一种简易高效的葛根多倍体诱导方法
阅读：88发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种简易高效的葛根多倍体诱导方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 植物 育种技术领域，具体涉及一种简易高效的葛根 多倍体 诱导方法。一种简易高效的葛根多倍体诱导方法，其包括外植体处理、无菌苗培养、丛生芽诱导、茎节伸长培养、多倍体诱导、嵌合体分离和纯系筛选等步骤。本发明先利用幼嫩的藤蔓进行培养获得无菌苗，然后诱导无菌苗获得丛生芽，再利用培养基对获得的丛生芽继续培养，得到茎节较长的组培苗；通过该方法可以获得茎节较长的单芽茎段，使单芽茎段也可以作为诱导的材料，丰富了现有的葛根多倍体诱导材料，提高了诱导的工作效率；另外利用葛根单芽茎段作为诱导材料的诱导率高于茎尖。，下面是一种简易高效的葛根多倍体诱导方法专利的具体信息内容。
1.一种简易高效的葛根多倍体诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.外植体处理：选取生长健壮、无病虫害的幼嫩藤蔓，先用0.1％升汞浸泡消毒6-
10min，然后用无菌水冲洗4-5次，最后用无菌滤纸吸干茎段表面水分备用；
S2.无菌苗培养：在无菌条件下，将经过S1处理的藤蔓切成单芽茎段，将生物学下端垂直竖插于初代培养基中培养28-30d，获得无菌苗；
S3.丛生芽诱导：在无菌条件下，将无菌苗转接到丛生芽诱导培养基中培养20-25d，获得丛生芽；
S4.茎节培养：在无菌条件下，将丛生芽转接到茎节伸长培养基中培养25-30d，获得茎节较长的葛根组培苗；
S5.多倍体诱导：在无菌条件下，将茎节较长的葛根组培苗先切成单芽茎段转接到诱导剂液体培养基中进行震荡培养48h-72h；
S6.嵌合体分离：在无菌条件下，将经过S5处理的单芽茎段用无菌水冲洗干净，然后转接到嵌合体分离培养基上培养，然后挑选变异植株将其单芽茎段用茎节伸长培养基连续进行4-6次的继代培养；
S7.纯系筛选：取经过S6培养的整株叶片，进行倍性鉴定，筛选出多倍体纯系材料。
2.根据权利要求1所述的葛根多倍体诱导方法，其特征在于，S2中所述初代培养基为：
MS基本培养基+0.3mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为
5.8；
培养条件为：温度25±1℃，光照1500-2000lx，光照时间16h/d。
3.根据权利要求1所述的葛根多倍体诱导方法，其特征在于，S3中所述丛生芽诱导培养基为：MS基本培养基+0.02mg/L6-BA+0.02mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；
培养条件为：温度25±1℃，光照1500-2000lx，光照时间16h/d。
4.根据权利要求1所述的葛根多倍体诱导方法，其特征在于，S4中所述茎节伸长培养基为：MS基本培养基+0.01-0.05mg/L IAA+0.01-0.05mg/L NAA+0.01-0.02mg/L GA3+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；
培养条件为：温度25±1℃，光照1500-2000lx，光照时间16h/d。
5.根据权利要求1所述的葛根多倍体诱导方法，其特征在于，S5中所述诱导剂液体培养基为：MS基本培养基+质量百分数为0.6-0.8％秋水仙素，初始培养基pH为5.8；
培养条件为：震荡频率100-220r/min，温度25±1℃，黑暗。
6.根据权利要求1所述的葛根多倍体诱导方法，其特征在于，S6中所述嵌合体分离培养基为：MS基本培养基+0.01-0.05mg/L IAA+0.01-0.05mg/L NAA+0.01-0.02mg/L GA3+
30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；
培养条件为：温度25±1℃，光照1500-2000lx，光照时间16h/d。
7.根据权利要求1所述的葛根多倍体诱导方法，其特征在于，S7中倍性鉴定采用染色压片法和流式细胞仪，筛选出多倍体纯系材料之后对其进行扩繁、壮苗生根及移栽成活。
一种简易高效的葛根多倍体诱导方法
技术领域
背景技术
[0002] 葛根又叫葛藤、葛麻藤、粉葛，为豆科葛属藤本植物，富含淀粉，是中国卫生部首批批准的药食同源两用植物，素有“北参南葛”、“亚洲人参”之美誉。葛根由于含有丰富的异黄酮类物质而在食品、医药等行业应用广泛。但是，经过大量的检测发现目前市场上的葛根产品的葛根素含量偏低或很低，未能达到药典的相关标准。实践证明，很多药用植物诱导的多倍体材料其次生代谢产物的含量都有所增加。因此，开展葛根多倍体诱导技术研究，从中选育高葛根素材料，可为功能型葛根产业的发展提供品种保障。
[0003] 葛根多倍体的诱导研究中仅见以葛根茎尖作为诱导材料的报道，周堂英的《粉葛组织培养体系的建立及同源四倍体新种质的培育》中就公开对丛生芽茎尖和成苗茎尖进行秋水仙素诱导首次获得了粉葛多倍体。但是茎尖是顶芽只有一个，其材料来源有限，诱导材料的基数小，导致诱导工作效率较低，限制了葛根育种的发展。目前关于葛根离体快繁技术的研究都是通过诱导愈伤组织再分化丛生芽，未见有葛根通过单芽茎段产生不定芽的增殖方式；而且如以葛根组培苗单芽茎段作为外植体材料进行葛根多倍体诱导，葛根组培苗节间较短，不适合作多倍体诱导材料，目前未见有以葛根单芽茎段为外植体材料诱导产生多倍体的报道。
[0004] 另外，IAA、NAA和GA3是常见的植物生长调节剂，发明人在利用其进行茎节伸长培养时发现，将不同的植物生长调节剂以不同的浓度不同的配比组合对葛根茎节伸长培养时，有的组合对茎节的伸长起抑制作用，有的起促进作用。其中较多的配比组合培养获得的单芽茎段并不适合作为诱导材料。
发明内容
[0005] 为解决上述问题，本发明提供一种简易高效的葛根多倍体诱导方法，其通过改进培养方法，获得特定的诱导材料，提高了诱导率。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
[0007] 一种简易高效的葛根多倍体诱导方法，包括以下步骤：
[0009] S2.无菌苗培养：在无菌条件下，将经过S1处理的藤蔓切成单芽茎段，将生物学下端垂直竖插于初代培养基中培养28-30d，获得无菌苗；
[0010] S3.丛生芽诱导：在无菌条件下，将无菌苗转接到丛生芽诱导培养基中培养20-25d，获得丛生芽；
[0011] S4.茎节培养：在无菌条件下，将丛生芽转接到茎节伸长培养基中培养25-30d，获得茎节较长的葛根组培苗；
[0012] S5.多倍体诱导：在无菌条件下，将茎节较长的葛根组培苗先切成单芽茎段转接到诱导剂液体培养基中进行震荡培养48h-72h；
[0013] S6.嵌合体分离：在无菌条件下，将经过S5的处理的单芽茎段用无菌水冲洗干净，然后转接到嵌合体分离培养基上培养，然后挑选变异植株将其单芽茎段用茎节伸长培养基连续进行4-6次的继代培养；
[0014] S7.纯系筛选：取经过S6培养的整株叶片，进行倍性鉴定，筛选出多倍体纯系材料。
[0015] 作为优选，S2中所述初代培养基为：MS基本培养基+0.3mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；
[0016] 培养条件为：温度25±1℃，光照1500-2000lx，光照时间16h/d。
[0017] 作为优选，S3中所述丛生芽诱导培养基为：MS基本培养基+0.02mg/L6-BA+0.02mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；
[0018] 培养条件为：温度25±1℃，光照1500-2000lx，光照时间16h/d。
[0019] 作为优选，S4中所述茎节伸长培养基为：MS基本培养基+0.01-0.05mg/L IAA+0.01-0.05mg/L NAA+0.01-0.02mg/L GA3+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；
[0020] 培养条件为：温度25±1℃，光照1500-2000lx，光照时间16h/d。
[0021] 作为优选，S5中所述诱导剂液体培养基为：MS基本培养基+质量百分数为0.6-0.8％秋水仙素，初始培养基pH为5.8；
[0022] 培养条件为：震荡频率100-220r/min，温度25±1℃，黑暗。
[0023] 作为优选，S6中所述嵌合体分离培养基和继代培养为：MS基本培养基+0.01-0.05mg/L IAA+0.01-0.05mg/L NAA+0.01-0.02mg/L GA3+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；
[0024] 培养条件为：温度25±1℃，光照1500-2000lx，光照时间16h/d。
[0025] 作为优选，S7中倍性鉴定采用染色压片法和流式细胞仪，筛选出多倍体纯系材料之后对其进行扩繁、壮苗生根及移栽成活。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0027] (1)通过本发明诱导茎节伸长的培养基，可以获得节间较长的葛根组培苗，使单芽茎段也可以作为诱导的材料，丰富了现有的葛根多倍体诱导材料，提高了诱导的工作效率；
[0028] (2)通过本发明所用葛根单芽茎段作为多倍体诱导材料，其多倍体诱导率提高至35％左右，大大提高了葛根多倍体诱导效率。
具体实施方式
[0029] 下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0030] 实施例1
[0031] 一种简易高效的葛根多倍体诱导方法，包括以下步骤：
[0032] S1.外植体处理：选取生长健壮、无病虫害的幼嫩藤蔓，先用0.1％升汞浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗4次，最后用无菌滤纸吸干茎段表面水分备用；
[0033] S2.无菌苗培养：在无菌条件下，将经过S1处理的藤蔓切成单芽茎段，将生物学下端垂直竖插于初代培养基中培养28d，获得无菌苗；
[0034] 所述初代培养基为：MS基本培养基+0.3mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；培养条件为：温度24℃，光照1500lx，光照时间16h/d；
[0035] S3.丛生芽诱导：在无菌条件下，将无菌苗转接到丛生芽诱导培养基中培养25d，获得丛生芽；
[0036] 所述丛生芽诱导培养基为：MS基本培养基+0.02mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；培养条件为：温度24℃，光照1500lx，光照时间16h/d；
[0037] S4.茎节伸长培养：在无菌条件下，将丛生芽转接到茎节伸长培养基中培养30d，获得茎节较长的葛根组培苗；
[0038] 所述茎节伸长培养基为：MS基本培养基+0.01mg/L IAA+0.01mg/L NAA+0.01mg/L GA3+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；培养条件为：温度24℃，光照1500lx，光照时间16h/d；
[0039] S5.多倍体诱导：在无菌条件下，将茎节较长的葛根组培苗先切成单芽茎段转接到诱导剂液体培养基中进行震荡培养48h；
[0040] 所述诱导剂液体培养基为：MS基本培养基+质量百分数为0.6％秋水仙素，初始培养基pH为5.8；培养条件为：震荡频率110r/min，温度24℃，黑暗；
[0041] S6.嵌合体分离：在无菌条件下，将经过S5处理的单芽茎段用无菌水冲洗干净，然后转接到嵌合体分离培养基上培养，然后挑选变异植株的单芽茎段用继代培养基连续进行6次的继代培养；
[0042] S6中所述嵌合体分离培养基和继代培养基为：MS基本培养基+0.01mg/L IAA+0.01mg/L NAA+0.01mg/L GA3+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；培养条件为：温度24℃，光照1500lx，光照时间16h/d；
[0043] S7.纯系筛选：取经过S6培养的整株叶片，采用染色压片法和流式细胞仪进行倍性鉴定，筛选出多倍体纯系材料之后对其进行扩繁、壮苗生根及移栽成活。
[0044] 实施例2
[0045] 一种简易高效的葛根多倍体诱导方法，包括以下步骤：
[0046] S1.外植体处理：选取生长健壮、无病虫害的幼嫩藤蔓，先用0.1％升汞浸泡消毒8min，然后用无菌水冲洗5次，最后用无菌滤纸吸干茎段表面水分备用；
[0047] S2.无菌苗培养：在无菌条件下，将经过S1处理的藤蔓切成单芽茎段，将生物学下端垂直竖插于初代培养基中培养32d，获得无菌苗；
[0048] 所述初代培养基为：MS基本培养基+0.3mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；培养条件为：温度25℃，光照1750lx，光照时间16h/d；
[0049] S3.丛生芽诱导：在无菌条件下，将无菌苗转接到丛生芽诱导培养基中培养23d，获得丛生芽；
[0050] 所述丛生芽诱导培养基为：MS基本培养基+0.02mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；培养条件为：温度25℃，光照1750lx，光照时间16h/d；
[0051] S4.茎节伸长培养：在无菌条件下，将丛生芽转接到茎节伸长培养基中培养25d，获得茎节较长的葛根组培苗；
[0052] 所述茎节伸长培养基为：MS基本培养基+0.03mg/L IAA+0.03mg/L NAA+0.02mg/L GA3+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；培养条件为：温度25℃，光照1750lx，光照时间16h/d；
[0053] S5.多倍体诱导：在无菌条件下，将茎节较长的葛根组培苗先切成单芽茎段转接到诱导剂液体培养基中进行震荡培养60h；
[0054] 所述诱导剂液体培养基为：MS基本培养基+质量百分数为0.7％秋水仙素，初始培养基pH为5.8；培养条件为：震荡频率150r/min，温度25℃，黑暗；
[0055] S6.嵌合体分离：在无菌条件下，将经过S5处理的单芽茎段用无菌水冲洗干净，然后转接到嵌合体分离培养基上培养，然后挑选变异植株的单芽茎段用继代培养基连续进行5次的继代培养；
[0056] S6中所述嵌合体分离培养基和继代培养基为：MS基本培养基+0.03mg/L IAA+0.03mg/L NAA+0.02mg/L GA3+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；
[0057] 培养条件为：温度25℃，光照1750lx，光照时间16h/d；
[0058] S7.纯系筛选：取经过S6培养的整株叶片，采用染色压片法和流式细胞仪进行倍性鉴定，筛选出多倍体纯系材料之后对其进行扩繁、壮苗生根及移栽成活。
[0059] 实施例3
[0060] 一种简易高效的葛根多倍体诱导方法，包括以下步骤：
[0061] S1.外植体处理：选取生长健壮、无病虫害的幼嫩藤蔓，先用0.1％升汞浸泡消毒6min，然后用无菌水冲洗5次，最后用无菌滤纸吸干茎段表面水分备用；
[0062] S2.无菌苗培养：在无菌条件下，将经过S1处理的藤蔓切成单芽茎段，将生物学下端垂直竖插于初代培养基中培养35d，获得无菌苗；
[0063] 所述初代培养基为：MS基本培养基+0.3mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；培养条件为：温度26℃，光照2000lx，光照时间16h/d；
[0064] S3.丛生芽诱导：在无菌条件下，将无菌苗转接到丛生芽诱导培养基中培养25d，获得丛生芽；
[0065] 所述丛生芽诱导培养基为：MS基本培养基+0.02mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；培养条件为：温度26℃，光照2000lx，光照时间16h/d；
[0066] S4.茎节伸长培养：在无菌条件下，将丛生芽转接到茎节伸长培养基中培养27d，获得茎节较长的葛根组培苗；
[0067] 所述茎节伸长培养基为：MS基本培养基+0.05mg/L IAA+0.05mg/L NAA+0.02mg/L GA3+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；培养条件为：温度26℃，光照2000lx，光照时间16h/d；
[0068] S5.多倍体诱导：在无菌条件下，将茎节较长的葛根组培苗先切成单芽茎段转接到诱导剂液体培养基中进行震荡培养72h；
[0069] 所述诱导剂液体培养基为：MS基本培养基+质量百分数为0.8％秋水仙素，初始培养基pH为5.8；培养条件为：震荡频率200r/min，温度26℃，黑暗；
[0070] S6.嵌合体分离：在无菌条件下，将经过S5处理的单芽茎段用无菌水冲洗干净，然后转接到嵌合体分离培养基上培养，然后挑选变异植株的单芽茎段用继代培养基连续进行6次的继代培养；
[0071] S6中所述嵌合体分离培养基和继代培养基为：MS基本培养基+0.05mg/L IAA+0.05mg/L NAA+0.02mg/L GA3+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8；培养条件为：温度26℃，光照2000lx，光照时间16h/d；
[0072] S7.纯系筛选：取经过S6培养的整株叶片，采用染色压片法和流式细胞仪进行倍性鉴定，筛选出多倍体纯系材料之后对其进行扩繁、壮苗生根及移栽成活。
[0073] 测试试验1-2中葛根的品种为“桂粉葛1号”。
[0074] 测试试验1：诱导剂对茎尖和单芽茎段的诱导效果比较
[0075] 试验设置研究组1、研究组2、研究组3和对照组共4个试验组；
[0076] 研究组1、研究组2和研究组3分别按照实施例1、实施例2和实施例3操作；
[0077] 对照组利用周堂英《粉葛组织培养及同源四倍体诱导》中公开的最适合的培养基培养获得的茎尖作诱导材料，其诱导方法也参照该文献公开的诱导效果最好的方法操作；
[0078] 2个试验组每组处理150个诱导材料，在诱导结束后统计加倍的株数，计算其诱导率，试验结果见下表1。
[0079] 诱导率(％)＝加倍株数÷150(处理的单芽茎段数)；
[0080] 表1诱导剂对茎尖和单芽茎段的诱导效果比较
[0081]组别 诱导材料 诱导材料数量 加倍株数 诱导率(％)
研究组1 单芽茎段 150 49 32.67
研究组2 单芽茎段 150 52 34.67
研究组3 单芽茎段 150 45 30.00
对照组 茎尖 150 36 24.00
研究组1 单芽茎段 150 49 32.67
研究组2 单芽茎段 150 52 34.67
研究组3 单芽茎段 150 45 30.00
对照组 茎尖 150 36 24.00
[0082] 从表1可以看出，研究组1、研究组2和研究组3与对照组相比，采用本申请培养后的单芽茎段作为诱导材料时其诱导率分别为32.67％、34.67％、30.00％，参照文献公开的方法培养的茎尖作为诱导材料时其诱导率为24.00％，采用单芽茎段作为诱导材料的诱导率明显高于对照组；说明经过培养后的单芽茎段比茎尖更适合作为葛根多倍体的诱导材料，相比之前仅以葛根茎尖作为诱导材料，丰富了葛根多倍体的诱导材料，提高了葛根多倍体诱导的工作效率，且操作简单方便。
[0083] 测试试验2：不同IAA、NAA和GA组合的茎节伸长培养基对葛根茎节的影响[0084] 研究组1：按照实施例1操作；
[0085] 研究组2：按照实施例2操作；
[0086] 研究组3：按照实施例3操作；
[0087] 对照组1：茎节伸长培养基为：MS基本培养基+0.03mg/L NAA+0.02mg/L GA3+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8，其他步骤按照实施例2操作；
[0088] 对照组2：茎节伸长培养基为：MS基本培养基+0.03mg/L IAA+0.02mg/L GA3+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8，其他步骤按照实施例2操作；
[0089] 对照组3：茎节伸长培养基为：MS基本培养基+0.03mg/L IAA+0.03mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8，其他步骤按照实施例2操作；
[0090] 对照组4：茎节伸长培养基为：MS基本培养基+0.03mg/L IAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8，其他步骤按照实施例2操作；
[0091] 对照组5：茎节伸长培养基为：MS基本培养基+0.03mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8，其他步骤按照实施例2操作；
[0092] 对照组6：茎节伸长培养基为：MS基本培养基+0.02mg/L GA3+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，初始培养基pH为5.8，其他步骤按照实施例2操作；
[0093] 每组设置20个重复，在进行茎节伸长培养获得葛根组培苗后，每组随机选取5株，分别测量各株的茎节长度并求其平均值，将平均值作为该组的茎节长度。
[0094] 表2不同IAA、NAA和GA组合对葛根茎节的影响
[0095]
[0096]
[0097] 从表2可以看出，将研究组2与各对照组相比，可以看出研究组2的茎节长度明显高于各对照组，说明本申请的葛根茎节伸长培养基可以有助于改变现有葛根茎节较短的现状，有效使较短的葛根茎节变长，使其也能作为多倍体诱导的材料，丰富了葛根多倍体诱导的材料，有利于葛根多倍体诱导工作的开展。
[0098] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
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