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一种香港牡蛎四倍体幼贝的制备方法

阅读：274发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种香港牡蛎四倍体幼贝的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种香港牡蛎四倍体幼贝的制备方法。本发明通过优选三倍体卵子、精选二倍体精子、抑制受精卵第二极体、获得四倍体幼虫、培育四倍体子代等技术环节，利用了部分三倍体卵子可以行使正常减数分裂的特性，创造了一种抑制受精卵(三倍卵子+二倍体精子)第二极体制备四倍体的育种方法。本发明不同于通过抑制受精卵第一极体获取四倍体的方法，颠覆了传统制种模式，打破了美国、法国、韩国等国外势力对牡蛎四倍体培育技术的垄断，首次获得了可存活的香港牡蛎幼贝，为今后采用生物学方法生产100％香港牡蛎三倍体提供了可行性，也为华南沿海香港牡蛎产业稳步发展，产业良种化提供了可能。本发明具有可实施、可重复、可应用等优点。，下面是一种香港牡蛎四倍体幼贝的制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种香港牡蛎四倍体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、优选三倍体卵子：在香港牡蛎繁殖季节，利用流式细胞仪检测香港牡蛎三倍体个体，选择3N个体，之后解剖三倍体，挑选性腺部分，进行显微镜镜检性别，筛选到雌性个体，选择卵子发育整齐、卵黄颜色较深、卵量≥1000万个的个体作为雌性亲本，剔除掉卵子数量少、性腺未发育及个别雄性个体；将雌性亲本的卵子挤出来，利用200目筛绢网过滤，放置于盐度15-20ppt海水中激活30-60min，之后用400目筛绢网洗卵，重复2-3次，去除杂质，待卵子完全变圆，再用流式细胞检测卵子倍性为6N的方可使用；
b、精选二倍体精子：解剖常规香港牡蛎二倍体，取部分性腺，显微镜镜检性别，选择性腺饱满、精子活力强的个体作为雄性亲本，剔除掉精子活力差或者无活力个体；待步骤a中三倍体卵子数量的90％以上变圆时，解剖雄性亲本的精子放入15-20ppt海水中激活10-
15min，显微镜下精子≥90％活蹦乱跳，利用流式细胞仪检测精子倍性为1N的方可使用；
c、抑制受精卵第二极体：单体精子加入单体三倍体卵中，控制每个卵子周围有6-9个精子，受精卵密度控制在≤3万个/ml，形成受精卵；在此期间，温度控制在28-30℃，盐度控制在15-20ppt；之后，用显微镜观察受精卵第一二极体释放时间，当第一极体的数量占比出现
50％时候，利用细胞松弛素B开始抑制受精卵，直至发现有数量的10％未处理的受精卵进入二细胞期时，药物处理结束，洗去卵液中的细胞松弛素，放置于水泥池中孵化；
d、获得四倍体幼虫：经过孵化，获得多倍体D形幼虫；
e、培育四倍体子代：采用常规方法培育四倍体幼虫，获得四倍体幼贝。
2.根据权利要求1所述的香港牡蛎四倍体的制备方法，其特征在于，所述的细胞松弛素的使用浓度是0.5mg/L的细胞松弛素B。
3.根据权利要求1或2所述的香港牡蛎四倍体的制备方法，其特征在于，所述的选择卵子发育整齐、卵黄颜色较深、卵量≥1000万个的个体作为雌性亲本，其卵子的卵径为70μm。

说明书全文

一种香港牡蛎四倍体幼贝的制备方法

技术领域：

[0001] 本发明属于海洋农业中贝类遗传育种技术领域，具体涉及一种香港牡蛎四倍体幼贝的制备方法。背景技术：

[0002] 四倍体是指细胞或生物体具有四套染色体，它不同于二倍体生物仅仅包含两套染色体，也不同于三倍体生物包括三套染色体。自然界中，天然四倍体贝类几乎尚未见报道，人工诱导的四倍体主要集中牡蛎、扇贝、贻贝等物种上。通常情况下，四倍体的生产方法包括抑制受精卵极体释放、抑制第一次卵裂、通过细胞融合或者雌核发育促使正常倍性受精卵染色体加倍，经过胚胎发育形成四倍体。经过学者们多年研究发现，利用三倍体的卵子与二倍体精子受精，通过抑制受精卵第一极体释放，可以获得存活贝类四倍体成体，其他方法目前均不适用，虽然大多数方法都可以获得四倍体幼虫，但其幼虫无法变态形成四倍体幼贝，导致后续工作研究无法开展。

[0003] 对于牡蛎而言，郭希明等采用三倍体卵子与二倍体精子受精，利用化学药物抑制受精卵第一极体，首次在国际上生产出长牡蛎四倍体，紧接着，采用相同方法培育出近江牡蛎、美洲牡蛎、熊本牡蛎等四倍体。郭希明教授在专利CN1144454A中认为，三倍体卵子与二倍体精子受精后形成的受精卵，通过抑制第一极体释放，会产生双单极分裂(在减数分裂的过程中，1个第一极体与卵细胞结合形成一组3N，1个第一极体与第二极体形成一组3N，仅第二次减数分裂过程中，向两极分离的现象)，也就是说，三倍体卵子第一极体被抑制住后，形成了3N的(1.5N卵子+1个1.5N第一极体)及3N的(1个1.5N第一极体+1.5N第二极体)，那么这样的受精卵抑制第一极体后会保留下3N的(1.5N卵子+1个1.5N第一极体)及1N的精子，从而形成四倍体，经过细心培育，获得了可存活的四倍体长牡蛎。

[0004] 经过反复研究发现，采用郭希明教授的方法，利用三倍体卵子与二倍体精子受精，抑制第一极体，可以获得一定数量的四倍体幼虫，且这种幼虫可以存活下来，形成四倍体幼贝及成体。CN102573453B专利的发明人也延续了郭希明教授的方法，改变了抑制药物的使用方法，由单独使用一种抑制剂发展为联合使用两种抑制剂，也获得了存活的长牡蛎四倍体。但发明人发现，除了利用三倍体卵子与二倍体精子受精后，抑制受精卵的第一极体方法可以获得存活四倍体外，也可以抑制其第二极体释放，获得存活牡蛎四倍体。究其原因是因为部分三倍体卵子可以执行正常的减数分裂功能，所以可以获得4N子代(1.5N卵子+1.5N第二极体+1N精子)，且该幼虫可以存活至变态，形成幼贝，长成成体。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种香港牡蛎四倍体幼贝的制备方法，利用该制备方法获得了可存活的香港牡蛎四倍体幼贝，为今后使用二倍体卵子+四倍体生精子生物学方法生产100％三倍体奠定了坚实的基础。

[0006] 为了解决华南沿海香港牡蛎夏季繁殖期过于消瘦的难题，本发明在应用了CN104255586B专利技术成功获得100％香港牡蛎三倍体基础上，利用三倍体卵子与二倍体精子受精，通过抑制第二极体释放，利用部分三倍卵子可执行正常减数分裂功能的特点，获得了可存活的香港牡蛎四倍体幼贝，为今后通过二倍体卵子+四倍体精子模式生产100％三倍体奠定了坚实的基础，也为华南区牡蛎养殖提供了新的优良品种。

[0007] 本发明的香港牡蛎四倍体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0008] a、优选三倍体卵子：在香港牡蛎繁殖季节，利用流式细胞仪检测香港牡蛎三倍体个体，选择3N个体，之后解剖三倍体，挑选性腺部分，进行显微镜镜检性别，筛选到雌性个体，选择卵子发育整齐、卵黄颜色较深、卵量≥1000万个的个体作为雌性亲本，剔除掉卵子数量少、性腺未发育及个别雄性个体；将雌性亲本的卵子挤出来，利用200目筛绢网过滤，放置于盐度15-20ppt海水中激活30-60min，之后用400目筛绢网洗卵，重复2-3次，去除杂质，待卵子完全变圆，再用流式细胞检测卵子倍性为6N的方可使用；

[0009] b、精选二倍体精子：解剖常规香港牡蛎二倍体，取部分性腺，显微镜镜检性别，选择性腺饱满、精子活力强的个体作为雄性亲本，剔除掉精子活力差或者无活力个体；待步骤a中三倍体卵子数量的90％以上变圆时，解剖雄性亲本的精子放入15-20ppt海水中激活10-15min，显微镜下精子≥90％活蹦乱跳，利用流式细胞仪检测精子倍性为1N的方可使用；

[0010] c、抑制受精卵第二极体：单体精子加入单体三倍体卵中，控制每个卵子周围有6-9个精子，受精卵密度控制在≤3万个/ml，形成受精卵；在此期间，温度控制在28-30℃，盐度控制在15-20ppt；之后，用显微镜观察受精卵第一二极体释放时间，当第一极体的数量占比出现50％时候，利用细胞松弛素B开始抑制受精卵，直至发现有数量的10％未处理的受精卵进入二细胞期时，药物处理结束，洗去卵液中的细胞松弛素，放置于水泥池中孵化；

[0011] d、获得四倍体幼虫：经过24-30h孵化，可以获得多倍体D形幼虫，经过流式细胞仪检测，发现幼虫组成仅为4N和2.5N，无其它倍性幼虫产生，其中，四倍体比率在30-90％。

[0012] e、培育四倍体子代：采用常规方法培育四倍体幼虫，当幼虫生长至第15d时，存活率为3.2-6.5％，经过检测，均为四倍体，2.5N的非整倍体已经全部死亡；经过30d培育，获得了壳高为3-5mm的四倍体稚贝，其幼虫变态率为10-20％；经过90d培育，获得了壳高2-3cm的四倍体幼贝。

[0013] 所述的细胞松弛素的使用浓度是0.5mg/L的细胞松弛素B。

[0014] 所述的选择卵子发育整齐、卵黄颜色较深、卵量≥1000万个的个体作为雌性亲本，其卵子的卵径优选为70μm左右。

[0015] 本发明不同于传统牡蛎四倍体制备方法，存在着以下主要差别：①核心技术方法完全不同：传统方法均为抑制受精卵(三倍体卵子+二倍体精子)第一极体，因为部分受精卵会出现双单极分裂现象，从而获得四倍体(3N单极分裂+1N精子)子代；而本发明是抑制受精卵(三倍体卵子+二倍体精子)第二极体，因为部分受精卵可以执行正常的减数分裂，从获得四倍体(1.5N卵子+1.5N第二极体+1N精子)子代；②处理时机不同：传统方法选择在第一极体出现开始处理，而本发明选择在50％出现第一极体开始处理；传统方法选择受精卵出现50％结束处理，而本发明选择在对照组受精卵数量的10％进入二细胞期时结束处理；③处理时间不同：传统方法利用抑制剂处理受精卵时间大多为12-15min，而本发明的处理时间为30-40min；④处理效果不同：传统方法处理获得D形幼虫组成非常复杂，包括了2N、3N、4N及非整倍体，而本发明处理后获得的D形幼虫组成比较简单，仅为2.5N和4N；⑤子代培育难度不同：传统方法获得幼虫后，幼虫存活率低于0.1％，而本发明获得的幼虫发育至眼点幼虫的存活率在1.2％以上；传统方法从眼点幼虫至变态的变态率低于1％，而本发明获得眼点幼虫至完成变态，其变态率在10％以上。

[0016] 本发明通过优选三倍体卵子、精选二倍体精子、抑制受精卵第二极体、获得四倍体幼虫、培育四倍体子代等技术环节，利用了部分三倍体卵子可以行使正常减数分裂的特性，创造了一种抑制受精卵(三倍卵子+二倍体精子)第二极体制备四倍体的育种方法。

[0017] 本发明不同于通过抑制受精卵第一极体获取四倍体的方法，颠覆了传统制种模式，打破了美国、法国、韩国等国外势力对牡蛎四倍体培育技术的垄断，首次获得了可存活的香港牡蛎幼贝，为今后采用生物学方法生产100％香港牡蛎三倍体提供了可行性，也为华南沿海香港牡蛎产业稳步发展，产业良种化提供了可能。本发明具有可实施、可重复、可应用等优点。附图说明：

[0018] 图1为传统方法，其中1-三倍体卵子；2-受精，3-抑制pb1，4-双单极分离，5-四倍体；

[0019] 传统方法技术路线图，利用三倍体卵子与二倍体精子受精，抑制受精卵第一极体，部分受精卵产生了双单极分离现象，释放出3N的第二极体，从而获得四倍体；

[0020] 图2是本发明的技术路线图，其中1-三倍体卵子；2-受精，3-释放pb1，4-抑制pb2，5-四倍体；

[0021] 本发明技术路线示意图。利用三倍体卵子与二倍体精子受精，抑制受精卵第二极体，由于部分受精卵行驶正常减数分裂功能，释放出3N的第一极体，抑制住1.5N的第二极体+1.5N卵细胞+1N精子＝4N，形成4倍体，且子代可存活；

[0022] 注：pb1表示第一极体；pb2表示第二极体；N表示一套染色体。其中，表示一套染色体(10条染色体)，而表示半套染色体(5条染色体)。具体实施方式：

[0023] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0024] 实施例1

[0025] a、优选三倍体卵子：于2017年5月30日，在香港牡蛎繁殖季节，随机选择63个壳高在12-15cm的二龄香港牡蛎三倍体，利用流式细胞仪检测三倍体个体，发现有57个3N个体，之后解剖三倍体，利用牙签挑选性腺部分，进行显微镜镜检鉴定性别，发现46个雌性个体、10个性腺未发育、1个雄性个体；在46个雌性个体中，筛选到7个性腺比较饱满，卵子质量较好个体，卵子发育整齐，卵黄颜色较深，卵径在70μm左右，将其卵子挤出来，利用200目筛绢网过滤，卵放置于盐度15ppt海水中激活30min，之后用400目筛绢网洗卵，重复3次，去除杂质，经过计算卵量在1000-2500万之间，发现有3个个体的卵子可以完全变圆，其它4个个体卵子为椭圆或者梨形，将其剔除掉，用流式细胞仪检测3个个体的卵子倍性为标准的6N，将其作为三倍体亲本卵液备用；

[0026] b、精选二倍体精子：解剖18个壳高为10-13cm的二龄二倍体香港牡蛎，利用牙签取部分性腺，显微镜镜检鉴定性别，发现有5个雄性个体，选择性腺饱满、精子活力强的3个个体作为雄性亲本，剔除掉精子活力差的2个个体；经过48min盐度15ppt海水激活，步骤a中三倍体卵子90％变圆，此时解剖3个雄性亲本个体的精子放入20ppt海水中激活10min，3个个体在显微镜下精子跳动比率分别为90％、96％、99％，利用流式细胞仪检测精子倍性为1N，作为二倍体精液备用；

[0027] c、抑制受精卵第二极体：按照单对单原则，选用步骤b中3个单体精子加入步骤a中3个单体的三倍体卵中进行人工授精，控制每个卵子周围有6-9个精子，受精卵密度控制在≤3万个/ml，不停搅拌受精卵，确保每个卵子均有精子进入，形成3组家系受精卵；在此期间，温度控制在28.2℃，盐度控制在15ppt；之后，用显微镜观察受精卵第一二极体释放时间，受精后25min时，受精卵第一极体出现50％(即在所有的受精卵中，有数量的50％比例出现第一极体的时候处理)，利用0.5mg/L的细胞松弛素B开始抑制受精卵，直至受精后60min，发现有10％数量的未处理的受精卵进入二细胞期，药物处理结束，利用400目筛绢网洗去卵液中的细胞松弛素，每个单对单家系分别放置于1m3水泥池中孵化；

[0028] d、获得四倍体幼虫：经过30h孵化，3个水泥池中均获得多倍体D形幼虫，数量分别为100万个、80万个、50万个；经过流式细胞仪检测，发现幼虫组成仅为4N和2.5N，无其它倍性幼虫产生，其中，四倍体比率分别为37.5％、54.6％、87.3％，其余的均为2.5N的非整倍体幼虫；

[0029] e、培育四倍体子代：培育四倍体子代，当幼虫生长至第15d时，3组家系存活率分别为3.2％、4.5％、6.5％，经过检测，均为四倍体，2.5N的非整倍体已经全部死亡；经过30d培育，获得了壳高为3-5mm的四倍体稚贝，3组家系分别稚贝数量为3840个、5400个、6500个，幼虫变态率分别为12％、15％、20％；经过90d培育，获得了壳高2-3cm的四倍体幼贝，3组家系从稚贝到幼贝阶段的存活率接近100％，尚未见死亡发生。

[0030] 实施例2

[0031] a、优选三倍体卵子：于2017年6月3日，在香港牡蛎繁殖季节，随机选择35个壳高在12-15cm的二龄香港牡蛎三倍体，利用流式细胞仪检测三倍体个体，发现有28个3N个体，之后解剖三倍体，利用牙签挑选性腺部分，进行显微镜镜检鉴定性别，发现23个雌性个体、5个性腺未发育；在23个雌性个体中，筛选到5个性腺比较饱满，卵子质量较好个体，卵子发育整齐，卵黄颜色较深，卵径在70μm左右，将其卵子挤出来，利用200目筛绢网过滤，卵放置于盐度20ppt海水中激活60min，之后用400目筛绢网洗卵，重复2次，去除杂质，经过计算卵量在
1000-2000万之间，发现有2个个体的卵子可以完全变圆，其它3个个体卵子为椭圆或者梨形，将其剔除掉，用流式细胞仪检测2个个体的卵子倍性为标准的6N，将其作为三倍体亲本卵液备用；

[0032] b、精选二倍体精子：解剖10个壳高为11-13cm的二龄二倍体香港牡蛎，利用牙签取部分性腺，显微镜镜检鉴定性别，发现有3个雄性个体，选择性腺饱满、精子活力强的2个个体作为雄性亲本，剔除掉精子活力差的1个个体；经过45min盐度20ppt海水激活，步骤a中三倍体卵子90％变圆，此时解剖2个雄性亲本个体的精子放入15ppt海水中激活15min，3个个体在显微镜下精子跳动比率分别为95％、99％，利用流式细胞仪检测精子倍性为1N，作为二倍体精液备用；

[0033] c、抑制受精卵第二极体：按照单对单原则，选用步骤b中2个单体精子加入步骤a中2个单体的三倍体卵中进行人工授精，控制每个卵子周围有6-9个精子，受精卵密度控制在≤3万个/ml，不停搅拌受精卵，确保每个卵子均有精子进入，形成2组家系受精卵；在此期间，温度控制在29.6℃，盐度控制在20ppt；之后，用显微镜观察受精卵第一二极体释放时间，受精后23min时，受精卵第一极体出现50％(即在所有的受精卵中，有数量的50％比例出现第一极体的时候处理)，利用0.5mg/L的细胞松弛素B开始抑制受精卵，直至受精后52min，发现有10％数量的未处理的受精卵进入二细胞期，药物处理结束，利用400目筛绢网洗去卵液中的细胞松弛素，每个单对单家系分别放置于1m3水泥池中孵化；

[0034] d、获得四倍体幼虫：经过24h孵化，2个水泥池中均获得多倍体D形幼虫，数量分别为80万个、90万个；经过流式细胞仪检测，发现幼虫组成仅为4N和2.5N，无其他倍性幼虫产生，其中，四倍体比率分别为60.9％、90.0％，其余的均为2.5N的非整倍体幼虫；

[0035] e、培育四倍体子代：采用常规方法培育四倍体幼虫，当幼虫生长至第15d时，2组家系存活率分别为3.9％、4.8％，经过检测，均为四倍体，2.5N的非整倍体已经全部死亡；经过30d培育，获得了壳高为3-5mm的四倍体稚贝，3组家系分别稚贝数量为3120个、5616个，其幼虫变态率分别为10％、13％；经过90d培育，获得了壳高2-3cm的四倍体幼贝，3组家系从稚贝到幼贝阶段的存活率接近100％，尚未见死亡发生。

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