显示出二倍体/双单倍体的染色体组大小减少。基于与用作标准的高粱叶染色体组峰Sa(2n/2c)和Sb(2n/4c)相比较，种子显示出来自未减少胚胎的小米基因组峰Mc(2n/2c)和Md(2n/4c)伴随着来自减少胚胎的小米基因组峰Me(1n/1c)和Mf(1n/2c)。

[0035] 图15描述了遗传gPsASGR-BBML转基因的珍珠小米性子代T0品系g52和g3f在子房中的孤雌繁殖的胚胎发育。在开花后2天收集和固定子房的实例，用水杨酸甲酯清洁并且在20X光学对比下可视化。图15A描述了一个衍生自非转化组织培养源的未受精的结构化成熟胚囊的对照子房。没有观察到胚胎发育。基于在胚囊孔端的胚胎样结构(EM)外观，在转基因品系g52的性子代306(图15B)和转基因品系g3f的子代105(图15C)中可以清楚看到未受精子房中的胚胎发育；极核(PN)和反足细胞(AN)。

[0036] 图16描述了在g3f子代子房中gPsASGR-BBML表达的非定量RT-PCR分析结果。在开花当天，从g3f和g3f子代的子房中分离总RNA。3微克的总RNA被进行DNA酶处理，反转录并且用PsASGR-BBML特异性引物p779/80(Y.Akiyama et al,BMC Evolutionary Biology,11:289(2011))扩增部分第一链cDNA。从一个无融合生殖的BCs植物中分离染色体组DNA样品。
梯形图是HI-LO DNA标记(Minnesota Molecular)。

[0037] 图17描述了在无融合生殖RNAi F1品系中PsASGR-BBML表达减数的半定量RT-PCR分析结果。来自开花当天的RNAi F1品系未授粉子房组织的RT-PCR产物杂交后产生的信号图像用于定量。平均3份PCR反应的信号以确定相比于对照植物(ASGR+/RNAi-)，在ASGR+/RNAi+品系上PsASGR-BBML的最终减少量。ADF3信号被用于标准化每个样品的起始RNA量。使用下列公式计算减少量：(1-(ASGR-BBML RNAi品系的平均信号/ADF3的平均信号)/(ASGR-BBML对照品系的平均信号/ADF3的平均信号))×100(表7)。

[0038] 图18描述了用于确定在对照和PsASGR-BBML的RNAi品系中胚胎细胞数的组织学观察值的一个实例。图18A描述了对照植物S7-6T10的部分和胚胎细胞计数。胚胎发育是用框架标记的。这个胚胎含有超过16个细胞。图18B描述了RNAi品系S5-5T-28的部分。在这个含有由星形表示的2个无孢子生殖胚囊的子房(卵细胞用箭头标记)中没有识别到胚胎发育。

[0039] 图19描述了解剖胚胎的流式细胞仪，显示出在携带PsASGR-BBM转基因的水稻转基a b因植物中单倍体子代的生产。图19A显示了未转化的水稻叶染色体组峰R(2n/2c)和R(2n/
4c)和未转化的高粱叶染色体组峰Sa(2n/2c)和Sb(2n/4c)。由于相同的染色体组大小，水稻峰Rb和高粱峰Sa重叠。图19B显示了包含转录活性PsASGR-BBM转基因的水稻T0品系26的5个解剖胚胎。基于与高粱叶染色体组峰Sa(2n/2c)和Sb(2n/4c)相比较，水稻品系26胚胎显示出来自受精胚胎的水稻染色体组峰Ra(2n/2c)伴随着来自未受精的减数胚胎的水稻峰Rc(1n/
1c)。图19C显示出包含转录活性PsASGR-BBM转基因的水稻T0品系34的5个解剖胚胎。基于与高粱叶染色体组峰Sa(2n/2c)和Sb(2n/4c)相比较，水稻品系34胚胎显示出来自受精胚胎的水稻染色体组峰Ra(2n/2c)伴随着来自未受精的减少胚胎的水稻峰Rc(1n/1c)。
发明详述

[0040] 除非另有说明，术语将由相关领域的普通技术人员根据常规应用而理解。

[0041] 如本文所用，术语“植物”和“植物部分”可以包括(含)，如上下文中所示，植物细胞，植物原生质体，植物可以再生的植物细胞组织培养物，植物愈伤组织，植物团块和在植物或植物部分中保持完整的植物细胞如胚胎，花粉，胚珠，种子，花，果仁，穗，穗轴，外壳，茎，根，根尖，花药等。

[0042] 术语多核苷酸可以包括术语“核酸”，“核酸序列”和“寡核苷酸”，如这些术语在本领域中的常规理解。在一个特定实例中所包括的内容将由本领域的技术人员根据上下文所示而理解，但是在没有特别的上下文限制其范围，然后该术语将被理解为具有广泛的包容性。因此，术语多核苷酸也可以包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA。因此，如该术语在本文中所预期的，具有为了稳定性或为了其他原因而修饰的主链DNA或RNA是“多核苷酸”。此外，仅举两个例子，包含稀有碱基或经修饰碱基的DNA或RNA，是如该术语在本文中所使用的多核苷酸，所述稀有碱基如肌苷，所述经修饰碱基如三苯甲基化碱基。应当理解的是，为了许多有益目的已经对DNA和RNA进行了众多类型的修饰，是本领域的技术人员已知的。本文所使用的术语多核苷酸涵盖了如多核苷酸的化学，酶或代谢修饰形式，以及病毒和细胞的DNA和RNA特性的化学形式，尤其包括简单和复杂细胞。

[0043] 如本文所使用的，术语“转基因”描述了一种包含由人类修饰的染色体组的非天然存在的植物，其中所述植物在其染色体组中包含外源性核酸分子，所述外源性核酸分子可以来自相同或不同的物种，包括非植物物种。外源核酸分子可以是基因调控要素，如启动子，增强子或其他调控要素，或者可以包含编码序列，其可以链接到天然的或异源的基因调控要素上。来自有性杂交或通过自体杂交所产生的转基因植物是这类植物的子代。

[0044] 如本文所使用的，“多态性”意味着在一个或多个个体的群体中的一种或多种核酸序列在一个或多个基因座上变体的存在。所述变体可以包括但不限于，一个或多个碱基变化，一个或多个核苷酸的插入，或一个或多个核苷酸的删除。多态性包括单核苷酸多态性(SNP)，简单序列重复(SSR)，插入缺失(插入和缺失)，限制性片段长度的多态性，单倍型和标签SNP。此外，多态性可以包括遗传标记，基因，DNA衍生序列，RNA衍生序列，启动子，基因的5'非编码区，基因的3'非编码区，微小RNA，siRNA，数量性状基因座(QTL)，卫星标记，转基因，mRNA，ds mRNA，转录模式或甲基化模式。多态性可以通过诱变而在核酸复制的随机过程产生，作为从拷贝数变体和在减数分裂过程中染色体组要素移动的结果，例如不等交换，染色体组复制和染色体断裂和融合。所述变体通常在群体内可以被发现，或者可以以低频率存在，前者通常在植物育种中具有更大效用，后者可以是与罕见但是重要的表型的变体相关。

[0045] 如本文所使用的，“标记”可以指多态性核酸序列或核酸特征。在更广泛的方面，“标记”可以是可用于区分生物之间遗传差异的可检测特性。这类特性的实例可以包括遗传标记，蛋白质组成，蛋白质含量，油组成，油含量，碳水化合物组成，碳水化合物含量，脂肪酸组成，脂肪酸含量，氨基酸组成，氨基酸含量，生物聚合物，药品，淀粉组成，淀粉含量，发酵淀粉，发酵产量，发酵效率，能量产量，次级化合物，代谢产物，形态特性和农艺特性。

[0046] 如本文所使用的，“基因型”可以指表型的遗传成分，这可以通过使用标记间接地表征或通过核酸测序而直接地表征。适宜的标记包括表型特征，代谢分布，遗传标记或一些其他类型的标记。基因型可以构建用于至少一个遗传标记基因座的一个等位基因，或用于至少一个单倍型窗口的一个单倍型。在一些实施方案中，基因型可以代表单个基因座，而在其他它可以代表一个全基因组的基因座集。在一些实施方案中，基因型可以反映染色体的一部分，整个染色体，染色体组的一部分，和整个染色体组的序列。

[0047] 如本文所使用的，“构建体”或“基因构建体”可以指多核苷酸，其编码用于基因构建体的特定基因。此类多核苷酸可以被可操作地连接到一个或多个非编码区(UTR)，和/或一个或多个转录起始调节序列/启动子调节区，其能够指导所述多核苷酸在预期的宿主细胞中的转录，例如转化植物的组织，从而调节给定基因的表达。给定基因的表达可以由所表达的基因产物或蛋白质的数量而决定，并且多种方法可以被用于检测蛋白质表达水平，包括，例如，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，Western印迹法，免疫沉淀法，和免疫荧光法等。

[0048] 根据现有技术所公开的，可以与本发明一起使用的这类基因构建体的构建是本领域技术人员所公知的。参见，例如，Sambrook et al；Molecular Cloning；A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Gelvin et al；Plant Molecular Biology Manual(1990)；Plant Biotechnology:Commercial Prospects and Problems,eds.Prakash et al；Oxford&IBH Publishing Co.；New Delhi,India；(1993)；and Heslot et al；Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts；CRC Press,Inc.,USA；(1992)。例如，植物表达载体可以包括(1)在5'和3'调节序列的转录控制下克隆的植物基因和(2)显性选择标记。这类的植物基因构建体还可能包括，如果需要的话，启动子调节区域(例如，赋予诱导型，组成型，环境或发育调节的，或细胞或组织特异性/选择性表达)，转录起始位点，核糖体结合位点，RNA加工信号，转录终止位点，和/或聚腺苷酸化信号。可以使用组成型的，组织优选的或者可诱导的启动子。例如，某些启动子是本领域技术人员所公知的能够在某些组织优先起始转录的，所述组合物如叶，根，果实，种子，或花。

[0049] 如本文所使用的，“载体”可以指任何能够进入植物细胞的核酸构建体，其包括圆形或线性核酸，和/或细菌，病毒，真菌，植物和合成的核酸，以及同源或异源核酸构建体。

[0050] 如本文所用，术语“转化”，“转化的”和“转化”可以是指将外源基因引入到植物中。用于将外源基因引入植物的许多方法是已知的，并且可以用于将核酸序列插入植物宿主中，所述转化包括生物的和物理的植物转化方案。参见，例如，Miki et al.(1993)“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants,”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,ed.Glick and Thompson(CRC Press,Inc.,Boca Raton),pages 67-88。所选择的方法可以随宿主植物而变化，并且许多这样的方法是本领域技术人员所已知的；这些方法包括化学转染法，例如磷酸钙，微生物介导的基因转移法，如农杆菌(Agrobacterium)(Horsch et al.(1985)Science227:1229-1231)，电穿孔法，显微注射法，和基因枪轰击法。表达试剂盒和载体以及用于植物细胞或组织转化和植物再生的体外培养方法是已知的和可应用的。参见，例如，Gruber et al.(1993)“Vectors for Plant Transformation,”in Methods in Plant Molecular Biology and 
Biotechnology,ed.Glick and Thompson(CRC Press,Inc.,Boca Raton),pages 89-119。

[0051] 一旦已经获得单个转化的植物，例如，用所需基因转化的植物，常规植物育种方法可以通过杂交和回交而被用于转移结构化基因和相关的调节序列。通常的，这类植物育种技术被用于将所期望的基因转移到一个特定的植物中，例如作物植物或用于商业目的的另一种类型的植物。因此，所要求保护的本发明的方法可以用于，例如，植物育种，植物改良，不稳定和/或隐性基因型的繁殖，种子生产，和性状繁殖，以及涉及植物再生的其它目的。

[0052] 如本文所使用的，在两个核酸或多肽序列的上下文中，术语“序列同一性”或“同一性”包括当在特定的比对窗口中对最大一致性比对时，两个序列中涉及的残基是相同的。当序列同一性的百分比被用于蛋白质时，人们认识到不相同的残基位置经常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被用于取代具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，并且因此不改变该分子的功能特性。当序列在保守取代不同时，序列同一性百分比可能被向上调整以校正取代的保守性质。经常的，经由这种保守取代而不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调节的方法是本领域的技术人员所公知的。通常，这涉及保守取代的得分作为部分而不是完全错配，从而增加了序列同一性百分比。因此，例如，相同的氨基酸被给予1分和非保守取代的氨基酸被给予0分，保守取代的氨基酸被给予0至1之间的分数。计算保守取代的分数，例如，在PC/GENE程序(Intelligenetics,Mountain View,Calif.)中实施。

[0053] 本领域技术人员认识到，通过在比较窗口中比较两个最佳比对序列而确定数值，其中在所述比较窗口中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即缺口)作为相比于参考序列(其不包含添加或缺失)而用于两个序列的最佳比对。计算百分比，通过确定位置的数目，所述位置数目是在相同核酸碱基或氨基酸残基出现在两个序列中以产生匹配位置的数目，用在比较窗口中总位置数目除以匹配位置的数目，并且结果乘以100以产生序列同一性的百分比。

[0054] 序列同一性/相似性的百分比是选自由50至99组成的群组中的整数。示例性的序列同一性/相似性数值包括55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％和95％。可以使用例如GAP，CLUSTALW或BLAST算法确定序列同一性，优选的是BLAST。用于这些目的的核苷酸或氨基酸序列的基本同一性通常意味着至少60％>，70％>，80％>，90％>，和95％或更高的序列同一性。

[0055] 此外，本领域技术人员将认识到，通过考虑到密码子简并，氨基酸相似性，阅读框定位等，序列同一性数值可以适当地调整以确定经由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相关同一性。“基本上类似的”多肽是共享除了残基位置之外的如上所述的序列，所述残基位置是不相同，所述多肽可以通过保守氨基酸改变而不同。核苷酸序列基本相同的另一个指示是，如果两个分子在严格条件下彼此杂交。通常的，严格条件是选择为在限定的离子强度和pH下，比用于特定序列的比热熔点(Tm)低约5℃至约20℃温度。Tm是(在限定的离子强度和pH下)50％的靶序列杂交到完全匹配的探针的温度。通常的，严格洗涤条件是其中盐浓度是在pH 7时大约0.02摩尔并且温度是至少约50，55，或60℃。然而，在严格条件下不相互杂交的核酸仍然是基本相同的，如果它们编码的多肽是基本相同的。这是可能会发生的，例如，当核酸的拷贝是使用由遗传密码允许的最大密码子简并性而产生时。两个核酸序列基本相同的一个指示是，由第一核酸编码的多肽是与由第二核酸编码的多肽免疫交叉反应的。

[0056] 对于各个库，载体，核酸等的说明，参见，例如，Stratagene Cloning Systems,Catalogs 1999(La Jolla,Calif)；和Amersham Life Sciences,Inc,Catalog'99(Arlington Heights,111.)。

[0057] 本说明书和权利要求书使用单数形式“一”，“一个”，和“该”。这些术语是旨在不排除复数的解释，并且可以优选地包括复数的解释，这取决于上下文。因此，例如，提及“一个化合物”可以包括多个这类的化合物，或几个这些相同的化合物，除非解释是有悖于使用它的上下文。

[0058] 无融合生殖是天然存在的无性生殖的发育过程，其中所产生的子代是遗传上与母株相同的，由此导致通过种子的母体植物的克隆繁殖。自然界中存在着多种形式的无融合生殖。例如，配子体无融合生殖的特征在于不完全减数分裂，其是衍生自子房的珠心细胞的非减数胚囊的形成，和是经由孤雌繁殖的，所述孤雌繁殖是未减数的卵细胞进入到胚胎发育。通过基因工程或基因渗入实现无融合生殖的能力可以对农作物具有重大经济影响，因为育种计划将有能力通过父本配子而传播无融合生殖，随后通过母体种子的克隆繁殖固定杂合基因型/活力。

[0059] 无孢子生殖是无融合生殖的一种形式，其在禾本科中是普遍的。无融合生殖的这个配子体形式的特征在于减数分裂的失败(不完全减数分裂)或由减数分裂产物的变性和来自染色体未减数的珠心细胞的胚囊发育。在这些胚囊中，未减数的卵细胞孤雌繁殖发育。因此，不完全减数分裂和孤雌繁殖是无融合生殖的两个基本的组成部分。本文所述的结果证明了在植物物种中无融合生殖的分子基础，其中所述生殖过程已经自然演变。这一发现可以被用于促进在作物植物中优良基因组合的繁殖。诱导无融合生殖性状的基因已经备受追捧了几十年。这种基因可以在植物育种中具有巨大的价值。

[0060] 目前的工作描述了在狼尾草(Pennisetum)属和蒺藜草(Cenchrus)属中无融合生殖品种；这两个属是禾本科，禾本科是栽培植物中唯一最重要的家族。其中这个家族的一个成员是珍珠小米(狼尾草藜syn(Pennisetum glaucum syn).美洲蒺藜草(Cenchrus americanus))，其是一种在半干旱热带地区具有显著产量的性二倍体粮食。狼尾草属也有许多无融合生殖的物种，其中大部分已经与珍珠小米杂交以尝试引入无融合生殖的基因；然而，迄今为止，在回交期间，雄性不育已经限制它们对无融合生殖性状传统转移的应用(Dujardin M.,Hanna W.,J.Hered.74:277-279(1983a)；Dujardin M.,Hanna W.,Crop Sci.23:156-160(1983b)；Dujardin M.,Hanna W.,Theor.Appl.Genet.69:97-100(1984)；
Dujardin M.,Hanna W.,Crop Sci.25:59-62(1985))。通过使用无融合生殖P.squamulatum(2n＝8x-56),应用传统转移已经获得了一些进展(Akiyama Y.et al,J.Hered.97:521-524(2006))，如在人工诱导四倍体珍珠小米杂交的父本(Dujardin M.,Hanna W.,J.Genet.Breed.43:145-151(1989))。

[0061] 无孢子生殖是狼尾草/蒺藜草无融合生殖的一种类型(Ozias-Akins P.et al,Funct.Integr.Genomics 3:94-104(2003))，即，一个或多个体细胞的珠心开始放大，并且每个无孢子生殖的初始核经历两次连续有丝分裂，以产生一个四核胚囊。该四个核包括卵细胞，两个助细胞，以及一个极核，或，可选地，卵细胞，一个助细胞和两个极核。为了胚乳的发育，单向的或双向的核中央细胞必须是在具假配子的物种中受精(Kojima A.,Nagato Y.,Sex.Plant Reprod.5:79-85(1992)；Naumova T.et al.,Acta Botanica Neerlandica 42:299-312(1993)；Nogler G.,Gametophytic apomixis,in:B.M.Johri(Ed.),Embryology of Angisoperms,Springer,Berlin,pp.475-518.(1984))。因此，即使雌性减数分裂可以是不规则的，存在对产生可行授粉的正常孢子的选择压力。或在无融合生殖水牛草(Cenchrus ciliaris)中央细胞单独受精略微之前或不久之后，未减数的卵细胞开始孤雌繁殖发育(Vielle J.et al.,Link.Plant J.8:309-316(1995))。

[0062] 在一个属中的物种和杂种的繁殖表型通常就可以被明确地确定，根据相对少量的清洁雌蕊(通过化学处理，其已经变成光学透明的)的筛选。狼尾草属表型也可以通过一个显著的红色的标记基因建立(Hanna W.,Burton G.,J.Heredity 83:386-388(1992))，即当存在于杂交测试的花粉父本中，将允许作为经由有性繁殖产生的红色子代的分类。

[0063] 无融合生殖的非洲狼尾草(Pennisetum squamulatum)原点在先前已经被描述(美国专利No.5,811,636)。另外，核酸标志物已经被用于识别含有目的基因的克隆(美国专利No.6,028,185)，和一些无孢子生殖基因在先前已经被描述(Huo H.“Genetic analysis of the apospory-specific genomic region(ASGR)in Pennisetum squamulatum:from mapping to candidate gene”(Doctoral dissertation)(2008).Retrieved from http://dbs.galib.uga.edu/cgi-bin/getd.cgi？userid＝galileo&serverno＝9&instcode＝ugal；Zeng Y.“Identification and characterization of apospory candidate genes in Pennisetum and Cenchrus”(Doctoral dissertation)(2008).Retrieved from http://dbs.galib.uga.edu/cgi-bin/getd.cgi？userid＝galileo&serverno＝9&instcode＝ugal))。无融合生殖是由P.squamulatum中一个物理尺寸较大的，非重组染色体区域所传送的；这个区域被称为特异性的无孢子生殖-染色体组区域(ASGR)(P.Ozias-Akins,D.Roche,W.W.Hanna,Proc Natl Acad Sci USA 95:5127-5132(1998))，和PsASGR-婴儿潮样(PsASGR-BBML)基因位于此区域(G.Gualtieri et al.,Plant Physiology 140:963-971(2006))。

[0064] 经由在回交群体中进行RAPD，RFLP，AFLP和SCAR标记和经由P.squamulatum(作为父本)与性珍珠小米之间的伪测交，狼尾草的无融合生殖已经被分子化测绘图像(Dujardin M.,Hanna W.,J.Genet.Breed.43:145-151(1989)；Goel S.et al,Genetics 163:1069-1082(2003)；Ozias-Akins P.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:5127-5132(1998)；
Ozias-Akins P.et al.,.Theor.Appl.Genet.85:632-638(1993))。经测定，来自所述无融合生殖父本的单个连接基团是必需的和足以用于无融合生殖的传送，和一个单个的完整的染色体已经被传送到BC8子代中，其中其已经被发现驻留在四倍体珍珠小米背景中(Singh et al,Crop Sci.50:892-902(2011))。在第二个物种的图像中，即C.ciliaris，已经产生了相似的结果(Jessup R.et al,Crop Sci.42:1688-1694(2002)；Roche D.et al,Plant J.19:203-208(1999))。在这两个物种中，高分辨率图像被一个非重组染色体块所阻止，虽然通过重组到～1/4染色体或～50Mb，ASGR的尺寸已经被减少。纤毛狼尾草的重组最近已经恢复，其演示不完全减数分裂和孤雌繁殖的分离(Conner et al,Planta 238:51-63(2013))。该重组保留了无孢子生殖胚囊形成所需的ASGR部分；然而，孤雌繁殖所必需的ASGR部分被丢失。纤毛狼尾草和P.squamulatum之间ASGR比较显示出在宏观共线性和微观共线性级别上的保护(Goel S.et al,Genetics 173:389-400(2006)；Gualtieri G.et al,Plant Physiol 140 963-971(2006))。

[0065] 映射到ASGR的细菌人工染色体克隆的DNA序列分析(Roche D.et al,Theor.Appl.Genet.104:804-812(2002))已经进行以搜索水稻和正在研究的两个无融合生殖物种之间的同线性。微观共线性的小区域被确定，而没有建立宏观共线性，25个C.ciliaris和23个P.squamulatum ASGR基因被识别(Conner J.et al,Plant 
Physiol.147:1396-141 1(2008))，定序数据显示整体ASGR是基因贫乏的和转座子丰富的地区。在ASGR测序数据中的高丰度长末端重复(LTR)序列的识别已经允许序列特异性扩增多态性(SSAP)的发育标记物，其已经被用于有效地靶向ASGR(Huo H.et al.,
Theor.Appl.Genet.119:199-212(2009))。

[0066] 如本文所述，在非洲狼尾草(L.)R.Br.中，无融合生殖已经被发现分离为单个显性基因座，即ASGR，其中包含PsASGR-BBML基因的多个拷贝。本研究调查在性四倍体珍珠小米和无融合生殖Fi植物中PsASGR-BBML的功能。PsASGRBBML被发现在受精之前在卵子细胞中被表达，并且在性珍珠小米中PsASGR-BBML的表达被发现诱导孤雌繁殖和生产单倍体子代。遗传了PsASGR-BBML沉默结构的无融合生殖Fi转基因植物中，减数的PsASGR-BBML表达被发现与更少的孤雌繁殖胚胎和孤雌繁殖胚胎中细胞数量相对应。这些数据证明了在无融合生殖途径中PsASGR-BBML基因在孤雌繁殖中的关键作用。

[0067] 本文中所述的结果描述了在两个无融合生殖物种中紧密联系的ASGR细菌人工染色体(BAC)载体中发现的基因，但在缺乏孤雌繁殖的重组C.ciliaris植物中丢失；这种基因具有与Brassica napus的婴儿潮(BBM)基因相似的高蛋白质。BBM最初被创造作为用于cDNA转录物的基因命名，其经由体细胞胚胎发生而在Brassica napus(BnBBM)的小孢子培养物中被诱导(Boutilier K.et al.,Plant Cell 14:1737-1749(2002))。BnBBMl和BnBBM2预测的蛋白质是98％的彼此相似，并且85％的类似于它们的拟南芥同源物。

[0068] 这三种蛋白质具有AP2结构域区域的重要特征。AP2结构域，被命名为拟南芥的APETALA2基因中识别的氨基酸重复(Jofuku K.et al,Plant Cell 6:121 1-1225(1994))，一个花发育基因，其也被显示参与调节其他花卉同源异型基因，是60-70个氨基酸的DNA结合结构域(Pfam-PF00847)。这些AP2结构域具有转录因子蛋白质大家族的特性，由于在这个保守区域中它们的相似性，其不但在BBM中而且在这个类的其他相关发育基因中是高度保守的。

[0069] 该APETALA 2/乙烯反应因子(AP2/ERF)的DNA结合结构域家族已经在植物的广泛群组中被识别，如苔藓，藻类，裸子植物和被子植物。AP2的基因家族分为两个分组，即ERF样组(乙烯反应要素结合因子)和AP2样组(Weigel D.Plant Cell 7:388-389(1995)；Ohme-Takagi M.and Shinshi H.Plant Cell 7:173-182(1995)；Okamuro J.et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences 94:7076-7081(1997))。ERF样组的特征是仅具有单个AP2结构域；在该组中，功能往往与应激反应(生物和非生物)相关(Riechmann J.and Meyerowitz E.,Biol.Chem.379:633-646(1998))。AP2样组含有两个AP2结构域(repeat 1和2)，其具有彼此相似性和一个短的域间连接体区域；这个组可以进一步被分为两组，即eu-AP2(其包括APETELA2)和ANT(用于AINTEGUMENTA)谱系。ANT谱系本身可以被划分为basalANT和euANT谱系，其中包含特异性基序euANTl thur4(S.Kim,P.S.Soltis,K.Wall,D.E.Soltis,Mol.Biol.Evol.23:107-120(2006))，其中包含PLETHORA样，AINTEGUMENTA样，AINTEGUMENTA-样1，AINTEGUMENTA-样5和BBM样的亚组。这些亚组中的蛋白质具有在分生组织维护，细胞增殖，器官的萌发和生长，胚胎发生，和根形成的关键作用(A.Horstman,V.Willemsen,K Boutilier,R.Heidstra,Trends in Plant Science 19:146-157(2014))。除了根部之外，所述ANT谱系是珠被启动和雌性配子体发育以及其他原基早期生长所需的(Elliott R.et al,Plant Cell 8:155-168(1996)；Klucher K.et al,The Plant Cell 8:137-153(1996))。ANT,AtBBM,and BnBBM基因落入到ANT进化枝范围内(Kim S.et al.,Mol.Biol.Evol.23:107-120(2006))。

[0070] 来自玉米的被称为ODP2的一个BBM样基因在先前已经被描述(国际专利NO.WO2005075655；美国专利No.8,420,893)。但是，无融合生殖特异性BBM与来自玉米AP2结构域之外的BBM基因显著不同。BBM，BBM样，和ASGR-BBM样蛋白质共享保守的BBM-1结构域，所述结构域没有在euANT谱系的其他成员中被识别。BBM-1结构域的缺失已经消除了转基因植物诱导子叶体细胞胚胎发生的能力(S.El Ouakfaoui et al,Plant Mol Biol 74:313-326(2010))。公开的BBM样蛋白质的系统发育研究(S.El Ouakfaoui et al,Plant Mol Biol 74:313-326(2010))被扩展到包括新测序的单子叶植物BBM样蛋白质。来自Oryza sativa的不同进化枝中的蛋白质，包括ASGRBBMs，BBM1(Os1lgl9060)以及来自Setaria italica和Panicum virgatum的蛋白质被发现在构建的成熟系统发育树中形成(图2)。在此进化枝中，相比于PsASGR-BBML，除了PsASGR-BBML之外，在这个进化枝中没有关于这些基因的功能研究已经被报道，虽然在NCBI的UniGene数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene)和水稻寡核苷酸阵列数据库(http://www.ricearray.org/expression/expression.php)中包含BBM1的有限表达数据。

[0071] 虽然BBM基因在受精之前已经在性物种的胚珠中被表达，没有观测到胚胎发育，也没有观测到无融合生殖的表型。在诱导后3-4天，已经在小孢子中观察到BnBBM的表达(在它们注定要成为胚胎发生的时间)，并且在整个测试时间段内持续(诱导后28天)(Boutilier K.et al,Plant Cell 14:1737-1749(2002)；Malik M.et al,Plant Physiology 144:134-154(2007))。BnBBM表达，通过RT-PCR检测，也已经在3日龄种子/球形胚中被观察到，并且表达被发现持续在整个胚胎发育中(Malik M.et al,Plant Physiology 144:134-154(2007))。BnBBM和BnLECl(LEAFY COTYLEDON 1)，所述表达主要发生在小孢子和合子胚胎发育过程中，被认为是对胚胎发育的标记。BBM也被发现在拟南芥胚珠的游离核胚乳中是可以被检测的，通过原位杂交而确立(Boutilier K.et al,Plant Cell 14:1737-1749(2002))。
虽然发现一旦细胞化起始，在胚乳中的表达下降，迄今为止还没有在胚珠内卵细胞或受精卵细胞中BBM表达的公开证据。BnBBM最初被认为是提供在种子中不定胚生殖诱导的路径，因此母系衍生的胚胎为无融合生殖的一种形式(美国专利No.7,151,170)。在不定胚生殖中，在胚囊中的发育没有发生改变；相反，胚珠体细胞，通常是珠心，直接分裂以形成胚胎。
因此不定胚生殖是孢子体无融合生殖。

[0072] 虽然AP2区域的ASGR-BBML和BnBBM之间的氨基酸相似性是高的(96％)，这个区域外的相似性显著降低(上游35％的相似性和下游27％的相似性)。迄今为止，PsASGR-BBML的三种高度保守的染色体组重复已经从ASGR链接的BACs p203，p207(J.A.Conner et al,Plant Physiol 147:1396-411(2008))，和p208被识别。p208PsASGR-BBML序列是与p207PsASGR-BBML2序列同一的(EU559277.1)，具有内含子1中发现的AT重复数目的表达(11vs.17)。基因序列的保守性意味着还不清楚PsASGR-BBML染色体组区域的转录。所述PsASGR-BBML转录物编码了衍生自8个外显子拼接的545个氨基酸蛋白质，一个73bp的5'非编码区以及多个3'非编码区，具有从30到258碱基对范围的长度。所述PsASGR-BBML基因含有两个AP2的DNA结合结构域，因此被预测为具有转录因子的功能(图1)。ASGR-BBML的两个ASGR链接副本也已经发现存在于无融合生殖水牛草中(J.A.Conner et al,Plant Physiol 147:1396-411(2008))，这两者是被转录的。CcASGR-BBM-样l包含了几乎与PsASGR-BBML相同的一个完整的开放阅读框，而CcASGR-BBM样2包含了两个无义突变，其中第一个定位于第一个AP2结构域内。两个相关的但是ASGR-未链接的BBML(non-ASGR-BBML)基因也已经被从C.ciliaris中分离，和直系同源已经被发现存在于P.squamulatum中。关于水稻的先前的比较研究表明，ASGR-BBML是与水稻基因Os11gl9060最密切相关的一个BBM基因(Conner J.et ah,Plant Physiol.147:1396-1411(2008))，迄今为止没有功能已经被识别；表达已经在种子中被证明(授粉后5天)和在胚胎中被证明(授粉后25天)，但没有在雌蕊中被证明(参见http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/ORFinfopage.cgi？orf＝LOC_Osllgl9060)。此外，ASGR-BBML在8个无融合生殖中是保守的，但是在测试的7个性狼尾草物种中不存在(Akiyama Y.et al,BMC Evol.Biol.11:289(2011))。

[0073] 由于ASGR-BBM-样(ASGR-BBML)基因与BBM的蛋白相似性，它被评价为其用作一个“无融合生殖的”基因。如本文所述，ASGR-BBML基因被识别，并且其在孤雌繁殖中的作用被表征。ASGR-BBML被发现在无融合生殖途径中作为孤雌繁殖诱导的关键基因中具有重要作用。

[0074] 这些结果表明ASGR-BBML可以被用于在植物中实现孤雌繁殖，其通常不显示这个表型。该种子组的转化品系是低的，而且植物子代可以筛选倍性水平。孤雌转基因品系可以由此产生子代，其被减少到二倍体水平(或在细胞周期范围内的单倍体)。因为单倍体诱导随后染色体加倍是随后在许多谷类作物中的育种实践以便于更迅速地获得纯合系，通过在卵细胞中依赖于染色体非减数分裂的无融合生殖途径，这些发现可以用于在有性植物或克隆繁殖的单倍体诱导。

[0075] 已经详细地描述了本发明，显而易见的是，不脱离在所附的权利要求限定的本发明的范围的修改，变体和等价实施方案是可能的。此外，应该认识到，在本发明所公开的所有实施例是作为非限制性实例提供的。实施例

[0076] 提供下述非限制性实施例以进一步说明本文所公开的本发明的实施方案。本领域的技术人员应当预期的是，在以下实施例中公开的技术方案已经被发现在本发明的实施中起到很好的作用，并且因此可以被认为构成用于其实施的实例模式。然而，根据本发明的公开内容，本领域的技术人员应该理解，许多变化可以在具体实施方案中进行，其被公开并且仍然获得相同或类似的结果而不脱离本发明的精神和范围。实施例1
材料和方法
DNA提取

[0077] 使用溴化十六烷基三甲铵(CTAB)方案完成DNA提取(J.Conner,G.Gunawan,P.Ozias-Akins,Planta 238:51-63(2013))。PCR扩增

[0078] 基于引物重组和扩增长度需要不同的PCR条件。所有未公开扩增子的引物和PCR信息出现在表1中。根据制造商的说明实施PCR反应，除非另有说明。反应在GeneAmp 9700热循环仪中实施(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)。ASGR-BBML组织表达的非定量RT-PCR

[0079] 使用从各种组织分离的RNA，经由RT-PCR证实ASGR-BBML的表达，包括以下：开花前1天，通过种子发育，和最多开花后5天而分离的子房；在开花前第1天的花药；从温室种植的盆栽植物所收集的根尖；新生的叶组织；和衍生自无融合生殖狼尾草BCg品系的胚性愈伤组织(M.Singh et al,Crop Science 50:892-902(2010))。总RNA经由RNeasy植物小型试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA,USA)从各种组织中提取总RNA，并且进行DNA酶处理(Invitrogen，Carlsbad，USA)。通过寡聚-dT和SuperScriptlll(Invitrogen)，3至5微克的总RNA被用于第一链cDNA的合成。2μL的第一链cDNA合成反应物被用于使用ASGR-BBML特异性引物p779/80的PCR扩增(Y.Akiyama et al,BMC Evolutionary Biology,11:289(2011))，或被用作对照的肌动蛋白解聚因子3(ADF3)的引物pi 127/1128的PCR扩增。PCR产物在1.25％的琼脂糖凝胶上运行，用溴化乙锭染色，并且用分子成像仪Gel DocXR系统(Bio-Rad Laboratories,Hercules，CA，USA)成像。
PsASGR-BBML的cDNA末端(RACE)快速扩增

[0080] 经由GeneRacer RLM-RACE试剂盒(Invitrogen)，生成PsASGR-BBML的5'和3'非编码区的RACE产物，并且从无融合生殖BC7品系58的小穗组织中提取总RNA(M.Singh et al,Crop Science 50:892-902(2010))。所使用的PCR引物列在表1中。用QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN)凝胶纯化扩增的PCR产物，并且克隆到PCR4-TOPO(Invitrogen)载体或pGEM-T easy(Promega，Madison，WI，USA)载体中。使用CEQ 8000遗传分析系统(Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)进行核苷酸测序，并且用载体NTI(Invitrogen)处理序列。PsASGR-BBML转基因的序列分析

[0081] 在开花当天，为了g3f子代从子房中提取总RNA，即105，123，144和159。3微克RNA进行DNA酶处理(Invitrogen)和使用寡-dT和SuperScriptlll(Invitrogen)用于第一链cDNA合成中。经由转基因特异性引物pl792/pl801和p2347/p423，2μL的第一链cDNA合成反应物被用于PCR扩增。用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)凝胶纯化扩增的PCR产物，并且克隆到PCR4-TOPO(Invitrogen)中。在实验室中为了基因组学与生物信息学而实施核苷酸测序(University of Georgia，Athens，GA)。去除载体和质量差的序列，然后使用Geneious Pro5.6.6(Biomatters Limited，Auckland，New Zealand)组装修剪的序列。转化构建体

[0082] 构建PsASGR-BBMpromoter-GUS。用BamHI/NcoI消化pCambia3301以除去CaMV 35S启动子，其被一个2,074bp的PCR产生的BamHI/NcoI位PsASGR-BBML启动子片段所替代，所述PsASGR-BBML启动子是使用引物p690和p692而从BAC p208扩增的(D.Roche et al.Theor Appl Genet.,104:804-812(2002))。该BamRl位点是内源性的启动子，并且正好定位于p690的下游。一个Ncol位点被掺入到p692中。通过用BamHI/BseYl的消化作用去除，钝化pCambia3301的PsASGR-BBMLpromoter-GUS-NospolyA基因盒，然后被放入到pACH20的一个钝化的和去磷酸化HindIII位点中(A.H.Christensen,P.H.Quail,Transgenic Research,5:213-218(1996))以创建质粒2BE。

[0083] 构建gPsASGR-BBML。该pBluescript载体被装配为2,074bp的PsASGRBBML启动子，3540bp的8个外显子，来自BAC p208的PsASGR-BBML编码区的7个内显子(D.Roche et al.Theor Appl Genet,104:804-812(2002))和609bp的3'终止密码子，包括预测的多聚(A)信号。

[0084] 构建RNAi-BBM-3p。二元表达载体pMCG161(http://www.chromdb.org)用于RNAi载体构建。经由引物p966和p967，生成一个425bp的扩增子，所述扩增子覆盖52％的PsASGRBBML的最后外显子和掺入用于克隆到pMCG161的限制酶，并且被插入pMCG161中，根据下面的可用说明http://www.chromdb.org。

[0085] 构建Ubi-Hygro。用HindllVBamRl消化pCB13(H.Yang et al,Plant Cell Reports,17:693-699(1998))以除去CaMV 35S启动子和用来自pAHC20的HindIII/BamHI玉米泛素(Ubi-1)启动子片段替换(A.H.Christensen,P.H.Quail,Transgenic Research,5:213-218(1996))。
植物转化

[0086] 按照先前的方案，由四倍体性IA4X植物的7-10日龄幼胚产生的胚性愈伤组织被轰击，选择(25毫克/升潮霉素B或15毫克/升草丁膦)和再生(J.J.Goldman,W.W.Hanna,G.Fleming,P.Ozias-Akins,Plant Cell Rep.,21:999-1009(2003))。用质粒2BE和p524EGFP.1的混合物轰击PsASGR-BBMpromoter-GUS品系(G.H.Fleming,O.Olivares-Fuster,S.Del-Bosco,J.W.Grosser,In Vitro Cell Dev Biol Plant 36:450-455(2000))，用质粒gPsASGR-BBML，p524EGFP.1和Ubi-Hygro的混合物轰击gPsASGR-BBML品系，和用质粒RNAi-BBM-3p轰击RNAi品系。胚挽救

[0087] 用于胚挽救的培养基是基于在5DAP用于狼毒草合子胚的先前工作(C.Nitsch et al.,“Production of haploid plants of Zea mays and Pennisetum through androgenesis.”Variability in plants regenerated from tissue culture.Praeger,New York(1982):69-91)和使用IX NITSCH&NITSCH基础培养基重量/维生素(PhytoTechnology Laboratories,Shawnee Mission,KS)，1％蔗糖，赤霉酸(1毫克/升)，吲哚乙酸(0.03毫克/升)，0.75％琼脂，pH 5.8的0.2％>植物防腐剂混合物(PPM)(Plant Cell Technology,Inc.,Washington,DC)。根据先前的方案，发育(授粉后10-15天)和成熟的种子进行灭菌(J.J.Goldman,W.W.Hanna,G.Fleming,P.Ozias-Akins,Plant Cell Rep.,21:
999-1009(2003))。手术切除胚胎，盾片侧朝上放置在培养基上，并且监测根和枝条的伸长。
胚胎被放置在GA/IAA培养基上最多10天，然后弃去如果没有根/枝条生长发生。根和枝条生长的子代被转移到一个IXMurashige&Skoog(MS)培养基中重量/维生素(PhytoTechnology Laboratories)，所述培养基补充有3％蔗糖，0.75％琼脂，pH5.8的PPM直到生长允许硬化和移动到温室中。
用于PsASGR BBMpromoter-GUS品系X-Gluc染色的β葡萄糖醛酸酶活性

[0088] 基于使用转基因特异性引物，即p2354/p2355；p2349/p2350；和p2885/p2886而过量的PCR扩增，产生含有全长转基因的8个独立的PsASGR BBMpromoter-GUS品系(表1)。所述PsASGR BBMpromoter-GUS的To品系是或允许自花授粉或呈现与无融合生殖BCg-品系63花粉的交叉授粉。5个品系的种子发芽，然后如果是杂交的话则进行ASGR遗传的基因分型和PsASGR BBMpromoter-GUS转基因。最初，从开花前一天解剖的子房或在柱头外露之前在开花当天从包裹的头部，检查PsASGR BBMpromoter-GUS基因的表达模式；在开花之前，机械方式移除柱头。

[0089] 新的PsASGR BBMpromoter-GUS植物发芽和被分离到单个温室中以便于进一步控制意外授粉。在花粉散落之前持续削减所有的头部以便于保持温室中小米花粉的游离。在开花前一天收集小花，用手工除去花药。删割的小花然后被置于IX MS培养基上，0.75％琼脂，pH 5.8的含有0.2％>PPM以及在27℃下在长日照光条件的生长室中孵育24小时。解剖子房并且在X-Gluc反应溶液(100mM磷酸钠/pH 7.0，10mMEDTA，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mM铁氰化钾，0.1％的Triton X-100和1mM 5-溴-4-氯-3-P-D-葡糖苷酸)中在37℃下孵育48小时。X-Gluc-染色子房在室温下分别在15，30和50％>乙醇中脱水1小时，然后固定在FAA(50％乙醇，3.7％甲醛，和5％乙酸)上过夜。FAA-固定的子房在室温下分别在70，85，90，100，和
100％的乙醇中进一步脱水1小时，然后通过一系列乙醇：水杨酸甲酯溶液(3：1，1：1和1：3，每个1小时)清洁脱水的子房。清洁的子房储存在100％的水杨酸甲酯中1小时。使用Axioskop 2plus显微镜，AxioCam照相机和AxioVision软件4.8(Zeiss，Thornwood，NY)获得的子房相衬图像。
gPsASGR BBML/Ubi Hvgo转基因品系的基因分型

[0090] 基于分别使用pl800/01和p297/298的PCR扩增结果，恢复含有gPsASGR_BBML和Ubi_Hygo构建体的9个独立株。流式细胞仪

[0091] 在BD Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences，Sun Jose，CA USA)或Partec倍性分析仪(Partec，Munster，Germany)上运行以处理样品。该过程涉及切碎的高粱(对照)和样品(未知)的幼叶组织与1000μL的Tris-氯化镁的核提取缓冲液(0.2M的Tris-HCl，pH7.5，4mM氯化镁x6H20，0.5％的Triton X-100)混合，并且该混合物通过一个30μm的CellTrics一次性过滤器(Partec)。500μL的RNA酶/碘化丙啶溶液(BD Biosciences)加入到过滤的样品中，然后在冰上孵育15分钟。对于BD Accuri C6流式细胞仪分析，通过对象的选择而设置选通，其表现出使用每分钟14μL样品流速在FL2和FL3信号之间有很强的相关性。在选通区域内收集每个样品至少3000个事件。在Partec倍性分析仪上运行样品直到可以明确的看到峰。基于G1和G2样品峰相对于高粱对照G1和G2峰，确定倍性水平。
根尖染色体计数

[0092] 如果可用，从g3f子代收获6个健康的根尖，清除土壤，放置在含有300μL dH2O的Eppendorf管中，用一氧化二氮在150磅下处理2个半小时，最后固定在新鲜的乙醇：乙酸(3：1)中至少2天。根的分生组织区域在含有0.3％纤维素RS(Karlan Research，Torrance，CA)，
0.3％>果胶酶Y23(Karlan Research)和0.3％>N,N-二丁基苯胺(Sigma-Aldrich,St.Louis)的pH 4.5的30mM柠檬酸盐缓冲液中，在37℃下孵育60-90分钟。酶消化之后，来自每个植株的至少3个根尖分别在载玻片上扩散。定位染色体扩散，数字化拍照，然后使用Adobe Photoshop CS6计数染色体数目。使用源自至少2个载玻片的最少4个扩散测定每个植物的倍性水平。
RNAi筛选

[0093] 基于分别使用以下引物：p992/p993，pl222/pl223和pl224/p1125的BAR基因和RNAi正义和反义插入的PCR扩增，含有RNAi_BBM_3p构建体的16个独立的性四倍体IA4X品系被恢复。8个品系与P.squamulatum花粉进行杂交，因此产生Fi子代。用P.squamulatum特定引物pl032/1035，RNAi_BBM_3p引物p992/p993，pl222/pl223和pl224/p1125以及ASGR特异性引物Ugtl97筛选来自每个品系的Fi子代植物(P.Ozias-Akins,D.Roche,W.W.Hanna,Proc Natl Acad Sci USA 95:5127-5132(1998))。使用来自叶组织和衍生自转基因的章鱼碱合酶终止子区域的引物pl226/pl227的总RNA的RT-PCR分析，ASGR+/RNAi+和ASGR-/RNAi+植物随后测试RNAi转基因的表达。来自5个品系的25个植物被选择用于进一步分析；这些包括14个ASGR+/RNAi+，5个ASGR+/RNAi-和6个ASGR-/RNAi+植物。PsASGR-BBML表达的半定量分析

[0094] PsASGR-BBML的半定量RT-PCR定量是基于一个先前的方案(E.Albertini et al,Plant Molecular Biology 56:879-894(2004))。ADF3引物pi 127/1128被用作内部对照，伴随着PsASGR-BBML特异性引物，即p779/p780(Y.Akiyama et al,BMC Evolutionary Biology,11:289(2011))。经由RNeasy植物小试剂盒(QIAGEN)，每个试验中使用3.3微克在开花当天从子房中提取的总RNA，和使用DNA酶(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)处理样品而用于使用寡脱氧胸苷和SuperScriptlll(Invitrogen)的第一链cDNA合成。在所有的PCR反应中使用2μL的cDNA合成反应物；所有的反应一式三份运行。凭经验确定ADF3和PsASGR-BBML的PCR循环数被发现分别是26和40个循环。用Storm phosphorimager(Amersham Biosciences,Pittsburgh,PA,USA)进行杂交成像，并且按照制造商的说明使用ImageQuant 5.0版(AmershamBiosciences)定量条带。
在RNAi品系中胚胎发育的组织学分析

[0095] 在柱头外露之前包裹头部，在开花之前除去柱头以防止授粉。开花后2天从头部收集小穗，固定在FAA上，然后在室温下固定24小时之前，在15毫米汞柱下真空处理30分钟。起初用TBA1(40％乙醇，10％叔丁醇(TBA)，50％蒸馏水)脱水2小时，然后转移到TBA2(50％乙醇，20％的TBA，30％蒸馏水)中8小时，TBA3(50％乙醇，35％的TBA，15％蒸馏水)1小时，TBA4(45％乙醇，55％的TBA)1小时，TBA5(25％乙醇，75％的TBA)1小时，和TBA6(100％的TBA)1小时。然后子房被转移至新鲜100％的TBA中8小时，转移到TBA：石蜡油(Fisher,Pittsburgh,PA,USA)中在58℃下(1：1)过夜。在嵌入之前，子房通过纯Paraplast X-tra的三个转变(Fisher,Pittsburgh,PA)，每个48小时。然后所有样品以9μm进行切片。使用修改的先前描述方案(Jensen 1962)，用番红O/快绿进行样品染色，其中嵌入并切片的样品在乙醇中脱蜡，再在醚-醇(50％乙醚，50％乙醇)中用0.05％>硝化纤维素(用火棉胶稀释，Fisher,Pittsburgh,PA)包裹30秒。通过70％>乙醇，30％>乙醇和蒸馏水转移而完成样品的再水化，每次转移5分钟。首先用番红O溶液(4g番红O，100ml蒸馏水，100ml95％的乙醇，4g醋酸钠)染色5分钟。然后在以下系列溶液对样品进行脱水，每次5分钟：蒸馏水更换两次，50％>乙醇，95％乙醇，100％乙醇。随后样品被快绿溶液(1g快绿，100ml 100％的乙醇，100ml溶纤剂和
100ml丁香油)染色4秒钟，然后立即放入纯丁香油10秒，迅速被转移到清洁混合物(50％>丁香油，25％乙醇，25％脱蜡剂)中。切片最终在脱蜡剂中被清洁5分钟，然后嵌入装配。
Phylo遗传分析

[0096] 从NCBI下载在BBM状进化枝中发现的蛋白质(S.El Ouakfaoui et al.,Plant Mol Biol 74:313-326(2010))。然后使用BLASTP和PsASGR-BBML完整蛋白在Phytozome草分枝的每个成员中搜索。下载与延伸超越AP2结构域的PsASGR-BBML相似的所有蛋白质，而截短蛋白和那些没有BBM-1结构域(S.El Ouakfaoui et al.,Plant Mol Biol 74:313-326(2010))被除去。使用的phytozome目标数据库是高粱1.4蛋白质组，玉米蛋白质组，小米蛋白质组，柳枝稷vO.O蛋白质组，水稻蛋白质组和二穗短柄草蛋白质组。被发现与BBM样进化枝(S.El Ouakfaoui et al,Plant Mol Biol 74:313-326(2010))之间相同的蛋白质和Phytozome被除去。使用网络基于比对程序比对26个氨基酸序列；结果是，T-Coffee(http://tcoffee.erg.cat/apps/tcoffee/do.regular)和Mafft(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server)比对确定BBM状分枝中最保守的结构域，特别是在未编辑的蛋白质的C末端。T-Coffee比对产生了对所有蛋白的一个具有283个保守位点的1,067个氨基酸共有序列长度(图1)。使用E-INS-I命令，Mafft比对产生了对所有蛋白的一个具有264个保守位点的1,040个氨基酸共有长度。经由MEGA6软件((K.Tamura et al,Molecular Biology and Evolution 30:2725-2729(2013)))，T-Coffee比对被用于创建系统发育树(P.Di Tommaso et al,Nucl.Acids Res.39(suppl 2):W13-W17(2011))(图2)。表1.引物和PCR条件
iProof(Bio-Rad实验室)
JumpStart Taq DNA聚合酶(Sigma)
Takara ExTaq Hot Start，Primestar GXL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶(Clonetch Laboratories，Inc，Mountain View，CA)
实施例2
在拟南芥中ASGR-BBML的过度表达

[0097] 通过5'和3'RACE识别来自P.squamulatum的全长ASGR-BBML cDNA。该cDNA被发现使用CaMV35S启动子在拟南芥中被过表达，过表达的多效性作用如异位枝条，带毛状突起，和不完整的花的形成(图3A-C)。在这些品系中发现繁殖力受损，并且观察到转基因的偏态分离。当过表达是在诱导型启动子的控制下时，ASGR-BBML过表达的表型是更容易被理解的。实施例3
在P.SQUAMULATUM，C.CILIARIS和无融合生殖回交中ASGR-BBML的表达

[0098] 用ASGR-BBML基因构建体的染色体组拷贝转化性四倍体珍珠小米，发现在没有相应胚乳受精时诱导胚胎在减数分裂衍生胚囊中形成，所述染色体组拷贝包括一个启动子和3'非编码区。通过之前的在柱头外露之前通过包裹头部以及随后在再次外露之前除去柱头/花柱而预防受精，具有作为胚珠缺乏受精的证据，所述胚珠是在中央细胞的二极核中持续和缺少胚乳形成。在开花前1天起始和持续到早期种子发育的子房中，以及在开花前1天的花药和根部中，通过RT-PCR在两种无融合生殖物种(P.squamulatum和C.ciliaris)和在无融合生殖狼尾草回交7个和8个品系内事先观察到ASGR-BBML的表达(M.Singh et al,Crop Science 50:892-902(2010))。

[0099] PsASGR-BBML被发现在衍生自无融合生殖狼尾草BC8品系的胚性愈伤组织中被表达。在无融合生殖的物种和无融合生殖回交中，在花粉脱落之前，在无孢子生殖胚囊中胚胎发育可以起始，在花粉脱落后持续数天，当授粉被预防和无胚乳形成时(图4)。虽然球状和后期胚胎表现出良好的信号，在生殖组织中ASGR-BBML基因表达的低水平导致对胚胎发育早期阶段的原位杂交实验无效RNA(图5A-D)。因此，使用RT-PCR检测表达。

[0100] 在花粉脱落当天和最多花粉脱落后两天之前，为了ASGR-BBML转录和胚胎发育而检测未授粉雌蕊；授粉是通过除去柱头而防止的。证实了ASGR-BBML基因的表达与无融合生殖P.squamulatum和C.ciliaris中未减数的卵细胞的孤雌繁殖发育相关联；即，在花药开裂和花粉脱落之前，通过去除柱头确保缺乏授粉的情况下检测所述表达(图6中的DAP0)。来自P.squamulatum和C.ciliaris的花药，花粉，根显示出ASGR-BBML表达，但是柱头和叶组织没有；然而，在叶中的表达被证明是无融合生殖狼尾草BC7和BCS品系。第二胚胎表达基因表达的时间模式(通过半定量RT-PCR)，即LEC，并且在C.ciliaris中识别的非-ASGR-BBML基因相比于ASGR-BBML有轻微的延迟。AtBBM已经显示出上调其自身的表达，但不能直接调节LEC的表达(Passarinho P.et al,Plant Mol.Biol.68:225-237(2008))。因此，非-ASGR-BBML基因可以是ASGR-BBML的靶点。实施例4
敲减ASGR-BBML的表达

[0101] 通过基因枪法，用一个反向重复(IR)构建体中ASGR-BBML编码区的一部分转化四倍体珍珠小米，并且用草丁膦筛选。IR的转录通过CaMV 35S启动子进行。同源-依赖性基因沉默取决于发夹RNA的形成和RNA干扰的触发，其中内源基因正义转录是靶向降解的(Ossowski S.et al.,Plant Journal 53:674-690(2008)；Eamens A.et al.,Plant Physiology 147:456-468(2008))。根据Southern印迹杂交，ASGR-BBMLIR没有表现出与珍珠小米显著的同源性。

[0102] 通过四倍体IA4X转化产生RNAi品系，但是没有预期RNAi的表型直到IR通过杂交与ASGR组合。IA4X RNAi品系与P.squamulatum的杂交产生了具有两者组合基因的子代，和然后筛选转基因的转录，ASGR-BBML转录的变化，和在生殖发育的变化。通过半定量RT-PCR测定ASGR-BBML转录在几个子代事件中的变化，如下：ASGR-BBML信号的减少(图6A)与减少的早熟胚的发育(图6B)相关联以及事件S7>S4>S2>S5。分析含有该基因不同部分的基因敲减少品系作为在水稻肌动蛋白1启动子控制下的反向重复表达时，进行类似的观察。

[0103] 由于从这些实验中没有实现完全的敲减，这些数据没有使ASGR-BBML表达与胚胎发育的程度与因果关系(ASGR-BBML表达负责胚胎诱导)相关联；因此，进行另外的实验以测试ASGR-BBML在孤雌繁殖中的作用。这些由以下步骤组成：1)用β-葡萄糖苷酸酶(GUS)作为报告基因转化性珍珠小米，在天然BBM启动子的控制下表达，和2)在天然启动子的控制下，用ASGR-BBML或作为cDNA或作为染色体DNA转化珍珠小米。

[0104] 虽然ASGR-BBML的器官特异性表达模式通过RT-PCR已经在两种无融合生殖物种(P.squamulatum和C.ciliaris)和无融合生殖狼尾草回交中被充分的表征，这不会使表达的细胞定位被确定。在授粉前最多2天，观察到雌蕊(雌蕊)中无融合生殖的表达；在授粉后也观察到表达，因为胚胎开始发育并且持续生长。用RT-PCR进行这些分析，因为在开花雌蕊中ASGR-BBML转录是低丰度的；因此，通过原位杂交未检测出转录。

[0105] 在授粉之前，经由PsASGR-BBML-启动子-GUS构建体，在细胞水平研究子房内PsASGR-BBML表达模式。从转基因珍珠小米杂交回收无融合生殖系，在无孢子生殖胚囊中识别表达GUS的分裂的未减数的卵细胞(图7)。在开花当天未授粉的胚囊中，在卵细胞内观察到GUS信号；有时候在助细胞中有较弱的GUS信号(图8A-C)。助细胞信号可以归因于来自卵细胞的PsASGR-BBML的较低表达或GUS信号泄漏。胚囊内完好助细胞和极核的存在表明，在授粉前发生PsASGR-BBML表达。在有性胚囊的中央细胞或反足细胞或在周围的子房组织中没有GUS染色被可视化(图8A-C)。最多授粉后3天，GUS活性也在发育胚胎特征中被识别(图8D)；GUS活性没有在发育胚乳中被识别。

[0106] 这种表达模式表示在发育时间框架中，BBM是细胞自主的和表达的，其在孤雌繁殖角色中是稳定的角色。为了得到更确切的证据，在其天然启动子的控制下，用ASGR-BBML转化有性珍珠小米或作为cDNA或染色体DNA。根据下表2中提供的序列，下面描述该构建体的两个版本，下表提供了ASGR-BBML的cDNA，染色体DNA，氨基酸序列，和启动子序列。染色体构建体：2074bp的ASGR-BBM启动子(p208)(含有6个残基的GGATCC BamHI限制位点序列)，3,540bp的编码区(外显子：内含子)的上游和3'非编码的610bp。cDNA构建体：2074bp的ASGR-BBM启动子(含有6个残基的GGATCC BamHI限制位点序列)融合至1638bp cDNA编码区和3'非编码区的610bp。在图9中描绘了cDNA对染色体DNA的比对。
表2.ASGR-BBML的cDNA，染色体DNA，氨基酸序列和启动子序列；起始密码子是由单下划线表示的，并且终止密码子是通过双下划线表示的。
SEQ ID NO：1.ASGR-BBM cDNA序列与非编码区
TCTCTCTCTCTTCTCTCTCTCCATTTCTCTTCCCTAGGATCAGTGCTAGTGCTTGCA
GCGGCCGCGTTCCGAGATGGGTTCCACCAACAACTGGCTGCGCTTCGCCTCGTTC
TCCGGCGGCGGCGGCGCCAAGGATGCCGCGGCCCTGCTCCCGCTGCCGCCCTCGC
CCCGTGGCGATGTCGACGAGGCCGGCGCAGAGCCGAAGCTCGAGGACTTCCTCG
GCCTGCAGGAGCCGAGCGCCGCCGCGGTGGGGGCTGGGCGGCCATTCGCGGTGG
GTGGCGGTGCGAGCTCCATCGGGCTGTCCATGATCAGGAACTGGCTGCGCAGCC
AGCCGGCGCCGGCCGGGCCTGCTGCGGGGGTCGATTCGATGGTGCTGGCGGCTG
CGGCGGCGTCGACGGAGGTGGCCGGCGATGGCGCGGAGGGCGGCGGCGCCGTG
GCTGACGCGGTGCAGCAGAGGAAGGCGGCGGCGGTGGACACTTTCGGGCAGCGG
ACCTCCATATACCGCGGCGTCACAAAGCATAGATGGACAGGAAGGTATGAAGCC
CATCTTTGGGACAATAGCTGCAGAAGAGAAGGTCAAACTCGGAAAGGTAGACAA
GTGTATCTTGGTGGATATGATAAAGAAGAAAAAGCAGCTAGAGCTTATGATTTA
GCTGCTCTCAAGTACCGGGGCACCACAACTACTACAAATTTTCCGATGAGCAACT
ATGAAAAGGAGTTAGAAGAGATGAAGCATATGTCACGACAAGAATATGTTGCAT
CCCTTAGAAGGAAAAGCAGTGGTTTTTCTCGTGGTGCATCAATTTACCGAGGGGT
TACCAGGCACCATCAGCATGGAAGGTGGCAAGCAAGAATAGGAAGTGTGGCAG
GAAACAAGGATCTTTATTTGGGCACATTCAGTACCCAGGAGGAAGCTGCAGAGG
CTTACGACATTGCTGCCATCAAATTCCGAGGCCTCAATGCTGTCACGAACTTTGA
CATGAGCCGGTATGACGTCAAGAGCATCATTGAGAGCAGCTCCCTGCCTGTTGGC
GGCACTCCAAAGCGTCTCAAGGAAGTGCCTGATCAATCAGATATGGGCATCAAC
ATAAACGGTGACTCTGCTGGTCATATGACTGCTATCAACCTTCTTACTGATGGCA
ATGACAGCTATGGAGCTGAGAGTTATGGTTACAGTGGTTGGTGTCCCACAGCCAT
GACGCCAATCCCCTTTCAATTCAGCAATGGCCATGACCATTCCAGGCTGTGGTGC
AAGCCAGAGCAGGACAATGCGGTTGTTGCAGCACTGCATAACCTGCATCACCTC
CAGCACTTGCCAGCCCCAGTTGGCACCCATAATTTTTTCCAGCCATCGCCTGTTCA
GGACATGACAGGTGTTGCCGATGCTTCATCGCCACCAGTAGAATCTAATTCATTC
CTGTACAATGGGGACGTTGGTTACCATGGTGCCATGGGTGGCAGCTATGCCATGC
CGGTTGCCACACTAGTTGAGGGCAACTCTGCGGGCAGTGGCTATGGAGTTGAGG
AAGGCACAGGGTCTGAAATCTTTGGTGGACGGAACTTGTATTCTCTCTCCCAAGG
TTCCTCAGGCGCCAATACTGGAAAGGCAGATGCTTATGAAAGCTGGGATCCATCT
ATGCTGGTGATATCACAGAAGTCTGCCAATGTGACTGTCTGCCATGGCGCACCTG
TATTTTCAGTTTGGAAATGATGGTTAGATGAAAATATAGTAGTGATATTAACTAG
TTCTTGGAGGGGAAGATTAAATTCTAGGTATACAAAAGTTTAATTTATTAGTGCT
TCAAGATCTCGTATGAAAAAAAGTTTTGCTGCTTAATCAGCTCCAGTGGGAGTCT
AGGAGCCATGAGAAATGTCGTTTTATTATTGACTAATGCTACAATGCTAACATGC
TGACTCTTTTGAATGGCACAAGAGCTCTGGTGTTTCAATACATCAGCCAGTTTCA
TT
SEQ ID NO:2.ASGR-BBM cDNA序列
ATGGGTTCCACCAACAACTGGCTGCGCTTCGCCTCGTTCTCCGGCGGCGGCGGCG
CCAAGGATGCCGCGGCCCTGCTCCCGCTGCCGCCCTCGCCCCGTGGCGATGTCGA
CGAGGCCGGCGCAGAGCCGAAGCTCGAGGACTTCCTCGGCCTGCAGGAGCCGAG
CGCCGCCGCGGTGGGGGCTGGGCGGCCATTCGCGGTGGGTGGCGGTGCGAGCTC
CATCGGGCTGTCCATGATCAGGAACTGGCTGCGCAGCCAGCCGGCGCCGGCCGG
GCCTGCTGCGGGGGTCGATTCGATGGTGCTGGCGGCTGCGGCGGCGTCGACGGA
GGTGGCCGGCGATGGCGCGGAGGGCGGCGGCGCCGTGGCTGACGCGGTGCAGCA
GAGGAAGGCGGCGGCGGTGGACACTTTCGGGCAGCGGACCTCCATATACCGCGG
CGTCACAAAGCATAGATGGACAGGAAGGTATGAAGCCCATCTTTGGGACAATAG
CTGCAGAAGAGAAGGTCAAACTCGGAAAGGTAGACAAGTGTATCTTGGTGGATA
TGATAAAGAAGAAAAAGCAGCTAGAGCTTATGATTTAGCTGCTCTCAAGTACCG
GGGCACCACAACTACTACAAATTTTCCGATGAGCAACTATGAAAAGGAGTTAGA
AGAGATGAAGCATATGTCACGACAAGAATATGTTGCATCCCTTAGAAGGAAAAG
CAGTGGTTTTTCTCGTGGTGCATCAATTTACCGAGGGGTTACCAGGCACCATCAG
CATGGAAGGTGGCAAGCAAGAATAGGAAGTGTGGCAGGAAACAAGGATCTTTAT
TTGGGCACATTCAGTACCCAGGAGGAAGCTGCAGAGGCTTACGACATTGCTGCC
ATCAAATTCCGAGGCCTCAATGCTGTCACGAACTTTGACATGAGCCGGTATGACG
TCAAGAGCATCATTGAGAGCAGCTCCCTGCCTGTTGGCGGCACTCCAAAGCGTCT
CAAGGAAGTGCCTGATCAATCAGATATGGGCATCAACATAAACGGTGACTCTGC
TGGTCATATGACTGCTATCAACCTTCTTACTGATGGCAATGACAGCTATGGAGCT
GAGAGTTATGGTTACAGTGGTTGGTGTCCCACAGCCATGACGCCAATCCCCTTTC
AATTCAGCAATGGCCATGACCATTCCAGGCTGTGGTGCAAGCCAGAGCAGGACA
ATGCGGTTGTTGCAGCACTGCATAACCTGCATCACCTCCAGCACTTGCCAGCCCC
AGTTGGCACCCATAATTTTTTCCAGCCATCGCCTGTTCAGGACATGACAGGTGTT
GCCGATGCTTCATCGCCACCAGTAGAATCTAATTCATTCCTGTACAATGGGGACG
TTGGTTACCATGGTGCCATGGGTGGCAGCTATGCCATGCCGGTTGCCACACTAGT
TGAGGGCAACTCTGCGGGCAGTGGCTATGGAGTTGAGGAAGGCACAGGGTCTGA
AATCTTTGGTGGACGGAACTTGTATTCTCTCTCCCAAGGTTCCTCAGGCGCCAAT
ACTGGAAAGGCAGATGCTTATGAAAGCTGGGATCCATCTATGCTGGTGATATCAC
AGAAGTCTGCCAATGTGACTGTCTGCCATGGCGCACCTGTATTTTCAGTTTGGAA
ATGA
SEQ ID NO:3.ASGR-BBM构建体序列
GGATCCAGCCATGTCTAAACGATCAACAGATGACTGCCTAATATAAGGTTTTTGG
GTTGTTGAATAATTAGGCAATATCCATATTAGATTCCGAAAGCAGTAAAACATGA
CAATGATAGTAACTAGTATGCACGCATAAGACATACTAGACGATAGTAACAACA
TAACCATGAACTCAGTAAACATGACTAAAGATTGGATCTTAGATCCGTACCTGGC
GCTCAGAGTTGCAAGCACTGCGGAGGGCGTCGATACTTCGGGGAAGACAAGCGG
CGCAGACGAAGCGACGACGGTGTTCCGGACGGCACGTAGCAGCCGACATTGAAG
GCAATGCGCCCTCTCGTCAGGAGACTTGCTAGGAAGACGAGCCACGATGACGAC
GATTGAGCAGTCACGCGGAGCACTTCCCAAAAACCTTATTCGCCCTCTCCCGGTG
CAGGATCGCAAGGACGGACGGTTCCGGAGACCTGCTCTCCCAATCACCTGTGCA
CGCAGGTGTTCGGGATGGAGTAGATGGCGGCGGCGGCGGCGCAGCAGCGAGCG
AGAGAGGCAAAGTCCTAACTCAGATCAGATCTATTTTAGGGATACCCTTTCATGG
GGCCTTTCCGTAGATAGTCTATTGTGCATCTCTTCTGTGAGGGGGTGGTCCATTTT
TATATGGAGGGAAACCTCCAACACCCTCGTCTATTAGCAATATGAGACTAATAGA
TGGTGTACCCCCTCATCACGCTAATGGGCCTTTGAGATTTATTCAGGAATTATTG
GATTGGCTAATGGGCCAAGCCCAAAATTCCAACACAATCAAGTTTGCCTCGCATA
TCTCGATTCTCGAACCAACCTCCGAGCCATATCTGATTGTAGACAAGTAAACAAA
CTCGGAGGCGGAAGGGGGAACTGACCCGTTGAACGCCGTCACTGCCGGAACCGA
CGTCGCCGTCACTGAAGAAGAAGGAAGATGCTTCCGAACCACCCAATACAAAAC
CTCACTAATTCCTCGCTGACGCCAGAGCAGACGCCGACGAAACGGGAAAGGAGT
CAAAATACCTTATTCCATCGCCACCACATCATTTGGGCGCTGCTCGCTGATACGC
CGGCGGGAGCGGTGGCAGCCAGGTGTACGCCCCCGCGGACTGCGCGCCGGCTGG
CCGGCCGGCCACCGGGGCCGGGGCCCTTCAATCTCTTAGGGCGTCCCCAACAAG
GCTGATTCAGCTAGCTATTTGAGTGTACACATCAGCATGTATCCTACATGGAGGA
AAGAGAGTATGCATTGAACATTGAGCCGGCTATTTGCTCGTCGCCTATCTAGCAC
ATCACCCAAGGCAGCGCTGTGTCTATGGCCTGGCAGAAAATATTGTTTAAATAAC
AAGTAGCCAGCTTTAGTAGATAGTACTTTCTCTTGCTGGCTTTTTTTTTTTTTGATA
ACAGCTCTTGCTGGCTTTTAGCGTGCCGGCTCCGAGCTACTCCCTCTGTCCCAGA
ATTTGAGTCGCCGGCCAACAGTGAAATGAGAGAGGGGCACGGAGTCCCAACGAC
AGTAATATTGGGACAGGGAGTAGCAGCTATCCAGGACTGCTGTAGACGCCCTTA
GTCCTCGACTCCTCGCAGCCTTTCGCCGTTGAAAGAATCACACCGCCCCCTGCAG
TTACGTGTTAACCCAACCCGGGCCATTGGTCAGTCCCTAACCCGGGCGGTTGACC
GCTAGAAATTAGAATTAACCCTTGGTTAACACCGGTCAAAGCGCACATATGCGGT
GCAATCTAATCGAAGTGGCCGCGTCATAATTACACACGCCCGCTCCTATACGTGT
GCCCCGTTCATACGCATGCTCACCTCGCGCGTTCCCATGAGGTTTCACACCCCTTG
TGGGAATCCAAGGCGTCAGAGATTTATTGATCCCATTTCCCTAGCCTGCCTCGCC
TCTCTATCTACTTGTGTGGAGATTAGAGCACAGCAGCGAGAAAGGGCTTGCAGTC
TATAAAGGCGACAAGAGCCCACACCCTCCTCTCTCTCTCTCTTCTCTCTCTCCATT
TCTCTTCCCTAGGATCAGTGCTAGTGCTTGCAGCGGCCGCGTTCCGAGATGGGTT
CCACCAACAACTGGCTGCGCTTCGCCTCGTTCTCCGGCGGCGGCGGCGCCAAGGA
TGCCGCGGCCCTGCTCCCGCTGCCGCCCTCGCCCCGTGGCGATGTCGACGAGGCC
GGCGCAGAGCCGAAGCTCGAGGACTTCCTCGGCCTGCAGGAGCCGAGCGCCGCC
GCGGTGGGGGCTGGGCGGCCATTCGCGGTGGGTGGCGGTGCGAGCTCCATCGGG
CTGTCCATGATCAGGAACTGGCTGCGCAGCCAGCCGGCGCCGGCCGGGCCTGCT
GCGGGGGTCGATTCGATGGTGCTGGCGGCTGCGGCGGCGTCGACGGAGGTGGCC
GGCGATGGCGCGGAGGGCGGCGGCGCCGTGGCTGACGCGGTGCAGCAGAGGAA
GGCGGCGGCGGTGGACACTTTCGGGCAGCGGACCTCCATATACCGCGGCGTCAC
AAAGTAGGTTCTTGATTTTATTTTGGTTTTGGAAAAATTCTTCTTTGTTTTTTCTGT
TTTCTTCCGACTGGTATATCTTGTGTTAAGAACTTTTTCATTAGATGCATGTCATA
CTGTTGCTTTTTCTTGTTGCTTTGAACCTTTTGGCGTTTGCAGCTTCGTTTGGATAT
ACAGAACCTATATTATCCCCTTTAGTAACCAGTAGATTCTTTTTTTTTCTTTTTTTT
TTTTTGCTTTCGATGTTGTTAGTGTTCTTGCATCACGCATGTTTTTCCTCTGATATT
TTAATGGACGATATCATCTCTAGTTCAAGTTTTTGCTCTTGCTCTTGTTGTAGTGG
TGCTAAGATTTTTAAAAAAAAAAATTATGAGCAGTTCTTGTGCTGTTTGAAAATG
TAAGCATCTCACAGTTCTAAAATATATATATATATATATATATAAGTCTCTCATGT
TGATTTGTGGATGTACTGAAGCCCCGCGCGCACACATGCACACACCGCACGCTCA
CACGCCCTAAATCCCCGGTGCAACACCAGGGTTGTCCCCGATGGGGATCGAACC
CTGGCGGGTGGCCTAACCACCGTCAGCTCCCACCACCGAGCTATCAGCTCGTTTG
CCCATATTTCGTGTGGTACCTCGATATTTTTATATTTCTAGATTGCTGTATCTATCT
TCTAGACTTATATAAGTGTTGCGCCACTCATACTTTTTACCGCCTGTAATCGAGTA
GAACTGCTTCCTCTTTTGATTATATTGTATCAGTTAAATGATCTTGTTGTTGATGT
GTTTACCACTTTACCATCACCATTGCATGAAATCACTTCAAGACATGTATTCATG
ATTTGGCTGGCTAAATTTGCTAGTGGCACATACATGTGGTAAAAAAATATTTTTA
GTTTGTGCTTGCTATTCTTTTCGGTCATCCCTTCGTGCCTGTTTATCCAGAACACC
CAATCTGCTTCACATAGTTTTTGAATGCTATCATCATATTTCTTTTTTGGAGATAT
TGTTACTAAAAGTTTGGCTTTGTCCTCAATAGGCATAGATGGACAGGAAGGTATG
AAGCCCATCTTTGGGACAATAGCTGCAGAAGAGAAGGTCAAACTCGGAAAGGTA
GACAAGGTAATGATTATAATATAGATATTTAAATTTGTAATTATAAGCTGCATCA
TATTATTATTTATTAGATCGGCTTTAAAATTTCACTAGCTAATTTAGTGTTTTTCTT
TTCTTCATCGATACCTGCAATCGCTTCATTCCATTGATTCAGTGTATCTTGGTAAG
TAATACTTGTTTACAATTGCAAAATGGTATATCTCTTGTTGTTTCTCATGTCAAGT
ATATTAAATATGTGGTTGATGCATTGAAGGTGGATATGATAAAGAAGAAAAAGC
AGCTAGAGCTTATGATTTAGCTGCTCTCAAGTACCGGGGCACCACAACTACTACA
AATTTTCCGGTATTACTTATTGTTAATATGTTGGTTCTCCAGAATTGATATTTTAC
TTCTAATATATAACTGCGTATATGAATGAATGTTGTAAGATTTTGCATTTTATGTT
CAGATGAGCAACTATGAAAAGGAGTTAGAAGAGATGAAGCATATGTCACGACAA
GAATATGTTGCATCCCTTAGAAGGTACATGTGTTGTCAAAACTTTGTACCTTCAT
GGAAACTGAACTTATATATTTCACAAATGGATTGACATAGAACATATATTTGTGA
TACAGGAAAAGCAGTGGTTTTTCTCGTGGTGCATCAATTTACCGAGGGGTTACCA
GGTACAAAATATTCCTTTTCCTTATTATCTCTGGTTTTAGTTAGCAAGTGCATTGT
TTCTATGGGAATTTGTGTTGCATGTAGATGGGAATTTGTGTTGCATGTAGATCAT
AAATAGTTGCAACTATTAATCTCATCGTTCTATTGCTGAATAGTTGTGGTACTCCT
TTACCACAGTTGACTATGATATTCTATTATATTATTTTTCTTGCAAAGTTGATATT
TAATTGCTTGTCTAGCTAACTTTCAAGCAATCATGTAAAACAGGCACCATCAGCA
TGGAAGGTGGCAAGCAAGAATAGGAAGTGTGGCAGGAAACAAGGATCTTTATTT
GGGCACATTCAGTAAGTCACATTTTAATATTTTTAATGAAGCACTGATTTTTTTTT
GTCAAGCAAAATGGAAGCAAGACAGAAAAACATAAACCTACTGGAGCACCTTTT
TCATTATTTTGTCTCTTGAATATAATAGTATGTGGCTGACCTCTCCCTGTGTAGGT
ACCCAGGAGGAAGCTGCAGAGGCTTACGACATTGCTGCCATCAAATTCCGAGGC
CTCAATGCTGTCACGAACTTTGACATGAGCCGGTATGACGTCAAGAGCATCATTG
AGAGCAGCTCCCTGCCTGTTGGCGGCACTCCAAAGCGTCTCAAGGAAGTGCCTG
ATCAATCAGATATGGGCATCAACATAAACGGTGACTCTGCTGGTCATATGACTGC
TATCAACCTTCTTACTGATGGCAATGACAGCTATGGAGCTGAGAGTTATGGTTAC
AGTGGTTGGTGTCCCACAGCCATGACGCCAATCCCCTTTCAATTCAGCAATGGCC
ATGACCATTCCAGGCTGTGGTGCAAGCCAGAGCAGGACAATGCGGTTGTTGCAG
CACTGCATAACCTGCATCACCTCCAGCACTTGCCAGCCCCAGTTGGCACCCATAA
TTTTTTCCAGCCATCGCCTGTTCAGGACATGACAGGTGTTGCCGATGCTTCATCGC
CACCAGTAGAATCTAATTCATTCCTGTACAATGGGGACGTTGGTTACCATGGTGC
CATGGGTGGCAGCTATGCCATGCCGGTTGCCACACTAGTTGAGGGCAACTCTGCG
GGCAGTGGCTATGGAGTTGAGGAAGGCACAGGGTCTGAAATCTTTGGTGGACGG
AACTTGTATTCTCTCTCCCAAGGTTCCTCAGGCGCCAATACTGGAAAGGCAGATG
CTTATGAAAGCTGGGATCCATCTATGCTGGTGATATCACAGAAGTCTGCCAATGT
GACTGTCTGCCATGGCGCACCTGTATTTTCAGTTTGGAAAJGATGGTTAGATGAA
AATATAGTAGTGATATTAACTAGTTCTTGGAGGGGAAGATTAAATTCTAGGTATA
CAAAAGTTTAATTTATTAGTGCTTCAAGATCTCGTATGAAAAAAAGTTTTGCTGC
TTAATCAGCTCCAGTGGGAGTCTAGGAGCCATGAGAAATGTCGTTTTATTATTGA
CTAATGCTACAATGCTAACATGCTGACTCTTTTGAATGGCACAAGAGCTCTGGTG
TTTCAATACATCAGCCAGTTTCATTATTGTCCATTTGCTGTGCACATTTTCTGCGC
TGGCACCTATAATAATATGATTCTAAACTGTGAATTAGTTCAGATGTCAACTGTA
AGTAACTTTATTTTAGCTTTCTTATATACATCTCTTTTTCTTTTTGAGAAACGGGCT
TTGCCCCCAGCCTTCATAGGAGGCTGGTGCAGCGTACCGGGTCCGAACCTGGGCT
GGTGACGTCCTCAGCATGAGCGCCCACCACCGAGCTACACGCTCGTCTGCTCTTA
TATACATCTCTTCAGTAAGGGTAATATGGTACTTCACAGTTCACAGTCCAGTCAT
TCCAACCATGGATGAGCAAAATGTGCTTGTGCACATGGTGGGTC
SEQ ID NO:4.ASGR-BBM氨基酸序列
MGSTNNWLRFASFSGGGGAKDAAALLPLPPSPRGDVDEAGAEPKLEDFLGLQEPSA
AAVGAGRPFAVGGGASSIGLSMIRNWLRSQPAPAGPAAGVDSMVLAAAAASTEVA
GDGAEGGGAVADAVQQRKAAAVDTFGQRTSIYRGVTKHRWTGRYEAHLWDNSCR
REGQTRKGRQVYLGGYDKEEKAARAYDLAALKYRGTTTTTNFPMSNYEKELEEMK
HMSRQEYVASLRRKSSGFSRGASIYRGVTRHHQHGRWQARIGSVAGNKDLYLGTFS
TQEEAAEAYDIAAIKFRGLNAVTNFDMSRYDVKSIIESSSLPVGGTPKRLKEVPDQSD
MGININGDSAGHMTAINLLTDGNDSYGAESYGYSGWCPTAMTPIPFQFSNGHDHSRL
WCKPEQDNAVVAALHNLHHLQHLPAPVGTHNFFQPSPVQDMTGVADASSPPVESNS
FLYNGDVGYHGAMGGSYAMPVATLVEGNSAGSGYGVEEGTGSEIFGGRNLYSLSQ
GSSGANTGKADAYESWDPSMLVISQKSANVTVCHGAPVFSVWK*
SEQ ID NO:5.ASGR-BBM启动子序列
GGATCCAGCCATGTCTAAACGATCAACAGATGACTGCCTAATATAAGGTTTTTGG
GTTGTTGAATAATTAGGCAATATCCATATTAGATTCCGAAAGCAGTAAAACATGA
CAATGATAGTAACTAGTATGCACGCATAAGACATACTAGACGATAGTAACAACA
TAACCATGAACTCAGTAAACATGACTAAAGATTGGATCTTAGATCCGTACCTGGC
GCTCAGAGTTGCAAGCACTGCGGAGGGCGTCGATACTTCGGGGAAGACAAGCGG
CGCAGACGAAGCGACGACGGTGTTCCGGACGGCACGTAGCAGCCGACATTGAAG
GCAATGCGCCCTCTCGTCAGGAGACTTGCTAGGAAGACGAGCCACGATGACGAC
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CAGGATCGCAAGGACGGACGGTTCCGGAGACCTGCTCTCCCAATCACCTGTGCA
CGCAGGTGTTCGGGATGGAGTAGATGGCGGCGGCGGCGGCGCAGCAGCGAGCG
AGAGAGGCAAAGTCCTAACTCAGATCAGATCTATTTTAGGGATACCCTTTCATGG
GGCCTTTCCGTAGATAGTCTATTGTGCATCTCTTCTGTGAGGGGGTGGTCCATTTT
TATATGGAGGGAAACCTCCAACACCCTCGTCTATTAGCAATATGAGACTAATAGA
TGGTGTACCCCCTCATCACGCTAATGGGCCTTTGAGATTTATTCAGGAATTATTG
GATTGGCTAATGGGCCAAGCCCAAAATTCCAACACAATCAAGTTTGCCTCGCATA
TCTCGATTCTCGAACCAACCTCCGAGCCATATCTGATTGTAGACAAGTAAACAAA
CTCGGAGGCGGAAGGGGGAACTGACCCGTTGAACGCCGTCACTGCCGGAACCGA
CGTCGCCGTCACTGAAGAAGAAGGAAGATGCTTCCGAACCACCCAATACAAAAC
CTCACTAATTCCTCGCTGACGCCAGAGCAGACGCCGACGAAACGGGAAAGGAGT
CAAAATACCTTATTCCATCGCCACCACATCATTTGGGCGCTGCTCGCTGATACGC
CGGCGGGAGCGGTGGCAGCCAGGTGTACGCCCCCGCGGACTGCGCGCCGGCTGG
CCGGCCGGCCACCGGGGCCGGGGCCCTTCAATCTCTTAGGGCGTCCCCAACAAG
GCTGATTCAGCTAGCTATTTGAGTGTACACATCAGCATGTATCCTACATGGAGGA
AAGAGAGTATGCATTGAACATTGAGCCGGCTATTTGCTCGTCGCCTATCTAGCAC
ATCACCCAAGGCAGCGCTGTGTCTATGGCCTGGCAGAAAATATTGTTTAAATAAC
AAGTAGCCAGCTTTAGTAGATAGTACTTTCTCTTGCTGGCTTTTTTTTTTTTTGATA
ACAGCTCTTGCTGGCTTTTAGCGTGCCGGCTCCGAGCTACTCCCTCTGTCCCAGA
ATTTGAGTCGCCGGCCAACAGTGAAATGAGAGAGGGGCACGGAGTCCCAACGAC
AGTAATATTGGGACAGGGAGTAGCAGCTATCCAGGACTGCTGTAGACGCCCTTA
GTCCTCGACTCCTCGCAGCCTTTCGCCGTTGAAAGAATCACACCGCCCCCTGCAG
TTACGTGTTAACCCAACCCGGGCCATTGGTCAGTCCCTAACCCGGGCGGTTGACC
GCTAGAAATTAGAATTAACCCTTGGTTAACACCGGTCAAAGCGCACATATGCGGT
GCAATCTAATCGAAGTGGCCGCGTCATAATTACACACGCCCGCTCCTATACGTGT
GCCCCGTTCATACGCATGCTCACCTCGCGCGTTCCCATGAGGTTTCACACCCCTTG
TGGGAATCCAAGGCGTCAGAGATTTATTGATCCCATTTCCCTAGCCTGCCTCGCC
TCTCTATCTACTTGTGTGGAGATTAGAGCACAGCAGCGAGAAAGGGCTTGCAGTC
TATAAAGGCGACAAGAGCCCACACCCTCCTCTCTCTCTCTCTTCTCTCTCTCCATT
TCTCTTCCCTAGGATCAGTGCTAGTGCTTGCAGCGGCCGCGTTCCGAG
实施例5
包含gPsASGR-BBML的转基因珍珠小米品系

[0107] 从这些实验中再生转基因品系，为每个构建体轰击珍珠小米胚性愈伤组织的两个板。对于这些构建体，选择性标记基因是潮霉素抗性的，而不是草丁膦抗性的。5个cDNA构建体品系，总共由13个植物组成，其是通过胚珠清洁进行再生和筛选的，3个植物显示出在珠心细胞中低频率的小群细胞质分裂细胞；然而，所有这些不能清楚的解释为代表一个超出球形期的有组织的胚胎结构。

[0108] 9个独立的转基因品系(18个植物)中含有转基因，从有性四倍体珍珠小米产生gPsASGR-BBML，由于缺乏开花或植物的消亡，由6个植物组成4个品系没有被分析。在3个品系中的4个植物显示出在没有授粉的情况下来自卵细胞的胚胎形成证据，和3个植物在子房分析之前死亡。缺乏授粉的证据是胚囊中央细胞极核的持久性。在开花后两天，使用清洁-雌蕊技术，对剩余的转基因植物进行孤雌繁殖测定((B.A.Young,R.T.Sherwood,E.C.Bashaw,Can.J.Bot.57:1668-1672(1979))，和通过差异干涉对比(DIC)或相差光学器件实施观察。在柱头外露前经由包裹头部，和在开花前去除柱头/花柱(因为植物是雌蕊先熟的，这意味着在开花之前柱头外露)而防止授粉。

[0109] 如表3中所示，在同一胚囊中发育胚胎的存在提供了表明胚囊是未授粉的证据以及所述卵细胞是孤雌繁殖发育的证据，所述胚胎中存在极核(胚胎+PN)。在具有极核的胚囊中胚胎形成的实例显示在图10中。因为这将是在发生减数分裂的有性植物中指示孤雌繁殖的，孤雌繁殖衍生的单倍体胚胎是预期具有母本的半数染色体数目和DNA含量(图10)。子代#105(图10D)和#106(图10C)是来自性二倍体(2n＝4x)植物(如：#100(图10B)，#107(图10D)和#108(图10A，10C))子代的一半预期DNA含量的单倍体(1n＝2x)个体的实例。虽然在这些品系(胚囊+PN)中不是所有的胚胎是孤雌繁殖发育的，这可能是由于该表型的不完全外显和转基因的分离。虽然在这些品系中不是所有的胚囊是正常发育的(无胚囊/异常囊结构)，这可能是由于通过组织培养，植物的健康状况不佳，和/或转基因的多效性诱导的变化。关于这些替代品的进一步信息可以通过基因分析而收集。柱头去除率不是100％，导致偶尔授粉(最后一栏)。
表3.

[0110] 基于中央细胞中极核的持久性和胚乳发育的缺乏，含有结构化成熟胚囊的所有品系(图11A)，其中3个独立的品系(g3f，g11a，和g52)显示孤雌繁殖(图11B，11C)，因此胚乳可以在相同发育阶段的授粉胚囊中容易地被可视化。当没有阻止授粉时，所有的3个品系显示出在第2天胚乳的形成(图11D)。对这3个品系的每个进行至少3个头部和150个子房的分析，其中在开花后第2天，每个头部的结构化成熟胚囊的百分比(图11A)和那些含有孤雌繁殖胚胎的百分比对品系g11a，g52和g3f分别为66，79，71和35，36，35。经由RT-PCR，在开花后第2天用从开放授粉的子房中提取的RNA验证品系g52和g3f的gPsASGR-BBML转基因表达(图12)。为了排除通过组织培养选择和再生所诱导的潜在倍性变化，通过流式细胞仪分析3个T0gPsASGR-BBML品系(图13A)。所有3个品系均表现为维持四倍体倍性水平。

[0111] 作为设置为系g11a和g52的低发芽率和低种子的结果，胚拯救被用于授粉后10-15天的发育种子和不发芽成熟的种子，以便于从3系中恢复子代。通过流式细胞术分析的种子显示出减数分裂的子代的生产(图14)。

[0112] 给红色IA4X植物授粉，所述植物是含有显性等位基因Rpl的有性四倍体品系，所述等位基因提供了在中脉和叶鞘中的深红色色素沉淀(W.W.Hanna,G.W.Burton,J Hered.83:386-388(1992))，在多个头部和天数被用于部分地补偿所述转基因品系的潜在花粉不育。
植物g11a放置了总共9个种子，两个幸存的子代在温室中种植。植物g52放置了97个种子，31个幸存的子代在温室中种植。植物g3f放置了数百个种子，其中194个是随机抽取饿，107个幸存的在温室中种植。

[0113] 所有子代进行分析覆盖gPsASGR-BBML开放阅读框的一个3,694bp扩增子的遗传，所述阅读框从起始密码子下游5个碱基对开始和扩增到3'非编码区(ORF扩增子)。这两个g11a的子代没有表现出转基因的遗传。所有的g52子代显示中脉的红色色素沉淀；这些都是衍生自具有红色IA4X花粉的g52有性胚囊的授粉。所述子代植物中的9个具有至少一个ORF扩增子的拷贝。所述g3f子代植物具有绿色和红色色素沉淀混合的中脉。26个g3f子代植物具有至少一个ORF扩增子的拷贝。

[0114] 来自品系g52的所有子代植物测定孤雌繁殖(表4，图15B)，其表明了仅遗传ORF扩增子的子代在开花后2天显示孤雌繁殖。在来自没有遗传ORF扩增子的21个g52子代的791个结构化成熟性胚囊中，没有胚胎形成被识别。在来自遗传ORF扩增子的9个g52子代的90个性胚囊显示胚胎发育和极核。在多种g52子代中，表示胚胎发育的胚珠百分比是介于从12％至53％。

[0115] 从g3f品系产生的子代植物的一个子集被测定孤雌繁殖(表5，图15C)。在来自没有遗传ORF扩增子的28个g3f子代的总数951个结构化成熟性胚囊中，没有胚胎形成被识别。26个遗传ORF扩增子的子代中的3个在孤雌繁殖评价中是不可用的，因为它们没有花。剩下的23个遗传ORF扩增子的子代中，19个显示孤雌繁殖，和4个没有显示孤雌繁殖。观察到胚胎发育的结构化成熟胚囊的百分比范围为从1‰至52‰的显示孤雌繁殖的各种g3f子代。在携带该转基因但是不显示孤雌繁殖的4个子代中，植物123，144和159通过RT-PCR分析测定转基因的表达(图16)。在所有的3个子代中，在开花当天在未授粉的子房中检测gPsASGR-BBML表达。在植物123，144和159中，2个从5'非编码区至3'非编码区覆盖gPsASGR-BBML cDNA转基因的转基因特异性扩增子被测序，伴随着也显示孤雌繁殖的植物105。所有的序列被认为是相同于衍生自BC7和BC8无融合生殖植物的PsASGR-BBM cDNA序列。

[0116] 由于g3f子代是红色和绿色色素沉淀混合的中脉，绿色表型的倍性水平的测定是必需的(表6)。经由流式细胞术，使用高粱作为染色体组大小的参考，6个子代均在染色体组大小中如被分析的二倍体/双单倍体(图13B-C)。通过与预测二倍体/双单倍体和四倍体子代混合以产生3个峰(图13D)，二倍体/双单倍体子代被进一步证实。所有6个单倍体子代携带ORF扩增子；所述花的4个单倍体子代，所有均显示孤雌繁殖(图15C)。使用RNAi-BBM-3p构建体的RNAi基因敲减方法，在无融合生殖Fi转基因品系中评估PsASGR-BBML在无融合生殖发育中的作用。因为P.squamulatum的直接转化和无融合生殖再生是不可能的，用于产生具有PsASGR-BBML减数表达的无融合生殖Fi植物的可替代方法和筛选方案被使用。经过筛选，3个植物，其中每一个是由不同的品系衍生的，基于在授粉当天的PsASGR-BBML表达的半定量分析，具有ASGR+/RNAi+的基因型显示减少的PsASGR-BBML基因表达(表7，图17)，相比于ASGR+/RNAi-对照基因型。发现3个PsASGR-BBML减少表达的Fi植物含有与对照植物相同的具有无孢子生殖胚囊形成的胚珠的百分比(表7)。然后用红IA4X花粉将植物授粉，并且基于缺乏红色色素沉淀的中脉和均匀的表型而发现子代是衍生自无融合生殖的。然而，组织学观察表明，在开花后2天显示孤雌繁殖胚胎发育的子房数量和在那些胚胎中细胞数量是在PsASGRBBML减少的表达品系中显著减少的(表7，图18)。

[0117] 携带gPsASGR-BBML转基因和产生与授粉无关的胚胎形成和二倍体/双单倍体子代，稍微低外显率的有性转基因品系分析，表明单独的PsASGR-BBML基因能够促进性四倍体珍珠小米的孤雌繁殖，尽管所述珍珠小米是通常不显示此特征的植物。没有T0品系或来自T0品系的子代表现出此特征的完全外显率；在原始T0品系和品系g3f和g52子代范围内，这个不完全外显率可能是由于转基因分离，转基因的表达水平，和/或与PsASGRBBML相互作用的未知遗传因素。尽管在没有表现出孤雌繁殖的子代中没有识别转基因的转录，转基因表达水平的定量是困难的，由于在结构化成熟性胚囊的百分比的变化和无法验证RNA是从处于相同发育阶段的子房提取的。含有gPsASGR-BBML转基因的单份拷贝或使用特定卵细胞启动子的具有不同表达水平的gPsASGRBBML转基因表达的自交品系产生将是有益于确认这些问题的。

[0118] 倍性水平没有发现对PsASGR-BBML转基因诱导孤雌繁殖是至关重要的，因为从g3f产生的4个染色体减少二倍体/双单倍体子代显示出孤雌繁殖水平与未减数四倍体子代相类似的范围。虽然大多数天然无融合生殖是多倍体，来自几个物种的自然种群和实验恢复的无融合生殖二倍体/双单倍体已经被识别。例如，多倍体无融合生殖植物可以产生二倍体/双单倍体子代，或通过不完全减数分裂和孤雌繁殖基因位点的遗传分离((R.D.Noyes,J.D.Wagner,American Journal of Botany 101:1-10(2014))，或通过携带无融合生殖基因座的减数卵细胞的孤雌繁殖发育(M.Dujardin,W.W.Hanna,Theor Appl Genet 72:33-36(1986))。

[0119] 显示PsASGRBBML完全基因敲减的Fi无孢子生殖转基因品系的缺乏妨碍了确定PsASGR-BBML是否是在植物程序中诱导孤雌繁殖所需的唯一基因，其中所述程序是用于通过ASGR遗传的无融合生殖途径。然而，考虑到在开花后2天表示孤雌繁殖胚胎发育的子房数和在那些胚胎中的细胞数量是在FiPsASGR-BBML-减数-表达品系中显著减少的，PsASGRBBML显然是无融合生殖的生殖通路中孤雌繁殖的一个重要角色。

[0120] 虽然AP2转录因子的BBM状进化枝成员已经注意到在体细胞胚胎发生和细胞增殖中的作用，这些结果首次揭示了在孤雌繁殖中PsASGRBBML的作用。值得注意的是，与更远亲物种稻米相比，玉米和高粱均没有更关联与PsASGR-BBML的PsASGR-BBML蛋白。因此，这种新发现的作用可以具有关于基因工程无融合生殖到作物物种中能力的一个主要影响。这种技术因此也可以被用作单倍体诱导的替代方法以便于迅速的获得进行繁殖的纯合品系。表4.在开花后2天来自g52子代的清洁子房中孤雌繁殖的可视化确定。
*在不同的天数从2个头部收集的组合的数据进行分析
表5.在开花后2天来自g3f子代的清洁子房中孤雌繁殖的可视化确定。
N/A＝植物没有开花或收集的子房在-50处理之外不包含>15个结构化成熟性胚囊。
*来自两个独立收集的头部相组合的数据。
0具有没有显示预期的孤雌繁殖的gASGR-BBM转基因植物。
具有2倍倍性水平的植物。
表6.或通过流式细胞仪或根尖染色体计数而确定具有绿色色素沉着的中脉的g3f子代的倍性水平。
*由染色体根尖数确定的倍性水平。
表7.来自选择的Fi RNAi植物的PsASGR-BBML表达和胚胎发育的分析。
实施例6
包含gPsASGR-BBML的转基因水稻品系

[0121] 在珍珠小米转化中使用的染色体组PsASGR-BBM构建体，在对pCambial300的多重克隆位点使用酶类，为了水稻的转化而转移所述构建体，所述构建体包括了3,540bp的编码区(外显子：内含子)上游的一个2074bp的ASGR-BBM启动子(p208)(含有一个6个残基GGATCC BamHI限制位点序列)加上610bp的3'非编码区以及驻留在蓝色脚本质粒中(Oryza sativa Japonicacv.Nipponbare)。基于PCR分析，16个不同的水稻品系被发现含有PsASGR-BBM的完整编码区构造体。从水稻种子发育的4个不同品系中分离RNA，并且PsASGR-BBM转基因的表达是由非定量RT-PCR测定的。所有的4个品系显示PsASGR-BBM转基因的表达。使用～5个解剖的发育水稻胚胎的流式细胞仪被用于确定单倍体(1n/1c)子代是否是从携带PsASGR-BBM转基因的水稻转基因品系产生(图19)。高粱被用作样品的对照。基于这个分析，8个品系显示出单倍体子代的生产。实施例7
玉米和其他农作物中的单倍体诱导

[0122] 本发明可以被用作用于在玉米和其他谷物中单倍体诱导的替代方法。当用作授粉者时，玉米的特定品系已经被识别，导致来自母本种子的单倍体子代的低(2-8％)频率恢复(Chang M.and Coe E.H.,“Doubled haploids,”ppl27-142,inMolecular Genetic Approaches to Maize Improvement,Kritz A.L.and Larkins B,Eds,Springer)。这些品系在北美和欧洲的商业玉米育种计划中被广泛的应用。

[0123] 在育种中单倍体诱导的优点是，一旦染色体数目是从单倍体加倍到二倍体，不同的基因组合可以被固定在每个品系中。这种纯合自交品系的快速恢复允许自交亲本的选择，其可以生成高产优质的杂交种。玉米的多个诱导品系已经被识别，和至少一种报告的单倍体诱导机制是染色体消除(Zhang Z.et al.,Plant Cell Reports 27:1851-1860(2008))。授粉后染色体消除更可能导致雄性比本文所描述的发明对单倍体子代的贡献，其中避免了卵细胞的受精作用。

[0124] 使用本发明的单倍体诱导可以在除玉米之外的其它作物中应用，其中诱导物品系不是已知的。如果卵细胞是从减数分裂衍生产物形成的和是单倍体的，任何杂合个体将在每个卵细胞中产生独特的基因组合。一旦染色体通过化学处理被人为的增加了一倍，每一个独特的个体单倍体将成为纯合的和可繁殖的。通过本文描述的方法，纯合的品系可以更快速的形成而用于现场检测。实施例8
在缺少授粉的情况下，ASGR-BBML的表达对诱导的卵细胞划分

[0125] 本发明的一个进一步使用是作为无融合生殖的一个组成部分。不完全减数分裂和孤雌繁殖是功能性配子体无融合生殖所必需的。不完全减数分裂可以通过影响减数分裂的突变的组合而实现(Crismani W.et al.,J.Exp.Bot.64:55-65(2013))，具有在大孢子中染色体非减数效益，即，是有丝分裂而不是减数分裂。假定一个配子体注定通过遗传改变的体细胞(Grimanelli D.,Curr.Opin.Plant Biol.15:57-62(2012))也导致未减数的孢子样细胞，其潜在的能够产生未减数配子(卵细胞)。用任何手段形成未减数的卵细胞，ASGR-BBML的适当时间和空间表达可以诱导卵细胞表现为受精卵和在没有受精的情况下分裂。未减数卵细胞的分裂以形成种子胚胎部分满足了无融合生殖的条件，只要种子的胚乳也可以完全的发育以产生一个可行的繁殖。实施例9
无融合生殖在高效种子生产中的应用

[0126] 无融合生殖导致母株的子代遗传特性。母株可以是高度杂合的，但是由于无融合生殖绕过了减数分裂，在种子衍生的子代中没有性状的分离。无融合生殖可以被用于在杂交作物中更有效地杂交种子生产，如玉米等，而消除了对在隔离生长中使用分离的父本和母本以产生杂交种子的需求。无融合生殖也可以被用于杂合作物种子的孤雌繁殖，所述杂合作物如土豆等，其通常是通过块茎，器官而无融合生殖的，所述器官可以携带和跨代传播疾病的。无融合生殖还可以促进作物中杂交种的发育，其中由于缺乏可以在商业规模上容易杂交的亲本品系，杂交种目前无法应用。无融合生殖可以被用作育种工具以增加和测试大量经由有性生殖所产生的但是通过无融合生殖增加的新的杂交种。本发明，即未受精的卵细胞发育成胚胎，是无融合生殖或通过种子的克隆繁殖的一个重要组成部分。

[0127] 在上面描述的各种方法和技术提供了实施本发明的多种方式。当然，可以理解的是，根据本文描述的任何特定实施方案，不需要实现所描述的所有目标或优点。因此，例如，本领域的技术人员将认识到，这些方法可以以如下的方式实施，所述方式是获得或优选如本文所教导的一个优点或一群优点而没有必要获得如本文所教导或建议的其它目的或优点。各种替代方式在本文中被提及。应该理解的是，一些优选的实施方案具体的包括一个，另一个，或若干个特征，而其它具体的排除一个，另一个，或若干个特征，而仍然其它通过包含一个，另一个，或若干个有益的特征以减轻特定的特征。

[0128] 此外，本领域技术人员将认识到来自不同实施方案的各种特征的适用性。类似地，以上所讨论的各种要素，特征或步骤，以及每一类这些要素，特征或步骤的其它已知等价物，可以由在本领域中普通技术人员按照本文所描述的原理实施的方法以各种组合而应用。在不同的实施方案中，各种要素，特征和步骤中的某些将被明确的包括和其它被特异的排除。

[0129] 虽然本申请已经在某些实施方案和实施例的上下文中被公开，应当被本领域技术人员理解的是，本申请的实施方案延伸超出具体公开的实施方案到其它替代实施方案和/或应用和修改及其等同物。

[0130] 在一些实施方案中，表示成分数量、特性的数字，例如分子量，反应条件等，用于描述和宣称本申请的某些实施方案，在某些情况下应被理解为被术语“约”所修饰。因此，在一些实施方案中，在书面的说明书和所附的权利要求书中陈述的数值参数是近似值，其可以取决于通过特定实施方式力求获得的所需性质而变化。在一些实施方案中，所述数值参数应该根据所报道的显著数字的数目和通过应用普通的四舍五入技术而解释。尽管在本申请的一些实施方案中列出广泛范围的数值和参数是近似值，在具体实施例中列出的数值是被尽可能精确地执行。

[0131] 在一些实施方案中，在描述本申请一个具体实施方案的上下文中使用的术语“一”和“一个”和“该”和类似物(特别是在某些以下权利要求的上下文中)可以被解释为涵盖单数和复数。本文数值的范围叙述是仅意欲于用作对落入在该范围内的每一个单独数值分别提及的速记方法。除非本文另有说明，每个单独的数值被结合到本说明书中，就好像它是在本文中单独列举的。本文所描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或另外与上下文有明显的矛盾。提供给相对于本文某些实施方案的任何和所有实施例，或示例性语言(例如，“如”)的应用，仅仅是意欲更好地说明本申请，并且不造成对所要求的其它的本申请范围的限制。说明书中的语言不应当被解释为表示本申请实施所必须的任何非要求保护的元素。

[0132] 本申请的优选实施方式在本文中被描述，其包括用于实施本申请的发明人已知的最佳模式。在阅读前面的描述后，这些优选实施方案的变体将变得对本领域的普通技术人员是显而易见的。可以预期的是本领域技术人员可以适当的使用这样的变体，并且本申请可以以本文具体描述之外的其它方式来实施。因此，本申请的许多实施方案包括由适用的法律所允许的所附权利要求书中列举主题的所有修改和等同物。此外，在其所有可能变体中上述要素的任何组合是被本申请所包括的，除非本文另有说明或另外与上下文有明显矛盾。

[0133] 所有的专利，专利申请，专利申请出版物和其他材料，如文章，书籍，说明书，出版物，文件，事物和/或类似物，本文的参考文献因此为了所有的目的通过引用而以全文并入本文，除非与此相关的任何起诉提交历史，任何与本申请文件不符合或相冲突的，或任何可能对现在或以后与本申请文件相关的权利要求书的最广泛范围具有限制影响的。通过举例的方式，在与任何掺入物质相关的描述，定义和/或术语应用与本申请文件相关部分之间可能存在任何不一致或冲突，以在本申请文件中描述，定义和/或术语应用为准。

[0134] 最后，应该理解的是，本文所描述的本申请的实施方案是对本申请实施方案原理的说明。可以使用的其它修改可以是在本申请的范围内。因此，以举例的方式，但不是限制性的，本申请实施方案的替代性配置可以根据本文的教导而应用。因此，本申请的实施方案是不限于精确的如显示和描述的实施方案。