一种四倍体曼地亚红豆杉培育方法
阅读：705发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种四倍体曼地亚红豆杉培育方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于改良基因型的方法技术领域，公开了一种四倍体曼地亚红豆杉培育方法，所述四倍体曼地亚红豆杉培育方法包括：利用七年生曼地亚红豆杉植株的枝条进行扦插；制作扦插阳畦；用筷子在灭菌沙床上扎洞，将插条插入洞中，顶端保留露于沙面外，用塑料作拱形棚密封，上面覆 遮阳网 降温；灌 水 ，下切口产生愈伤组织，产生不定根；第二年进行 多倍体 诱变；新芽初生时用0.5％的秋水仙素琼脂凝胶连续处理8天；经细胞学鉴定后获得四倍体曼地亚红豆杉植株。本发明提供的四倍体曼地亚红豆杉培育方法能够培育异源四倍体红豆杉新品种；同时培育出的异源四倍体红豆杉其红豆杉产量与有效成分含量明显高于现有普通红豆杉。，下面是一种四倍体曼地亚红豆杉培育方法专利的具体信息内容。
1.一种四倍体曼地亚红豆杉培育方法，其特征在于，所述四倍体曼地亚红豆杉培育方法包括以下步骤：
步骤一，利用七年生曼地亚红豆杉植株的枝条进行扦插；
步骤二，制作扦插阳畦；用筷子在灭菌沙床上扎洞，将插条插入洞中，顶端保留露于沙面外，用塑料作拱形棚密封，上面覆遮阳网降温；
步骤三，灌水，下切口产生愈伤组织，产生不定根；
步骤四，第二年进行多倍体诱变；新芽初生时用0.5％的秋水仙素琼脂凝胶连续处理8天；经细胞学鉴定后获得四倍体曼地亚红豆杉植株。
2.如权利要求1所述四倍体曼地亚红豆杉培育方法，其特征在于，步骤一中，所述曼地亚红豆杉植株的枝条扦插方法具体为：春末夏初利用曼地亚红豆杉植株的枝条进行扦插，以一至二年生枝条为插穗，用生根剂蘸根，形态学下端切面成马蹄形，上截面呈平截，扦条长10cm，去插条下面的叶子，保留顶端3至5片叶子。
3.如权利要求1所述四倍体曼地亚红豆杉培育方法，其特征在于，步骤二中，所述扦插阳畦的制作方法为：
选取室外平地，挖宽度为1.5m，长度为3m，深度为150cm的坑，将所挖坑的四面坑壁用力夯实，之后填上30cm的细河沙；用浓度为1％的高锰酸钾溶液充分灭菌后，留下备用。
4.如权利要求1所述四倍体曼地亚红豆杉培育方法，其特征在于，步骤二中，用筷子在灭菌沙床上扎出10cm的洞，将插条插入洞中，顶端保留2cm露于沙面外。
5.如权利要求1所述的四倍体曼地亚红豆杉培育方法，其特征在于，步骤三中，每隔10天灌水一次，持续40天至60天。
6.如权利要求1所述的四倍体曼地亚红豆杉培育方法，其特征在于，步骤四中，第二年3月进行多倍体诱变。
7.如权利要求1所述的四倍体曼地亚红豆杉培育方法，其特征在于，步骤四中，所述进行多倍体诱变的红豆杉植株高度在3cm到7cm之间，每个植株为单一植株，上面只有一个新生的顶芽。
8.如权利要求1所述的四倍体曼地亚红豆杉培育方法，其特征在于，步骤四中，所述进行多倍体诱变的秋水仙素的配制方法为：
(1)1％的母液的配制：取1克秋水仙素，用少量95％酒精溶解之后，摇匀，再量取100ml的去离子水充分混合，4℃下冰箱冷藏保存，备用；
(2)0.5％的秋水仙素的配制：取200mg的琼脂，量取10ml去离子水，使琼脂与去离子水充分溶解；取10ml母液，倒入上述溶液中，充分搅拌，混合后，水密保存，待用。
一种四倍体曼地亚红豆杉培育方法
技术领域
[0001] 本发明属于改良基因型的方法技术领域，尤其涉及一种四倍体曼地亚红豆杉培育方法。
背景技术
[0002] 目前，最接近的现有技术：红豆杉属(Taxus)植物是一类起源古老的植物类群，属于裸子植物(Gymnospenmae)中的红豆杉科(Taxaceae)。Florin认为，红豆杉在欧洲有一个起源中心，在侏罗纪至第三纪之后，迁移至北美东部和西部，根据其化石的研究结果，其化石在欧洲和东亚地区有过发现，因此横断山区亦应是红豆杉属的另一个起源中心，而且还是现代种的分化繁殖中心。
[0003] 红豆杉植物分布广范，全世界约有11种，而中国有3个种2个变种，分布区域在海拔500～3400米左右。红豆杉之所以能够引起广范关注，主要原因是其含有紫杉醇(taxol)，而作为全球三大抗癌药物之一的紫杉醇主要是从野生资源红豆杉树皮中分离提取。近年来，相关研究发现红豆杉根、皮、枝叶中也含有抗癌物质—紫杉醇，对于某些癌症和肿瘤有治疗效果。紫杉醇药物，1992年在美国获准上市，1994年先后在世界20几个国家获准上市。目前由于国际对红豆杉需求量相当大，并且随着研究的不断深入，红豆杉的药用价值及利用的不断开发，市场对于其需求量只会增加。分布在我国的红豆杉属植物主要有以下5种(含变种)，即：南方红豆杉(美丽红豆杉)、云南红豆杉、西藏红豆杉(喜马拉雅红豆杉)、东北红豆杉(紫杉)、中国红豆杉。在国产的红豆杉属植物中，除南方红豆杉只分离出紫杉烷类化合物外，其余种类均含有紫杉醇(taxol)。
[0004] 近年来，开发研究利用较多的红豆杉属植物还有曼地亚红豆杉。曼地亚红豆杉属常绿针叶灌木植物，小叶互生。叶螺旋状着生，基部扭转排成二列，条形，通常微弯，长1～2.5cm，宽2～2.5cm。边缘微反卷，先端渐尖或微急尖，下面沿中脉的两侧有两条宽灰绿色或黄绿色气孔带，绿色边带急窄，中脉带上有密生的均匀微小乳头点。雌雄异株，雄球花单生叶腋，雌球花的胚球单生于花轴上部侧生短轴的顶端，基部托以圆盘状假种皮。种子扁卵圆形，生于红色肉质的杯状假种皮中，长约5mm，先端微有2脊，种脐卵圆形。种子成熟时外被肉质红色的假种皮。我国少数民族也有将红豆杉作为药物使用的历史。在滇西北利用红豆杉枝叶作为治疗肿瘤重要成分之一，在民间已经有很长的历史。据《全国中草药汇编》记载南方红豆杉的种子名为血榧，可以“治食积，驱虫”。从1960年起，美国Research Triangle Institute的科学家Monroe Wall博士和Mansukh Wani博士开始研究从短叶红豆杉的茎皮中分离紫杉醇，发现其对卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤有显著的疗效，1971年Wani等人证实紫杉醇具有很高的抗肿瘤细胞活性。药理实验表明，紫杉醇的抗肿瘤活性主要是两方面：一是对于快速分裂的肿瘤细胞，紫杉醇可冻结有丝分裂纺锤体，从而抑制细胞有丝分裂的进行，阻止了肿瘤细胞的快速繁殖；二是抑制肿瘤细胞的迁移。
[0005] 一般所说，多倍体是染色体的数目在3(3x)或大于3(>3x)的种、居群和个体，根据多倍体增加的染色体来源，又分来同源多倍体和异源多倍体。目前许多植物已经有了同源多倍体，它们的产生和保存主要是人为的，人工保存同源多倍体的主要途径是进行无性繁殖。自然界中虽然也会出现同源染色体多倍体，但由于高度不育，不能留给后代。一般实验室所做的多倍体诱导主要是通过一些物理、化学等方法，人工诱变植物而使染色体加倍。一般来说，染色体的同源多倍体越多，核体积和细胞体积越大，因此多倍体植株由于染色体数目增加，细胞、组织和器官表现出巨型性。药用植物的药用部位繁多，依据不同植物和不同的功效，几乎包括了植物的所有组织和器官，大多数以叶、根、茎为药用部位，染色体加倍之后，叶、根、茎的巨型化，可以大大提高此类中药材的收获量，满足中药材市场日益增长的需求。此外，药用植物的染色体加倍常常引起次生代谢产物含量发生改变，这就为获得高质量、有效成分含量高的药用植物新品种提供极大的可能。红豆杉的主要药用价值在于从其树皮中分离出来的紫杉醇，紫杉醇属于红豆杉的次级代谢产物，理论上，通过诱导染色体加倍，很有可能获得紫杉醇含量较高的红豆杉植株。
[0006] 曼地亚红豆杉原产于美国，是欧洲短叶红豆杉和东北红豆杉的杂交品种，有杂交优势，生长速度快，适应性非常强，既可以提取紫杉醇，作为药物使用，又可以作为观赏或绿化性植物种植，具有园艺价值，总体来讲，红豆杉属植物最重要的价值仍然体现在其治疗癌症的作用上。异源多倍体是当前自然界表现最好的多倍体。多倍体植株一般表现为营养体巨大与化学成分含量较高等特点。然而现有技术中并无公开的四倍体红豆杉，且也未公开相应的四倍体红豆杉的培育方法。
[0007] 综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术中并无对四倍体红豆杉的培育方法的研究；而现有的曼地亚红豆杉产量与有效成分的含量偏低。
发明内容
[0008] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种四倍体曼地亚红豆杉培育方法。
[0009] 本发明是这样实现的，一种四倍体曼地亚红豆杉培育方法，所述四倍体曼地亚红豆杉培育方法包括以下步骤：
[0010] 步骤一，利用七年生曼地亚红豆杉植株的枝条进行扦插。
[0011] 步骤二，制作扦插阳畦；用筷子在灭菌沙床上扎洞，将插条插入洞中，顶端保留露于沙面外，用塑料作拱形棚密封，上面覆遮阳网降温。
[0012] 步骤三，灌水，下切口产生愈伤组织，产生不定根。
[0013] 步骤四，第二年进行多倍体诱变；新芽初生时用0.5％的秋水仙素琼脂凝胶连续处理8天；经细胞学鉴定后获得四倍体曼地亚红豆杉植株。
[0014] 进一步，步骤一中，所述曼地亚红豆杉植株的枝条扦插方法具体为：春末夏初利用曼地亚红豆杉植株的枝条进行扦插，以一至二年生枝条为插穗，用生根剂蘸根，形态学下端切面成马蹄形，上截面呈平截，扦条长10cm，去插条下面的叶子，保留顶端3至5片叶子。
[0015] 进一步，步骤二中，所述扦插阳畦的制作方法为：选取室外平地，挖宽度为1.5m，长度为3m，深度为150cm的坑，将所挖坑的四面坑壁用力夯实，之后填上30cm的细河沙；用浓度为1％的高锰酸钾溶液充分灭菌后，留下备用。
[0016] 进一步，步骤二中，用筷子在灭菌沙床上扎出10cm的洞，将插条插入洞中，顶端保留2cm露于沙面外。
[0017] 进一步，步骤三中，每隔10天灌水一次，持续40天至60天。
[0018] 进一步，步骤四中，第二年3月进行多倍体诱变。
[0019] 进一步，步骤四中，所述进行多倍体诱变的红豆杉植株高度在3cm到7cm之间，每个植株为单一植株，上面只有一个新生的顶芽。
[0020] 进一步，步骤四中，所述进行多倍体诱变的秋水仙素的配制方法为：
[0022] (2)0.5％的秋水仙素的配制：取200mg的琼脂，量取10ml去离子水，使琼脂与去离子水充分溶解；取10ml母液，倒入上述溶液中，充分搅拌，混合后，水密保存，待用。
[0023] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明提供的四倍体曼地亚红豆杉培育方法能够培育异源四倍体红豆杉新品种；同时培育出的异源四倍体红豆杉其红豆杉产量与有效成分含量明显高于现有普通红豆杉。本发明对曼地亚红豆杉植株进行扦插繁殖实验，探究其最适宜的扦插条件，并通过初生分生组织诱导法进行诱变，获得曼地亚红豆杉多倍体植株。实验表明：
[0024] (1)在当地气候环境下，曼地亚红豆杉扦插枝条的年龄二年生最为合适。
[0025] (2)在曼地亚红豆杉扦插过程中，扦插基质最好用适宜浓度的高锰酸钾溶液作处理，可提高扦插的成活率。
[0026] (3)曼地亚红豆杉的扦插季节最好选在春季，利于生根，从而提高成扦插成活率。
[0029] 图2是本发明实施例提供的母本枝条的枝龄与扦插曼地亚红豆杉植株成活率关系统计示意图。
[0030] 图3是本发明实施例提供的经0.5％的秋水仙素处理的植株与对照组的植株比较情况示意图。
具体实施方式
[0031] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0032] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种四倍体曼地亚红豆杉培育方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0033] 如图1所示，本发明实施例提供的四倍体曼地亚红豆杉培育方法包括以下步骤：
[0034] S101，利用七年生曼地亚红豆杉植株的枝条进行扦插。
[0035] S102，制作扦插阳畦；用筷子在灭菌沙床上扎洞，将插条插入洞中，顶端保留露于沙面外，用塑料作拱形棚密封，上面覆遮阳网降温。
[0036] S103，灌水，下切口产生愈伤组织，产生不定根。
[0037] S104，第二年进行多倍体诱变；新芽初生时用0.5％的秋水仙素琼脂凝胶连续处理8天；经细胞学鉴定后获得四倍体曼地亚红豆杉植株。
[0038] 本发明实施例提供的S101中，曼地亚红豆杉植株的枝条扦插方法具体为：春末夏初利用曼地亚红豆杉植株的枝条进行扦插，以一至二年生枝条为插穗，用生根剂蘸根，形态学下端切面成马蹄形，上截面呈平截，扦条长10cm，去插条下面的叶子，保留顶端3至5片叶子。
[0039] 本发明实施例提供的S102中，扦插阳畦的制作方法为：选取室外平地，挖宽度为1.5m，长度为3m，深度为150cm的坑，将所挖坑的四面坑壁用力夯实，之后填上30cm的细河沙；用浓度为1％的高锰酸钾溶液充分灭菌后，留下备用。
[0040] 本发明实施例提供的S102中，用筷子在灭菌沙床上扎出10cm的洞，将插条插入洞中，顶端保留2cm露于沙面外。
[0041] 本发明实施例提供的S103中，每隔10天灌水一次，持续40天至60天。
[0042] 本发明实施例提供的S104中，第二年3月进行多倍体诱变。
[0043] 本发明实施例提供的S104中，进行多倍体诱变的红豆杉植株高度在3cm到7cm之间，每个植株为单一植株，上面只有一个新生的顶芽。
[0044] 本发明实施例提供的S104中，进行多倍体诱变的秋水仙素的配制方法为：
[0045] (1)1％的母液的配制：取1克秋水仙素，用少量95％酒精溶解之后，摇匀，再量取100ml的去离子水充分混合，4℃下冰箱冷藏保存，备用。
[0046] (2)0.5％的秋水仙素的配制：取200mg的琼脂，量取10ml去离子水，使琼脂与去离子水充分溶解；取10ml母液，倒入上述溶液中，充分搅拌，混合后，水密保存，待用。
[0047] 下面结合具体实验对本发明作进一步描述。
[0048] 1、材料与方法
[0049] 1.1曼地亚红豆杉的扦插
[0050] 1.1.1材料
[0051] 裸子植物亚门(Cymnospermai)
[0052] 松杉纲(Coniferopside)
[0053] 红豆杉目(Taxales)
[0054] 红豆杉科(Taxaceae)
[0055] 红豆杉属(Taxus)
[0056] 曼地亚红豆杉(Taxus media)
[0057] 实验材料为七年生曼地亚红豆杉植株的枝条，将扦插枝条处理成下切为马蹄形，上切面平切，长度为10cm的枝条，只保留顶端4至6片叶子。
[0058] 1.1.2扦插阳畦制法
[0059] 选取室外平地，挖宽度为1.5m，长度为3m，深度为150cm的坑，将所挖坑的四面坑壁用力夯实，之后填上30cm的细河沙。用浓度为1％的高锰酸钾溶液充分灭菌后，留下备用。
[0060] 1.1.3扦插过程
[0061] 采用七年生曼地亚红豆杉植株的枝条，分为一年生枝条、二年生枝条、三年生枝条。用根宝原液蘸根，下切面成马蹄形，上切面呈平切，扦条长10cm左右，去插条下面的叶子，只保留顶端3至5片叶子。用筷子在灭菌沙床上扎出10cm的洞，将插条插入洞中，顶端保留2cm露于沙面外，用塑料作拱形棚密封保水，上面覆遮阳网降温。充分灌水以后，每隔十天灌水一次，约40天至2个月后，下切口产生愈伤组织，秋季9月至10月之间产生不定根。依照前法过冬，冬季每一个月浇水一次，第二年春季依法进行。
[0062] 第一组扦插的时间为2012年5月16日；第二组扦插的时间为2013年5月26日。两组在2014年4月19日分别移栽于温室内。
[0063] 1.1.4营养钵的配制
[0064] 取直径10cm，高度15cm的黑色塑料营养钵，按3：1的比例填壤土和肥，壤土为无菌壤土，肥为沤熟的厩肥，装于营养钵。移栽的时候，在4：1浓度的根保液中蘸根，植入营养钵中，加入营养土后，向上提苗，加土直至营养钵满为止。整齐排列于阳畦中，并立即灌水，喷水洗田以后，每隔10天浇水一次，一直持续到定植时。
[0065] 1.1.5计算植株的成活率
[0066] 计算曼地亚红豆杉总数量中成活植株所占比例以及不同枝龄枝条的各自成活率。
[0067] 1.2曼地亚红豆杉的多倍体诱变
[0068] 1.2.1材料
[0069] 筛选扦插成活的曼地亚红豆杉植株。要求实验所用的红豆杉植株，每个植株上高度在3cm到7cm之间，每个植株为单一植株，上面只有一个新生的顶芽。
[0070] 1.2.2秋水仙素的配制
[0071] 实验诱变的化学试剂是浓度为0.5％的秋水仙素。
[0072] 1％的母液的配制：取1克秋水仙素，用少量95％酒精溶解之后，摇匀，再量取100ml的去离子水充分混合，4℃下冰箱冷藏保存，备用。
[0073] 0.5％的秋水仙素的配制：取200mg的琼脂，量取10ml去离子水，使琼脂与去离子水充分溶解。取10ml母液，倒入上述溶液中，充分搅拌，混合后，水密保存，待用。
[0074] 1.2.3诱变材料的处理
[0075] 从阳畦中筛选出符合诱变条件的曼地亚红豆杉植株，一共96株，将其平均分为四组，每一组有24株，标上数字1、2、3、4。第一组用0.5％的秋水仙素溶液处理四天；第二组用0.5％的秋水仙素溶液处理六天；第三组用0.5％的秋水仙素溶液处理八天；第四组不做任何处理，作为对照组。
[0076] 将用水润湿过的透明小塑料杯加盖植株上。
[0077] 1.3株高的测量
[0078] 恢复生长后测量株高。实验与对照组中各随即选5株为样本，测量平均值。
[0079] 1.4侧面新生芽数量的统计
[0080] 待植株恢复生长后，从变异组与对照组中各随即选5株为样本，统计植株侧面新生芽的数目，测量平均值,并作记录。
[0081] 1.5叶片厚度的测量
[0082] 恢复生长后，从实验组与对照组中各随机选5株为样本，每株在相同位置各摘片，测量平均值，记录。
[0083] 2、结果与分析
[0084] 2.1扦插成活率的统计
[0085] 表1曼地亚红豆杉成活数量及成活率的统计
[0086]
[0087] 经统计，2012年扦插的曼地亚红豆杉成活率为91％，2013年扦插的曼地亚红豆杉成活率为87％，而两年内扦插的曼地亚红豆杉总数量统计的成活率为90％。
[0088] 2.2母本枝条的枝龄与扦插曼地亚红豆杉植株成活率关系的统计
[0089] 表2枝龄不同的曼地亚红豆杉成活数量及成活率的统计
[0090]
[0091] 如图2所示，经统计，一年生的扦插曼地亚红豆杉枝条成活率为84％，二年生的扦插曼地亚红豆杉枝条成活率为100％，三年生的扦插曼地亚红豆杉枝条为0％；死亡的扦插曼地亚红豆杉植株中，一年生的植株占30％，三年生的植株占70％。
[0092] 2.3经0.5％的秋水仙素处理的植株与对照组的植株比较情况表3诱后的植株株高与空白对照组比较
[0093]
[0094]
[0095] 如图3所示，相比较于对照组，4天处理的植株低了1.4cm，6天处理的植株低了1.16cm，8天处理的植株低了1.29cm；4天处理的植株株高最低，其次是8天处理的植株株高，
6天处理的植株株高于4天和8天处理的植株株高，但三组均明显低于未处理的植株株高。
6天处理的植株株高于4天和8天处理的植株株高，但三组均明显低于未处理的植株株高。
[0096] 表4诱变后的植株侧面新生芽与空白组对照比较
[0097]
[0098] 未经秋水仙素处理的植株顶芽生长旺盛，侧芽生长较少且不明显，植株相对于经过秋水仙素处理的曼地亚红豆杉植株较高、生长较快；经过秋水仙素处理的曼地亚红豆杉植株，处理的顶芽部位停止生长，侧芽生长相对于未经秋水仙素处理的植株较多、较旺盛，植株生长缓慢。
[0099] 2.4叶片厚度的观察
[0100] 表5诱变后的曼地亚红豆杉植株叶片的厚度
[0101]
[0102] 经过处理的植株叶片均厚于未作处理的植株叶片，其中8天处理的植株叶片最厚。
[0103] 3、讨论
[0104] 3.1曼地亚红豆杉植株扦插基质与成活率的研究讨论
[0105] 扦插基质直接影响曼地亚红豆杉的扦插枝条成活率。扦插基质主要是影响扦插枝条的生根，另外，扦插基质也是植株生长的营养物质和矿物质来源，植株生长需要充足的水分、养分、空气，理想的基质应合理调节三者。重粘土容易积水、土壤致密从而通气不良，而砂土孔隙大但保水能力弱，也不利于扦插，扦插地宜选择结构疏松、通气良好、既能够保持稳定土壤水分的砂质壤土。有研究表明：曼地红豆杉扦插的生根率，在混合基质中最高，高达95％，清水河沙次之，为88％，田园土最低仅为69％。细河沙与田园土混合的砂质壤土最好，单一的田园土较致密、孔隙小，不利于通气、排水性差，容易寄生微生物，造成扦插枝条的感染，降低扦插植株的成活率，单一的细河扦插基质较稀松、孔隙大，保水性极差，也会降低扦插植株的成活率，而混合扦插基质，将两者的优点充分结合到一起，既保持了良好的透气性，又保持了良好的保温性。本次实验所用基质为细河沙，结果表明在其条件相同的情况下，用细河沙基质扦插曼地亚红豆杉，植株的成活率大约在90％左右。
[0106] 3.2化学药剂的处理对曼地亚红豆杉植株扦插的影响
[0107] 药剂处理能显著增强扦插枝条新陈代谢的作用，常用化学药剂有高锰酸钾、醋酸、氧化锰、硫酸镁、二氧化碳、磷酸等；高锰酸钾溶液处理的扦插枝条，可以促进氧化，使枝条内部的营养物质转变成可溶状态，增强扦插枝条的吸收能力，加速根的发生，另一方面，高锰酸钾溶液具有强氧化性，对微生物有一定的杀伤力，而起到灭菌作用，增强扦插枝条适应土壤环境的能力，提高成活率。本次实验所有的化学药剂是高锰酸钾，在枝条扦插入阳畦之前，细河沙用高锰酸钾溶液充分处理，一方面起到灭菌作用，一方面起到增强扦插枝条新陈代谢能力的作用，结果表明，经过如此处理后，扦插枝条成活率维持在90％左右。
[0108] 3.3不同季节对曼地亚红豆杉植株扦插的影响
[0109] 树木扦插生长的状况与扦插地的气候有关。曼地亚红豆杉，首先在下切口及枝叶的切口处形成愈伤组织，然后在愈伤组织的地方生长出不定根，不定根大多数长在切口处的愈伤组织上，少数的不定根生长在枝叶的伤口的愈伤组织上。曼地亚红豆杉茎段愈伤组织形成率比叶高，春夏季比秋冬的外植体愈伤组织形成率高。春季扦插：气温比地温上升快，气温高，枝条易于发芽，但地温低不利于发根，所以扦插时能够提高地温则有利于扦插枝条生根，一般白天气温达21℃-25℃，夜间温度达15℃，土温15℃-20℃或略高于平均气温3℃-5℃时，就可以满足生要需要了。本次实验扦插曼地亚红豆杉枝条的季节选在春季，扦插枝条生长过程中有塑料拱棚保密处理，降低地面气温，增高地下土温，同时保持枝条生长环境的空气有一定的湿度，实验结果显示，效果良好，两个年份的扦插成活率都保持在90％左右。
[0110] 3.4曼地亚红豆杉扦插植株的枝龄对成活率的影响
[0111] 扦插植株的枝龄直接对成活率产生影响。本次实验表明，曼地红豆杉在山西省地区的气候环境下的扦插情况，一年生的枝条成活率为为50％，二年生的枝条成活率高达标100％，三年生的枝条成活率为0％。一年生的枝条太嫩，积累的营养物质少，不能够满足枝条生根、发芽的条件，导致扦插效果差；三年生的枝条木质化程度过高，所含生长素少，枝条切口粗、伤口大，不利于形成的愈伤组织生根，导致扦插成活率大大降低；二年生的枝条木质化程度低，积积累的营养物质足以维持扦插枝条的生长需要，含有适量的生长素，对愈伤组织的生根具有促进作用，大大提高扦插枝条的成活率。
[0112] 3.5曼地亚红豆杉诱变植株的观察
[0113] 植物生长过程中存在顶端优势，导致侧芽生长受阻。用低浓度的秋水仙素处理的活细胞，秋水仙素可以结合于微管蛋白二聚体上，阻止其他微管蛋白加入，从而阻止纺缍丝形成，细胞不能够分裂。曼地亚红豆杉的诱变部位是植株的顶芽，在秋水仙素的作用下，顶芽的细胞分裂减缓，生长受阻，因此植株的顶端优势解除，侧芽生长的状态由抑制转变为分裂旺盛。
[0114] 3.6诱变植株的选择对实验的影响
[0115] 在实验材料的选择上，本实验选择株高在3cm到7cm之间的植株，并且要求顶端只有一个新生芽，由于最后每个植株都要用透明小塑料杯加盖，所以株高一定不能超过塑料杯的高度，否则会起到限制植株生长的作用，从而造成植株生长畸形，不利于诱变植株的生长发育和观察。另外，顶芽被秋水仙素处理过后，顶端优势解除，侧芽生长旺盛，如果选择侧芽作为处理对象，由于新生的侧芽太多，不利于观察鉴定，本实验因此选用单一的顶生芽作为处理对象。
[0116] 3.7加盖透明塑料小杯对实验的影响
[0117] 本实验所用的诱变化学试剂为秋水仙素，由于秋水仙素是有毒物质，其使用剂量和材料的诱变效率受到限制，因此在实验过程中，秋水仙素的浓度不能过高，也不能过低，本次实验所用秋水仙素的浓度为0.5％。实验材料处理后的生长环境是温室，室内温度较室外温度略高，滴在顶芽的秋水仙素溶液中的水分会蒸发，导致秋水仙素的浓度有所降低，若不再做任何其它处理，诱变效率很可能降低，因此本实验中加盖透明塑料小杯，防止水分蒸发，保持秋水仙素的浓度在有效范围内，提高诱变效率。
[0118] 4、结论
[0119] (1)在当地气候环境下，曼地亚红豆杉扦插枝条的年龄二年生最为合适。
[0120] (2)在曼地亚红豆杉扦插过程中，扦插基质最好用适宜浓度的高锰酸钾溶液作处理，可提高扦插的成活率。
[0121] (3)曼地亚红豆杉的扦插季节最好选在春季，利于生根，从而提高成扦插成活率。
[0122] (4)诱变曼地亚红豆杉的秋水仙素化学试剂选择合适的浓度，浓度太大容易造成植株死亡，浓度太小起不到诱变效果，本次实验所有浓度为0.5％的秋水仙素溶液。
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