技术领域
[0001] 本
发明涉及分离纯化技术领域，更具体地说，它涉及一种白藜芦醇提取分离纯化工艺。
背景技术
[0002] 白藜芦醇(化学名为芪三酚)是含有芪类结构的非黄
酮多酚类化合物，是
植物在受到应激时自身合成的一种抗毒素，难溶于
水，易溶于甲醇、
乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等
有机溶剂。主要有抗
肿瘤、抗炎、抗菌、抗
氧化、抗自由基、保护肝脏、保护心血管和抗心肌缺血等功能，被广泛应用于食品保健品、
化妆品及医药领域。
[0003] 目前白藜芦醇的生产主要是
植物提取法。提取白藜芦醇的植物有葡萄、花生、桑葚、虎杖等。然而，植物中的白藜芦醇含量非常低，使得其分离纯
化成本偏高。而白藜芦醇类似物白藜芦醇苷在植物中的含量为白藜芦醇的7～12倍，如果将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，白藜芦醇的产率可大大提高。酶法
水解白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，因条件温和，反应产物较单一，产率高，而被广泛采用。但是传统酶法水解白藜芦醇苷方法中，酶分散在溶液中易失活，不易回收，成本高。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种白藜芦醇提取分离纯化工艺，其具有低成本，可反复提取白藜芦醇的。
[0005] 本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种白藜芦醇提取分离纯化工艺，其特征在于：包括如下步骤：
[0006] S1:植物样品处理：将植物碾磨
粉碎，并加入
多倍体积的去离子水制成植物样品悬浮液；
[0007] S2:制备β-
葡萄糖苷酶酶液：将产β-葡萄糖苷酶的菌种接种于培养基中，在25℃～50℃，摇床转速120～220rpm的条件下，产酶
发酵36～72小时，然后将所有发酵物在5000～
10000r/min的转速下离心15～40min，收集上清液即获得β-葡萄糖苷酶粗酶液，将β-葡萄糖苷酶粗酶液进一步在4000～12000r/min的转速下离心15min，去除上清液，得到提纯的β-葡萄糖苷酶酶液；
[0008] S3:固定化酶：取5mlβ-葡萄糖苷酶酶液，加到3mL
质量分数为3.5％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，再加入适量戊二
醛溶液，在摇床中恒温振荡，用5mL
注射器吸取
混合液，以10cm左右高度逐滴注入质量分数为2％的CaCl2溶液中，立即形成光滑的凝胶状小球，出凝胶小球，更换CaCl2溶液，置于4℃
冰箱中静置硬化2h；再次滤出凝胶小球，用质量分数为
0.9％的NaCl溶液洗涤3次再用蒸馏水冲洗2次，得固定化β-葡萄糖苷酶；
[0009] S4:向植物样品悬浮液中加入固定化β-葡萄糖苷酶酶液，充分搅拌后于25℃～45℃条件下静置转化反应15～24小时；或充分搅拌后置于25℃～45℃、摇床转速80～180rpm条件下进行转化反应；
[0010] S5:转化液收集：将S4转化反应后的所有物料以4000～8000r/min条件离心，收集上清液即得含白藜芦醇的溶液；
[0011] S6:白藜芦醇的提取纯化：向步骤S5获得的含白藜芦醇的溶液中加入其1倍体积量的50～95％的乙醇，在50℃～100℃
温度下进行加热回流提取，得纯β-葡萄糖苷酶的转化产物-白藜芦醇液。
[0012] 通过采用上述技术方案，将β-葡萄糖苷酶通过包埋法固定，固定化酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化酶极易与反应体系分离，简化了提纯工艺，而且产品收率高、质量好；在多数情况下，酶经固定化后
稳定性得到提高；固定化酶的催化反应过程更易控制。另外，将植物样品制成悬浮液可与固定化酶充分反应，加快反应速度，提高了植物样品的利用率。
[0013] 进一步的，S1中的所述植物样品可选用葡萄、花生、桑葚或虎杖。
[0014] 进一步的，S1中加入三倍或四倍体积的去离子水制成植物样品悬浮液。
[0015] 进一步的，S2中所述产β-葡萄糖苷酶的菌选桔青霉(Penicillium citrinum)CGMCC 3.2938，少根根霉(Rhizopus arrhizus)CGMCC No.1963，绿色木霉(Trichodermaviride)CGMCC No.1962，毛霉(Mucor sp.)CGMCC NO.0151，土曲霉(Aspergillus terreus)CGMCC No.0569中的一种。
[0016] 进一步的，S3中制备得到的固定化β-葡萄糖苷酶用吸水纸吸干小球表面水分，贮存于4℃冰箱中备用。
[0017] 进一步的，S5中离心速度为10～15min。
[0018] 进一步的，S6中加热回流提取的温度为60℃～100℃。
[0019] 进一步的，S4中转化反应的时间为5～24小时。
[0020] 综上所述，本发明具有以下有益效果：
[0021] 将β-葡萄糖苷酶通过包埋法固定，固定化酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化酶极易与反应体系分离，简化了提纯工艺，而且产品收率高、质量好；在多数情况下，酶经固定化后稳定性得到提高；固定化酶的催化反应过程更易控制。另外，将植物样品制成悬浮液可与固定化酶充分反应，加快反应速度，提高了植物样品的利用率。且利用
微生物酶法水解植物中的白黎芦醇苷，将其转化为白黎芦醇，具有条件温和，反应产物较单一，产物得率高，环境友好等许多优点，从而可以克服传统的糖苷水解反应需要在高温高压下，由酸或
碱催化来完成，对设备要求高，且对环境造成污染的缺点。
具体实施方式
[0023] 一种白藜芦醇提取分离纯化工艺，其特征在于：包括如下步骤：
[0024] S1:植物样品处理：将植物碾磨粉碎，并加入三倍体积的去离子水制成植物样品悬浮液，植物选用葡萄；
[0025] S2:制备β-葡萄糖苷酶酶液：将产β-葡萄糖苷酶的桔青霉(Penicillium citrinum)CGMCC 3.2938接种于培养基中，在25℃，摇床转速120rpm的条件下，产酶发酵36小时，然后将所有发酵物在5000r/min的转速下离心15min，收集上清液即获得β-葡萄糖苷酶粗酶液，将β-葡萄糖苷酶粗酶液进一步在4000r/min的转速下离心15min，去除上清液，得到提纯的β-葡萄糖苷酶酶液；
[0026] S3:固定化酶：取5mlβ-葡萄糖苷酶酶液，加到3mL质量分数为3.5％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，再加入适量戊二醛溶液，在摇床中恒温振荡，用5mL注射器吸取混合液，以10cm左右高度逐滴注入质量分数为2％的CaCl2溶液中，立即形成光滑的凝胶状小球，出凝胶小球，更换CaCl2溶液，置于4℃冰箱中静置硬化2h；再次滤出凝胶小球，用质量分数为
0.9％的NaCl溶液洗涤3次再用蒸馏水冲洗2次，得固定化β-葡萄糖苷酶，吸水纸吸干小球表面水分，贮存于4℃冰箱中备用；
[0027] S4:向植物样品悬浮液中加入固定化β-葡萄糖苷酶酶液，充分搅拌后于25℃条件下静置转化反应15小时；或充分搅拌后置于25℃、摇床转速80rpm条件下进行转化反应12小时；
[0028] S5:转化液收集：将S4转化反应后的所有物料以4000r/min条件离心10min，收集上清液即得含白藜芦醇的溶液；
[0029] S6:白藜芦醇的提取纯化：向步骤S5获得的含白藜芦醇的溶液中加入其1倍体积量的50％的乙醇，在60℃℃温度下进行加热回流提取，得纯β-葡萄糖苷酶的转化产物-白藜芦醇液。
[0030] 实施例2：
[0031] 一种白藜芦醇提取分离纯化工艺，其特征在于：包括如下步骤：
[0032] S1:植物样品处理：将植物碾磨粉碎，并加入三倍体积的去离子水制成植物样品悬浮液，植物选用花生；
[0033] S2:制备β-葡萄糖苷酶酶液：将产β-葡萄糖苷酶的少根根霉(Rhizopus arrhizus)CGMCC No.1963接种于培养基中，在30℃，摇床转速140rpm的条件下，产酶发酵40小时，然后将所有发酵物在6000r/min的转速下离心20min，收集上清液即获得β-葡萄糖苷酶粗酶液，将β-葡萄糖苷酶粗酶液进一步在6000r/min的转速下离心15min，去除上清液，得到提纯的β-葡萄糖苷酶酶液；
[0034] S3:固定化酶：取5mlβ-葡萄糖苷酶酶液，加到3mL质量分数为3.5％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，再加入适量戊二醛溶液，在摇床中恒温振荡，用5mL注射器吸取混合液，以10cm左右高度逐滴注入质量分数为2％的CaCl2溶液中，立即形成光滑的凝胶状小球，出凝胶小球，更换CaCl2溶液，置于4℃冰箱中静置硬化2h；再次滤出凝胶小球，用质量分数为
0.9％的NaCl溶液洗涤3次再用蒸馏水冲洗2次，得固定化β-葡萄糖苷酶，吸水纸吸干小球表面水分，贮存于4℃冰箱中备用；
[0035] S4:向植物样品悬浮液中加入固定化β-葡萄糖苷酶酶液，充分搅拌后于30℃条件下静置转化反应17小时；或充分搅拌后置于30℃、摇床转速100rpm条件下进行转化反应16小时；
[0036] S5:转化液收集：将S4转化反应后的所有物料以5000r/min条件离心11min，收集上清液即得含白藜芦醇的溶液；
[0037] S6:白藜芦醇的提取纯化：向步骤S5获得的含白藜芦醇的溶液中加入其1倍体积量的60％的乙醇，在70℃温度下进行加热回流提取，得纯β-葡萄糖苷酶的转化产物-白藜芦醇液。
[0038] 实施例3：
[0039] 一种白藜芦醇提取分离纯化工艺，其特征在于：包括如下步骤：
[0040] S1:植物样品处理：将植物碾磨粉碎，并加入三倍体积的去离子水制成植物样品悬浮液，植物选用桑葚；
[0041] S2:制备β-葡萄糖苷酶酶液：将产β-葡萄糖苷酶的毛霉(Mucor sp.)CGMCC NO.0151接种于培养基中，在37.5℃，摇床转速170rpm的条件下，产酶发酵54小时，然后将所有发酵物在7500r/min的转速下离心27.5min，收集上清液即获得β-葡萄糖苷酶粗酶液，将β-葡萄糖苷酶粗酶液进一步在7000r/min的转速下离心15min，去除上清液，得到提纯的β-葡萄糖苷酶酶液；
[0042] S3:固定化酶：取5mlβ-葡萄糖苷酶酶液，加到3mL质量分数为3.5％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，再加入适量戊二醛溶液，在摇床中恒温振荡，用5mL注射器吸取混合液，以10cm左右高度逐滴注入质量分数为2％的CaCl2溶液中，立即形成光滑的凝胶状小球，出凝胶小球，更换CaCl2溶液，置于4℃冰箱中静置硬化2h；再次滤出凝胶小球，用质量分数为
0.9％的NaCl溶液洗涤3次再用蒸馏水冲洗2次，得固定化β-葡萄糖苷酶，吸水纸吸干小球表面水分，贮存于4℃冰箱中备用；
[0043] S4:向植物样品悬浮液中加入固定化β-葡萄糖苷酶酶液，充分搅拌后于35℃条件下静置转化反应19.5小时；或充分搅拌后置于35℃、摇床转速130rpm条件下进行转化反应18小时；
[0044] S5:转化液收集：将S4转化反应后的所有物料以6000r/min条件离心12.5min，收集上清液即得含白藜芦醇的溶液；
[0045] S6:白藜芦醇的提取纯化：向步骤S5获得的含白藜芦醇的溶液中加入其1倍体积量的72.5％的乙醇，在80℃温度下进行加热回流提取，得纯β-葡萄糖苷酶的转化产物-白藜芦醇液。
[0046] 实施例4：
[0047] 一种白藜芦醇提取分离纯化工艺，其特征在于：包括如下步骤：
[0048] S1:植物样品处理：将植物碾磨粉碎，并加入三倍体积的去离子水制成植物样品悬浮液，植物选用虎杖；
[0049] S2:制备β-葡萄糖苷酶酶液：将产β-葡萄糖苷酶的土曲霉(Aspergillus terreus)CGMCC No.0569接种于培养基中，在37.5℃，摇床转速170rpm的条件下，产酶发酵54小时，然后将所有发酵物在7500r/min的转速下离心27.5min，收集上清液即获得β-葡萄糖苷酶粗酶液，将β-葡萄糖苷酶粗酶液进一步在7000r/min的转速下离心15min，去除上清液，得到提纯的β-葡萄糖苷酶酶液；
[0050] S3:固定化酶：取5mlβ-葡萄糖苷酶酶液，加到3mL质量分数为3.5％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，再加入适量戊二醛溶液，在摇床中恒温振荡，用5mL注射器吸取混合液，以10cm左右高度逐滴注入质量分数为2％的CaCl2溶液中，立即形成光滑的凝胶状小球，出凝胶小球，更换CaCl2溶液，置于4℃冰箱中静置硬化2h；再次滤出凝胶小球，用质量分数为
0.9％的NaCl溶液洗涤3次再用蒸馏水冲洗2次，得固定化β-葡萄糖苷酶，吸水纸吸干小球表面水分，贮存于4℃冰箱中备用；
[0051] S4:向植物样品悬浮液中加入固定化β-葡萄糖苷酶酶液，充分搅拌后于35℃条件下静置转化反应19.5小时；或充分搅拌后置于35℃、摇床转速130rpm条件下进行转化反应18小时；
[0052] S5:转化液收集：将S4转化反应后的所有物料以6000r/min条件离心12.5min，收集上清液即得含白藜芦醇的溶液；
[0053] S6:白藜芦醇的提取纯化：向步骤S5获得的含白藜芦醇的溶液中加入其1倍体积量的72.5％的乙醇，在80℃温度下进行加热回流提取，得纯β-葡萄糖苷酶的转化产物-白藜芦醇液。
[0054] 实施例5：
[0055] 一种白藜芦醇提取分离纯化工艺，其特征在于：包括如下步骤：
[0056] S1:植物样品处理：将植物碾磨粉碎，并加入三倍体积的去离子水制成植物样品悬浮液，植物选用虎杖；
[0057] S2:制备β-葡萄糖苷酶酶液：将产β-葡萄糖苷酶的土曲霉(Aspergillus terreus)CGMCC No.0569接种于培养基中，在50℃，摇床转速220rpm的条件下，产酶发酵72小时，然后将所有发酵物在10000r/min的转速下离心40min，收集上清液即获得β-葡萄糖苷酶粗酶液，将β-葡萄糖苷酶粗酶液进一步在12000r/min的转速下离心15min，去除上清液，得到提纯的β-葡萄糖苷酶酶液；
[0058] S3:固定化酶：取5mlβ-葡萄糖苷酶酶液，加到3mL质量分数为3.5％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，再加入适量戊二醛溶液，在摇床中恒温振荡，用5mL注射器吸取混合液，以10cm左右高度逐滴注入质量分数为2％的CaCl2溶液中，立即形成光滑的凝胶状小球，出凝胶小球，更换CaCl2溶液，置于4℃冰箱中静置硬化2h；再次滤出凝胶小球，用质量分数为
0.9％的NaCl溶液洗涤3次再用蒸馏水冲洗2次，得固定化β-葡萄糖苷酶，吸水纸吸干小球表面水分，贮存于4℃冰箱中备用；
[0059] S4:向植物样品悬浮液中加入固定化β-葡萄糖苷酶酶液，充分搅拌后于45℃条件下静置转化反应24小时；或充分搅拌后置于45℃、摇床转速180rpm条件下进行转化反应24小时；
[0060] S5:转化液收集：将S4转化反应后的所有物料以8000r/min条件离心15min，收集上清液即得含白藜芦醇的溶液；
[0061] S6:白藜芦醇的提取纯化：向步骤S5获得的含白藜芦醇的溶液中加入其1倍体积量的95％的乙醇，在100℃温度下进行加热回流提取，得纯β-葡萄糖苷酶的转化产物-白藜芦醇液。
[0062] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
