一种培育四倍体银杏的方法
阅读：693发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种培育四倍体银杏的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 银 杏培育技术领域，公开了一种培育四倍体银杏的方法，所述培育四倍体银杏的方法包括：秋季 收获 银杏 种子 经层积处理过冬；次年春银杏种子 播种 出苗后，当银杏 幼苗 子叶展平，真叶刚露尖时，用0.2％秋 水 仙素琼脂溶胶涂抹银杏茎尖；所述涂抹秋水仙素琼脂溶胶的茎尖长度要小于0.3cm；12h后除去固体凝胶，并重新处理一次，连续处理六次，共处理72h；经细胞学鉴定后就获得四倍体银杏植株。本发明可以获得四倍体银杏植株； 多倍体 植株具有营养体巨大性，本发明为扩大银杏种质资源，增加遗传多样性培育新品种，对银杏进行多倍体育种。通过多倍体育种，可以培育生长速度快产量高的银杏新品种。，下面是一种培育四倍体银杏的方法专利的具体信息内容。
1.一种培育四倍体银杏的方法，其特征在于，所述培育四倍体银杏的方法包括以下步骤：
步骤一，秋季收获银杏种子经层积处理过冬；
步骤二，次年春银杏种子播种出苗后，当银杏幼苗子叶展平，真叶刚露尖时，用秋水仙素琼脂溶胶涂抹银杏茎尖；
步骤三，12h后除去固体凝胶，并重新处理一次，连续处理六次，共处理72h；
步骤四，进行细胞学鉴定，获得四倍体银杏植株。
2.如权利要求1中所述培育四倍体银杏的方法，其特征在于，步骤二中，所述涂抹秋水仙素琼脂溶胶的茎尖长度要小于0.3cm。
3.如权利要求1中所述培育四倍体银杏的方法，其特征在于，步骤二中，所述涂抹的秋水仙素琼脂溶胶的浓度为0.2％。
4.如权利要求1中所述培育四倍体银杏的方法，其特征在于，步骤二中，所述秋水仙素琼脂溶胶的组分为0.2％秋水仙素和1％琼脂溶胶。
一种培育四倍体银杏的方法
技术领域
[0001] 本发明属于银杏培育技术领域，尤其涉及一种培育四倍体银杏的方法。
背景技术
[0002] 目前，最接近的现有技术：银杏(Ginkgo biloba L.)，又名白果，古称鸭脚树、公孙树，属裸子植物门，是银杏科银杏属的唯一生存种，是现存裸子植物中最古老的孑遗植物，被公认为是“活化石”，是我国特有的多用途经济树种。
[0003] 银杏营养丰富，一方面是指它所含营养成分的多样性。据山东医学科学院对郸城产的100克鲜白果(银杏种核)仁分析：含蛋白质6.96克，脂肪1.18克，糖38.20克，水分52克，灰分1.47克，钙1.88毫克，铁2.79毫克，磷89.74毫克，胡萝卜素0.86毫克，维生素B10.31毫克，维生素B20.24毫克，维生素C2.72毫克，另外含维生素D；另一方面是指与其他果品相比，某些基本营养成分含量高。
[0004] 银杏叶富含活性物质，是较好的制药原料。银杏花粉具有丰富的营养和广泛的药理作用。它富含人体所必需的氨基酸、多种不饱和脂肪酸、矿物元素和维生素E，可用于研制延缓皮肤老化、抗衰老的化妆品和作为防治肿瘤、心血管疾病的药品和保健品。银杏的外种皮内含物质丰富，是很好的制药原料。外种皮是一层较厚的肉质层，其重量约占果实总重量的70％，含有大量的氢化白果酸、白果粉、白果醇、银杏黄素、多糖类成分和微量的银杏内酯化合物。银杏是优良和极其珍贵的用材树种，是用于雕刻及制作家具和模具的良材。银杏是园林中常见的观赏树种，银杏的生态效益也十分显著。
[0005] 多倍体生物指的是细胞内含有三套或三套以上染色体组的生物。因为多倍体在植物中的普遍存在，所以多倍体常被认为是一个高度动态的过程并在植物多样化过程中起着重要作用。多倍体的自然发生包括合子的染色体加倍、配子的染色体未减数等方式。其中合子的染色体加倍是指二倍体产生少数四倍体细胞或四倍体组织，如四倍体月见草的自发形成等。配子的染色体未减数即未减数的雄配子(2n)与减数的雌配子(n)结合，形成三倍体，产生的未减数雄配子(3n)与减数的雌配子(n)结合，形成四倍体。有时未减数的雄配子(2n)与未减数的雌配子(2n)结合，直接形成四倍体。据不完全统计，已在85个属植物中发现过2n配子，故认为这种方式是自然界多倍体形成的普遍方式。
[0006] 多倍体除了自然发生外，也可通过人工方式诱导。常见的方式是物理和化学方式。物理方式有温度激变、机械创伤、电离辐射、非电离辐射、离心力、热冲击、γ射线、X射线等。
化学方式多为药剂诱导，可以诱导多倍体的化学药剂有秋水仙素、吲哚乙酸、萘骈乙烷、芫荽脑、苯及其衍生物、有机砷制剂、有机汞制剂(富民隆)、磺胺剂、藜芦碱及其他植物碱、麻醉剂和生长素等不下200种。秋水仙素诱导多倍体已被证实是最为有效的加倍方式，它对植物诱变有效的刺激作用，只发生在细胞分裂活跃状态的组织，使分生组织的染色体加倍，所以常处理种子、子叶、生长点等部位。秋水仙素诱导植物无性阶段产生多倍体，普遍采用浸种和滴涂生长点的方法，效果与使用的具体浓度和作用时间及处理的植物种类、器官、甚至温度等因素有关，一般常用的浓度在0.01％～1.0％，又以0.2％最为常用；浓度过高、时间过长会对处理材料产生抑制作用，甚至引起伤害；浓度过低、时间过短起不到作用；处理最适宜温度为20℃左右。目前用秋水仙素诱导多倍体在瓜类、茄果类、根菜类、叶菜类、花菜类等方面都获得了同源四倍体、三倍体品系。
化学方式多为药剂诱导，可以诱导多倍体的化学药剂有秋水仙素、吲哚乙酸、萘骈乙烷、芫荽脑、苯及其衍生物、有机砷制剂、有机汞制剂(富民隆)、磺胺剂、藜芦碱及其他植物碱、麻醉剂和生长素等不下200种。秋水仙素诱导多倍体已被证实是最为有效的加倍方式，它对植物诱变有效的刺激作用，只发生在细胞分裂活跃状态的组织，使分生组织的染色体加倍，所以常处理种子、子叶、生长点等部位。秋水仙素诱导植物无性阶段产生多倍体，普遍采用浸种和滴涂生长点的方法，效果与使用的具体浓度和作用时间及处理的植物种类、器官、甚至温度等因素有关，一般常用的浓度在0.01％～1.0％，又以0.2％最为常用；浓度过高、时间过长会对处理材料产生抑制作用，甚至引起伤害；浓度过低、时间过短起不到作用；处理最适宜温度为20℃左右。目前用秋水仙素诱导多倍体在瓜类、茄果类、根菜类、叶菜类、花菜类等方面都获得了同源四倍体、三倍体品系。
[0007] 随着组织培养技术的发展，染色体加倍可通过离体组织培养获得。通过离体培养获得四倍体可以提高再生植株群体中四倍体的频率，容易控制实验条件，减少或避免倍性嵌合体，这一方法逐渐受到重视。
[0008] 与二倍体植株相比，多倍体植株一般具有茎秆粗壮、叶色浓绿、叶脉明显、叶片变宽，花器、果实、花粉粒和气孔增大，花期延长，但生长减慢，花果数目减少，雄性不育等特征。多倍体植物对外界环境的适应性较强，表现出较强的抗寒、抗旱、抗病等抗逆性，因为多倍体植株中基因序列的增加提高了基因功能的保险性，为逆境条件下的生存与竞争提供了稳定的遗传基础。与二倍体植株相比，多倍体植株的气孔在长度和宽度上都变大，保卫细胞的叶绿体数目也增加。在西瓜和甜瓜的四倍体植株中发现，保卫细胞的叶绿体数目和二倍体植株相比明显增。多倍体植株还能合成一些新的有效成分，如四倍体中含有二倍体植株不含有的酮类成分。
[0009] 多倍体植株在药用植物中的应用：(1)植株巨大性。药用植物是一类具有特殊用途的经济植物，一般以其根、茎、叶等器官为收获对象以供药用，而多倍体植株由于染色体加倍，细胞核和细胞变大，组织器官也变大，突出表现为根、茎、叶等器官的巨大性，能大幅度提高以相应部位入药的药材的产量。例如丹参同源四倍体普遍比原植物生长旺盛而浓绿，茎杆粗壮，植株增高，根部药材比原植物粗大。(2)抗性增加。在自然界中，多倍体是适应恶劣环境的结果，南部地区，温度变化激烈，紫外线辐射强，许多植物产生了多倍体类型，从一个侧面说明多倍体植物具有较强的抗性，适应性强。由于多倍体植株一般茎杆粗壮，故能较好地抗倒伏。有的还具有抗旱、抗病虫害等其他抗性，如由日本薄荷和库页薄荷诱导的异源四倍体具抗粉霉菌和抗寒等优点，这些优点对扩大种植区域，提高药材产量极为有利。(3)有机合成速率加快。多倍体植株由于染色体加倍，有了多套基因，即基因模板增加，转录出的mRNA也增加，相应的酶蛋白合成必然增加，使酶的整体催化活性加倍，新陈代谢旺盛，有机物的合成速率提高。(4)药用成分增加。实践中发现，大多数多倍体植株中次生代谢产物的含量都有所增加。对于很多药用植物，次生代谢产物药用有效成分，非常具有实用价值。如曼陀罗同源四倍中生物碱含量大约是原植物的2倍。怀牛膝同源四倍体中蜕皮激素较原植物高出达10倍之多。丹参同源四倍体中隐丹参酮、丹参酮ⅠA、丹参酮ⅡA分别较原植物高
203.26％、70.48％、53.16％。(5)克服远缘杂交不育性。不同种或不同属的植物杂交获得的杂种通常具有杂种优势，但杂种的染色体同源性较低，减数分裂时很难同源染色体配对，不能形成生殖细胞，所以一般不育。可以通过人工诱导使杂种的染色体加倍，从而能够进行正常的减数分裂，产生种子，使杂种优势得以保存下去。同时，可以扩大药材种质来源，使一些具有优势性状的远源野生品种通过杂交育种和多倍体育种变为栽培品种，解决目前药材资源匮乏的问题。
203.26％、70.48％、53.16％。(5)克服远缘杂交不育性。不同种或不同属的植物杂交获得的杂种通常具有杂种优势，但杂种的染色体同源性较低，减数分裂时很难同源染色体配对，不能形成生殖细胞，所以一般不育。可以通过人工诱导使杂种的染色体加倍，从而能够进行正常的减数分裂，产生种子，使杂种优势得以保存下去。同时，可以扩大药材种质来源，使一些具有优势性状的远源野生品种通过杂交育种和多倍体育种变为栽培品种，解决目前药材资源匮乏的问题。
[0010] 银杏生长速度较慢，有性生殖周期长，是造成通过有性方式培育新品种的主要困难，前人在这方面的研究较少，尤其是多倍体育种周期更长，在相关研究中以银杏幼苗茎尖为材料进行多倍体诱导的研究未见报道。以银杏幼苗茎尖为材料进行多倍体诱变以期获得多倍银杏，从中选出形态学与细胞学性状发生变异的植株已为选育银杏新品种和丰富银杏种质资源打下基础。
[0011] 综上所述，现有技术存在的问题是：银杏生长速度较慢，有性生殖周期长，是造成通过有性方式培育新品种的主要困难，前人在这方面的研究较少，尤其是多倍体育种周期更长，在相关研究中以银杏幼苗茎尖为材料进行多倍体诱导的研究未见报道。
[0012] 解决上述技术问题的难度：二倍体银杏生长速度慢，四倍体植株一般表现为营养体巨大，通过多倍体诱变，培育四倍体银杏，可提高银杏生长速度，增高银杏有效成分含量。
[0013] 解决上述技术问题的意义：培育银杏新品种，获得四倍体银杏，丰富了生物多样性。
发明内容
[0014] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种培育四倍体银杏的方法。
[0015] 本发明是这样实现的，一种培育四倍体银杏的方法，所述培育四倍体银杏的方法包括以下步骤：
[0016] 步骤一，秋季收获银杏种子经层积处理过冬。
[0017] 步骤二，次年春银杏种子播种出苗后，当银杏幼苗子叶展平，真叶刚露尖时，用秋水仙素琼脂溶胶涂抹银杏茎尖。
[0018] 步骤三，12h后除去固体凝胶，并重新处理一次，连续处理六次，共处理72h。
[0019] 步骤四，进行细胞学鉴定，获得四倍体银杏植株。
[0020] 进一步地，步骤二中，所述涂抹秋水仙素琼脂溶胶的真叶长度要小于0.3cm。
[0021] 进一步地，步骤二中，所述涂抹的秋水仙素琼脂溶胶的浓度为0.2％。
[0022] 进一步地，步骤二中，所述秋水仙素琼脂溶胶的组分为0.2％秋水仙素和1％琼脂溶胶。
[0023] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明的提供的培育四倍体银杏的方法，可以获得四倍体银杏植株；多倍体植株具有营养体巨大性，本发明为扩大银杏种质资源，增加遗传多样性培育新品种，对银杏进行多倍体育种。通过多倍体育种，可以培育生长速度快产量高的银杏新品种。
[0024] 实验表明：(1)用0.2％秋水仙素琼脂溶胶涂抹法对银杏幼苗茎尖处理72h，获得银杏多倍体变异植株，变异率是24.4％。(2)银杏多倍体变异植株表现出生长缓慢，植株矮小，叶片增厚，叶形指数发生变化，叶色浓绿，气孔变大，气孔内叶绿体含量增加，气孔频度下降等特征。附图说明
[0026] 图2是本发明实施例提供的银杏二倍体与四倍体幼苗；
[0027] 图中：A：银杏二倍体；B：银杏变异株。
[0028] 图3是本发明实施例提供的银杏核型示意图。
[0029] 图4是本发明实施例提供的银杏二倍体染色体核型模式图。
具体实施方式
[0030] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0031] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种培育四倍体银杏的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0032] 如图1所示，本发明实施例提供的培育四倍体银杏的方法包括以下步骤：
[0033] S101，秋季收获银杏种子经层积处理过冬。
[0034] S102，次年春银杏种子播种出苗后，当银杏幼苗子叶展平，真叶刚露尖时，用秋水仙素琼脂溶胶涂抹银杏茎尖。
[0035] S103，12h后除去固体凝胶，并重新处理一次，连续处理六次，共处理72h。
[0036] S104，进行细胞学鉴定，获得四倍体银杏植株。
[0037] 本发明实施例提供的S102中，涂抹秋水仙素琼脂溶胶的真叶长度要小于0.3cm。
[0038] 本发明实施例提供的S102中，涂抹的秋水仙素琼脂溶胶的浓度为0.2％。
[0039] 本发明实施例提供的S102中，秋水仙素琼脂溶胶的组分为0.2％秋水仙素和1％琼脂溶胶。
[0040] 下面结合具体实验对本发明作进一步描述。
[0041] 1、材料与方法
[0042] 1.1试验材料
[0043] 裸子植物门
[0044] 银杏纲(Ginkgopsida)
[0045] 银杏科(Gonkgoaceac)
[0046] 银杏(Ginkgo biloba)
[0047] 1.2实验方法
[0048] 1.2.1多倍体诱变
[0049] 当银杏幼苗了叶展平，真叶露尖时，用0.2％秋水仙素+1％琼脂溶胶涂抹银杏茎尖，24h后除去剩余凝胶，并重新处理一次，连续处理三次，共处理72h。
[0050] 1.2.2形态学观察
[0051] 1.2.2.1株高的测量
[0052] 定植缓苗7d后开始测量株高。变异株和对照株随即选10株作为样本，每7d测量一次，共测量五次。
[0053] 1.2.2.2叶片厚度的测量
[0054] 在变异株上和对照株中随即选择10株，取每株相同部位的叶片为样本(所取的叶片都为每株第2节的叶片)，每叶片选择不同部位做切片2张，在显微镜下观察，用显微测微尺测量切口横截面，取平均值得叶片厚度。
[0055] 1.2.2.3叶片大小的测量
[0056] 取叶片方法与测量叶片厚度的方法相同，用直尺测量叶片的叶长、叶宽。
[0057] 1.2.3气孔性状观察
[0058] 对变异株和对照株，选取相同节位的叶片，用尖嘴镊子轻轻撕取叶片下表皮，置于洁净的载玻片上，滴加一小滴1％I-KI染液，静置10min后，在显微镜下观察并用显微测微尺测量，测量时每种处理和对照随即选取15个气孔测量其长与宽，观察气孔内叶体个数，并同时观察保卫细胞内的叶绿体数量和固定显微镜倍数下的气孔数。
[0059] 1.2.4染色体制片
[0060] 染色体制片使用植物染色体常规制片法—根尖压片法。
[0061] 1.2.5染色体核型分析
[0062] 经镜检，选出具有中期分裂相、分散良好的染色体进行显微摄影。选出染色体形态比较完整、清晰的分裂相，做核型分析，分别计算各染色体的相对长度、臂比，染色体计算与命名按Leven方法，核型类型按Stebbins方法划分，做出核型模式图。
[0063] 2、结果分析
[0064] 2.1秋水仙素对银杏的诱变效果
[0065] 诱变72h后，在形态上对处理幼苗进行仔细观察，并将其与二倍体对照株进行详细比较，结果发现诱变后的植株与对照株形态上有很大差异，具体表现为：生长缓慢；植株矮小；叶片增厚，并且叶长和叶宽都有减小的趋势，部分植株出现畸形叶，导致叶形指数发生了很大变化；叶色浓绿等。以上现象将作为诱变是否成功的依据之一，也将作为初步鉴定多倍体的重要指标之一。二倍体与四倍体的植株对照，见图2。
[0066] 2.2诱变成功率的统计
[0067] 诱变后对银杏幼苗进行仔细的观察，通过统计得出了经秋水仙素处理的诱变形态变异率，详见表1。
[0068] 表1 0.2％秋水仙素对银杏二倍体幼苗诱变效果
[0069]
[0070] 共诱变了45株银杏幼苗，发现诱变后发生明显形态变异的有11株，秋水仙素对银杏的诱变形态变异率为24.4％。
[0071] 2.3形态学观察
[0072] 2.3.1株高
[0073] 对银杏变异株和诱变株进行了定期的测量，并且对二者株高进行了比较分析，结果见表2。
[0074] 表2经秋水仙素处理后植株高度的测量结果(单位：cm)
[0075]
[0076] 由表2可知，银杏的变异株在测量的各个时期的株高均低于对照株。定植后35d，变异株的高度为4.66cm，对照株为8.44cm，可见植株经秋水仙素诱变后，生长速度降低是变异株的一个明显特征。
[0077] 2.3.2叶形指数
[0078] 叶片的形变是多倍体诱变后最为普遍的现象，与二倍体的植株相比，部分植株出现畸形叶，试验中变异株与对照株叶片有缩小的趋势，但叶长的缩小幅度较大，所以叶形指数有下降的趋势。
[0079] 统计结果表明，诱导后的银杏叶形指数有下降趋势，由原来的1.30下降到1.20。
[0080] 2.3.3叶片厚度
[0081] 经秋水仙素处理后变异株的叶片厚度发生明显变异，目测与触摸均可感觉到明显差异。叶片厚度的增加在其他作物的多倍体育种中也是普遍出现的现象，是多倍体巨大性的表现。试验分别对银杏诱变株和对照株进行叶片厚度的测量，原始数据显示，变异株的叶片厚度明显大于对照株。
[0082] 统计结果表明，诱导后三个月的银杏叶片厚度为0.50mm，对照为0.31mm。可见，叶片厚度的变化也是多倍体的典型特征之一。
[0083] 2.4气孔性状的观察
[0084] 经秋水仙素诱变后，气孔大小的变化、气孔频度的变化、保卫细胞内叶绿体的含量的变化在前人研究中是比较受重视的，并把这些变化作为鉴定倍性的指标。观察发现，该品种的变异株的气孔器的纵径和横径均显著大于对照株的纵径和横径；银杏经秋水仙素处理后下表皮气孔密度呈显著下降；通过I-KI溶液染色后，在显微镜下可以看到保卫细胞内的叶绿体数量，多倍体较二倍体对照明显增多。
[0085] 2.5染色体观察
[0086] 2.5.1染色体计数
[0087] 选出5-10个分裂相清晰的染色体图进行计数取其平均值，银杏染色体数目为2n＝2x＝24，见图3。
[0088] 2.5.2染色体核型
[0089] 取分裂相清晰的染色体图，通过Photoshop处理之后进行同源染色体配对，并且按长度进行染色体编号，计算每对染色体的臂比值，臂比平均值为1.55，详见表3。
[0090] 按Leven方法确定染色体类型，银杏二倍体含有9对中部着丝粒染色体与3对近中着丝粒染色体，即核型公式为：2n＝2x＝24＝18m+6sm，做出银杏核型图，见图3。
[0091] 在银杏二倍体的染色体中，最长/最短＝3.92，并且在12个臂比值中，臂比>2:1的染色体百分比＝25％，按照Stebbins方法，确定银杏核型类型为3B。
[0092] 根据表3的数据，借助Excel系统绘制银杏二倍体核型模式图，见图4。
[0093] 表3染色体长度、臂比及类型分析
[0094]
[0095] 结果
[0096] (1)用0.2％秋水仙素琼脂溶胶涂抹法对银杏幼苗茎尖处理72h，获得银杏多倍体变异植株，变异率是24.4％。
[0097] (2)银杏多倍体变异植株表现出生长缓慢，植株矮小，叶片增厚，叶形指数发生变化，叶色浓绿，气孔变大，气孔内叶绿体含量增加，气孔频度下降等特征。
[0098] (3)二倍体银杏核型公式为2n＝2x＝24＝18m+6sm。
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