鉴定多倍体作物优良单倍型的方法及应用、NPC6基因在油菜种子产油量育种中的应用
阅读：232发布：2020-05-08
专利汇可以提供鉴定多倍体作物优良单倍型的方法及应用、NPC6基因在油菜种子产油量育种中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于作物分子育种技术领域，尤其涉及鉴定 多倍体 作物优良单倍型的方法及应用、NPC6基因在油菜 种子 产油量育种中的应用。本发明首次构建了在多倍体作物中能够快速鉴定目标性状优良单倍型的方法，并以油菜产油量为例，快速鉴定到一个能够提高甘蓝型油菜种子产油量的优良单倍型；确定了NPC6基因与油菜产油量之间的关系，为甘蓝型油菜产油量育种提供有重要价值的基因信息。，下面是鉴定多倍体作物优良单倍型的方法及应用、NPC6基因在油菜种子产油量育种中的应用专利的具体信息内容。
1.一种鉴定多倍体作物优良单倍型的方法，其特征在于，包括：
获取目标作物自然群体的全基因组SNP数据，以及所述自然群体的目标表型数据；
针对目标性状，获取可能调控目标性状的基因数据；
鉴定可能调控目标性状的基因在目标作物中的同源基因；
基于目标作物基因组的LD decay，获得同源基因上下游各2倍LD decay区段内的SNP数据；
基于所述LD decay区段内的SNP数据，结合目标性状的表型数据，进行候选基因关联分析，鉴定与目标性状显著关联的SNP；
基于显著关联的SNP信息，鉴定目标基因在自然群体中的优势单倍型。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定多倍体作物优良单倍型的方法，其特征在于：获取目标作物基因组LD decay的方法包括从发表的文献中查询或利用SNP基因型数据进行计算。
3.如权利要求1或2所述的鉴定多倍体作物优良单倍型的方法在多倍体作物优良单倍型鉴定中的应用。
4.根据权利要求3所述的鉴定多倍体作物优良单倍型的方法在多倍体作物优良单倍型鉴定中的应用，其特征在于：所述多倍体作物包括油菜。
5.根据权利要求4所述的鉴定多倍体作物优良单倍型的方法在多倍体作物优良单倍型鉴定中的应用，其特征在于：包括在甘蓝型油菜种子产油量优良单倍型鉴定中的应用。
6.根据权利要求5所述的鉴定多倍体作物优良单倍型的方法在多倍体作物优良单倍型鉴定中的应用，其特征在于：包括在鉴定NPC基因与甘蓝型油菜种子产油量的关系中的应用。
7.根据权利要求6所述的鉴定多倍体作物优良单倍型的方法在多倍体作物优良单倍型鉴定中的应用，其特征在于：所述NPC基因包括NPC6基因。
8.NPC6基因在油菜种子产油量育种中的应用。
鉴定多倍体作物优良单倍型的方法及应用、NPC6基因在油菜
种子产油量育种中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于作物分子育种技术领域，尤其涉及鉴定多倍体作物优良单倍型的方法及应用、 NPC6基因在油菜种子产油量育种中的应用。
背景技术
[0002] 目前绝大部分的作物相对其原始祖先，都经历过基因组的多倍化或者复制，因此大部分的作物为多倍体，典型的作物如：小麦、甘蓝型油菜、棉花、大豆等。作物复杂的基因组为挖掘作物本身优良变异、鉴定目标性状优良基因带来了很大的挑战与困难。
[0003] 甘蓝型油菜是我国也是世界上最重要的油料作物之一，其是在约7500年前由二倍体的白菜(AA；2n＝2x＝20)和甘蓝(CC；2n＝2x＝18)自然杂交形成的异源四倍体(AACC；2n＝4x＝38)。由于白菜和甘蓝同属芸薹属，因此在A基因组和C基因组间存在大量的同源片段，因此甘蓝型油菜异源四倍体的基因组内存在大量的同源染色体片段交换，其基因组高度复杂。
[0004] 油菜最重要的育种目标是提高其种子的产油量，产油量是由单株产量和种子含油量二个性状组成。对于大部分的作物来讲，在人类长期驯化的过程中，对作物的产量和种子含油量进行了长期的人工选择(人类偏向于选择产量高，种子含油量高的后代)。因此对于这二个性状来讲，其受多位点或者多基因控制，且具有加性效应，每个位点或者基因对目标性状的贡献相对其他性状来讲较小。
[0005] 植物种子含油量遗传调控机制复杂。例如，在模式植物拟南芥中，参与植物油脂积累与代谢的基因多达600多个，但是并不是所有这些基因最终都会影响成熟种子的含油量。而且这些基因中部分存在负向效应，例如在玉米中过表达LEC1基因虽然能够提高种子的含油量，但同时造成种子发芽率降低、叶片发育不良进而影响产量(Expression of ZmLEC1 and ZmWRI1 increases seed oil production in maize,Shen et al.,2010)；在拟南芥中过表达PLIP1虽然能够提高种子含油量，但同时植物生长弱小、产量严重降低(A plastid phosphatidylglycerol lipase contributes to the export of acyl groups from plastids for seed oil biosynthesis,Wang et al., 2017)。因此在植物中筛选鉴定既能提高植物种子含油量、同时又不影响产量或者能同时提高产量是一个巨大的挑战。甘蓝型油菜作为异源四倍体作物，和拟南芥同属十字花科。平均而言，一个拟南芥的基因在甘蓝型油菜中存在4-6个拷贝，因此，在甘蓝型油菜中参与油脂代谢与调控的基因可能高达3000个(甘蓝型油菜全基因预测共有10万个基因)，但是这些基因中哪些基因最终确实影响了成熟种子油脂的积累，以及其自然变异目前并不清楚。
[0006] 目前针对甘蓝型油菜复杂的基因组及其基因组特性开展研究常规选择的策略一般是全基因组关联分析(GWAS)。全基因组关联分析(GWAS)，是基于人类群体的特点(没有办法人工创造特殊的用于遗传学研究的群体)，创建的用于发掘人类基因组变异与特殊性状/疾病之间的关系。GWAS也在植物中开展了大规模的研究和应用，用于挖掘作物基因组的优良变异和目标性状的遗传机制以及单倍型。基于GWAS的原理和方法，一般情况下需要目标物种的组装良好的基因组，以及在全基因组范围内的高通量、高密度SNP的信息，基于目标性状与SNP信息的关联，利用不同的算法及模型鉴定目标性状关联的SNP和单倍型。
[0007] 但是，传统的研究方法存在如下的缺点：(1)：传统方法基于全基因SNP，算法费时，需占用大量的服务器内存和资源；(2)：检出效率低。通常情况下，最终获得的与目标性状紧密关联的SNP只占全基因组的0.1％不到甚至更少；(3)：假阳性率高。由于通用算法的限制，目前只能利用表型和基因型数据进行较为简单的关联，较难控制遗传背景、群体结构、SNP 间的互作等带来的检出SNP高假阳性率的问题。而甘蓝型油菜复杂的基因组及其基因组特性又进一步地为挖掘其本身优良变异、鉴定目标性状优良基因带来了较大的挑战。
发明内容
[0008] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了鉴定多倍体作物优良单倍型的方法及应用、 NPC6基因在甘蓝型油菜种子产油量育种的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
[0009] 本发明是这样实现的，一种鉴定多倍体作物优良单倍型的方法，包括：
[0010] 获取目标作物自然群体的全基因组SNP数据，以及所述自然群体的目标表型数据；
[0011] 针对目标性状，获取可能调控目标性状的基因数据；
[0012] 鉴定可能调控目标性状的基因在目标作物中的同源基因；
[0013] 基于目标作物基因组的LD decay，获得同源基因上下游各2倍LD decay区段内的SNP 数据；
[0014] 基于所述LD decay区段内的SNP数据，结合目标性状的表型数据，进行候选基因关联分析，鉴定与目标性状显著关联的SNP；
[0015] 基于显著关联的SNP信息，鉴定目标基因在自然群体中的优势单倍型。
[0016] 进一步地，获取目标作物基因组LD decay的方法包括从发表的文献中查询或利用SNP 基因型数据进行计算。
[0017] 如上述的鉴定多倍体作物优良单倍型的方法在多倍体作物优良单倍型鉴定中的应用。
[0018] 进一步地，所述多倍体作物包括油菜。
[0019] 进一步地，包括在甘蓝型油菜种子产油量优良单倍型鉴定中的应用。
[0020] 进一步地，包括在鉴定NPC基因与甘蓝型油菜种子产油量的关系中的应用。
[0021] 进一步地，所述NPC基因包括NPC6基因。
[0022] NPC6基因在油菜种子产油量育种中的应用。
[0023] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：
[0024] 本发明首次构建了在多倍体作物中能够快速鉴定目标性状优良单倍型的方法，并以油菜产油量为例，快速鉴定到一个能够提高甘蓝型油菜种子产油量优良单倍型；确定了NPC6基因与油菜产油量之间的关系，为甘蓝型油菜产油量育种提供有重要价值的基因信息。
[0025] 本发明构建的鉴定方法的优点及积极效果为：1.目标明确。针对特殊性状有目标地进行候选基因关联分析，可极大提高分析效率。2.分析方法效率高、耗时低。该方法只用到了传统方法5％不到的SNP基因型信息，极大地降低了计算量，该方法在常规操作下(常规服务器下20线程(CPU)，64G内存)1个小时内即可完成，而传统方法一般需要超过24个小时甚至更长。3.假阳性率低。本发明由于极好地控制了目标候选基因，并且排除了目标作物复杂基因组的影响，以及群体结构和遗传背景的影响，能很好控制假阳性率，获得的关联SNP 真实可靠(与目标性状在群体中的表现一致)；而传统方法由于其算法、占用服务器资源大以及耗时长等原因，只能进行SNP和目标性状的简单关联，无法排除物种的基因组结构，群体结构和遗传背景的影响。4.直接与目标基因关联。传统方法在全基因组范围内筛选与目标性状相关联的SNP，在某些区段由于LD decay较大或者SNP分布较少，即使能找到关联的SNP，但是很难将目标区段缩小到基因范围。本发明中选取目标基因上下游各2倍LD decay的区段进行分析，最为经济而且有效。既避免了1倍区段在很多情况下很难确定置信区间边界的问题，同时又避免了选取3倍或更长区段，包含的无用信息太多。
[0026] 目前在植物中通过正向遗传学鉴定出来的控制种子含油量的基因/位点的效应可以达到 1％左右，甚至更低。已进行研究的植物主要有拟南芥、大豆、玉米、油菜。例如Liu et al.(2016) 利用甘蓝型油菜自然群体鉴定到5个控制种子含油量的位点，其中效应最大的位点(OILA5) 利用双亲群体进行了确认，其表型效应仅有0.9％。在油菜中通常每增加1％的含油量相当于增加2.5-3％的产量。在本发明中，甘蓝型油菜BnNPC6.C01的单倍型NPC6.C01-1能同时提高含油量2.1％，千粒重1.4％，产量6.1％，是目前通过正向遗传学鉴定到的对含油量效应最大、并且能同时提高产量的基因。
附图说明
附图说明
[0027] 图1是甘蓝型油菜NPC基因的表达量分析结果；
[0028] 图2是含油量、千粒重、单株产量候选基因关联分析曼哈顿图；
[0030] 图4是BnNPC6.C01的单倍型分析。
具体实施方式
[0031] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0032] 本发明披露了鉴定多倍体作物优良单倍型的方法及应用、NPC6基因在油菜种子产油量育种中的应用，具体如下各实施例所示。
[0033] 实施例1鉴定多倍体作物优良单倍型方法的主要流程
[0034] 1.获取目标作物自然群体的全基因组SNP数据，以及该群体的目标表型数据。
[0035] 2.针对目标性状，获取可能调控目标性状的基因数据。例如，含油量，生育期等，这些在模式植物中有较为系统的研究。
[0036] 3.鉴定这些基因在目标作物中的同源基因。
[0037] 4.基于目标作物基因组的LD decay(可以从发表的文献中获取，也可以利用SNP基因型数据进行计算)，获得这些同源基因上下游各2倍LD decay区段内的SNP数据。
[0038] 5.基于上述获得的SNP数据，结合目标性状的表型数据，进行候选基因关联分析，鉴定与目标性状显著关联的SNP。
[0039] 6.基于显著关联的SNP信息，鉴定目标基因在自然群体中的优势单倍型。
[0040] 实施例2鉴定多倍体作物优良单倍型方法在油菜产油量优良单倍型鉴定中的应用[0041] 非特异性磷脂酶C(NPC)是一种新的磷脂酶C类型，为探索NPC基因是否与油菜产油相关，以及二者之间的具体相互作用关系，本发明利用实施例1中建立的方法对二者之间的关系进行探索。本实施例包含505份甘蓝型油菜自交系的自然群体。本发明本实施例涉及到的方法如下所示：
[0042] 基因型分析：采用CTAB法提取505份甘蓝型油菜自交系及5组亲本/F1组合幼嫩叶片高质量的基因组DNA。利用 Infinium Brassica 60K SNP芯片进行基因分型。SNP 基因分型参照Illumina公司提供的操作流程( HD Assay Ultra Protocol Guide, http://www.illumina.com/)。SNP的质量控制及筛选采用以下步骤。首先，使用Illumina GenomeStudioV2011.1软件对SNP数据进行自动聚类；然后，根据505份材料以及5组亲本 /F1组合聚类情况对自动聚类错误的结果进行人工校正；最后对SNP进行筛选，删除AA或 BB基因型频率为0，缺失基因型频率大于20％，杂合基因型AB频率大于20％，最小等位基因频率(MAF)小于或等于0.05的SNPs。
[0043] 利用BlastN程序(Altschul et al 1990)将52,157SNPs的50bp探针序列定位到甘蓝型油菜Darmor-bzh参考基因组(Brassica napus v4.1,Chalhoub et al 2014)上。以E-value≤1E-10为阈值，只取blast比对得分最高的结果，去除blast到多个位置且得分相同的结果。SNP的位置根据探针的blast结果确定，去除位置不确定的SNP。
[0044] 表型调查：505份甘蓝型油菜自交系于2012-2013年种植于重庆西南大学油菜试验田(代码CQ2013)，2012-2013、2013-2014年连续两年种植于武汉华中农业大学油菜试验田(代码 WH2013和WH2014)。田间试验设计采用完全随机区组试验，每份材料种植二行区三次重复，每行保留11-12株材料，株距21cm，行距30cm。田间管理按一般的大田管理进行。
[0045] 自然群体收获时，每个小区选取中间长势均匀一致的自由授粉的8个单株整株收获后挂入挂藏室自然风干。然后整株脱粒，去杂后称取每个单株种子的净含量作为单株产量。然后随机取1000粒种子称取重量作为千粒重(随机取3次)。每个单株取至少3克种子，利用 Foss公司NIRSystems5000近红外仪测定种子含油量，取小区平均值作为每个材料的含油量值，以占种子干重的百分比表示。表型的统计分析主要采用SAS9.3软件。采用一般线性模型 (GLM)，将表型变异分解为遗传变异、环境变异、基因型×环境互作变异和误差。在P＝0.05 显著性水平下，采用Shapiro-Wilk方法对含油量表型进行正态性检验。采用PROCGLM方法计算群体结构对表型的贡献率。依据MIXED方法采用最佳线性无偏估计(Best Linear Unbiased Prediction,BLUP)对含油量、千粒重、单株产量多环境多重复表型进行整合，BLUP结果作为表型值用于全基因组关联分析。
[0046] 候选基因关联分析：首先利用同源序列法鉴定甘蓝型油菜中所有的NPC基因，然后选取这些NPC基因上下游二倍LD decay区间(甘蓝型油菜基因组的平均LD decay为0.45Mb，本实施例选取上下游各1Mb的区间)的SNP，然后利用混合线性模型进行候选基因关联分析。选取5.0和7.3分别作为significant(-log(1e-5)＝5.0)and rigorous(-log(5e-8)＝7.3)阈值鉴定和表型显著相关的SNP位点。
[0047] 具体到本实施例的甘蓝型油菜产油优良单倍体的鉴定中，详细如下：
[0048] 甘蓝型油菜基因组NPC基因的鉴定：本实施例利用拟南芥中已知的6个NPC基因的CDS 序列，通过blast甘蓝型油菜基因组(Darmor-bzh和中双11)，一共鉴定到13个NPC基因，结果如下表1所示：
[0049] 表1：甘蓝型油菜NPC基因家族信息
[0050]
[0051] 甘蓝型油菜NPC基因表达模式分析：为了进一步分析上述鉴定得到的甘蓝型油菜NPC 基因在甘蓝型油菜的不同组织中是否有表达，本实施例提取了野生型甘蓝型油菜(华双5号) 不同组织的RNA，然后利用real-time PCR的方法对上述13个NPC基因的表达量进行分析，结果如图1所示。结果显示BnNPC2.A09,BnNPC4/5.C01,和BnNPC6.C08在上述检测的8个组织中几乎不表达，因此这个三个基因为假基因。
[0052] 植物组织RNA提取、反转录、real-time PCR的方法及体系参照Expression of Brassica napus TTG2,a regulator of trichome development,increases plant sensitivity to salt stress by suppressing the expression of auxin biosynthesis genes.Li et al.(2015)的方法，内参引物选取甘蓝型油菜 ACT7，实验所用引物如下表2：
[0053] 表2：荧光定量PCR(real-time PCR)用引物(5’to 3’)
[0054]
[0055]
[0056] 候选基因关联分析：利用上述13个基因上下游各1Mb区段内的所有SNP位点(289,824 个SNP位点)，与含油量、千粒重、单株产量等三个性状开展候选基因关联分析，鉴定潜在的提高产油量的SNP位点/基因。
[0057] 结果如图2和表3所示，其中图2中横线分别为阈值5.0和7.3。结果显示，NPC同源基因BnNPC3.A05,BnNPC4/5.A01,BnNPC4/5.C01和BnNPC6.C01这四个基因与含油量显著关联。然而BnNPC4/5.C01为假基因，因此剩余三个为潜在的含油量关联候选基因。
[0058] 表3：与含油量(SOC)、千粒重(TSW)、单株产量(PY)显著关联的SNP信息[0059]
[0060]
[0061] a:SOC:含油量；TSW:千粒重；PY:单株产量；
[0062] b:下划线左边和右边的数字分别代表在阈值5.0和7.3下鉴定到的SNP位点的数目；
[0063] c:峰值SNP解释的表型变异(％)。
[0064] 为了进一步分析上述三个候选基因是否同时提高产量，本实施例利用上述关联到的峰值 SNP的基因型，对自然群体进行基因分型，然后分析不同基因型间的表型变化，结果如图3 所示。
[0065] 结果显示BnNPC3.A05基因的C单倍型虽然能提高含油量，但是也同时降低单株产量；类似地，BnNPC4/5.C01的C单倍型提高含油量的同时，千粒重和单株产量也随之降低；仅有BnNPC6.C01的A单倍体能同时提高含油量，千粒重和单株产量，因此该基因在提高甘蓝型油菜产油量中具有重要的作用。
[0066] BnNPC6.C01的优势单倍型分析：为了进一步鉴定该基因在自然群体中的自然变异，鉴定这些自然变异中的优势单倍型，本实施例对该基因的启动子、编码区和下游进行了测序，然后结合表型数据进行优势单倍型分析，结果如图4所示。BnNPC6.C01-HAP1和 BnNPC6.C01-HAP2的基因序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
[0067] 结果显示BnNPC6.C01的单倍型NPC6.C01-1能同时提高含油量2.1％，千粒重1.4％，产量6.1％，表明该单倍型在甘蓝型油菜产油量育种中具有重要的应用价值。
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