变应性反应通常是由组织肥大细胞和相关的效应分子(例如，嗜碱性粒细胞)的IgE依赖性刺激引发的免疫反应。细胞表面结合的IgE分子和抗原之间的结合事件导致生物反应修饰剂的迅速释放，由此引起血管通透性增加，血管舒张，平滑肌收缩和局部炎症。这一系列事件称为速发型超敏反应，并迅速地开始，在致敏个体中通常在暴露的几分钟内开始。在其最严重的系统形式(过敏反应)中，此类速发型超敏反应会引起窒息，产生心血管性虚脱(cardiovascular collapse)，甚至导致死亡。易受强烈的速发型超敏反应应答的个体被称为“特应性的”。变态反应或特应性的临床表现包括花粉热(hay fever)(鼻炎)，哮喘，荨麻疹(urticaria)(风疹(hives))，皮肤刺激(如湿疹如慢性湿疹)，过敏反应，和相关病症。
自20世纪初(此时估计变态反应流行性在欧洲，英国和美国不到0.1％)起，特应性的流行性在发达国家已经增加(Schadewaldt H,1980,Geschichte der Allergies in vier Dustri-Verlag；如Matthias Wjst,2009,Allergy,Asthma&Clinical Immunology.5:8引用)。现在约30-40％的世界人口受到一种或多种变应性病症影响。哮喘，鼻炎，湿疹现在发达国家流行，变应性病症是在发达国家的儿童中最常见的慢性疾病。例如，如今在澳大利亚超过25％的婴儿呈现出湿疹，超过20％的一岁龄是食品致敏的，超过25％的儿童有哮喘，并且超过40％的成人具有过敏性鼻炎的历史(Pawnkar R,Walter Canonica G,Holgate ST,Lockey RF,2001,World Allergy Organization(WAO)White Book on Allergy)。在美国，变态反应也影响约20％的所有个体。预计到2050年特应性将增至澳大利亚人口的约26。
尽管儿童哮喘通常在童年时期改善，但是哮喘和鼻炎在整个成年期持续，在那些年龄超过60岁的人中哮喘相关的死亡率大幅增长(Martin PE et al.,2011,J.Allergy 
Clin.Immunol.127:1473-1479)。
存在与变应性病症相关的重大经济负担。例如，在2007年，澳大利亚的相关的经济成本估计为94亿澳元，额外的213亿澳元来自损失的健康(例如，残疾和早产儿死亡)。在英国，用于特应性湿疹的每年的总支出估计为4.65亿英镑(521m欧元)。在德国，已估计特应性湿疹患者的总平均成本是约4400欧元。在美国，据预测在2010年哮喘对美国经济的直接和间接成本已经达到207亿美元，并且仅仅治疗儿童哮喘的直接成本就超过每名患者每年1,100美元。年龄为0至5岁的患者中单独治疗湿疹发病的费用大约是每名患者每年360美元，年度费用在澳大利亚超过400,000澳元，在西欧为500万欧元和在美国为300万美元。
几个研究已经证明了在过去10年期间在发达国家中的从儿童中的变应性哮喘和花粉
热的流行性(Mullins RJ,2007,Med J Aust.186:618-621)向增加的湿疹和食物变态反应的变态反应模式的时间变化。在这第二波变态反应流行中，10％儿童具有某种形式的食物变态反应(Osborne NJ et al.,2011,J.Clin.Immunol.127:668-676；Prescott S and Allen KJ,2011,Pediatr.Allergy Immunol.22:155-160)。变应性病症的这种变化的流行病学在很大程度上仍然不清楚。
如本文的图1中(A)图所示，具有中度至重度湿疹的婴儿在以后的生活中，例如，在童年时期处于发展成食物变态反应和/或变应性哮喘的较高风险，并且相当大比例的这些个体将如成人一样具有特应性或呼吸道变态反应。这就是所谓的“特应性行进(atopic march)”或“变应性行进(allergic march)”(Martin PE et al.,2011,J.Allergy 
Clin.Immunol.127:1473-1479)。目前具有食物变态反应的这一代似乎比具有呼吸道变态反应的前几代在生命中更早呈现出症状，而且似乎不太可能在早期成年期消除(outgrow)他们的变态反应(Prescott S and Allen KJ,2011,Pediatr.Allergy Immunol.22:155-
160)。
所谓的“卫生学假说(hygiene hypothesis)”将发达国家的特应性的增加归因于使用抗生素治疗在婴儿期和/或儿童期微生物感染的增加(Strachan DP,1989,BMJ,299:1259-
1260；Strachan DP,Harkins LS,Golding J,1997,Clin.Exp.Allergy.27:151-155；Renz H and Herz U,2002,Eur.Respir.J.19:158-171)。根据卫生学假说，微生物环境(人类微生物菌群(microbiome))的生物多样性的改变和对调节宿主免疫系统的微生物的暴露减少引起导致特应性行进的儿童变态反应，例如，因为除了减少病原体的发生率外，抗生素减少了对于平衡的免疫系统发展有益的微生物的发生率(Guarner F et al.,2006,
Nat.clin.Pract.Gastroenterol.Hepatol.3:275-284)。
适当的T细胞群体的选择发生在未处理的(naive)未致敏宿主(如新生婴儿(neonate)
和新生儿(new born)和具有未发育的免疫系统的婴儿)的免疫应答的早期阶段期间。如果选择有利于朝着诱导变应原特异性Th1细胞引发宿主免疫系统，那么IgG和IgA应答可能随之发生。TH1细胞似乎在针对各种微生物抗原，包括细菌，病毒和真菌感染的防御中发挥作用，并且不受控的TH1应答参与器官特异性自身免疫，例如，类风湿性关节炎，多发性硬化，甲状腺炎，克罗恩病，系统性红斑狼疮，实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎
(uveoretinitis)(Dubey et al.,1991,Eur.Cytokine Network,2:147-152)，实验性自身免疫性脑炎(EAE)(Beraud et al.,1991,Cell Immunol.133:379-389)，胰岛素依赖性糖尿病(Hahn et al.,1987,Eur.J Immunol.18:2037-2042)，接触性皮炎(Kapsenberg et al.,Immunol Today,12:392-395)和一些慢性炎性病症。通过TH1细胞产生的主要炎性细胞因子是IFN-γ(参见，例如Romragnani编,TH1 and TH2 Cells in Health and 
Disease.Chem.Immunol.,Karger,Basel,63,pp.158-170and 187-203(1996))。
另一方面，TH2细胞的出现可导致IgE产生和嗜酸性粒细胞增多，并最终导致特应性疾病。参见例如，WO2005/030249。变态反应，哮喘，湿疹，银屑病，过敏性鼻炎，花粉热和特应性皮炎各自与意义深远的免疫学脱调节(deregulation)有关，该免疫学脱调节的特征在于TH2细胞的过度产生(Romragnani,同上；van der Heijden et al.,1991；J Invest Derm.97:389-394；Walker et al.,1992,Am.Rev.Resp.Dis.148:109-115；及Renz H and Herz U,2002,同上)，并且不受控的TH2型应答负责触发针对环境变应原和化学变应原的变应性病症。在某些原发性免疫缺陷，如高IgE综合征(Del Prete et al.,1989,
J.Clin.Invest.84:1830-1835)和Omenn综合征(Schandene et al.,1993,
Eur.J.Immunol.23:56-60)中，也优先地诱导TH2型应答。
TH2效应器功能可以通过TH1细胞负调控。卫生学假说提示，微生物感染的减少频率，不太严重的感染，和感染的预防(例如通过频繁使用抗生素)可以防止TH1免疫的成熟，并且在随后对变应原的暴露后产生变应原特异性的TH-2免疫应答(Renz H and Herz U,2002,同上)。
目前还没有针对严重的特应性的治愈方法，只有有限的治疗。治疗选择一般限于类固醇，抗组胺剂，免疫调节药物的使用和肾上腺素的施用。这些治疗方案最多提供了暂时的缓解，一般不适合持续使用。因此，在本领域仍然存在用于预防变应性病症的组合物和方法的未满足的需求。
幽门螺旋杆菌(H.pylori)是一种胃的细菌性病原体，其慢性感染超过一半的世界人
口。幽门螺旋杆菌的感染通常在童年早期获得，如果保持不处理，可以持续一生的时间，其中大多数的感染个体仍然是无症状的。另一方面，幽门螺旋杆菌感染是消化性溃疡病的主要原因，所述消化性溃疡病在超过10％的感染受试者中表现(Kuipers et al.,
1995.Aliment Pharmacol Ther,9Suppl 2:59-69)。幽门螺旋杆菌感染还与非心源性胃腺癌(其是最常见的致命性恶性肿瘤之一)的风险增加相关，并且与胃粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤(Suerbaum&Michetti,2002,N Engl J Med,347:1175-1186；Atherton
(2006),Annu Rev Pathol.1:63-96),以及慢性荨麻疹(风疹)相关。
流行病学人口研究提示胃粘膜中的活幽门螺旋杆菌的流行性与发达国家中的变态反
应发病率成反比。参见，例如，Zevit et al.,(2011),Helicobacter,17:30-35；Shiotani et al.,(2008),BMJ,320:412-7；Chen&Blaser(2007),Arch Intern Med,167:281-7；
McCune et al.,(2003),Eur J Gastroenterol Hepatol,15:637-40；Reibman et al.,(2008),PLoS ONE,3:e4060；Konturek et al.,(2008),Med Sci Monit,14:CR453-8。然而，许多其他研究已经提示了，下降的幽门螺旋杆菌感染率与增加的变态反应比率之间的相关性可能不正确。参见，例如Zevit et al.,(2011)supra；Raj et al.(2009),J Infect Dis,
199:914-5。这些相互矛盾的报告提示关于幽门螺旋杆菌对胃粘膜的定殖(colonization)降低是否直接牵涉特应性行进的不确定性。
发明概述
1.概要
在导致本发明的工作中，发明人试图鉴定和/或制备组合物，其用于例如通过预防或延迟受试者中的特应性发展或特应性行进，改善哺乳动物受试者的免疫系统对变态反应的耐受。具体地，发明人试图鉴定和/或制备组合物，其能够在哺乳动物受试者中预防对变应原的变应性免疫应答或降低对变应原的变应性免疫应答的严重性或发病率，或能够在受试者暴露于变应原后在哺乳动物受试者中中预防变应性疾病(如气道高反应性)或减弱变应性疾病(如气道高反应性)的严重性。发明人还试图鉴定和/或制备组合物，其能够防止或中断或限制儿童(例如新生儿和幼年)中的变应性疾病(如湿疹)特应性行进和进展成生命后期(如在青春期和/或成年期期间)的食物变态反应和/或严重哮喘。
发明人推论，最佳平衡的免疫系统在出生后早期形成，并且因此，为了防止受试者中的特应性行进和在青少年和成人中的变态反应的发展的药物施用最佳地可对新生儿或在童年早期期间递送。
如这里所列举，本发明人已表明，例如通过测量气道或肺阻力测定的，施用于新生儿或成人的包含灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌的口服组合物在变态反应的小鼠模型中降低了对抗原攻击的变应性应答的发病率或严重性。因此，施用灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌(例如其中灭活的幽门螺旋杆菌不具有与活幽门螺旋杆菌相同的定殖在接受其施用的哺乳动物的粘膜中的能力，或其中所述灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌不能定殖在接受其施用的哺乳动物的粘膜中)，或幽门螺旋杆菌细胞裂解物似乎中断或减慢或阻止或预防受试者中的特应性行进或进一步的特应性行进，例如通过延迟或防止或中断或减缓一种或多种变应性状况，如变应性湿疹，荨麻疹，风疹，鼻炎，哮鸣(wheezing)，气道阻力，气道限制，或气道高反应性或高反应性，食物变态反应，哮喘等的发作。
因此，本发明提供了个体对一种或多种变应原的超应答性的普遍降低，从而延迟或预防或中断或减缓一种或多种变应性状况的发作。降低的超敏感性可以通过受试者对特定变应原的降低的敏感性来证明，例如，超敏感性的公认模型变应原，例如作为攻击以烟雾化形式或通过管饲法对鼠动物施用的卵白蛋白和/或豚草，例如，BALB/c或C57/BL/6或SJL/J小鼠。参见，例如，Renz et al.,J.Allergy Clin.Immunol.89:1127-1138(1992)；Renz et al.,J.Immunol.151:1907-1917(1993)；Saloga et al.,J.Clin.Invest.91:133-140(1993)；Larsen et al.,J.Clin.Invest.89:747-752(1992)；Oshiba et al.,J.Clin,Invest.97:1938-1408(1996)。
例如，通过将灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，例如分离的灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌施用于对于湿疹而言无症状或对于变态反应而言无症状(例如特征在于鼻炎或哮鸣或气道阻力或限制或气道高反应性)，或对于哮喘而言无症状的受试者，可防止湿疹和/或变态反应和/或哮喘的随后发作。在一个具体的实例中，将灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌施用于幼年受试者诸如新生儿或婴儿，以防止在婴儿中的湿疹或在以后的生活例如在青春期或成年期的变态反应或哮喘的后续发作。在另一实例中，将灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，例如分离的灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌施用于青少年或成人受试者以防止在受试者中的湿疹或变态反应或哮喘的后续发作，如在以后的生活中。这是在下述的背景下，其中变应性湿疹，变态反应或哮喘在生命的任何阶段可通过使受试者暴露于一种或多种攻击变应原，包括一个或多个环境变应原，如花粉变应原，尘螨变应原，动物变应原，化学变应原等诱导。
备选地，通过将灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，例如分离的灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌施用于受试者，可以防止随后的攻击或可以降低随后的攻击的严重性，所述受试者先前已患有变应性湿疹，变态反应(例如，特征在于鼻炎或哮鸣或气道阻力或限制)，或哮喘的一种或多种发生。在一个具体的实例中，通过将灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，例如分离的灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌施用于已经患变应性湿疹的幼年受试者，以防止后续的攻击，或者减少后续攻击的严重性，任选地防止或减缓在受试者中的进一步特应性进行。在另一实例中，将灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，例如，分离的灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌施用于以前患变应性湿疹和/或变态反应和/或哮喘的青少年或成人受试者，以防止后续的攻击，或者减少后续攻击的严重性，任选地防止或减缓在受试者中的进一步特应性进展。
在流行病学背景中，将灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌(例如，分离的灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌)施用于受试者减少了变应性免疫应答在群体中的发病率，特别是降低了在他们是幼年时治疗的群体的青少年和/或成年成员中的变应性免疫应答的发病率。
灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌细菌在变应性气道疾病的小鼠模型中保护受试者的证明提供了避免与使用活的幽门螺旋杆菌细胞相关的健康风险，如诱导消化性溃疡和/或胃癌的显著优势。换句话说，灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌或幽门螺旋杆菌的裂解物提供了积极地影响正在发育的免疫系统和预防或减少针对变应原的变应性应答的安全和可控的方式。相似地，灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌或幽门螺旋杆菌的裂解物通过靶向在生命的早期，例如，在儿童如新生儿和/或幼年中的事件提供了延迟或防止特应性行进的安全和可控的方式。
本发明因此提供了将灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌细菌或其裂解物施用(例如重
复施用)于例如儿童或婴儿(如年龄0至5岁)，由此促进平衡的免疫发育，以用于降低变态反应(如作为变应性湿疹和/或终身食物变态反应和/或变应性哮喘)的严重性或发病率。灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌细菌或其裂解物也可用于调节哺乳动物受试者的免疫系统和/或用于改善免疫系统对变态反应的耐受性。
如本文所公开，将灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌细菌或其裂解物配制成和/或用作食物成分或食物产品，例如医疗食品，如乳或非乳和/或食品添加剂和/或如片剂和/或胶囊。这样的制剂优选是粘膜组合物，其用于改善免疫系统对变应原的耐受和/或防止或减少例如在成人和/或青少年中的变态反应症状。该制剂优选供重复施用，例如，每日施用于患有湿疹和/或食物变态反应或易发展成湿疹或食物变态反应的儿童和/或婴儿，例如，年龄为0至5岁。在这方面，受试者可以在0-5岁或0-4岁或0-3岁或0-2岁或0.5-5岁或0.5-4岁或
0.5-3岁或0.5-2岁或0.5-1岁或1-2岁或1-3岁或1-4岁或1-5岁或2-3岁或2-4岁或2-5岁或
3-4岁或3-5岁易发展成变态反应。例如，为了防止或限制在受试者中的特应性行进，如在以后的生活中进展为食物变态反应和/或变应性哮喘，对受试者施用多个剂量的制剂，其包含灭活的幽门螺旋杆菌或其细胞提取物或裂解物，其中第一剂量在下文中当受试者易于发展成变态反应的时间施用。例如，受试者可以正在服用抗生素治疗或规定的抗生素治疗，特别是易于发展成变态反应的婴儿或儿童的情况下。
不受限于理论或特定的作用模式，发明人推测，本发明的灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌保持和/或形成细胞的结构支架和/或细胞结构支架的聚结物或聚集体。不受限于理论或特定的作用模式，发明人还推测，此支架和/或聚结物或聚集体可能对于以下是重要的：
促进受试者中的免疫调节朝向针对变应原的平衡免疫应答，例如，在受试者中平衡的Th1/Th2免疫应答和/或例如通过延迟或预防或中断或减缓本文中所描述的一种或多种变应性状况的发作来中断或减慢或阻止或预防受试者中的特应性行进或进一步特应性行进。
本发明的具体例子
本发明的范围将是从与本申请一起提交的实施例之后的权利要求书中明显的。将与本申请一起提交的权利要求书在此并入说明书。本发明的范围也将是从具体实施方案的以下描述和/或优选实施方案的详细描述中明显的。
因此，在一个实例中，本发明提供包含幽门螺旋杆菌细胞，其细胞裂解物或它们的组合和药学可接受载体的组合物，其中所述幽门螺旋杆菌细胞被灭活，例如，借此相对于活的幽门螺旋杆菌细胞，例如具有与灭活细胞相同基因型的活的幽门螺旋杆菌细胞具有降低的定殖在哺乳动物的粘膜中的能力，或借此不能定殖在所述哺乳动物的粘膜中，优选其中所述幽门螺旋杆菌例如通过热处理被杀死。
在一些实施方案中，本发明的组合物基本上由幽门螺旋杆菌细胞和/或其细胞裂解物和药学可接受载体组成，其中所述幽门螺旋杆菌细胞被灭活，例如，借此相对于活的幽门螺旋杆菌细胞，例如具有与灭活细胞相同基因型的活的幽门螺旋杆菌细胞具有降低的定殖在哺乳动物的粘膜中的能力，或借此不能定殖在所述哺乳动物的粘膜中，优选其中所述幽门螺旋杆菌例如通过热处理被杀死。
本领域的技术人员应当理解使用任何幽门螺旋杆菌菌株；然而，在一些实例中，幽门螺旋杆菌菌株是cagA阴性(cagA-)。在一些实例中，幽门螺旋杆菌菌株是cagA-并且也是vacA基因的产毒性s1和m1等位基因阳性。
在一些实例中，本发明提供的幽门螺旋杆菌菌株具有选自由以下组成的组的菌株的特性：OND737，以登记号V09/009101保藏于国家测量研究所(National Measurement 
Institute)；OND738，以登记号V09/009102保藏于国家测量研究所V09/009102；OND739，以登记号V09/009103保藏于国家测量研究所；OND248,以登记号V10/014059保藏于国家测量研究所；OND256，以登记号V10/014060保藏于国家测量研究所；OND740,以登记号V09/
009104保藏于国家测量研究所；OND79,以登记号V13/023374保藏于国家测量研究所,和/或OND86,以登记号V14/013016保藏于国家测量研究所,或其传代菌株，突变体或衍生物。
在一些实例中，本发明的幽门螺旋杆菌菌株已通过动物宿主如人类宿主传代。例如，本发明的幽门螺旋杆菌菌株来源于人类受试者中的OND79菌株传代后的幽门螺旋杆菌菌株OND79，例如在幽门螺旋杆菌菌株OND79感染和/或定殖人类受试者的胃粘膜后。在一个这样的实例中，本发明的幽门螺旋杆菌菌株是OND86。
虽然在本发明中使用的幽门螺旋杆菌菌株通常是非遗传修饰的细菌，但是在一些实例中，幽门螺旋杆菌菌株经遗传修饰以包含编码至少一种异源抗原或其功能性片段的一种或多种核酸分子。
在一些实例中，核酸分子在染色体外存在于例如质粒载体如穿梭载体上。优选地，质粒载体将包含(a)编码异源抗原的核酸序列，和(b)与其可操作地连接的控制或调节序列，其能够在将载体转化到幽门螺旋杆菌菌株中时控制核酸的表达。在其它实例中，核酸分子在转化到幽门螺旋杆菌菌株时插入到幽门螺旋杆菌染色体中。
合适的抗原将是本领域技术人员已知的。优选地抗原是环境抗原，并且可以单独使用或以两种或更多种这样的抗原的组合使用。
在一些实例中，本发明的组合物将包含佐剂。佐剂可以是本领域中已知的任何佐剂；然而，优选地，佐剂选自下组：明矾，百日咳毒素，乳岩藻戊糖III，phosphopolymer(磷聚合物)，完全弗氏佐剂，单磷酰脂质A，3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)，铝盐，含有CpG的寡核苷酸，免疫刺激DNA序列，皂甙，Montanide ISA720，SAF，ISCOMS，MF-59，SBAS-3，SBAS-4，Detox，RC-529，氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯，和LbeIF4A或其组合。备选地，在其它实施例中，本发明的粘膜组合物不包含佐剂和/或在不存在佐剂的情况下施用。
本发明可用于预防和/或治疗有风险形成变态反应或具有变态反应的哺乳动物中的变态反应。在一些实例中，变态反应选自接触性皮炎，慢性炎性疾病，变应性特应性病症，变应性哮喘，变应性皮炎，高IgE综合征，Omenn综合征，银屑病，花粉热，变应性鼻炎，荨麻疹，湿疹和食物变态反应。
因此，在又一个实例中，本发明提供用于预防或治疗在哺乳动物中的变态反应的组合物，其包含幽门螺旋杆菌细胞如分离的幽门螺旋杆菌细胞，其细胞裂解物或它们的组合和药学可接受载体，其中所述幽门螺旋杆菌细胞被杀死或不能定殖在所述哺乳动物的粘膜中。任选地，细胞裂解物是灭活的幽门螺旋杆菌细胞的全细胞裂解物(WCL)。
在又一个实例中，本发明提供一种组合物，其包含幽门螺旋杆菌细胞如分离的幽门螺旋杆菌细胞，其细胞裂解物或它们的组合和药学可接受载体，其中所述幽门螺旋杆菌细胞被灭活，借此相对于活的幽门螺旋杆菌细胞，例如具有与灭活细胞相同基因型的活的幽门螺旋杆菌细胞具有降低的定殖在哺乳动物的粘膜中的能力，或借此不能定殖在所述哺乳动物的粘膜中。优选地，组合物用于粘膜递送。任选地，细胞裂解物是灭活的幽门螺旋杆菌细胞的全细胞裂解物(WCL)。
在另一实例中，本发明提供了一种组合物，其包含灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌细胞，如分离的灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌细胞，或其细胞裂解物，其中将所述组合物配制成通过粘膜施用于受试者以用于阻断或减缓或阻止或预防受试者中的特应性行进或特应性行进的进展。例如，细胞裂解物是WCL。在一个这样的实例中，中断或减缓或阻止或预防受试者中的特应性行进或特应性行进的进展包括延缓或防止或中断或减缓受试者中的一种或多种变应性状况的发作。
例如，变应性状况可以包含变应性湿疹，荨麻疹，风疹，鼻炎，哮鸣，气道阻力，气道限制，肺部炎症，食物变态反应或哮喘。优选地，变应性状况包含响应于变应原的高反应性或气道阻力或气道高反应性，并且其中组合物用于降低所述气道阻力。备选地，或此外，变应性状况包含响应于变应原的肺部炎症，并且其中组合物用于降低所述肺部炎症例如，其特征在于肺中降低的细胞浸润物水平。备选地，或另外，变应性状况的特征在于，变应原特异性IgE抗体的升高的血清水平和/或一种或多种炎性细胞因子在细支气管肺泡灌洗(BAL)中升高的水平和/或肺中的细胞浸润物的升高的水平。例如，相对于暴露于变应原且不施用所述组合物的受试者中的下述方面的水平，该组合物减少了变应原特异性IgE抗体的血清水平和/或一种或多种炎性细胞因子在细支气管肺泡灌洗(BAL)中的水平，和/或肺中的细胞浸润物的水平。备选地，所述组合物在暴露于变应原的受试者中预防或延迟变应原特异性的IgE抗体的血清水平的增加和/或防止或延迟一种或多种炎性细胞因子在细支气管肺泡灌洗(BAL)中的水平的增加和/或防止或延迟肺中的细胞浸润物水平的增加。
优选地，如根据本文任何实例中描述的组合物包含幽门螺旋杆菌细胞或菌株，其相对于活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株具有降低的定殖在受试者的粘膜中的能力，或不能定殖在受试者的粘膜中。或者/另外，根据本文描述的任何实例的组合物包含灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株，例如，通过辐射诸如γ辐射和/或紫外线照射和/或热处理和/或化学手段和/或通过暴露于酸和/或通过暴露于碱和/或通过物理方法，如压力和/或通过冻干和/或通过冷冻融化。备选地，或另外，根据本文的任何实例的组合物包含经杀死的幽门螺旋杆菌细胞或菌株，例如，通过热处理使得细胞不可逆地呈现无代谢活性。在另一实例中，根据本文的任何实例的组合物包含幽门螺旋杆菌细胞或菌株，其已经经历用于灭活幽门螺旋杆菌细胞的方法和用于杀死幽门螺旋杆菌细胞的方法。在一个特定实例中，根据本文的任何实例的幽门螺旋杆菌细胞或菌株是杀死的。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的组合物包含裂解物，如幽门螺旋杆菌细胞的WCL，其中所述细胞已经经历用于灭活幽门螺旋杆菌细胞的方法和/或用于杀死幽门螺旋杆菌细胞的方法。
例如，根据本文任何实例中描述的灭活的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于照射如γ照射和/或紫外线照射和/或通过暴露于可见光，例如波长范围为375nm至约500nm或范围为约400nm至约420nm，例如，405nm的紫色光。在一个实例中，根据本文任何实例中描述的灭活的幽门螺旋杆菌是通过下述方法制备，该方法包括使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于紫外线-C(UVC)照射，例如波长范围为约100nm至约
280nm，如约257.3nm，和/或紫外线B(UVB)照射，例如波长范围为约280nm至约315nm，和/或紫外线A(UVA)照射，例如波长范围为约315nm至约400nm。优选地，使活的幽门螺旋杆菌暴露于范围为约100nm至约280nm，例如约257.3nm的UVC光和/或使活的幽门螺旋杆菌暴露于约
405nm紫色光。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的灭活的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于一种或多种化学试剂，如甲醛和/或β-丙内酯和/或乙烯亚胺(ethyleneimine)和/或双乙烯亚胺(binary ethyleneimine)和/或硫柳汞和/或聚乙烯亚胺官能化的氧化锌纳米颗粒，或它们的衍生物。例如，活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株可以通过暴露于浓度约0.01％至约1％(w/w)或约0.01％至约0.1％(w/w)或介于约0.025％和约
0.1％(w/w)之间的甲醛而灭活。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的灭活的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于热处理，如在温度范围在约40℃至约70℃或更高的热处理。或者/另外，根据本文任何实例中描述的灭活的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于一种或多种酸，或低pH环境，例如pH3.0或更低，和/或一种或多种碱，或高pH环境，例如pH9.0或更高。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的灭活的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于一种或多种还原剂，例如亚硫酸氢钠和/或一种或多种氧化剂，如过氧化氢。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的灭活的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于胆汁盐。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的灭活的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：诱变活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的灭活的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：冻干或冷冻干燥活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株。或者/另外，根据本文任何实例中描述的灭活的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：对活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株进行冷冻和融化的一个或多个循环。
例如，根据本文任何实例中描述的杀死的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：使活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于热处理，如通过暴露于约60℃或更高的温度达60秒，优选地在约60℃或约70℃或约80℃或约90℃或约100℃或约110℃或约120℃或约130℃或约140℃或约150℃的温度下热处理，所述温度保留持续至少2分钟或至少3分钟或至少4分钟，或至少5分钟或至少6分钟或至少7分钟，或至少8分钟或至少9分钟或至少10分钟或至少20分钟或至少30分钟或至少40分钟或至少50分钟或至少1小时或至少2小时或至少3小时，或至少4小时，或至少5小时或至少6小时或至少7小时或至少8小时，或至少9个小时或至少10小时或至少11小时或至少12小时或至少13小时或至少14小时或至少15小时或至少16个小时，或至少17小时或至少18个小时，或至少19小时或至少20小时或至少21小时或至少
22小时或至少23小时或至少1天，或者至少2天或至少3天或至少5天或至少5天或至少6天或至少7天的时段。在一个优选的实例中，活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌通过以下被杀死：暴露于单个这种升高的温度或暴露于至少两个不同的升高温度，例如暴露于约70℃的第一温度，随后暴露于约90℃或约95℃的第二温度。在一个这样的优选实例中，活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌通过以下被杀死：暴露于约70℃的温度下约10分钟，随后暴露于约90℃或约
95℃的温度约5分钟。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的的经杀死的幽门螺旋杆菌通过以下制备：在蒸汽和升高的压力的存在下，使活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于升高的温度，如高压灭菌活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株。例如，活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌通过在约121℃和约15psi，高压灭菌细菌细胞或菌株约15分钟，或在约132℃和约
30psi高压灭菌约3分钟被杀死。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的经杀死的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：使活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于一种或多种杀菌剂。例如，可以用一种或多种抗生素对活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌进行处理，所述抗生素选自利福平，阿莫西林(amoxicillin)，克拉霉素，利福霉素，利福昔明，利福霉素衍生物3′-hydroxy-5′-(4-isobutyl-1-piperazinyl)benzoxazinorifamycin(同物异名KRM-1648)和/或利福霉素衍生物3′-hydroxy-5′-(4-propyl-1-piperazinyl)benzoxazinorifamycin(同物异名KRM-
1657)。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的经杀死的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：使活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于照射，如gamma照射和/或紫外照射和/或通过暴露于可见光，如波长范围为375nm至约500nm或范围为约400nm至约420nm。例如，经杀死的幽门螺旋杆菌是通过以下方法制备，所述方法包括使活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于紫外线-C(UVC)照射，例如波长范围为约100nm至约280nm，如约257.3nm，和/或紫外线B(UVB)照射，例如波长范围为约280nm至约315nm，和/或紫外线A(UVA)照射，例如波长范围为约315nm至约400nm。优选地，使活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌暴露于范围为约100nm至约280nm，例如约257.3nm的UVC光和/或灭活的幽门螺旋杆菌暴露于约405nm紫色光。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的经杀死的幽门螺旋杆菌是通过超声处理，例如以如约20kHz或更高的超声频率的超声处理来制备。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的经杀死的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：诱变活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株。
优选地，根据本文任何实例中描述的经杀死的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：首先使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于照射，如gamma照射和/或紫外照射，如UVC光和/或通过暴露于可见光，如波长范围为375nm至约500nm或范围为约400nm至约420nm的可见光，从而灭活幽门螺旋杆菌，然后使灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于根据本文任何实例中描述的热处理，从而杀死灭活的幽门螺旋杆菌或使灭活的幽门螺旋杆菌不可逆地无代谢活性。
例如，使灭活的幽门螺旋杆菌暴露于在温度约60℃或更高达至少约60秒，优选地在约
60℃或约70℃或约80℃或约90℃或约100℃或约110℃或约120℃或约130℃或约140℃或约
150℃的温度。所述温度暴露持续至少2分钟或至少3分钟或至少4分钟，或至少5分钟或至少
6分钟或至少7分钟，或至少8分钟或至少9分钟或至少10分钟或至少20分钟或至少30分钟或至少40分钟或至少50分钟或至少1小时或至少2小时或至少3小时，或至少4小时，或至少5小时或至少6小时或至少7小时或至少8小时，或至少9个小时或至少10小时或至少11小时或至少12小时或至少13小时或至少14小时或至少15小时或至少16个小时，或至少17小时或至少
18个小时，或至少19小时或至少20小时或至少21小时或至少22小时或至少23小时或至少1天，或者至少2天或至少3天或至少5天或至少5天或至少6天或至少7天的时段。在一个这样的实例中，灭活的幽门螺旋杆菌暴露于单个这种升高的温度或暴露于至少两个不同的升高温度，例如暴露于约70℃的第一温度，例如约10分钟，随后暴露于约90℃或约95℃的第二温度，例如约5分钟。
在一个优选的实例中，根据本文任何实例中描述的经杀死的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：首先使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于紫外线照射，如UVC光，例如约257.3nm，从而灭活幽门螺旋杆菌，然后使灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于根据本文任何实例中描述的热处理，从而杀死灭活的幽门螺旋杆菌或使灭活的幽门螺旋杆菌不可逆地无代谢活性。
因此，在一个优选实例中，根据本文任何实例的组合物包含已经进行通过照射灭活幽门螺旋杆菌的方法和通过热处理杀死灭活的幽门螺杆菌的方法的幽门螺旋杆菌。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的幽门螺旋杆菌是通过以下被灭活和/或杀死
的：使活的或灭活的幽门螺旋杆菌暴露于厌氧条件，例如，通过改变气氛，其中使幽门螺旋杆菌从微需氧到厌氧环境下培养，例如以模拟在幽门螺旋杆菌从胃到下肠道(例如，小和/或大肠)洗出(washout)期间的体内气氛条件。例如，活(如新鲜培养)的幽门螺旋杆菌通过以下灭活：使细菌细胞暴露(例如，通过培养或温育)到厌氧条件约1天至约5天或更长，包括至少约24小时，或至少约48小时或至少约72小时或至少约96小时或至少约120小时。在一个这样的实例中，活的幽门螺旋杆菌细胞通过使细胞暴露于厌氧条件和通过细胞的热处理而灭活。
在另一个实例中，根据本文任何实例中描述的活的或灭活的幽门螺旋杆菌通过以下被杀死：使活的或灭活的细菌细胞暴露(例如，通过温育)到厌氧条件约1天至约5天或更长，包括至少约24小时，或至少约48小时或至少约73小时或至少约96小时或至少约120小时。
在一个优选的实例中，根据本文任何实例中描述的组合物包含幽门螺旋杆菌，其已经经历了通过使细菌细胞暴露(例如，通过培养或温育)到厌氧条件约1天至约5天或更长，包括至少约24小时，或至少约48小时或至少约73小时或至少约96小时或至少约120小时来灭活幽门螺旋杆菌的方法和通过热处理细胞来杀死灭活的幽门螺旋杆菌的处理。
在另一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物包含药学可接受载体。在一个优选的实例中，组合物不包括佐剂。
在另一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物是一种配制为用于摄取
(ingestion)的口服制剂。备选地，根据本文描述的任何实例的组合物被配制用于吸入。例如，根据本文描述的任何实例的组合物被配制为食品或食品添加剂(dietary 
supplement)。在一个这样的实例中，组合物包含或被配制成婴儿配方奶粉(infant formula)和/或蛋白质补充物。在一个实例中，组合物是乳制品(dairy food product)或非乳制品(non-dairy food product)。在一个实例中，组合物被配制为片剂，例如用于摄取。
备选地，组合物是粉末形式，例如用于摄取和/或吸入。备选地，组合物是液体形式。在一个实例中，组合物不包括佐剂。
在一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物被配制为施用(例如，通过食用
(consumption))于婴儿，如不具有发育的淋巴样结构(developed lymphoid structures)的婴儿。例如，根据本文描述的任何实例的组合物被配制为施用于年龄在0岁至约5岁，或在
0至约4岁，或在0至约3岁，或在0至约2岁，或在0至约1岁的婴儿。在一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物被配制为施用(例如，通过食用)于年龄在0至约2岁的婴儿。在另一个实例中，组合物配制用于施用于约4个月到约12个月或约4个月至约18个月或约4个月至约24个月龄的婴儿。在另一个实例中，组合物被配制为施用(例如，通过食用)于年龄小于6个月的婴儿。
在一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物被配制为施用(例如，通过食用)于年龄小于约5岁的儿童和/或青少年和/或成年人。
在另一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物被配制为用于重复的施用，或者重复施用，例如，每周一次，或每周两次，或每周三次，或每周4次，或每周5次，或每周6次，或每周7次，或每周7次以上，或每天多于两次。
在一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物被配制为或施用为多剂量单位组合物。例如，每剂量的组合物包含在一定范围中的幽门螺旋杆菌细菌或其裂解物的量，所述范围对应于约102细胞至约1014细胞，或约103个细胞到约1013细胞，或约104个细胞至约1013细胞，或约105个细胞到约1013细胞，或约106个细胞到约1013细胞，或约106个细胞到约1012细胞，或约107个细胞到约1011细胞，或约108个细胞至约1010个细胞，或约109细胞到约1010个细胞。例如，每剂量的组合物包含对应于约108个细胞，或约109个细胞，或约1010个细胞的幽门螺旋杆菌或其裂解物的量。在一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物被配制为每日施用，或者每日施用，其中，每日剂量的所述组合物包含在一定范围中的幽门螺旋杆菌或其裂解物的量，所述范围对应于约102细胞至约1014细胞，或约103个细胞到约1013细胞，或约
104个细胞至约1013细胞，或约105个细胞到约1013细胞，或约106个细胞到约1013细胞，或约
106个细胞到约1012细胞，或约107个细胞到约1011细胞，或约108个细胞至约1010个细胞，或约
109细胞到约1010个细胞。例如，每个每日剂量的组合物包含对应于约108个细胞，或约109个细胞，或约1010个细胞的幽门螺旋杆菌细菌或其裂解物的量。
在一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物在至少约2周，或至少约4周，或至少约6周或至少约8周或至少约10周，或至少约11周或至少约12周或至少约13周，至少约14周或至少约15周或至少约16周或至少约17周或至少约18周或至少约19周，或至少约20周，或至少约21周或至少约22周，或至少约23周，或至少约24周，或至少约25周，或至少约6个月，或至少约一年或一年以上的时段里被配制施用，或者被施用。优选地，根据本文描述的任何实例的组合物在至少约13周或至少约3个月的时段中被配制施用，或被施用。
在一个实例中，在不存在佐剂和/或其中所述组合物不包含佐剂的情况下，根据本文描述的任何实例的组合物被配制施用，或被施用。
在另一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物或组合物的剂量(例如，每日剂量)促进青少年受试者中的免疫系统的平衡发育(balanced development of an immune system)。在另一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物或组合物的剂量(例如，每日剂量)促进受试者中的适应性免疫和/或先天性免疫的获得。在另一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物或组合物的剂量(例如，每日剂量)促进或增强在受试者中的CD1d受体激活和/或CD4阴性和CD8阴性天然杀伤(NK)细胞。在另一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物或组合物的剂量(例如，每日剂量)促进或增强γδ T-细胞活化。在另一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物或组合物的剂量(例如，每日剂量)促进或增强粘膜免疫，其涉及免疫识别和呈递至抗原呈递细胞(APC)。在另一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物或组合物的剂量(例如，每日剂量)促进针对一个或多个变应原的平衡的Th1/Th2免疫应答。
在另一个实例中，根据本文描述的任何实例的组合物包含一定量的经杀死的幽门螺旋杆菌细胞和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞和/或所述经杀死的或灭活细胞的细胞裂解物。
本发明明确地扩展至制备组合物，其用于在哺乳动物中预防或治疗变态反应，所述制备包括使用分离的幽门螺旋杆菌细胞，其细胞裂解物，其中所述幽门螺旋杆菌细胞被杀死或不能定殖所述哺乳动物的粘膜。
在一个实例中，本发明涉及幽门螺旋杆菌细胞，诸如分离的幽门螺旋杆菌细胞，和/或其细胞裂解物或它们的组合的用途，其中所述幽门螺旋杆菌细胞在制备用于预防或治疗在哺乳动物中的变态反应的组合物中是被灭活或被杀死的，例如，其中所述灭活的幽门螺旋杆菌细胞不具有与相同基因型的活的幽门螺旋杆菌细胞相同的定殖接受其施用的哺乳动物的粘膜的能力，或其中所述灭活的或经杀死的幽门螺旋杆菌不能定殖接受其施用的哺乳动物的粘膜。任选地，其中细胞裂解物是灭活的或经杀死的幽门螺旋杆菌细胞的全细胞裂解物(WCL)。
在另一个实例中，本发明涉及灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，如分离的且灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，或其细胞裂解物或它们的组合在制备根据本文描述的任何实例的组合物中的用途，所述组合物用于中断或减缓或阻止或预防受试者中的特应性行进或特应性行进的进展。任选地，其中所述细胞裂解物是灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌的全细胞裂解物(WCL)。
在另一个实例中，本发明涉及灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，如分离的且灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，或其细胞裂解物或它们的组合在制备根据本文描述的任何实例的组合物中的用途，所述组合物用于延迟或预防或中断或减缓受试者中的一种或多种变应性状况的发作。任选地，其中所述细胞裂解物是灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌的全细胞裂解物(WCL)。
在另一个实例中，本发明涉及灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，如分离的和灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，或其细胞裂解物或它们的组合在制备根据本文描述的任何实例的组合物中的用途，所述组合物用于延迟或预防或中断或减缓变应性湿疹，荨麻疹，风疹，鼻炎，哮鸣，气道阻力，气道限制，肺部炎症，食物变态反应，或哮喘中的一种或多种的发作。任选地，其中所述细胞裂解物是灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌细胞的全细胞裂解物(WCL)。
在另一个实例中，本发明涉及灭活的或经杀死的幽门螺旋杆菌，如分离的和灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，或其细胞裂解物或它们的组合在制备根据本文描述的任何实例的组合物中的用途，所述组合物用于延缓或防止或中断或减慢响应变应原的气道阻力的发作。任选地，其中所述细胞裂解物是灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌的全细胞裂解液(WCL)。
在另一个实例中，本发明涉及灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，如分离的和灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，或其细胞裂解物或它们的组合在制备根据本文描述的任何实例的组合物中的用途，所述组合物用于延缓或防止或中断或减慢响应变应原的肺部炎症的发作。任选地，其中所述细胞裂解物是灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌的全细胞裂解液(WCL)。
在另一个实例中，本发明涉及灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，如分离的和灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，或其细胞裂解物或它们的组合在制备根据本文描述的任何实例的组合物中的用途，所述组合物用于延缓或防止或中断或减慢细胞对肺的浸润(例如响应抗原)。任选地，其中所述细胞裂解物是灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌的全细胞裂解液(WCL)。
在另一个实例中，本发明涉及灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，如分离的和灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，或其细胞裂解物或它们的组合在制备根据本文描述的任何实例的组合物中的用途，所述组合物用于延迟或预防或中断或减缓变应性状况的发作，所述变应性状况的特征在于变应原特异性IgE抗体的升高的血清水平和/或一种或多种的炎性细胞因子在细支气管肺泡灌洗(BAL)中升高的水平和/或肺中的细胞浸润物的升高的水平。任选地，其中所述细胞裂解物是灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌的全细胞裂解液(WCL)。
优选地，在根据本文描述的任何实例的用途中，组合物在不存在佐剂的情况下配制施用，并且不包括佐剂。
在一个实例中，在根据本文描述的任何实例的用途中，组合物被配制为施用(例如，通过食用)于婴儿，如不具有发育的淋巴样结构的婴儿和/或年龄在0岁至约5岁的婴儿。例如，其中婴儿的年龄在0岁至约5岁，或在0至约4岁，或在0至约3岁，或在0至约2岁，或在0至约1岁。在一个实例中，婴儿是在0至约2岁。在另一个实例中，婴儿的年龄在约4个月到约12个月或约4个月至约18个月或约4个月至约24个月。在另一个实例中，婴儿小于6个月龄。
在一个实例中，在根据本文描述的任何实例的用途中，组合物被配制为施用(例如，通过食用)于年龄小于约5岁的儿童和/或青少年和/或成年人。
在另一个实例中，在根据本文描述的任何实例的用途中，组合物被配制为用于重复施用，例如，每周一次，或每周两次，或每周三次，或每周4次，或每周5次，或每周6次，或每周7次，或每周7次以上，或每天多于两次。在一个此类实例中，组合物被配制为多剂量单位组合物。例如，每剂量的组合物包含一定范围中的幽门螺旋杆菌细菌或其裂解物的量，所述范围对应于约102细胞至约1014细胞，或约103个细胞到约1013细胞，或约104个细胞至约1013细胞，
5 13 6 13 6 12
或约10个细胞到约10 细胞，或约10个细胞到约10 细胞，或约10个细胞到约10 细胞，或约107个细胞到约1011细胞，或约108个细胞至约1010个细胞，或约109细胞到约1010个细胞。例如，每剂量的组合物包含对应于约108个细胞，或约109个细胞，或约1010个细胞的幽门螺旋杆菌细菌或其裂解物的量。在一个这样的实例中，组合物被配制为每日施用，其中，每日剂量的组合物包含在一定范围中的幽门螺旋杆菌细菌或其裂解物的量，所述范围对应于约
102细胞至约1014细胞，或约103个细胞到约1013细胞，或约104个细胞至约1013细胞，或约105个细胞到约1013细胞，或约106个细胞到约1013细胞，或约106个细胞到约1012细胞，或约107个细胞到约1011细胞，或约108个细胞至约1010个细胞，或约109细胞到约1010个细胞。例如，每日剂量的组合物包含对应于约108个细胞，或约109个细胞，或约1010个细胞的幽门螺旋杆菌细菌或其裂解物的量。
在一个实例中，在根据本文描述的任何实例的用途中，将组合物的剂量，例如每日剂量在至少约2周，或至少约4周，或至少约6周或至少约8周或至少约10周，或至少约11周或至少约12周或至少约13周，至少约14周或至少约15周或至少约16周或至少约17周或至少约18周或至少约19周，或至少约20周，或至少约21周或至少约22周，或至少约23周，或至少约24周，或至少约25周，或至少约6个月，或至少约一年或一年以上的时段里，优选地，在至少约13周或至少约3个月的时段里施用于受试者(例如，通过食用)。
在一个实例中，在根据本文描述的任何实例的用途中，组合物或组合物的剂量(例如，每日剂量)促进青少年受试者中的免疫系统的平衡发展。在一个实例中，在根据本文描述的任何实例的用途中，组合物或组合物的剂量(例如，每日剂量)促进受试者中的适应性性免疫和/或先天性免疫的获得。在一个实例中，在根据本文描述的任何实例的用途中，组合物或组合物的剂量(例如，每日剂量)促进或增强在受试者中的CD1d受体激活和/或CD4阴性和CD8阴性天然杀伤(NK)细胞。在一个实例中，在根据本文描述的任何实例的用途中，组合物或组合物的剂量(例如，每日剂量)促进或增强γδT-细胞活化。在一个实例中，在根据本文描述的任何实例的用途中，组合物或组合物的剂量(例如，每日剂量)促进或增强粘膜免疫，其涉及免疫识别和呈递至抗原呈递细胞(APC)。在一个实例中，在根据本文描述的任何实例的用途中，组合物或组合物的剂量(例如，每日剂量)促进针对一个或多个变应原的平衡的Th1/Th2免疫应答。
在一个实例中，在根据本文描述的任何实例的用途中，组合物包含一定量的经杀死的幽门螺旋杆菌细胞和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞和/或所述经杀死的或灭活细胞的细胞裂解物。
本发明还明确地扩展至根据本文描述的任何实例的组合物的用途，分离的幽门螺旋杆菌细胞，其细胞裂解物的用途，其中所述幽门螺旋杆菌细胞是被杀死的或不能定殖所述哺乳动物的粘膜。
在一个实例中，本发明提供根据本文的任何实例描述的组合物在受试者中预防或治疗变态反应中的用途。
在另一个实例中，本发明提供根据本文描述的任何实例的组合物在中断或减缓或阻止或预防在受试者中的特应性行进或特应性行进的进展中的用途。
在另一个实例中，本发明提供根据本文描述的任何实例的组合物在延迟或预防或中断或减缓受试者中的一种或多种变应性状况的发作中的用途。
在另一个实例中，本发明提供根据本文描述的任何实例的组合物在延迟或预防或中断或减缓变应性湿疹，荨麻疹，风疹，鼻炎，哮鸣，气道阻力，气道限制，肺部炎症，食物变态反应，或哮喘中的一种或多种的发作中的用途。
在另一个实例中，本发明提供根据本文描述的任何实例的组合物在延缓或防止或中断或减慢响应变应原的气道阻力的发作中的用途。
在另一个实例中，本发明提供根据本文描述的任何实例的组合物在延缓或防止或中断或减慢响应变应原的肺部炎症的发作中的用途。
在另一个实例中，本发明提供根据本文描述的任何实例的组合物在延缓或防止或中断或减慢细胞对肺的浸润中的用途。
在另一个实例中，本发明提供根据本文描述的任何实例的组合物在延迟或预防或中断或减缓变应性状况的发作中的用途，所述变应性状况的特征在于变应原特异性IgE抗体升高的血清水平和/或一种或多种的炎性细胞因子在细支气管肺泡灌洗(BAL)中升高的水平和/或肺中的细胞浸润物的升高的水平。
在另一个实例中，本发明提供了治疗有效量的经杀死的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞，或其细胞裂解物或它们的组合在预防或减弱受试者暴露于变应原后在受试者的肺中变应性气道高反应性中的用途。优选地，其中所述用途包括使用治疗有效量的经杀死的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞。
在另一个实例中，本发明提供了治疗有效量的经杀死的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞，或其细胞裂解物或它们的组合在预防或减弱哮喘受试者暴露于变应原后在所述受试者的肺中气道阻力中的用途。优选地，其中所述用途包括使用治疗有效量的经杀死的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞。
在另一个实例中，本发明提供了治疗有效量的经杀死的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞，或其细胞裂解物或它们的组合在预防受试者对变应原的变应性免疫应答或降低受试者对变应原的变应性免疫应答的严重性或发病率中的用途。优选地，其中所述用途包括使用治疗有效量的经杀死的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞。
优选地，在根据本文描述的任何实例的用途中，在不存在佐剂的情况下使用幽门螺旋杆菌细胞，或裂解物或组合物。
在又一个实例中，本发明提供在处于发展成所述变态反应的风险中的哺乳动物中预防变态反应的方法，其包括将治疗有效量的组合物施用于所述哺乳动物，所述组合物包含分离的幽门螺旋杆菌细胞，其细胞裂解物或它们的组合和药学可接受载体，其中所述幽门螺旋杆菌细胞是被杀死的或不能定殖所述哺乳动物的粘膜，其中所述组合物在施用后提供了针对所述变态反应的保护性免疫。
因此，在一个实例中，本发明提供了治疗或预防在哺乳动物受试者中的变态反应的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用根据本文描述的任何实例的组合物。
在另一个实例中，本发明提供预防或减弱在受试者暴露于变应原后在受试者的肺中的变应性气道高反应性的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效量的经杀死的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞，或其细胞裂解物或它们的组合，其足以防止所述受试者暴露至变应原后受试者中的气道高反应性。优选地，其中所述方法包括施用治疗有效量的经杀死的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞。
在另一个实例中，本发明提供在哮喘受试者中预防或减弱气道阻力的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的经杀死的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞，或其细胞裂解物或它们的组合，其足以防止在所述受试者暴露至变应原后受试者的肺中的气道高反应性。优选地，其中所述方法包括施用治疗有效量的经杀死的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞。
在另一个实例中，本发明提供了预防受试者对变应原的变应性免疫应答或降低受试者对变应原的变应性免疫应答的严重性或发病率的方法，所述方法包括将治疗有效量的经杀死的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞，或其细胞裂解物或它们的组合施用于有此需要的受试者。优选地，其中所述方法包括施用治疗有效量的经杀死的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞。
在另一个实例中，本发明提供了中断或减缓或阻止或预防在受试者中的特应性行进或特应性的进展的方法，所述方法包括将根据本文描述的任何实例的组合物施用于受试者。
在另一个实例中，本发明提供了延迟或预防或中断或减缓受试者中的一种或多种变应性状况的发作的方法，所述方法包括将根据本文描述的任何实例的组合物施用于受试者。
在另一个实例中，本发明提供了在受试者中延迟或预防或中断或减缓变应性湿疹，荨麻疹，风疹，鼻炎，哮鸣，气道阻力，气道限制，肺部炎症，食物变态反应，或哮喘中的一种或多种的发作的方法，所述方法包括将根据本文描述的任何实例的组合物施用于受试者。
在另一个实例中，本发明提供了延缓或防止或中断或减慢在受试者响应变应原的气道阻力的发作的方法，所述方法包括将根据本文描述的任何实例的组合物施用于受试者。
在另一个实例中，本发明提供了延缓或防止或中断或减慢在受试者中响应变应原的肺部炎症的发作的方法，所述方法包括将根据本文描述的任何实例的组合物施用于受试者。
在另一个实例中，本发明提供了延缓或防止或中断或减慢响应变应原的细胞对受试者的肺的浸润的方法，所述方法包括将根据本文描述的任何实例的组合物施用于受试者。
在另一个实例中，本发明提供了延迟或预防或中断或减缓变应性状况在受试者中发作的方法，其中所述变应性状况的特征在于变应原特异性IgE抗体升高的血清水平和/或一种或多种的炎性细胞因子在细支气管肺泡灌洗(BAL)中升高的水平和/或受试者的肺中的细胞浸润物的升高的水平，且其中所述方法包括将根据本文描述的任何实例的组合物施用于受试者。
优选地，在根据本文描述的任何实例的方法中，在不存在佐剂的情况下，施用幽门螺旋杆菌，或裂解物或组合物，且其中组合物不包含佐剂。
在根据本文描述的任何实例的方法的一个实例中，组合物或灭活的或经杀死的幽门螺旋杆菌细胞和/或其裂解物通过口服途径(即用于受试者摄取)和/或通过吸入
(inhumation)施用于受试者。
在在根据本文描述的任何方法的一个实例中，将组合物或灭活的或经杀死的幽门螺旋杆菌细胞和/或其裂解物施用(例如，通过食用)于婴儿，如不具有发育的淋巴样结构的婴儿和/或其中的婴儿年龄在0岁至约5岁。例如，婴儿的年龄在0岁至约5岁，或在0至约4岁，或在
0至约3岁，或在0至约2岁，或在0至约1岁。在一个实例中，婴儿的年龄是在0至约2岁。在另一个实例中，婴儿的年龄在约4个月到约12个月或约4个月至约18个月或约4个月至约24个月。
在另一个实例中，婴儿小于6个月龄。
在另一个实例中，在根据本文描述的任何实例的方法中，将组合物或灭活的或经杀死的的幽门螺旋杆菌细胞和/或其裂解物施用(例如，通过食用)于年龄小于约5岁的儿童和/或青少年和/或成年人。
在另一个实例中，根据本文描述的任何实例的方法包括将组合物或灭活的或经杀死的的幽门螺旋杆菌细胞和/或其裂解物重复施用于受试者。在一个实例中，将组合物或灭活的或经杀死的的幽门螺旋杆菌细胞和/或其裂解物每周一次，或每周两次，或每周三次，或每周4次，或每周5次，或每周6次，或每周7次，或每周7次以上，或每天多于两次施用于受试者。
在一个这样的实例中，根据本文描述的任何实例的方法包括施用一剂组合物，其包含一定范围中的幽门螺旋杆菌细菌或其裂解物的量，所述范围对应于约102细胞至约1014细胞，或约103个细胞到约1013细胞，或约104个细胞至约1013细胞，或约105个细胞到约1013细
6 13 6 12 7 11
胞，或约10 个细胞到约10 细胞，或约10 个细胞到约10 细胞，或约10 个细胞到约10 细胞，或约108个细胞至约1010个细胞，或约109细胞到约1010个细胞。例如，每剂量的组合物包含对应于约108个细胞，或约109个细胞，或约1010个细胞的幽门螺旋杆菌细菌或其裂解物的量。在一个这样的实例中，根据本文描述的本发明的方法包括施用每日剂量的组合物，其中，所述每日剂量的组合物包含一定范围中的幽门螺旋杆菌细菌或其裂解物的量，所述范围对应于约102细胞至约1014细胞，或约103个细胞到约1013细胞，或约104个细胞至约1013细胞，或约105个细胞到约1013细胞，或约106个细胞到约1013细胞，或约106个细胞到约1012细胞，或约107个细胞到约1011细胞，或约108个细胞至约1010个细胞，或约109细胞到约1010个细
8 9 10
胞。例如，每日剂量的组合物包含对应于约10个细胞，或约10个细胞，或约10 个细胞的幽门螺旋杆菌细菌或其裂解物的量。
在一个实例中，根据本文描述的任何实例的方法包括在至少约2周，或至少约4周，或至少约6周或至少约8周或至少约10周，或至少约11周或至少约12周或至少约13周，至少约14周或至少约15周或至少约16周或至少约17周或至少约18周或至少约19周，或至少约20周，或至少约21周或至少约22周，或至少约23周，或至少约24周，或至少约25周，或至少约6个月，或至少约一年或一年以上的时段里，优选地，在至少约13周或至少约3个月的时间段中施用每日剂量的幽门螺旋杆菌或裂解物或组合物。
在根据本文描述的任何实例的本发明的方法的另一个实例中，幽门螺旋杆菌或裂解物或组合物的施用促进青少年受试者中的免疫系统的平衡发育。
在根据本文描述的任何实例的方法的另一个实例中，幽门螺旋杆菌或裂解物或组合物的施用促进受试者中的适应性免疫的获得。
在根据本文描述的任何实例的方法的另一个实例中，幽门螺旋杆菌或裂解物或组合物的施用促进受试者中的先天性/适应性免疫的获得。
在根据本文描述的方法的另一个实例中，幽门螺旋杆菌或裂解物或组合物的施用促进或增强CD1d受体激活和/或CD4阴性和CD8阴性天然杀伤(NK)细胞。
在根据本文描述的方法的另一个实例中，幽门螺旋杆菌或裂解物或组合物的施用促进或增强γδ T-细胞活化。
在根据本文描述的本发明的方法的另一个实例中，幽门螺旋杆菌或裂解物或组合物的施用促进或增强粘膜免疫，其涉及免疫识别和呈递至抗原呈递细胞(APC)。
在根据本文描述的任何实例的方法的另一个实例中，幽门螺旋杆菌或裂解物或组合物的施用促进针对一个或多个变应原的平衡的Th1/Th2免疫应答。
在根据本文描述的方法的另一个实例中，受试者对于湿疹是无症状的或对于变态反应是无症状的，或对于哮喘是无症状的，并且其中所述方法防止湿疹和/或变态反应和/或哮喘在受试者中的随后发作，例如在所述受试者暴露于变应原后。在一个这样的实例中，该方法包括将分离的且灭活的幽门螺旋杆菌施用于青少年受试者，以防止在婴儿中的湿疹或在以后的生活中湿疹或变态反应的后续发作。备选地，该方法包括将分离的且灭活的幽门螺旋杆菌施用于青少年或成人受试者以防止受试者中的湿疹或受试者的以后生活中变态反应或哮喘的后续发作。然而，湿疹和/或变态反应和/或哮喘的后续发作可以在尚未施用幽门螺旋杆菌或组合物的未处理受试者中通过使未处理受试者暴露于变应原可诱导。例如，变应原是环境变应原，花粉变应原，尘螨变应原，动物变应原，或化学变应原。
在根据本文描述的方法的另一个实例中，受试者先前已患有变应性湿疹，哮喘或变态反应的一次或多次发生，并且其中所述方法防止随后的攻击(attack)或可以降低在受试者中随后的攻击的严重性。在一个这样的实例中，该方法包括将灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，例如，分离的灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌或其细胞裂解物或它们的组合施用于先前已经患变应性湿疹和/或变态反应和/或哮喘的青少年或成人受试者，由此防止后续的攻击，或者减少后续攻击的严重性，任选地防止或减缓在受试者中的进一步特应性行进。备选地，该方法包括将灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，例如，分离的灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌或其细胞裂解物或它们的组合施用于先前已经患变应性湿疹和/或变态反应和/或哮喘的青少年或成人受试者，由此防止后续的攻击，或者减少后续攻击的严重性，任选地防止或减缓在受试者中的进一步特应性行进。然而，湿疹和/或变态反应和/或哮喘的后续发作可以在尚未施用幽门螺旋杆菌或组合物的未处理受试者中通过使未处理受试者暴露于变应原可诱导。例如，变应原是环境变应原，花粉变应原，尘螨变应原，动物变应原，或化学变应原。
在根据本文描述的方法的另一个实例中，将灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，例如，分离的灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌或其细胞裂解物或它们的组合施用于受试者减少了变应性免疫应答在受试者群体中的发病率。
在根据本文描述的方法的另一个实例中，将灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，例如，分离的灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌或其细胞裂解物或它们的组合施用于受试者，降低了群体中当他们是幼年时被治疗的青少年和/或成年成员中的变应性免疫应答的发病率(reduces the incidence of allergic immune responses in adolescent and/or adult members of the population treated when they were juveniles)。
在一些实施方案中，哺乳动物是未处理哺乳动物(naive mammal)。因此，在又一个实例中，本发明提供了在处于发展成变态反应的风险的在免疫学上未处理的哺乳动物中预防所述变态反应的方法，所述方法包括以下步骤：(i)鉴定处于发展成变态反应的风险的哺乳动物；(ii)对所述哺乳动物施用包含分离的幽门螺旋杆菌细胞，其细胞裂解物或它们的组合和药学可接受载体的组合物，其中所述幽门螺旋杆菌细胞是被杀死的或不能定殖所述哺乳动物的粘膜，和(iii)允许经过足够的时间以使变态反应能够形成。
在又一个实例中，本发明提供了在哺乳动物中治疗变态反应的方法，其包括对所述哺乳动物施用有效量的组合物的步骤，所述组合物包含分离的幽门螺旋杆菌细胞，其细胞裂解物或它们的组合和药学可接受载体，其中所述幽门螺旋杆菌细胞是被杀死的或不能定殖所述哺乳动物的粘膜，其中所述组合物在施用后，提供了针对所述变态反应的保护性免疫。
哺乳动物或受试者包括狗，猫，家畜动物，灵长类动物或马。在一些实施方案中，哺乳动物或受试者是人类受试者。优选地，人类受试者低于约5岁龄。更优选，人类受试者低于2岁龄。
在一个实例中，本发明提供了用于治疗和/或预防在哺乳动物中的变态反应的试剂盒，其包含(i)根据本文任何实例的组合物和(ii)用于根据本文任何实例的方法中的说明书。
本发明还明确地延伸到用于治疗和/或预防在受试者中的变态反应的试剂盒，所述试剂盒包含(i)根据本文任何实例描述的灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，或裂解物或组合物，和任选地(ii)用于根据本文任一个实例的方法或用途中的说明书。例如，试剂盒用于预防或减弱在受试者(如哮喘受试者)暴露于变应原后，在受试者的肺中的气道高反应性。
备选地或另外地，试剂盒用于预防或减弱在哮喘受试者暴露于变应原后，在所述受试者的肺中的气道阻力或气道高反应性。备选地或另外地，试剂盒用于预防受试者对变应原的变应性免疫应答或降低受试者对变应原的变应性免疫应答的严重性或发病率。备选地或另外地，试剂盒用于中断或减缓或阻止或预防在受试者中的特应性行进或特应性行进的进展。
备选地或另外地，试剂盒用于延迟或预防或中断或减缓一种或多种变应性状况在受试者中的发作，例如其中所述一种或多种状况的特征在于变应原特异性IgE抗体的升高的血清水平和/或一种或多种的炎性细胞因子在细支气管肺泡灌洗(BAL)中升高的水平和/或受试者的肺中的细胞浸润物的升高的水平。备选地或另外地，试剂盒用于延迟或预防或中断或减缓变应性湿疹，荨麻疹，风疹，鼻炎，哮鸣，气道阻力，气道限制，肺部炎症，食物变态反应，或哮喘中的一种或多种在受试者中的发作。备选地或另外地，试剂盒用于延缓或防止或中断或减慢受试者在对变应原的应答中气道阻力和/或肺部炎症的发作。备选地或另外地，试剂盒用于延缓或防止或中断或减慢受试者在对变应原的应答中细胞浸润到肺中。
在又一个实例中，本发明提供产生幽门螺旋杆菌菌株的方法，所述幽门螺旋杆菌菌株能够提供针对变态反应的保护性免疫，所述方法包括以下步骤：
(a)提供分离的幽门螺旋杆菌细胞，其是
(i)不能定殖哺乳动物的粘膜和/或
(ii)cagA负(cagA-)和任选地vacA基因的产毒素性s1和m1等位基因阳性；
(b)任选地通过动物宿主传代所述幽门螺旋杆菌细胞；和
(c)任选地灭活或杀死所述幽门螺旋杆菌细胞。
除非上下文另有要求或特别相反指出，本文以单数整体，步骤或元素记述的本发明的整体，步骤或元素明确地涵盖记述的整体，步骤或元素的单数和复数两种形式。
本文所用的术语“源自”应被视为表明可以从特定来源获得规定的整体，但不一定直接从该来源获得。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含”，或变型如“包括”，将被理解为暗示包括所述步骤或元素或整体或一组步骤或元素或整体但不排除任何其他步骤或元素或整体或一组元素或整体。
在整个说明书中，除非明确另有叙述或者上下文另有要求，提到单个步骤，物质组成，一组步骤或一组物质组成应视为涵盖那些步骤，物质组成，一组步骤或一组物质组成中的一个或复数个(即一个或多个)。因此，除非上下文另有明确说明，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”，“一个/种”和“该/所述”包括复数指代物。例如，提到“细菌”包括复数个这样的细菌，并且提到“变应原”指提到一种或多种变应原。
除非另有明确说明，按照实际情形将本文所述的每个实例应用于每一个其他实例。
本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些变型和修改，本文描述的发明易于进行其他变型和修改。应当理解，本发明包括所有这些变型和修改。本发明还包括在本说明书中单独或共同提及的或指出的全部步骤，特征，组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或多个。
本发明并不限于由本文所描述的具体实施例的范围，所述实施例仅用于示例的目的。
功能等同的产品，组合物和方法明确地在如本文所述的本发明的范围内。
将本文引用的所有出版物、专利和专利申请(无论在前或在后)以其整体并入本文作为参考。然而，为了描述并公开出版物中报告并且可能结合本发明使用的方案，试剂和载体，引用本文中提及的出版物。本文中的任何内容不应解释为凭借在先发明，本发明没有资格早于此类公开。
附图简述
图1，小图A中显示了“变应性(或特应性)行进”，它指的是变应性疾病的的典型进展，往往在生命早期开始并随着个体的年龄显示出变应性疾病的临床症状和表现的相对流行程度。变应性疾病包括特应性皮炎(湿疹)，食物变态反应，变应性鼻炎(花粉热)和哮喘。一般情况下，在出生时检测不到临床症状。大多数具有湿疹的儿童会进展到形成食物变态反应和/或过敏性哮喘，并且相当大比例的这些个体作为成人将具有特应性或呼吸道变态反应。
此外，哮喘性哮鸣可能已经在婴儿早期期间观察到，并且虽然大多数早期哮鸣者(wheezer)证明是短期症状的，但在一些儿童中哮鸣可能会持续到整个学龄期(school age)和青春期。
图1，小图B，显示幽门螺旋杆菌在胃肠道中的梯度或相对分布。幽门螺旋杆菌细菌是哺乳动物肠道共生生物体，可与许多其他细菌一起存在于肠道中。幽门螺旋杆菌一般通过口服途径获得并定殖肠道，并且在超过80％的人类中可能是无症状的，尽管胃的持续定殖与消化性溃疡，胃癌和其它病症如慢性荨麻疹(风疹)的较高风险相关。幽门螺旋杆菌连续地从胃大量脱落到下肠道中，在那里它可以被派尔斑(Peyer’s patches)吸收并可以通过派尔斑调节免疫系统以建立持久的胃感染(Gerirtz AT and Sitaraman SV,2007,
Gastroenterology 133:1044-1045；Nagi S et al.,2007,Proc Natl Acad Sci USA 109:
8971-8976；Watanabe N et al.,2008,Gastroenterology 134:642-643)。幽门螺旋杆菌的活跃定殖可以朝着幽门螺旋杆菌的免疫耐受调控宿主免疫系统，以允许持久定殖，并且与宿主中的变应性状况的降低的风险相关(Amedei A et al.,2010,J Asthma Allergy.3:
139-147；Kosunen TU et al.,2002,Clin Exp Allergy.32:373-378；Chen and Blaster MJ,2007,Arch Intern Med.167:821-827)
图1，小图C，显示用OVA致敏/攻击的急性变应性哮喘模型，其中将未经处理的幽门螺旋杆菌(标有“活Hp”)和经处理的幽门螺旋杆菌，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌(标有“经杀死的Hp”)各自施用于变态反应的小鼠模型并且在指示的时间点。
图2显示了活的未经处理的幽门螺旋杆菌OND86对照细胞(标记为“活”)和经处理的幽门螺旋杆菌(即通过UV-C照射(标有“UV”)和任选热处理(标为“UV+加热”)处理后或在厌氧条件下培养48小时(标记为“O2限制”)和任选地热处理(标记“O2限制+加热”)后的灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌)的复制效力。活的和经处理的细胞的复制效力通过细胞计数确定，即在37℃在含有5％(v/v)CO2和小于5％(v/v)O2的微需氧环境下温育活的和经处理的幽门螺旋杆菌，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌达3天后，测量CBA平板上的菌落形成单位(CFU)。显示了从两个独立的实验得到的结果(标记为“重复1”和“重复2”)。
图3显示了相对于未经处理的活幽门螺旋杆菌细胞(标有“活”)中的脲酶活性，经处理者(即热处理(标有“热”)，UV-C照射(标有“UV”)和任选地热处理(标“UV+热”)后或氧饥饿(标有“O2Res”)和任选地热处理(标有“O2Res+热”)后的灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌)中的脲酶活性的百分比。
图4显示了活幽门螺旋杆菌细胞(标有“活”)或在热处理之前和之后(标有“热”)，暴露于氧饥饿(标有“O2r”或“O2R”)，UV-C照射(标有“UV”)处理的幽门螺旋杆菌的膜氧化还原电位。
图5显示了未经处理的幽门螺旋杆菌(标有“活的幽门螺旋杆菌”)和经处理的幽门螺旋杆菌，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌(标有“经杀死的幽门螺旋杆菌”)各自改进在变应性气道疾病的OVA模型中的变应性哮喘的结果。
图6显示了未经处理的幽门螺旋杆菌(标有“Hp”)和经处理的幽门螺旋杆菌，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌(标有“经杀死的”)各自降低在变应性气道疾病的OVA模型中的总细胞计数(图A)和嗜酸粒细胞增多(eosinophilia)(图B)。
图7，在变应性哮喘模型中，在感染了未经处理的幽门螺旋杆菌(标有“Hp”)和经处理的幽门螺旋杆菌，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌(标有“经杀死的”)的小鼠中显示了降低的OVA特异性IgE(图A)和OVA特异性IgG(图B)应答。
图8显示在变应性哮喘模型中，在感染了未经处理的幽门螺旋杆菌(标有“活的幽门螺杆菌”)和经处理的幽门螺旋杆菌，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌(标有“经杀死的”)的小鼠的肺中降低了IL-13。
图9显示在OVA/明矾攻击后，相比于对照小鼠(标记为“未处理”)，在感染幽门螺旋杆菌的小鼠(标记为“活幽门螺旋杆菌”)中OVA‐特异性CD8T细胞的降低的数目(图A)和功能(图B)。
图10显示在初次(图A)和第二次(图B)OVA/明矾攻击后，相比于对照小鼠(标记为“未处理”)，在感染幽门螺旋杆菌的小鼠(标记为“活幽门螺旋杆菌”)中抗原特异性IgG的减少。
图11显示在对非特异性刺激物的应答中，相比于对照小鼠(标记为“未处理”)，来自感染幽门螺旋杆菌的小鼠(标记为“活幽门螺旋杆菌”)的CD4(图A)和CD8T(图B)细胞的降低的应答。
图12显示在新生儿变应性哮喘模型中，幽门螺旋杆菌定殖改进变应性气道疾病的结
果。
图13显示在新生儿变应性哮喘模型中，未经处理的幽门螺旋杆菌(在x轴标有“活的幽门螺杆菌”)和经处理的幽门螺旋杆菌，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌(在x轴标有“经杀死的”)各自改进免疫学结果。
图14显示在成年和新生小鼠中，未经处理的幽门螺旋杆菌(标有“活Hp”)和经处理的幽门螺旋杆菌，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌(标有“经杀死的Hp”)各种有效减少针对变应原的变应性气道应答。A图，显示了在感染了未经处理的幽门螺旋杆菌和经处理的幽门螺旋杆菌，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌的成年小鼠中肺组织响应增加剂量的乙酰甲胆碱(metacholine,MCh)攻击的气道高反应性(AHR)的结果。将未接收幽门螺旋杆菌，即未感染，致敏和攻击的变应性成年小鼠对照标记为“阳性”和将未接收幽门螺旋杆菌，即未感染且仅致敏的未经处理的健康成年小鼠对照标记为“阴性”。图B显示了在感染了未经处理的幽门螺旋杆菌的新生小鼠中肺组织响应增加剂量的乙酰甲胆碱(MCh)攻击的气道高反应性(AHR)的结果。图C显示了在感染了未经处理的幽门螺旋杆菌和经处理的幽门螺旋杆菌，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌的新生小鼠中肺组织响应增加剂量的乙酰甲胆碱(MCh)攻击的气道高反应性(AHR)的结果。在图A和B中，将未接收幽门螺旋杆菌，即未感染，致敏和攻击的变应性成年/新生儿小鼠对照标记为“阳性”和将未接收幽门螺旋杆菌，即未感染且仅致敏的未经处理的新生儿小鼠对照标记为“阴性”。在图A，B和C中所示的结果代表三个独立的实验。
图15显示在成人变应性哮喘模型中，未经处理的幽门螺旋杆菌(标有“活”)和经处理的幽门螺旋杆菌，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌(标有“经处理”)在变应性受试者中的定殖效力的结果。
图16显示了灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌在小鼠中的定殖效力的结果，所述灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌通过用UV-C照射(标有“OND79UV”)和任选热处理(标为“OND79UV+加热”)或氧饥饿(标记为“OND79O2R”)和任选地热处理(标记“OND79O2R+加热”)处理活的OND79幽门螺旋杆菌细胞产生。定殖效力显示为在感染的小鼠的胃中检测的菌落形成单位(CFU)的数目。
图17显示在新生儿变应性哮喘小鼠模型中，不同来源的经UV处理的，即，灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌OND79(标记为“OND79”)和幽门螺旋杆菌J99(标记为“J99”)菌株对于减少变应原(OVA)特异性IgE(图A)和IgG(图B)抗体是有效的。对照小鼠是未感染，致敏和攻击的(阳性对照，即未经处理的变应性小鼠；标有“Pos”)或仅致敏(阴性对照，即未经处理的健康小鼠；标有“Neg”)。在1:60稀释的小鼠血清中测量了OVA特异性抗体的滴度，并表示为OD 405nm处的单个和平均的吸光度。
图18显示了幽门螺旋杆菌OND79的单菌落分离物和衍生物幽门螺旋杆菌的单菌落分离物六个临床分离株的随机扩增多态性DNA(RAPD)分析，所述衍生物幽门螺旋杆菌的临床分离株在幽门螺旋杆菌OND79在人宿主中传代后从胃活组织检查样品获得。衍生物幽门螺旋杆菌的六个临床分离株标记为“#1157克隆1”，“#1157克隆9”，“#86198克隆1”，“#86198克隆
9”，“#45156克隆1”和“#45156克隆9“。如Akopyanz et al.,(1992)Nucleic Acids Research,20:5137-5142所述，使用在SEQ ID NO:3中给出的引物“1254”(具有序列5'-CCG CAG CCA A)(图A)，或在SEQ ID NO:4中给出的引物“1281”(具有序列5’-AAC GCG CAA C-
3’)(图B)进行遗传指纹法。在A图或B图的每个中，泳道M，1千碱基(KB)DNA梯度标记(New England Biolabs Inc.,Ipswich,MA,US)；泳道1，OND79(亲株)；泳道2，#1157克隆1；泳道
3，#1157克隆9；泳道4，#86198克隆1；第5道，#86198克隆9；第6道，#45156克隆1；泳道7，#
45156克隆9。对于亲本输入株OND79和人类传代衍生株的每个临床分离株，遗传指纹是相同的。
图19显示了幽门螺旋杆菌OND79在人宿主中传代后获得的幽门螺旋杆菌的六个临床分离株在小鼠中的感染和定繁效力的结果。六个幽门螺旋杆菌临床分离株标记为“#1157克隆
1”，“#1157克隆9”，“#86198克隆1”，“#86198克隆9”，“#45156克隆1”和“#45156克隆9”。幽门螺旋杆菌临床分离株#1157克隆9对应于以NMI登录号V14/013016保藏的幽门螺旋杆菌OND86。
图20显示了在C57BL/6小鼠模型中，在口服施用分离株后两周，幽门螺旋杆菌OND79在人宿主中传代后获得的幽门螺旋杆菌的六个临床分离株诱导特异性抗幽门螺旋杆菌IgG抗体反应的效力。抗体反应滴度表示为在405nm处测定的OD值。六个幽门螺旋杆菌临床分离株标记为“#1157克隆1”，“#1157克隆9”，“#86198克隆1”，“#86198克隆9”，“#45156克隆1”和“#
45156克隆9”。幽门螺旋杆菌临床分离株#1157克隆9对应于以NMI登录号V14/013016保藏的幽门螺旋杆菌OND86。
图21显示在变应性成年受试者中的安全性和耐受性研究，其包括剂量递增评估。
发明详述
1.幽门螺旋杆菌
本发明提供了包含灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌或其细胞裂解物的组合物。
在一个实例中，幽门螺旋杆菌是灭活的幽门螺旋杆菌。术语“灭活的幽门螺旋杆菌”应理解为幽门螺旋杆菌的细胞或菌株，其不具有与具有相同基因型的活幽门螺旋杆菌相同的诱发胃溃疡或其他病理学如恶性肿瘤的能力和/或不具有与具有相同基因型的活细菌幽门螺旋杆菌细菌相同的定殖能力和/或不具有具有相同基因型的活幽门螺旋杆菌细菌的功能性或完整基因组。例如，灭活幽门螺旋杆菌可以不具有完整的基因组，但仍保留功能性转录物组和/或翻译机器，使得其保持相应的活幽门螺旋杆菌的代谢活性的至少一部分。因此，优选地，灭活的幽门螺旋杆菌保留了相应的活幽门螺旋杆菌的部分或全部的代谢活性。在此上下文中，“活幽门螺旋杆菌”是指尚未进行根据本文任何实例中描述的那样处理以使其无活性和/或被杀死的幽门螺旋杆菌。
尽管灭活的幽门螺旋杆菌可短暂地与哺乳动物的胃粘膜相结合，优选的是这样的灭活的细菌是不能定殖哺乳动物的胃粘膜，以便建立胃粘膜的慢性或持续感染。例如，灭活的幽门螺旋杆菌可以具有受损的诱导一种或多种幽门螺旋杆菌相关的致病效果的能力，包括但不限于，形成消化性溃疡，胃癌如非心源性胃腺癌或MALT淋巴瘤，以及其它病症如慢性荨麻疹(风疹)，其通常与粘膜的持久性幽门螺旋杆菌定殖相关。
优选地，灭活的幽门螺旋杆菌保留活的幽门螺旋杆菌的细胞结构。例如，灭活的幽门螺旋杆菌保留活幽门螺旋杆菌的细菌细胞壁和/或细胞膜的结构完整性，使得它可以不被破坏或裂解。
或者/另外，灭活幽门螺旋杆菌保留活幽门螺旋杆菌被哺乳动物的下肠道中的派尔斑摄取的能力。例如，灭活的幽门螺旋杆菌可以保留具有复制和定殖功能性的相应的活幽门螺旋杆菌的免疫原性和/或抗原性和/或受体-配体相互作用。
或者/另外，灭活的幽门螺旋杆菌在其失活期间和/或之后经历一种或多种代谢变化，例如，增强的脂多糖合成和其表面呈递和/或增强的细胞蛋白降解和/或降低的脲酶的产生。
在另一个实例中，幽门螺旋杆菌是经杀死的幽门螺旋杆菌。术语“经杀死的幽门螺旋杆菌”应理解为幽门螺旋杆菌的细胞或菌株，其是不可逆地无代谢活性。例如，经杀死的幽门螺旋杆菌是不能诱导胃溃疡或其它病理学如恶性肿瘤和/或不能够定殖哺乳动物的胃粘膜和/或不具有具有相同基因型的活幽门螺旋杆菌细菌的功能性或完整基因组。因此，优选地，经杀死的幽门螺旋杆菌不保留保留功能性转录物组和/或翻译机器。
优选地，经杀死的幽门螺旋杆菌保留活的幽门螺旋杆菌的细胞结构。例如，经杀死的幽门螺旋杆菌保留灭活的或活的幽门螺旋杆菌的细菌细胞壁和/或细胞膜的结构完整性，使得它可以不被破坏或裂解。
或者/另外，经杀死的幽门螺旋杆菌保留活幽门螺旋杆菌被哺乳动物的下肠道中的派尔斑摄取的能力。例如，经杀死的的幽门螺旋杆菌可以保留具有复制和定殖功能性的相应的活幽门螺旋杆菌的免疫原性和/或抗原性和/或受体-配体相互作用。
在另一个实例中，本发明使用已经经历用于灭活细菌的方法和用于杀死幽门螺旋杆菌细胞的方法的幽门螺旋杆菌。例如，杀死细胞捕获了灭活的细胞在其施用后对免疫系统的益处，同时确保该生物体对于人类使用的增加安全性。
在上下文中，“细胞裂解物”是从根据本文任何实例描述的灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌细胞制成的制剂，其中已经破坏了无活性和/或经杀死的幽门螺旋杆菌细胞，使得所述细菌的细胞组分从细菌细胞解聚或释放。
本领域的技术人员知道用于产生细菌细胞裂解物的手段。例如，将幽门螺旋杆菌细胞沉淀，然后重悬于，例如，Dulbecco磷酸缓冲盐水(PBS；10mM磷酸盐，0.14M NaCl，pH 7.4)中，并以50％的工作循环(duty cycle)以脉冲和强度设定5用W-375超声Ultrasonic处理器(Heat Systems-Ultrasonics,Inc.,Farmingdale,N.Y.)在冰上进行超声处理，进行三个1分钟时间段。根据需要，然后可通过离心除去不溶性物质和未破碎的细菌细胞。备选地，将幽门螺旋杆菌细胞沉淀，然后重悬于裂解缓冲液中，所述裂解缓冲液含有25mM Tris,pH 
7.5,1mM MgCl2,1mM氨基多羧酸(EGTA)，150mM NaCl,1％v/v壬烷基苯氧基聚乙氧基乙醇(nonyl phenoxypolyethoxylethanol)(例如，来自Sigma-Aldrich Inc.的Tergitol型NP-
40)和1％v/v的蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂。例如，用细胞刮棒收集全细胞裂解物，并在1,
200g,4℃下离心15分钟。备选地，通过离心收集幽门螺旋杆菌细胞，并重悬于PBS中，然后通过以20,000LB/in穿过French press(SLM Instrument Inc.,Urbana,Ill.)来裂解。又根据需要，以102,000X g离心细菌裂解物10分钟以除去细胞碎片和/或通过0.45μM膜(Nalgene,Rochester,N.Y.)过滤细菌裂解物。产生幽门螺旋杆菌细胞裂解物的另一种方法涉及例如，在溶菌酶存在下，细菌沉淀物的一轮或多轮冷冻和融化。幽门螺旋杆菌细胞裂解物的一个特别的实例是例如过滤后获得的灭活的幽门螺旋杆菌的超声处理培养物的可溶性级分。备选地或此外，使用高压匀浆器(例如，Avestin model EmulsiFlexC5)碎片化幽门螺旋杆菌细胞。任选地，进一步用福尔马林处理细胞裂解物。在一个实例中，例如，如本文所述获得的幽门螺旋杆菌的全细胞裂解物(WCL)，进行额外的分级分离和/或纯化，以从幽门螺旋杆菌细胞裂解物分离或纯化或分开一种或多种组分，例如细胞蛋白和/或脂质。
在另一个实例中，活的和/或灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌可以是分离的形式。
在提到幽门螺旋杆菌，如活的和/或灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌，本文所使用的术语“分离的”是指在下述环境中存在的幽门螺旋杆菌或其细胞或菌株，所述环境不同于活幽门螺旋杆菌天然存在的天然环境。例如，分离的幽门螺旋杆菌可以从其天然环境取出或分离和/或基本上不含活幽门螺旋杆菌的天然环境发现的至少一种组分。在这样的背景下，术语“分离的”包括幽门螺旋杆菌细胞培养物，部分纯的幽门螺旋杆菌细胞制剂，和基本上纯的幽门螺旋杆菌细胞制剂。
在一个特定的实例中，以生物学上纯的形式提供幽门螺旋杆菌。本文所用的术语“生物学上纯的”是指幽门螺旋杆菌的体外或离体培养物，其基本上不含其它种类的微生物。任选地，生物上纯的幽门螺旋杆菌是幽门螺旋杆菌的单一菌株的培养物形式。
在又一实例中，经杀死和/或灭活的幽门螺旋杆菌可以包含细胞裂解物。例如，细胞裂解物可以是幽门螺旋杆菌的全细胞裂解物。
备选地，使用组合物而采用本发明，所述组合物包含根据本文任何实例描述的灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌和细胞裂解物，如根据本文任何实例描述的灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌的全细胞裂解物的混合物。
2.培养幽门螺旋杆菌
菌株
在本发明的幽门螺旋杆菌组合物的制备中，可以使用在本领域中已知的任何幽门螺旋杆菌菌株。在一个实例中，幽门螺旋杆菌菌株可以是在布达佩斯条约下，在用于专利程序目的的微生物保藏的国际承认的国际保存机构保藏的任何活的幽门螺旋杆菌菌株。例如，幽门螺旋杆菌菌株可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，例如，以登记号ATCC 43504或登记号ATCC 26695或登记号ATCC BAA-945或登记号ATCC 700392或登记号ATCC 49503或登记号ATCC 53726或登记号53727或登记号ATCC 43526或登记号ATCC:43579或登记号ATCC 
700824保藏的幽门螺旋杆菌。例如，幽门螺旋杆菌菌株可以是J99菌株(ATCC700824)。或者/另外，示例性幽门螺旋杆菌菌株是如Moodley Y et al.,(2009),Science,323:527-
530and/or by Falush D,et al.,(2003),Science,299:1582-1585描述的那些。或者/另外，可在本发明的组合物的制备中使用的示例性幽门螺旋杆菌菌株依照布达佩斯条约如下保藏于国家计量研究院(NMI)，1/153Bertrie Street,Port Melbourne,Victoria，澳大利亚：
幽门螺旋杆菌菌株名称 NMI登记号 保藏日期
OND737 V09/009101 2009年4月22日
OND738 V09/009102 2009年4月22日
OND739 V09/009103 2009年4月22日
OND740 V09/009104 2009年4月22日
OND248 V10/014059 2010年5月28日
OND256 V10/014060 2010年5月28日
OND79 V13/023374 2013年11月28日
OND86 V14/013016 2014年6月10日
在另一个实例中，幽门螺旋杆菌可以是获自哺乳动物的任何幽门螺旋杆菌临床分离
株，例如来自诊断为感染幽门螺旋杆菌的患者，例如表现出慢性胃炎，消化性溃疡，例如胃和十二指肠溃疡，和/或胃恶性肿瘤的那些患者的人胃活组织检查样品。在一个这样的实例中，例如如Cheng-Chou Yu et al.,(2013),PLoS ONE,1:e55724描述的，将在患者活组织检查中的幽门螺旋杆菌细菌接种到合适的培养基，例如含5％绵羊血(Invitrogen)的
Columbia琼脂中，并在37℃下在微需氧室(Don Whitley,West Yorkshire,UK)在10％CO2,
5％O2,和85％N2下培养。在另一个实例中，将在患者活组织检查中的幽门螺旋杆菌细菌接种到幽门螺旋杆菌选择培养基如F12琼脂培养基平板，所述培养基含有DENT补充剂，萘啶酸和杆菌肽，例如，可购自Thermoscientific，Australia。在一个这样的实例中，幽门螺旋杆菌菌株是如Cheng-Chou Yu et al.,(2013)同上描述的，TA1(Cag+和VacA+)。
因此，在一些实例中，本发明的幽门螺旋杆菌菌株已通过动物宿主例如人被传代。例如，本发明的幽门螺旋杆菌菌株来源于OND79菌株在人受试者中传代，例如幽门螺旋杆菌菌株OND79感染和/或定殖人类受试者的胃粘膜后的幽门螺旋杆菌菌株OND79。在一个这样的实例中，幽门螺旋杆菌菌株从已经施用了OND79细胞的人类受试者的人胃活组织检查样品获得。例如，本发明的幽门螺旋杆菌菌株是OND86。
培养基
用于培养幽门螺旋杆菌以进行细菌生长和/或维持的培养基通过本领域技术人员公知的方法制备，并且描述于，例如，在BD诊断学(Manual of Microbiological Culture Media,Sparks,Maryland,Second Edition,2009)；Versalovic et al.(In Manual of Clinical Microbiology,American Society for Microbiology,Washington D.C,10th Edition,2011),Garrity et al.(In Bergey’sManual of Systematic Bacteriology,Spring er ,New York ,Second Edition .,2001 )；Ndip et 
al.2003J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.36:616-622and Testerman et 
al.2001J.Clin.Microbiol.39:3842-3850中。如对于本领域技术人员将是显而易见的，幽门 螺 旋 杆 菌 的 形 态 可 以 通 过 进 行 革 兰氏 染 色( 参 见 ，例 如 C o i c o 
2005Curr.Protoc.Micorbiol.Appendix 3)进行评估，并且其活力可使用例如Murray等人(In:Manual of Clinical Microbiology,American Society for Microbiology,
Washington D.C.,Ninth Edition 2007)描述的菌落计数来评估。
优选的细胞培养基补充有牛血清，或是改良的细胞培养基，其包含适宜培养哺乳动物细胞的血清替代物并且包含充足的碳源和能源以支持在发酵过程中的幽门螺旋杆菌的生长。优选的细胞培养基具有用于生产人类治疗剂的管理批准。
例如，幽门螺旋杆菌可以在补充有牛血清和用Fe3+强化的确定成分培养基上培养。示例性培养基是补充有NaHCO3，10％(v/v)的胎牛血清(FBS)和FeSO4(75μM)的F12液体培养基。
在一个特别优选的实例中，用于培养幽门螺旋杆菌的培养基包含氯化钙(例如，无水氯化钙)，硫酸铜(例如，硫酸铜·5H2O)，硫酸亚铁(例如，硫酸亚铁·7·H2O)，氯化镁(如，无水氯化镁)，氯化钾，氯化钠，磷酸钠(例如，磷酸氢二钠[无水])，硫酸锌7·H2O(例如，硫酸锌
7·H2O)，L-丙氨酸，L-精氨酸(例如，L-精氨酸·HCl)，L-天冬酰胺(例如，L-天冬酰胺·H2O)，L-天冬氨酸，L-半胱氨酸(例如，L-半胱氨酸·HCl或L-半胱氨酸·HCl·H2O)，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨酸(例如，L-组氨酸·HCl或L-组氨酸·HCl·H 2O)，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸(例如，L-赖氨酸·HCl)，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸(例如，L-酪氨酸2Na·H2O)，L-缬氨酸，D-生物素，氯化胆碱，叶酸，肌肉肌醇，烟酰胺，D-泛酸(半钙)，吡多辛(例如，吡多辛·HCl)，核黄素，硫胺素(例如，硫胺素·HCl)，维生素B-12，D-葡萄糖，次黄嘌呤，亚油酸，酚红(例如，酚红·钠)，腐胺二盐酸盐，丙酮酸(例如，丙酮酸·Na)，硫辛酸，胸苷和牛血清。
在一个这样的优选的实例中，用于培养幽门螺旋杆菌的培养基包含0.0333g/L氯化钙(无水)，0.0000025g/L硫酸铜·5H2O，0.000834g/L硫酸亚铁·7H2O，0.0576g/L氯化镁[无水]，0.224g/L氯化钾，7.599g/L氯化钠，0.14204g/L的磷酸氢二钠(无水)，0.000863g/L的硫酸锌·7H2O，0.009g/L的L-丙氨酸，0.211g/L L-精氨酸·盐酸，0.01501g/L L-天冬酰胺·H2O，0.0133g/L的L-天冬氨酸，0.035g/L的L-半胱氨酸·HCl·H2O，0.0147g/L L-谷氨酸，0146g/L L-谷氨酰胺，0.00751g/L甘氨酸，0.02096g/L L-组氨酸·HCl·H2O，
0.00394g/L的L-异亮氨酸，0.0131g/L L-亮氨酸，0.0365g/L L-赖氨酸·HCl，0.00448g/L L-甲硫氨酸，0.00496g/L L-苯丙氨酸，0.0345g/L L-脯氨酸，0.0105g/L L-丝氨酸，
0.0119g/L L-苏氨酸，0.00204g/L L-色氨酸，0.00778g/L L-酪氨酸2Na·2H2O，0.0117g/L L-缬氨酸，0.0000073g/LD-生物素，0.01396g/L氯化胆碱，0.00132g/L叶酸，0.018g/L肌肉肌醇，0.000037g/L烟酰胺，0.00048g/L D-泛酸(半钙)，0.000062g/L吡哆醇·HCl，
0.000038g/L核黄素，0.00034克/L硫胺素·HCl，0.00136g/L维生素B-12，1.802g/L D-葡萄糖，0.00408g/L次黄嘌呤，0.000084g/L亚油酸，0.0013g/L酚红·Na，0.000161g/L腐胺二盐酸盐，0.11g/L的丙酮酸·Na，0.00021g/L硫辛酸，0.00073g/L胸苷和100ml牛血清。
在用于培养幽门螺旋杆菌的培养基中，可以用FBS代替具有或不具有脂质补充剂的牛血清白蛋白。备选地，可以用血浆代替FBS，因为血浆包含可以影响细胞的生理，例如它们的脂质概况和/或蛋白质概况和/或LPS概况的凝结级联组分。
也可以采用基于植物蛋白质的其它半合成培养基，或其它的细胞培养基。
可以以液体，半固体或固体形式培养幽门螺旋杆菌。液体培养基的实例包括Brucella肉汤培养基(Brucella Broth)，Columbia肉汤培养基，脑心脏浸剂肉汤培养基，Wilkins–Chalgren肉汤培养基，Ham F-10营养培养基，Ham F-12营养培养基，Mueller-Hinton肉汤培养基，Skirrow Campylobacter培养基，Belo Horizonte培养基，Dent CP培养基，和幽门螺旋杆菌专用蛋白胨肉汤培养基，例如，如Stevenson et al.2000Lett.Appl.Microbiol.30:
192-196描述的。通过加入固定剂如，例如，琼脂，可以由在本文任何实例所述的任何液体培养基制备半固体和固体介质。备选地，可以使用专用的半固体和/或固体培养基如，例如，巧克力琼脂，胰蛋白酶大豆琼脂，Glupszynski布鲁塞尔弯曲杆菌炭琼脂和Johnson-Murano琼脂(Chocolate agar,Tryptic Soy Agar,Glupszynski's Brussels campylobacter 
charcoal agar and Johnson-Murano agar)。
培养基可以补充有血液或血液成分。本文所用的术语“血液”应理解为全血，并且“血液成分”指的是血清和/或血浆和/或血浆成分和/或红血细胞和/或白细胞和/或血小板和/或蛋白质成分。优地，血液或血液成分是去纤维蛋白的。在一个实例中，血液成分是来自哺乳动物。合适的哺乳动物包括，例如，山羊，绵羊，野牛，牛，猪，兔，水牛，马，大鼠，小鼠，或人类。在一个优选的实例中，血液成分可包含血清。在一个实例中，血清可以是胎牛血清或新生小牛血清或牛血清。培养基可以以在培养基中的以下的终浓度补充有血液或血液制品：
1％(体积/体积)，或至少2％(体积/体积)或至少3％(体积/体积)或至少为4％(体积/体积)或至少5％(体积/体积)，或至少6％(体积/体积)或至少7％(体积/体积)，或至少8％(体积/体积)或至少9％(体积/体积)或至少10％(体积/体积)或至少15％(体积/体积)或至少20％(体积/体积)或至少25％(体积/体积)。在另一个实例中，血液可包含热灭活的血液。在另一个实例中，培养基可包含热灭活的和非热灭活的血液的混合物。热灭活血液的方法是本领域已知的且描述于例如Ayache et al.2006J.Transl.Med.4:40中。
备选地，幽门螺旋杆菌可以培养在无血清的培养基中，例如通过Westblom et 
al.1991J.Clin.Microbiol.29:819–821所描述的蛋黄乳液培养基，或例如通过Vega et al.2003J.Clin.Micrbiol.41:5384-5388所描述的基于蓝藻提取物的培养基。
在另一个实例中，培养基可以补充有化学添加物，例如，腺嘌呤和/或盐酸半胱氨酸和/或环糊精和/或硝酸铁和/或硫酸亚铁和/或蛋白胨和/或IsoVitaleX和/或Vitox和/或淀粉和/或碳酸氢钠和/或丙酮酸钠和/或粘蛋白和/或维生素B12和/或L-谷氨酰胺和/或鸟嘌呤和/或对氨基苯甲酸和/或L-胱氨酸和/或酵母提取物。
在另一实例中，培养基可以补充有能够抑制非幽门螺旋杆菌微生物生长的抗生素。合适的抗生素可以包括万古霉素和/或甲氧苄啶和/或头孢磺啶和/或两性霉素B和/或多粘菌素。
优选地，在不含抗生素的培养基中培养幽门螺旋杆菌。
环境条件
本领域技术人员已知，幽门螺旋杆菌可以在微需氧气氛中诸如，例如，在CO2培养箱或在具有微需氧气氛的厌氧室中或在具有描述的气体产生套件的气体罐中培养。合适的微需氧气氛，例如通过Mobley et al.(In H.pylori:Physiology and Genetics.American Society for Microbiology,Washington D.C.,2001)描述。在一个实例中，幽门螺旋杆菌可以在包含约1％至约10％的氧，约5％至约10％的二氧化碳，和大约0％至约10％的氢的气氛中培养。
用于培养幽门螺旋杆菌的温度条件是本领域已知的。例如，幽门螺旋杆菌可在约25℃至约45℃的温度下培养。优选地，幽门螺旋杆菌可在约30℃至约40℃的温度下培养。更优选地，幽门螺旋杆菌可在约37℃的温度下培养。
在一个实例中，幽门螺旋杆菌可以在培养过程中被应激。如本文所用，术语“应激”应理解为环境条件的变化。例如，幽门螺旋杆菌可以暴露于环境应激例如，例如氧化应激，pH应激，渗透应激，碳饥饿，磷酸盐饥饿，氮饥饿，氨基酸饥饿，氧应激例如，通过使幽门螺旋杆菌生长在无氧条件下，热或冷休克或突变应激。优选地，在培养期间幽门螺旋杆菌暴露于环境应激导致幽门螺旋杆菌中一种或多种代谢改变，如增加的脂多糖合成和其表面呈递和/或幽门螺旋杆菌细胞蛋白质的降解。
细胞培养容器
可以使用本领域技术人员公知的标准细胞培养容器，如例如多孔板，培养皿，滚瓶
(roller bottle)，T烧瓶，D烧瓶，培养室，hyperflask管，转瓶(spinner flask)和锥形瓶培养幽门螺旋杆菌。
优选的细胞培养条件对细胞培养基，剪切敏感性，氧和其他气体要求，和pH控制进行了优化以提供在大规模培养中幽门螺旋杆菌的最佳生长，例如，在短的时间范围中的细胞培养物的高光密度。
优选地，可以在生物反应器中培养幽门螺旋杆菌。本文所用的“生物反应器”应理解为意指在受控条件下用于培养原核和/或真核细胞培养物的装置。生物反应器可以以分批或补料分批或延长分批或重复分批或抽取/补充或旋转壁或转瓶或半连续或灌注或连续模式运行。
在一个实例中，生物反应器可以通过使用方法，例如摇动，搅拌，或引导(channeling)流体或气体穿过培养物来搅动细胞培养物以用于通气目的。这样的生物反应器的实例包括例如通过旋转混合装置搅动的搅拌式罐发酵罐或生物反应器，恒化器(chemostat)，通过摇动装置搅动的生物反应器，气升式发酵罐/生物反应器，流化床生物反应器，采用波感应的搅动的生物反应器，离心式生物反应器或摇瓶。
在另一个实例中，生物反应器可包含用于量化生物质的手段，诸如，例如，通过测量培养基的光密度量化生物质。用于量化生物质的手段包括例如光学传感器或波导传感器或拉曼光谱术。
在又一实例中，生物反应器可以包括用于监测和/或测量和/或调节一个或多个生物过程参数的手段。如本文所用的术语“生物过程参数”应理解为意指可能改变幽门螺旋杆菌的生长速度的化学或物理性质。合适的生物过程参数包括例如温度，pH值，溶解氧，二氧化碳浓度，碳源浓度，胆汁盐浓度，光，葡萄糖浓度，压力，离子种类的浓度，细胞代谢物的浓度，摩尔浓度(molarity)，重量摩尔渗透压浓度(osmolality)，葡萄糖浓度，血清浓度和搅拌程度。
对于本领域技术人员将是显而易见的，可以使用许多方法来测定幽门螺旋杆菌的生长速度。
优选，生物反应器是微反应器。如本文所用的术语“微反应器”指的是具有以下体积的的生物反应器：体积小于1000mL，或小于900mL，或小于800mL，或小于700mL，或小于600mL，或小于500mL，或小于400mL，或小于300mL，或小于200mL，或小于100mL，或小于90mL，或小于
80mL，或小于70mL，或小于60mL，或小于50mL，或小于40mL，或小于30mL，或小于20mL，或小于
15mL，或小于10mL，或小于9mL，或小于8mL，或小于7mL，或小于6mL，或小于5mL，或小于4mL，或小于3mL，或小于2mL，或小于1mL。市售微反应器包括，例如，micro-Matrix(Applikon BIotechnology),micro-flask(Applikon Biotechnology)和高级微型规模生物反应器(advanced micro-scale bioreactor)(Tap Biosystems)。
备选地，生物反应器是大规模生物反应器。如本文所用的术语“大规模生物反应器”，是指用于生产供出售的产品以或生产供出售的产品的中间产物的生物反应器。优选，大规模的生物反应器具有以下体积的内部容量：至少1L，至少2L，至少3L，至少4L，至少5L，至少6L，至少7L，至少8L，至少9L，至少为10L，至少20L，至少50L，至少100L，至少200L，至少300L，至少400L，至少500L，至少600L，至少700L，至少800L，至少900L，至少1000L，特别至少2000L，至少3000L，或至少4000L。
在一个特别优选的实例中，幽门螺旋杆菌是从冷冻或解冻甘油原种或其它液体原种或板原种中培养，使用例如，约3mL的原种体积中的人幽门螺旋杆菌，然后接种到多通道微型生物反应器系统或规模可变的搅拌罐生物反应器，例如，2L台式搅拌釜生物反应器并培养。
可以采用接种培养(seed train)，其中制备用于中试规模(pilot-scale)的生物反应器的接种物。例如，400L中试规模批次的幽门螺旋杆菌可以由一个或两个或三个或四个或五个接种阶段产生，其中每个接种阶段提供细菌培养物密度的10倍扩增，如通过在约600nm的OD测定的。在一个类似的按比例放大过程中，将来自中试规模的生物反应器的接种物用于接种生产规模的生物反应器。例如，组合来自中试规模的生物反应器过程的多批次的2L至20L培养物批次，直至获得用于接种生产规模的生物反应器的合适的体积。用于每个阶段的培养时间在从约16小时至约120小时，包括16个小时至约96小时的范围内不等。
在另一个实例中，将接种培养物用于扩增细胞和处理体积以产生用于中试规模的生物反应器的接种物，然后将所述接种物用于在生产规模的生物反应器中接种培养基。例如，通过在室温下融化复苏冷冻贮存在-80℃下的幽门螺旋杆菌细胞(0.5mL)，并将0.4mL转移到
20至100mL培养基中，在微需氧环境下在37℃培养培养物16至96小时，直到光密度(在600nm测量)是在约0.4至约20的范围内。然后将该接种培养物用于接种具有体积为约200mL至约
2000mL的较大培养物，然后在相同条件下温育，以达到和之前相同的细胞浓度。然后将较大的培养物用于接种具有以下操作体积的小的生物反应器：2L(例如，Biostat B,Sartorius-Stedim,Germany)或10L(例如，Biostat C10,Sartorius-Stedim,Germany)或16L(例如，New Brunswick Bioflo 510,Eppendorf,USA)或50L(例如，Biostat D50,Sartorius-Stedim,Germany)。在37℃下，在pH，溶解氧和泡沫控制下运行生物反应器。例如通过自动加入10％(v/v)磷酸或10％(v/v)的氨溶液，将pH控制在pH 6至pH 8的范围内的设定点。优选地，将含有氮气，二氧化碳和一小部分的氧气(或压缩空气)的气体混合物鼓入生物反应器，并且如通过改变搅拌器速度和/或气体流速和/或容器的反压，将溶解的氧饱和度控制在例如
0.5％至10％的饱和度的范围内。可通过自动添加化学消泡剂，例如，根据需要添加聚丙二醇控制泡沫。
在生产规模的生物反应器工艺的一个实例中，在实现幽门螺旋杆菌细胞高产率的配置下运行有约400L至约10,000L的的容积的生物反应器。该系统可配置有自动灭菌处理和一系列经重新灭菌的样品和添加阀，以能够在发酵过程中采集和添加试剂和产物。在接种时，将接种物无菌转移到生产生物反应器。在37℃下在pH，溶解氧和泡沫受控的情况下运行生物反应器，基本上如在中试规模的生产过程期间。
对于幽门螺旋杆菌的大规模生产，补料分批或“半分批”培养是特别优选的。在补料分批培养中，在培养过程中将一种或多种营养物供给至生物反应器，并且在运行结束之前细胞产物保留在生物反应器中。在一些情况下，将所有的营养物进料到生物反应器。补料分批培养允许更好地控制培养液中的营养物浓度。对补料分批幽门螺旋杆菌培养物，通常监测溶解氧浓度，用于增加细胞数量的进料组成，用于增加细胞数量的进料速度，增加细胞数量需要的气体要求，和增加细胞数量需要的培养基的营养物组成中的一个或多个。这是因为幽门螺杆菌的高营养物需要。监测光密度以比较分析培养基配方和细胞生长，使得在最短的时间范围中获得高细胞光密度。例如，可以获得高于通常在分配培养中观察到的水平的细胞浓度，诸如在600nm的大于20个光密度单位和/或在600nm的高达约40个光密度。
3.灭活和杀死幽门螺旋杆菌
幽门螺旋杆菌可以通过化学手段和/或物理方式和/或遗传手段被灭活和/或被杀死。
如本文所使用的，术语“化学手段”指的是通过使幽门螺旋杆菌暴露至化学试剂来灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌的方法。如本文所用的术语“物理手段”指的是通过使幽门螺旋杆菌暴露至不涉及化学制品的一种或多种物理处理来灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌的方法。如本文所用的术语“遗传手段”指的是通过修饰幽门螺旋杆菌的基因组来灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌的方法。
用于灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌的合适的化学手段包括加入一种或多种化学试剂，如甲醛和/或β丙内酯和/或乙烯亚胺和/或二乙烯亚胺和/或硫柳汞和/或酸和/或碱和/或一种或多种杀细菌剂和/或一种或多种还原剂和/或胆汁盐。也可以使用本领域中已知的这些化学试剂的衍生物。
在一个优选的实例中，通过暴露于浓度为约0.01％至约1％(w/w)或约0.01％至约
0.1％(w/w)或约0.025％至约0.1％(w/w)的甲醛来灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌。
或者/另外，例如，如Chakraborti et al.2012Langmuir,28:11142-11152描述的，通过暴露于聚乙烯亚胺官能团化的氧化锌纳米颗粒来灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌。
或者/另外，根据本文任何实例描述的经杀死的幽门螺旋杆菌通过使活和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露至一种或多种杀菌剂制备。例如，可以一种或多种抗生素对活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌进行处理，所述抗生素选自利福平，阿莫西林，克拉霉素，利福霉素，利福昔明，利福霉素衍生物3′-hydroxy-5′-(4-isobutyl-1-piperazinyl)
benzoxazinorifamycin，同物异名KRM-1648和/或利福霉素衍生物3′-hydroxy-5′-(4-propyl-1-piperazinyl)benzoxazinorifamycin，同物异名KRM-1657。
或者/另外，根据本文任何实例描述的灭活的幽门螺旋杆菌通过使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露至一种或多种酸或低pH环境，例如pH3.0更低和/或到一种或多种碱或高pH环境，例如pH9.0或更高制备。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的灭活的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于一种或多种还原剂，例如亚硫酸氢钠和/或一种或多种氧化剂如过氧化氢。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的灭活的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于胆汁盐。
用于灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌的适当的物理手段包括暴露于可见光和/或紫外光，例如UV-C光和/或低功率激光感光剂和/或热(例如，干热或湿热，如在蒸汽中)和/或升高的压力和/或温度变化和/或冷冻-融化和/或冷冻干燥(冻干)和/或超声处理。
或者/另外，通过暴露于波长范围为375nm至约500nm或范围为约400nm至约420nm的可见光灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌。
或者/另外，通过暴露于紫外光灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌，例如Hayes et al.2006,Appl.Environ.Microbiol.72:3763-3765。
例如，根据本文任何实例中描述的灭活的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于照射如紫外线照射和/或通过暴露于可见光，例如波长范围为
375nm至约500nm或范围为约400nm至约420nm，例如，405nm的紫色光。在一个实例中，根据本文任何实例中描述的幽门螺旋杆菌是通过一种处理制备：所述处理包括使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于紫外线-C(UVC)照射，例如波长范围为约100nm至约280nm内如约
257.3nm，和/或紫外线B(UVB)照射，例如波长范围为约280nm至约315nm，和/或紫外线A(UVA)照射，例如波长范围为约315nm至约400nm。优选地，使活的幽门螺旋杆菌暴露于范围为约100nm至约280nm，例如约257.3nm的UVC光和/或使活的幽门螺旋杆菌暴露于约405nm紫色光从而灭活幽门螺旋杆菌。
备选地，根据本文任何实例中描述的幽门螺旋杆菌是通过一种处理制备：所述处理包括使活的或灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于紫外线-C(UV-C)照射，例如波长范围为约100nm至约280nm内，例如约257.3nm，和/或紫外线B(UV-B)照射，例如波长范围为约280nm至约315nm，和/或紫外线A(UV-A)照射，例如波长范围为约315nm至约400nm。优选地，使活的或灭活的幽门螺旋杆菌暴露于范围为约100nm至约280nm，例如约257.3nm的UV-C光。备选地，使活的或灭活的幽门螺旋杆菌暴露于约405nm紫色光从而杀死幽门螺旋杆菌。
或者/另外，通过暴露于γ照射灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌。
或者/另外，如，例如MILLSONet al.1996J.Med.Microbiology,44:245-252所述，在感光剂(photosensitiser)的存在下通过使活的或灭活的幽门螺旋杆菌暴露于低功率激光灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌。或者/另外，通过热处理细胞灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌。
例如，幽门螺旋杆菌可通过热处理而灭活，其中使活的幽门螺旋杆菌细胞暴露于，如温度范围为约40℃至约70℃或更高的热处理。在上下文中优选的热处理可包括使活的幽门螺旋杆菌细胞暴露于约60℃或更高的温度至少约60秒，优选地在约60℃或约70℃或约80℃或约90℃或约100℃或约110℃或约120℃或约130℃或约140℃或约150℃的温度下热处理，所述温度暴露的时间段为至少3分钟或至少4分钟，或至少5分钟或至少6分钟或至少7分钟，或至少8分钟或至少9分钟或至少10分钟或至少20分钟或至少30分钟或至少40分钟或至少50分钟或至少1小时或至少2小时或至少3小时，或至少4小时，或至少5小时或至少6小时或至少7小时或至少8小时，或至少9个小时或至少10小时或至少11小时或至少12小时或至少13小时或至少14小时或至少15小时或至少16个小时，或至少17小时或至少18个小时，或至少
19小时或至少20小时或至少21小时或至少22小时或至少23小时或至少1天，或者至少2天或至少3天或至少5天或至少5天或至少6天或至少7天。
备选地，根据本文任何实例中描述的经杀死的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：使活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于热处理，如在温度为约60℃或更高热处理至少约60秒，优选地在约60℃或约70℃或约80℃或约90℃或约100℃或约110℃或约120℃或约130℃或约140℃或约150℃的温度下热处理，所述温度暴露的时间段为至少为2分钟或至少3分钟或至少4分钟，或至少5分钟或至少6分钟或至少7分钟，或至少8分钟或至少9分钟或至少10分钟或至少20分钟或至少30分钟或至少40分钟或至少50分钟或至少1小时或至少2小时或至少3小时，或至少4小时，或至少5小时或至少6小时或至少7小时或至少8小时，或至少9个小时或至少10小时或至少11小时或至少12小时或至少13小时或至少14小时或至少15小时或至少16个小时，或至少17小时或至少18个小时，或至少19小时或至少20小时或至少
21小时或至少22小时或至少23小时或至少1天，或者至少2天或至少3天或至少5天或至少5天或至少6天或至少7天。
在一个优选的实例中，活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌通过以下被杀死：暴露于单个这种升高的温度或暴露于至少两个不同的升高温度，例如暴露于约70℃的第一温度，随后暴露于约90℃或约95℃的第二温度。在一个这样的优选实例中，活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌通过以下被杀死：暴露于约70℃的温度下约10分钟，随后暴露于约90℃或约94℃或约95℃的温度约5分钟。
或者/另外，如根据本文的任何例子描述的经杀死的幽门螺旋杆菌通过以下制备：在蒸汽和升高的压力的存在下，使活的和/或灭菌的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于升高的温度，如高压灭菌活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株。例如，活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌通过在约121℃和约15psi，高压灭菌细菌细胞或菌株约15分钟，或在约132℃和约
30psi高压灭菌约3分钟被杀死。
在一个优选的实例中，幽门螺旋杆菌通过温度转变被杀死和/或被灭活，暴露于单个这种升高的温度或暴露于至少两个不同的升高温度，例如暴露于约70℃的第一温度，随后暴露于约90℃或约94℃或约95℃的第二温度。
或者/另外，幽门螺旋杆菌通过以下通过以下被灭活和/或杀死：使细胞暴露于一轮或多轮冷冻-融化循环，例如暴露至2或3或4或5或6或7或8或9或10轮冷冻-融化循环中。示例性冷冻-融化循环循环包括在干冰/乙醇浴中冷冻幽门螺旋杆菌，然后在37℃解冻材料。
或者/另外，通过冷冻干燥细胞灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌。
或者/另外，通过超声处理细胞灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌。例如，根据本文任何实例中描述的经杀死的幽门螺旋杆菌是通过超声处理，例如以约20kHz或更高的频率超声处理活的和/或灭活的幽门螺旋杆菌来制备。
优选地，根据本文任何实例中描述的灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：首先使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于照射如γ照射和/或紫外线照射如UV-C光和/或暴露于可见光如波长范围为375nm至约500nm或范围为约400nm至约420nm的可见光，从而灭活幽门螺旋杆菌，然后使灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于根据本文任何实例中描述的热处理，从而杀死灭活的幽门螺旋杆菌或使灭活的幽门螺旋杆菌不可逆地无代谢活性。
例如，然后使灭活的幽门螺旋杆菌暴露于在温度为约60℃或更高热处理达至少约60
秒，优选地在约60℃或约70℃或约80℃或约90℃或约100℃或约110℃或约120℃或约130℃或约140℃或约150℃的温度下热处理，所述温度暴露的时间段为至少为2分钟或至少3分钟或至少4分钟，或至少5分钟或至少6分钟或至少7分钟，或至少8分钟或至少9分钟或至少10分钟或至少20分钟或至少30分钟或至少40分钟或至少50分钟或至少1小时或至少2小时或至少3小时，或至少4小时，或至少5小时或至少6小时或至少7小时或至少8小时，或至少9个小时或至少10小时或至少11小时或至少12小时或至少13小时或至少14小时或至少15小时或至少16个小时，或至少17小时或至少18个小时，或至少19小时或至少20小时或至少21小时或至少22小时或至少23小时或至少1天，或者至少2天或至少3天或至少5天或至少5天或至少6天或至少7天。在一个这样的实例中，灭活的幽门螺旋杆菌暴露于单个这种升高的温度或暴露于至少两个不同的升高温度，例如暴露于约70℃的第一温度，例如约10分钟，随后暴露于约90℃或约95℃的第二温度，例如约5分钟。
在一个优选的实例中，根据本文任何实例中描述的经杀死的幽门螺旋杆菌是通过以下制备：首先使活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于紫外线照射，如UVC光，例如约257.3nm，从而灭活幽门螺旋杆菌，然后使灭活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株暴露于根据本文任何实例中描述的热处理，从而杀死灭活的幽门螺旋杆菌或使灭活的幽门螺旋杆菌不可逆地无代谢活性。
因此，在一个优选实例中，根据本文任何实例的组合物包含已经进行用于通过照射灭活幽门螺旋杆菌的方法和通过热处理杀死灭活的幽门螺旋杆菌的方法的幽门螺旋杆菌。
或者/另外，根据本文任何实例中描述的幽门螺旋杆菌是通过以下被灭活和/或杀死
的：使活的或灭活的幽门螺旋杆菌暴露于厌氧条件，例如，通过改变气氛，其中使幽门螺旋杆菌从微需氧到厌氧环境下培养，例如以模拟在幽门螺旋杆菌从胃到下肠道(例如，小和/或大肠)洗出(washout)期间的体内气氛条件。例如，活(如新鲜培养)的幽门螺旋杆菌通过以下灭活：使细菌细胞暴露(例如，通过培养或温育)到厌氧条件约1天至约5天或更长，包括至少约24小时，或至少约48小时或至少约72小时或至少约96小时或至少约120小时。在一个这样的实例中，活的幽门螺旋杆菌细胞通过使细胞暴露于厌氧条件和通过细胞的热处理而灭活。
在另一个实例中，根据本文任何实例中描述的活的或灭活的幽门螺旋杆菌是通过以下被杀死：使活的或灭活的细菌细胞暴露于(例如通过温育)厌氧条件约1天至约5天或更长，包括至少约24小时，或至少约48小时或至少约73小时或至少约96小时或至少约120小时。
在一个优选的实例中，根据本文任何实例的组合物包含幽门螺旋杆菌，其已经进行了用于通过使细菌细胞暴露于(例如，通过培养或温育)厌氧条件约1天至约5天或更长，包括至少约24小时，或至少约48小时或至少约73小时或至少约96小时或至少约120小时灭活幽门螺旋杆菌的方法，和通过细胞的热处理而杀死灭活的幽门螺旋杆菌的方法。
用于产生根据本文任何实例描述的灭活的幽门螺旋杆菌的合适的遗传手段包括诱变
活的幽门螺旋杆菌细胞或菌株以修饰一个或多个基因，其表达对于幽门螺旋杆菌在人类受试者的胃和肠粘膜中有效定殖和/或维持是需要的。例如，这样的基因可以通过重组而缺失或通过插入转座子或其他遗传元件而修饰，或者它们可以通过化学诱变而失活。在本领域中描述了这种手段。
可以对液体，半固体或固体形式的幽门螺旋杆菌细胞进行灭活和/或杀死。在一个实例中，可以在生长的对数期(即其中在培养物中的细胞数目指数增加)或生长的稳定期(即其中在培养物中的活细胞是对数后的(post-logarithmic)并且数目不会增加)灭活和/或杀死培养在液体中的幽门螺旋杆菌。
在一个特别优选的实例中，在例如具有如本文所述的中试规模反应器相同的操作系统的蒸汽就地生物反应器(steam-in-place bioreactor)或可灭菌就地生物反应器
(sterilisable-in-place bioreactor)中处理中试规模的培养物或其他大规模培养物，例如，大于2L或大于5L或大于10L或约100L或约400L体积包括100L或150L或200L或250L或
300L或350L或400L或更大体积的培养物。在这样的生物反应器中，灭活和/或杀死处理利用高温和高压以产生蒸汽，该蒸汽在细胞已经实现期望的细胞密度后对其应用，从而灭活和/或杀死细胞。
在另一个实例中，对补料分批过程中的培养物以在600nm处每OD大于100焦耳的辐照度经受紫外光，例如UV-C照射，并且然后以60℃至约120℃范围(包括121℃)中的温度热处理在约15分钟至约6小时的范围中的时间。
本发明还提供了主细胞库(master cell bank)，其包含如本文所述制备的本发明的经处理的幽门螺旋杆菌。例如，主细胞库可以包含经处理的幽门螺旋杆菌细胞的等分试样，例如，包含细胞产物的100或200或300或400或500小瓶。优选地，主细胞库冷冻贮存例如在-80℃。
4.收获经处理的幽门螺旋杆菌细胞
用于收获微生物的方法是本领域公知的并且描述于，例如Ausubel et al.(In:
Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience,ISBN 047150338,
1987)或Sambrook et al.(In:Molecular Cloning:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York,Third Edition 2001)中。如本文所用的术语“收获”是指在已经培养幽门螺旋杆菌群体后从培养基中或者从已经培养幽门螺旋杆菌群体的培养基中收集幽门螺旋杆菌。合适的方法包括例如如离心如超速离心，或过滤，例如超滤或微滤或深层过滤。
通常在灭活和/或杀死后收获幽门螺旋杆菌细胞。
在一个优选的实例中，通过采用如以约5000×g至约20,000×g的范围内的离心力连续
离心从培养物，例如生物反应器回收经处理的细胞。优选地，用配制缓冲液如磷酸缓冲盐水或其它药学可接受赋形剂或稀释剂洗涤收获的细胞。洗涤溶液可补充有葡聚糖或包囊制剂。
然后包装细胞产物，立即用于贮存或使用。优选地，将细胞冻干或喷雾干燥，以产生适合于长期储存的固体产物。
包装包含细胞产物的一种或多种规格，如细胞浓度，缓冲液组成，液体制剂，干制剂，包装大小等。
5.确定或鉴定灭活和/或经杀死的幽门螺旋杆菌
测量幽门螺旋杆菌或其细胞在如本文的任何例子中描述的组合物和/或方法中的效用包括测量幽门螺旋杆菌或其细胞复制和/或定殖哺乳动物的胃粘膜的能力的任何方法和/或测量幽门螺旋杆菌或或其细胞粘附到胃粘膜或其上皮细胞的能力的任何方法和/或测量幽门螺旋杆菌的活力和/或代谢活性的任何方法，例如在根据本文任何实例所述的应激和/或灭和和/或杀死处理幽门螺旋杆菌后。
在一个实例中，通过存活细菌的定量，例如通过菌落计数确定幽门螺旋杆菌或其细胞复制和/或定殖哺乳动物的胃粘膜的能力。参见例如，Drumm and Sheman 1991,
J.Med.Microbiol 35:197-202。
例如，将测量细胞当量为660nm处光密度为约0.2至约5.0或以上的已经培养并进行了应激和/或灭活和/或杀死处理(例如如根据本文任何实例所述)的储存幽门螺旋杆菌的
0.5ml样品重悬于250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶含有11ml补充了10％胎牛血清(例如，Boknek Laboratories,Ontario,Canada)的Brucella肉汤的新鲜培养基(例如,Gibco Laboratories,Madison,WI,USA)中，或适用于培养幽门螺旋杆菌的其他培养基，例如如本文任何实例所述。若需要的话，培养基补充有甲氧苄啶(例如Sigma Chemicals,St.Louis,MO,USA)5mg/L和/或万古霉素(例如Sigma)10mg/L。将烧瓶用松散安装螺旋帽闭合，并且置于温育罐内部，然后将该温育罐排空，并且用含有CO2 10％,O2 5％,N2 85％的气体混合冲洗，并于37℃在旋转摇动器上温育，并在摇动的情况下于100rpm温育。约24小时后，将约1ml的细菌培养物转移到Brucella肉汤新鲜培养基中并再培养。存活和复制的幽门螺旋杆菌的缺乏通过对补充的Brucella琼脂平板上传代培养肉汤培养基并通过相差显微术检查细菌形态来确认。参见，例如Drumm and Sherman,1989,J.Clin Microbiol,27:1655-1656。
或者/另外，在肉汤培养物中通过连续稀释和连续测量培养物在600nm处的光密度和/或通过如在温育18，24，30和36小时后菌落计数进行存活和复制的幽门螺旋杆菌的定量。例如，如果存在的话，存活和复制的幽门螺旋杆菌细菌的细胞计数通过将连续稀释的培养物一式三份地接种到Brucella琼脂，并在37℃在微需氧条件下培养板5天来确定。存活和复制的幽门螺旋杆菌在Brucella琼脂上产生光滑，半透明的菌落。为了提高活菌计数(CFU)的准确度，在用细菌培养物接种琼脂之前，将4mg/L的四唑盐添加到Brucella琼脂中。在37℃在微需氧条件下温育5天后，存活和复制的幽门螺旋杆菌细胞在此培养基上产生红色菌落。如本文所述的幽门螺旋杆菌的缺乏证实幽门螺旋杆菌是灭活的和/或被杀死的并且不能复制和定殖胃粘膜。
在另一个实例中，灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌可通过测定幽门螺旋杆菌代谢活性，如例如脲酶的产生和/或ATP消耗的任何测定法来证实。
在一个优选的实例中，将快速脲酶测试，也称为弯曲状菌属样生物(CLO)测试用于检测幽门螺旋杆菌的存在，所述幽门螺旋杆菌基于幽门螺旋杆菌分泌脲酶的能力具有部分或完全的代谢活性，所述脲酶催化尿素转化成氨和CO2。根据本实例，将测量细胞当量为在660nm处的光密度为约为0.2至约5.0或以上的经培养并进行了应激和/或灭活和/或杀死处理(如根据本文任何实例所述)的贮存幽门螺旋杆菌的约1μl至约100μl样品的等分试样，或在任何合适培养基，例如如上所述的Brucella肉汤培养基中培养的约1μl至100μl细菌细胞的等分试样加入到含有新鲜制备的脲酶指示剂试剂的无菌Eppendorf管中使得总体积为200μl。
例如，可以使用在0.01M磷酸缓冲盐水(PBS)中含有约2％(w/v)至约5％(w/v)尿素，和浓度约0.1％(w/v)或约0.05％(w/v)的至少一种pH指示剂如酚红，溴百里酚蓝，溴甲酚紫和甲基红的脲酶指示剂试剂。根据需要，可以使用0.1N或1.0N HCl将每一脲酶指示剂制剂的pH调节至每一指示剂公知的pH值范围的下端；例如，指示剂酚红具有6.6至8.0的pH范围，并且可将包含酚红的脲酶指示剂制剂调节至pH 6.6；溴百里酚蓝指示剂具有6.0至7.6的pH范围，并且可将包含溴百里酚蓝的脲酶指示剂制剂调节至pH 6.0；溴甲酚紫指示剂具有5.2至6.8的pH范围，并且可将包含溴甲酚紫的脲酶指示剂制剂调节至pH 5.2；甲基红指示剂具有4.8至6.2的pH范围，并且可将包含甲基红的脲酶指示剂制剂调节至pH 4.8；备选地，如Nedrud JG,Blanchard TG.Helicobacter animal models.In:Coligan JE,Bierer B,Margulies DH,Shevach EM,Strober W,Coico R,editors.Current Protocols in 
Immunology.Philadelphia:John Wiley and Sons；2000.p.19.8.1–26所描述的制备脲酶指示剂。备选地，脲酶指示剂试剂可以通过例如，从ASAN pharm.Co.,Seoul,Korea商业上购买获得。然后涡旋该管并在室温下温育。4小时后，以RCF6000离心管5分钟，将约100μl上清液转移到96孔板，并在550nm处用分光光度计读数。根据需要，可将例如如下所述制备的来自未感染幽门螺旋杆菌的小鼠的胃粘膜组织匀浆作为脲酶测定的阴性对照。此外，根据需要，可以将含有已知浓度的经培养的能够复制和定殖胃粘膜的幽门螺旋杆菌(如野生型幽门螺旋杆菌)用作阳性对照。显示如通过快速脲酶测试测定的小于5％的脲酶活性的幽门螺旋杆菌的样品表明幽门螺旋杆菌是灭活的和/或被杀死的。
如对本领域技术人员将是显而易见的，许多脲酶测试是商业上可获得的如，例如，
CLOtest(Kimberly-Clark),Hpfast(Sigma)和Pyloritek(Serim)。
在另一个实例中，灭活和/或经杀死幽门螺旋杆菌通过进行氧化酶试验来证实。如本文所用，术语“氧化酶试验”指的是用于检测细胞色素c氧化酶存在的测定，其使用氧化还原指示剂，如，例如，N，N，N，N-四甲基-对苯二胺(TMPD)或N，N-二甲基-对苯二胺(DMPD)。合适的氧化酶测试例如通过Tsukita et al.1999J.Biochem.1235:194-201或Murray et al.(In:
Manual of Clinical Microbiology,American Society for Microbiology,Washington D.C.,Ninth Edition 2007)描述。
在另一个实例中，灭活和/或经杀死幽门螺旋杆菌通过进行过氧化氢酶试验来证实。应认为术语“过氧化氢酶试验”包括确定幽门螺旋杆菌通过过氧化氢酶降解从过氧化氢释放氧气的能力的任何测定。对于本领域技术人员，合适的过氧化氢酶试验将是显而易见的。
在另一个实例中，灭活和/或经杀死幽门螺旋杆菌通过进行如，例如Worku et 
al.1999Microbiology 145:2803-2811描述的运动性测试来证实。
在另一个实例中，使用幽门螺旋杆菌附着到人体胃组织的体外测定来确定幽门螺旋杆菌或其细胞复制和定殖哺乳动物的胃粘膜的能力。参见例如Hemalatha et al.1991,J.Med.Microbiol 35:197-202；Falk et al.,1993,Proc.Natl.acad.Sci.USA.90:2035-
2039；Hsieh et al.2012Helicobacter 17:466-477。
在另一个实例中，使用体内胃定殖感染动物例如，小鼠的分析来确定幽门螺旋杆菌或其细胞复制和定殖哺乳动物的胃粘膜的能力。例如，收获已经培养并进行了应激和/或灭活和/或杀死处理(例如如根据本文任何实例所述)的幽门螺旋杆菌细菌并重悬于无菌盐水中。作为阳性对照，使用已知能够复制和定殖哺乳动物的胃粘膜中并且在下述接种攻击前一直没有进行应激和/或灭活和/或杀死处理的幽门螺旋杆菌的培养物。能够复制和定殖胃粘膜的合适的幽门螺旋杆菌是本领域已知的。简言之，用阳性对照幽门螺旋杆菌原种的等分试样接种含有添加了4％胎牛血清(FCS)的BHI肉汤培养基的烧瓶，并允许在37℃，在10％CO2+5％O2的气氛中，以125rpm摇动温育25至48小时，以产生具有预期形态的幽门螺旋杆菌细菌的纯培养物用于感染。对于攻击接种，在660nm处读取1:10稀释的无菌盐水悬浮液的光密度，所述悬浮液含有经过培养并进行应激和/或灭活和/或杀死处理的幽门螺旋杆菌细菌，并且将产生0.07至0.002之间的读数的接种物样品用于接种小鼠。
备选地，使用用于接种的样品，其包含在一定范围中的经过培养并进行应激和/或灭活和/或杀死处理的幽门螺旋杆菌细菌的量，所述范围相当于约1×107至2×1010个细胞/ml或CFU/ml，如例如通过血细胞计数器测定的。对于阳性对照幽门螺旋杆菌，使用约1×108个细胞的接种物。用包含一定范围中的细菌量的范围对应于108至1010个细胞之间，优选109个细胞的进行了应激和/或灭活和/或杀死处理的幽门螺旋杆菌细菌的剂量和包含对照幽门螺旋杆菌的约1×108个细胞的接种物通过管饲法在1周时期内两次，优选每次攻击隔开至少一天经口攻击6至8周龄C57BL/6小鼠(来自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)和/或BALB/c小鼠(来自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)，所述范围对应于进行应激和/或灭活和/或杀死处理的108至1010个细胞，优选109个细胞。
备选地，通过胃内免疫接种攻击小鼠，其中通过经由连接于皮下注射器的聚乙烯管插管将包含如上文的接种物剂量的约0.25ml或约0.5ml或约1ml体积递送至用醚轻度麻醉的小鼠的胃中。根据需要，这个过程可以在5天的时期中进行三次，给药之间24小时。
根据本实例，对于分析胃定殖的目的，攻击后两周，例如通过吸入CO2处死小鼠，并且取出胃和十二指肠用于定殖的定量评估。例如，将胃和十二指肠转移至含有5-10ml无菌PBS的经标记的无菌培养皿，然后转移到生物安全柜，其中通过正中切口打开胃，并使用无菌纱布轻轻地清洗内容物。窦是可视化的，并且从远离胃的其余部分无菌切开，丢弃所述其余部分。然后使用灭菌的单刃刀片切割窦部分，并且将切片放置在预先称重的含有脑心脏浸液肉汤(BHI)培养基(brain–heart infusion broth media)的5ml管中。根据需要，将含有窦切片的管再次称重至0.001克的精确度，并置于生物安全柜中。然后，例如使用无菌塑料组织匀浆器可以机械地浸渍切片，并且在BHI培养基中制备了系列1：10,1：100和1：1000稀释的匀浆。将来自各稀释管的100μl的等分试样放置在无菌BHI琼脂平板并进行全板涂布。例如，其上放置了匀浆的培养基含有BHI琼脂(Difco)，4％胎牛血清，杆菌肽，萘啶酸，两性霉素B和弯曲杆菌选择性补充物(Oxoid,Lenexa,KS)。将板置于含有BBL CampyPak
microaerophilic envelope(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ；product#271045)的厌氧培养罐中，并优选地在37℃温育6-7天。在每个罐子中包括了生长控制板，在所述罐子中接种了新鲜生长的同上的阳性对照幽门螺旋杆菌制备物。在该测定中的检出限是每克胃组织大约500个幽门螺旋杆菌细胞。幽门螺旋杆菌菌落的缺少表明幽门螺旋杆菌是无活性的，并且不能复制和定殖胃粘膜。然而，如果平板上观察到菌落，可以借助如本文中任何实例描述的方法，例如使用一种脲酶活性测定和/或氧化酶的活性测定法和/或过氧化氢酶活性测定和/或通过菌落形态学证实该菌落为幽门螺旋杆菌。
在另一实例中，幽门螺旋杆菌或其细胞复制和定殖哺乳动物的胃粘膜的能力是基于幽门螺旋杆菌的16S核糖体基因序列的检测通过在常规有胸腺小鼠中幽门螺旋杆菌定殖的聚合酶链式反应( PCR)检测确定的。参见，例如Smith et al .,1996 ,
Clinic.Diagn.Lab.Immuno.3:66-72。例如，收获已经培养并进行了应激和/或灭活和/或杀死处理(例如如根据本文任何实例所述)的幽门螺旋杆菌细菌并重悬于无菌盐水中。根据需要，分别收获作为阳性对照的已知能够复制和定殖哺乳动物的胃粘膜并且在下述接种攻击前一直没有进行应激和/或灭活和/或杀死处理的幽门螺旋杆菌(例如野生型(WT)幽门螺旋杆菌)培养物，并重悬于无菌盐水中。能够复制和定殖胃粘膜的合适的幽门螺旋杆菌是本领域已知的，并且如本文所描述的。对于攻击接种，在660nm处读取1:10稀释的接种物的光密度，并且将产生0.07至0.002之间的读数的接种物样品用于接种小鼠。
备选地，使用接种物样品，其包含在一定范围中的细菌量，所述范围相当于约2×107至
2×108个细胞/ml或CFU/ml，如例如通过血细胞计数器测定的。用如上所述制备的0.5ml幽门螺旋杆菌接种物通过管饲法在1周时期内两次经口攻击8至12周龄VAF和GF Swiss-
Webster小鼠或VAF CD-1小鼠(来自Taconic Laboratories(Germantown,N.Y.))和/或VAF-CD-1小鼠(来自Charles River Laboratories(Wilmington,Mass)和/或C57BL/6小鼠(来自Charles River Laboratories(Wilmington,Mass)和/或BALB/c(来自Charles River Laboratories(Wilmington,Mass)和/或SJL/J小鼠(来自The Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine,USA)，优选每个攻击间隔至少一天。将所有的小鼠装在无菌微型隔离笼中，其中无菌水和鼠粮无限制。根据需要，维持GF小鼠，在所有表面均消毒的层流通风橱中使用无菌GF程序操作，并且用于GF小鼠的笼子在无菌包装中高压灭菌，水也高压灭菌并在使用前过滤灭菌。为了评估幽门螺旋杆菌在经攻击的小鼠胃粘膜中的定殖，在攻击后约1至约4周，优选在攻击后约4周，例如，通过吸入CO2处死小鼠，并且通过无菌技术取出胃。然后纵向切割胃，并且通过用无菌的去离子H2O漂洗冲走胃内容物。然后通过用无菌玻璃显微镜载波片从胃内膜组织轻轻刮取粘膜来分离胃粘膜。然后在用于PCR分析的DNA提取之前，将粘膜样品放置在Tris-氯化钠-EDTA(TNE)缓冲液中并贮存在冰上或冷冻。用于从粘膜悬浮液提取DNA以用于PCR分析的方法是本领域已知的，并且可以容易地采用。例如通过在12,000rpm下离心TNE缓冲液中的胃粘膜悬浮液3分钟来提取DNA。然后去除上清液，并将细胞沉淀物重悬于570ml每ml含1％Triton X-100(Sigma)和0.5mg溶菌酶(Sigma)的TNE中。然后在37℃温育样品30分钟。接着，加入1mg/ml的蛋白酶K(Boehringer GmbH,Mannheim,Germany)，并在
65℃温育混合物2小时，或在37℃过夜。将消化物与等体积的酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)混合，然后在10,000 3g离心6分钟。然后除去顶部水层，并且优选用酚-氯仿-异戊醇进行第二次提取。然后将水层与等体积的氯仿-异戊醇(24：1)混合，并如前两次提取处理。然后通过加入1/10体积的3M乙酸钠和2个体积的无水乙醇并放置在干冰上20分钟来沉淀DNA。通过如上所述的离心并用70％的乙醇漂洗沉淀DNA。沉淀物优选例如通过高速真空干燥并重悬于
100ml 0.13TE(13TE是10mM Tris[pH 7.4的]，0.1mM EDTA)中。在PCR运行之前样品储存在4℃。
使用的用于扩增幽门螺旋杆菌的编码16S rRNA的DNA序列的PCR引物包括如SEQ ID 
NO：1中所示的具有序列5'-TTG GAG GGC TTA GTC TCT-3'的上游引物(HP前向)和如SEQ ID NO：2中所示的具有序列5'-AAG ATT GGC TCC ACT TCA的CA-3'的下游引物(HP反向)。在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中所示的引物被设计为跨越幽门螺旋杆菌DNA序列的碱基793至
1252的459bp PCR产物。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2引物是基于以基因库登录号U00679，U01328，U01329，U01330，U01331，U01332列出的幽门螺旋杆菌6个分离株的同源区域设计的，并且其不同于H.felis(基因库登录号M57398)，H.muridarum(基因库登录号M80205),和弯曲杆菌属(Campylobacter sp.)(基因库登录号L04315)列出的序列。因此使用这些引物可避免与密切相关的细菌交叉反应。
根据需要，也可以构建用于PCR反应中的内部PCT对照DNA模板。参见例如，Smith等人，
1996同上。例如，将使用如根据本文任何实例描述的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中所示引物从野生型幽门螺旋杆菌扩增的495-bp PCR产物克隆到多拷贝质粒中。随后，将便利地旁侧是StyI位点的237bp的内部限制片段从所克隆的幽门螺旋杆菌的DNA中删除，以产生具有与HP引物完美同源性的模板，但用那些引物会从其扩增出短得多的序列。通过使用
Geneclean kit(Bio 101,Inc.,La Jolla,Calif.)纯化459-bp经PCR扩增的幽门螺旋杆菌DNA片段，并用T4DNA连接酶(GIBCO BRL,Gaithersburg,Md.)连接到质粒pBluescript II SK1(Stratagene Co.,La Jolla,Calif.)的EcoRV位点，所述质粒pBluescript II SK1赋予氨苄青霉素抗性并编码lacZa肽。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中(GIBCO BRL)。在含有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D吡喃半乳糖苷)的Luria肉汤平板上选择氨苄青霉素抗性转化体，并且将携带插入DNA的质粒鉴定为给出白色菌落。用Qiagen质粒纯化试剂盒(Qiagen Inc.,Chatsworth,Calif.)从所选择的菌落提取质粒并用StyI限制性内切酶(New England BioLabs,Beverly,Mass.)切割，这从幽门螺旋杆菌DNA插入物除去了内部237-bp的DNA片段。用T4DNA连接酶重新环化剩余的DNA，并转化到菌株DH5α中，并且将菌落选择为氨苄青霉素抗性。当用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:2中所示的HP引物在PCR中扩增时，转化体产生所需的222-bp片段。可以选择一个转化体，并且提取质粒DNA以用作内部PCT控制模板。
通过制备主反应混合物，在无菌条件下进行PCT分析。在1.5ml微量离心管中制备每个主混合物，并且其含有用于45个样品反应的反应物。在每个主混合物中加入826.9ml的去离子H2O，112.5ml 103Taq缓冲液(Stratagene)，45ml脱氧核苷三磷酸(5mM)，22.5ml SEQ ID NO:1或SEQ ID N:2的每一引物(25至50mM)，和5.6ml Taq聚合酶(5U/ml；Stratagene)。根据需要，以每反应23ml将主混合物等分到200ml的PCR管中。通过加入2ml提取的DNA模板将每个PCR反应混合物的体积变成25ml，所述DNA模板是如上提取的小鼠粘膜DNA，且通常包含
2mg提取的DNA的量。根据需要，短暂离心PCR反应管以混合反应物。从用进行了应激和/或灭活和/或杀死处理的幽门螺旋杆菌攻击的小鼠和根据需要从用野生型幽门螺旋杆菌攻击的阴性对照小鼠提取的含粘膜DNA的PCR反应混合物在Perkin-Elmer 9600System thermal cycler(Perkin-Elmer,Norwalk,Conn.)中循环。以在94℃15秒，在55℃30秒，和在72℃1分钟的35个循环扩增DNA了，最终延伸循环是在72℃10分钟。阳性和阴性对照反应可以与每个扩增一同进行。根据需要，也可以在每个PCR运行中使用对照模板，其由去离子H2O，对应于
1，10，和100个细胞的幽门螺旋杆菌DNA，和小鼠粘膜组织DNA(2mg)组成。通过掺入了溴化乙啶的2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并在UV光下可视化。PCR产物的检出评为定殖，而缺乏PCR产物的评分为无定殖，并提供了幽门螺旋杆菌是无活性的，并且不能复制和定殖哺乳动物胃粘膜的正面确认。
用于测量幽门螺旋杆菌或其细胞在本文任何实例中描述的组合物和/或方法中的效用的其它方法对于本领域技术人员将是显而易见的，并且被本发明所涵盖。
6.制剂
灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌或其细胞裂解物可以配制用于口服施用于人或哺乳动物。
在一个实例中，灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌或其细胞裂解物是包封的。如本文所用的术语“包封的”应理解为意指将灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌或细胞裂解物密封在可降解屏障内。例如，可降解屏障可以在胃肠道内的预定位置降解。
在一个实例中，组合物是片剂或胶囊的形式。
在另一个实例中，本发明的组合物是冻干的。在另一个实例中，本发明的组合物是粉剂。
本发明的组合物可配制为食品或膳食补充物。如本文所使用的“食品”是指任何食物产品或饮料，并且术语“膳食补充物”是指意在补充人或哺乳动物的饮食的产品，其包含维生素和/或矿物质和/或草药或其他植物和/或酸。
在一个实例中，食品或膳食补充物可以是即饮的产品。如本文所用的术语“即饮”应理解为该产品是适合于口服施用的形式而无需额外制备。合适的即饮产品可以包括，例如，苏打水，调味水，苏打调味水，含有果汁饮料(源自任何水果或水果的任何组合的果汁，源自任何蔬菜或蔬菜的任何组合的果汁)，从动物获得的乳饮料，源于大豆，稻，椰子或其它植物材料的乳饮料，酸奶饮料，运动饮料，能量饮料，咖啡，不含咖啡因的咖啡，茶，源于水果制品的茶，源于草药制品的茶，不含咖啡因的茶和液体代餐。在一个实例中，即饮产品可以包含经过滤的水，脱脂奶粉，蔗糖，小麦麦芽糊精，大豆蛋白，植物油，淀粉，菊粉，玉米糖浆固体，果糖，谷物，香料，钙，磷，红曲，维生素C，烟酸，维生素A，维生素B12，维生素B6，维生素B2，维生素B1，叶酸和盐。在另一个实例中，即饮产品可包括苏打水，玉米糖浆，焦糖色(caramel color)，咖啡因，磷酸，古柯提取物，石灰提取物，香草和甘油。在另一实例中，即饮产品可以包括苏打水，蔗糖，葡萄糖，柠檬酸钠牛磺酸，葡糖醛酸内酯，咖啡因，肌醇，烟酰胺和维生素B12。
在另一个实例中，食品或膳食补充物可以是即食产品。如本文所用的术语“即食”应理解为该产品是适合于口服施用的形式而无需额外制备。合适的即食产品可以包括，例如，代餐棒，蛋白质棒，零食和糖果产品。在一个实例中，即食产品可以包含全粒谷物，葡萄糖，糖，植物油，玉米淀粉，保湿剂，米粉，燕麦粉，脱脂奶粉和蜂蜜。
在又一实例中，在施用前，所述食品或膳食补充剂可能需要悬浮和/或重构在液体或稀释剂中。例如，所述食品或膳食补充物可以是液体或液体浓缩物或粉末。
在一个实例中，食品或膳食补充物可以是婴儿配方奶粉或后续配方奶粉(follow-on formula)或用于特殊营养用途的婴儿配方奶粉或早产配方奶粉。如本文所用的术语“婴儿配方奶粉”指的是满足年龄为达约4至约6个月的婴儿的营养需要的母乳代用品。在一个实例中，婴儿配方奶粉可以具有不小于约2500kJ/L和不超过约3150kJ/L的能含量。在一个实例中，婴儿配方奶粉可包含每100kJ 0.45克至0.7克蛋白质的量和每100kJ 1.05克至1.5克脂肪的量。在一个实例中，婴儿配方奶粉可包含每100mL少于0.05mg的铝。如本文所用的术语“后续配方奶粉”指的是婴儿配方奶粉的母乳代用品或替代物，其组成约6个月以上婴儿的营养的主要液体来源。在一个实例中，后续配方奶粉可以具有不小于约2500kJ/L和不超过约3550kJ/L的能含量。在一个实例中，后续配方奶粉可包含每100kJ 0.45克至1.3克蛋白质的量和每100kJ 1.05克至1.5克脂肪的量。在一个实例中，婴儿配方奶粉可包含每100mL少于0.05mg的铝。如本文所用的术语“用于特殊营养用途的婴儿配方奶粉产品”应理解为指的是配制以满足具有特定的代谢和/或免疫学和/或肾和/或肝和/或不良吸收的状况的婴儿的特殊需要的婴儿配方奶粉产品。例如，用于特殊营养用途的婴儿配方奶粉产品可以具有不小于约2500kJ/L和不超过约3550kJ/L的能含量。在一个实例中，用于特殊营养用途的婴儿配方奶粉产品可包含每100kJ 0.45克至1.3克蛋白质的量和每100kJ 0.93克至每
100kJ 1.5克脂肪的量。在一个实例中，婴儿配方奶粉可包含每100mL少于0.05mg的铝。如本文所用的术语“早产配方奶粉”应被广泛地解释为是指专门配制以满足在妊娠36周之前出生的婴儿的特定需要的婴儿配方奶粉产品。优选地，早产配方奶粉可包含每100kJ 0.45克至每100kJ 1.3克蛋白质的量和每100kJ 0.93克至每100kJ 1.5克脂肪的量。在一个实例中，婴儿配方奶粉可包含每100mL少于0.02mg的铝。
本发明的组合物可包含一种或多种益生元或paraprobiotics或益生菌(probiotic),
例如，作为食品，饮料，膳食补充物或动物饲料。
本文所用的术语“益生菌”应理解为活的微生物，当其以足够量的施用时赋予宿主健康益处。合适的益生菌包括，例如黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)、凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)、迟缓芽胞杆菌(Bacillus lentus)、藓样芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜淀粉拟杆菌(Bacteroides amylophilus)、多毛拟杆菌
(Bacteroides capillosus)、Bacteroides ruminocola、猪拟杆菌(Bacteroides suis)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、Bifidobacterium animalis、两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、
Enterococcus cremoris、Enterococcus diacetylactis、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、中间肠球菌(Enterococcus intermedius)、乳肠球菌(Enterococcus lactis)、嗜热肠球菌(Enterococcus thermophilus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、Lactobacillus delbruekii、发酵乳杆菌
(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊乳杆菌
(Lactobacillus reuteri)、肠膜样明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、Pediococcus acidilacticii、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、费氏丙酸杆菌
(Propionibacterium freudenreichii)、谢曼丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。
术语“paraprobiotic”是创造的词，指包含经杀死的或灭活的可以积极地影响宿主健康的微生物的这些产品(Taverniti V and Guglielmetti S,2011,Genes Nutr.6(3):261–
274)。
如本文所用的术语“益生元”应理解为不可消化的食物成分，其通过在肠道中选择性地刺激一种或多种微生物的生长和/或活性有益地影响宿主。合适的益生元包括，例如，低聚果糖(fructooligosaccharides)，反式半乳寡糖(transgalactooligosaccharides)，菊粉，阿 拉伯胶 ，低聚 木糖( xylo oligosac charides )，低聚异麦芽 糖
(isomaltooligosaccharides)，乳果糖(lactulose)和大豆寡糖。
7.施用
本发明的组合物可以配制为每日或定期施用。例如，组合物可以在以下的时期内每天施用：至少约1周，或至少约2周，或至少约3周，或至少约4周，或至少约5周，或至少约6周，或至少约7周，或至少约8周，或至少约9周，或至少约10周，或至少约11周，或至少约12周，或至少约13周，或至少约14周，或至少约15周，或至少约16周，或至少约17周，或至少约18周，或至少约19周，或至少约20周，或至少约21周，或至少约22周，或至少约23周，或至少约24周，或至少约25周，或至少约6个月，或至少约1年或超过1年。优选地，在至少约13周，或至少月3个月的时期内施用组合物。
在另一个例子中，组合物可以定期地施用，如例如，每2天或每3天或每4天或每5天或每
6天或每2周施用至少约1周，或至少约2周，或至少约3周，或至少约4周，或至少约5周，或至少约6周，或至少约7周，或至少约8周，或至少约9周，或至少约10周，或至少约11周，或至少约12周，或至少约13周，或至少约14周，或至少约15周，或至少约16周，或至少约17周，或至少约18周，或至少约19周，或至少约20周的时段。在又一实例中，该组合物可间歇施用。例如，组合物可以施用至少约1周，或至少约2周，或至少约3周，或至少约4周，或至少约5周，或至少约6周，或至少约7周，或至少约8周，或至少约9周，或至少约10周，或至少约11周，或至少约12周，或至少约13周，或至少约14周，或至少约15周，或至少约16周，或至少约17周，或至少约18周，或至少约19周，或至少约20周，或至少约21周，或至少约22周，或至少约23周，或至少约24周，或至少约25周，或至少约6个月的施用时段，之后是中断期，之后是至少1周，或至少2周，或至少3周，或至少4周，或至少5周，或至少6周，或至少7周，或至少8周，或至少9周，或至少10周，或至少11周，或至少12周，或至少13周，或至少14周，或至少15周，或至少16周，或至少17周，或至少18周，或至少19周，或至少20周，或至少约21周，或至少约22周，或至少约23周，或至少约24周，或至少约25周，或至少约6个月的施用期。优选地，其中所述组合物施用至少约13周，或至少约3个月的时期，之后是中断期，之后是至少约13周，或至少约3个月的施用期。在另一个实例中，组合物可以施用至少1年，或2年，或3年，或4年，或5年，或6年，或7年，或8年，或9年，或10年，或15年，或20年，或25年，或30年，或35年，或40年的施用期。
在一个实例中，组合物被配制为一定量的包含幽门螺旋杆菌或其裂解物的每日剂量，所述量对应于约106细胞，或约107细胞，或约108细胞，或约109细胞，或约1010细胞，或约1011细胞，或约1012细胞，或约107细胞到约1011细胞，或约108个细胞至约1010个细胞，或约109细胞到约1010个细胞。如对于本领域技术人员将是显而易见的，单个或多个剂量单位可以施用以构成每日剂量。
在另一个实例中，组合物可以配制施用于以下年龄的婴儿：0至约5岁，或0至约4岁，或0至约3岁，或0至约2岁，或在0至约1岁。在一个实例中，该组合物可配制施用施用于0至约2岁的婴儿。在另一个实例中，组合物可配制施用于约4个月到约12个月的婴儿。在另一个实例中，组合物可配制施用于小于约6个月龄的婴儿。
在另一个实例中，组合物可以配制施用于大于5岁的儿童和/或青少年和/或成人。
在又一个实例中，根据本文任何实例的本发明的组合物是美容制剂或营养制剂，如食物，片剂，胶囊，或液体饮料，用于施用于不患有本文提及的医学状况如变态反应或变应性湿疹，荨麻疹，风疹，鼻炎，哮鸣，气道阻力，气道限制，肺部炎症，食物变态反应，或哮喘等中的一种或多种或需要预防这类医学病况的受试者。例如，本发明的美容制剂或营养制剂将促进一般意义上的安康和/或增强免疫系统和/或对不需要治疗或预防任何医学状况的受试者的免疫系统提供平衡。
在又一个实例中，本发明提供了美容制剂或营养制剂的使用方法，其包括将包含根据本文任何实例的灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌或其细胞裂解物的组合物施用于不患有本文提及的医学状况如变态反应或变应性湿疹，荨麻疹，风疹，鼻炎，哮鸣，气道阻力，气道限制，肺部炎症，食物变态反应，或哮喘等中的一种或多种或需要预防这类医学病况的受试者。在一个这样的实例中，本发明的方法促进一般意义上的安康和/或增强免疫系统和/或对不需要治疗或预防任何医学状况的受试者的免疫系统提供平衡。
在以下非限制性实施例中进一步描述了本发明：
实施例
实施例1：灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌细胞的处理-方法I
本实施例证明紫外线照射，和任选的额外的冷冻-融化对于灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌细胞的有效性。
根据标准程序如下获得以登录号V13/023374保藏于澳大利亚国家计量研究院(NMI)的幽门螺旋杆菌菌株OND79细胞：通过在包含Columbia琼脂基(Product Code CM0311,Thermo Fisher Scientific,Oxoid Ltd)和7％(v/v)的无菌去纤维蛋白的马血液的Columbia琼脂(CBA)板上培养24小时，通过将生长的细胞重悬于盐溶液[0.9％(w/v)氯化钠]中，然后离心来收获细胞。然后将细胞重悬于盐水溶液，并且调整重悬细胞的浓度到每ml 1个光密度(OD)的在600nm波长处测量的吸光度。将等体积(1ml)的重悬细胞接种到含有7％(v/v)的无菌去纤维蛋白马血液的CBA板上。在37℃，在含有5％(v/v)CO2和小于5％(v/v)O2的微需氧的环境下培养板24小时。
然后，在Bio-Link BLX交联剂UV室(Vilber Lourmat,France)用紫外线C(UV-C)光(200至290nm的波长)以4Joules/cm2或12Joules/OD600铺板细胞的辐照度对板样品进行紫外线照射。例如，9cm直径的板可以通过暴露于约240Joules的UV-C来照射。然后从平板上收集经照射的细菌，重悬于盐溶液中，并且将重悬细胞的浓度调整到在每ml 20个光密度(OD)的在
600nm波长处测量的吸光度。
作为未处理对照，也收集如上所述培养，收获并接种但没有使用UV-C照射的OND79幽门螺旋杆菌细胞()，并重悬于盐水溶液中，并且将未经处理的重悬浮细胞的浓度调整到在每ml 20个光密度(OD)的在600nm波长处测量的吸光度。
直接检测经照射细胞的等分试样以确定细胞的复制能力和脲酶活性，或备选地，冷冻于-20℃，然后融化，之后进行细胞复制和脲酶测试。
为了测试经照射细胞的复制能力(任选地进行照射和冻融)，将细菌悬液系列地稀释在盐水中，接种于CBA板，并在37℃在含有5％(v/v)CO2和小于5％(v/v)O2的微氧环境下温育平板3天。然后确定所测试的各种稀释液的细胞计数。
在两个独立的实验中，对一定浓度范围中的悬浮液没有鉴定到菌落形成单位，所述浓度范围对应于在每ml 0.056-3.6个OD单位的在600nm波长处测量的吸光度。如对于接受UV-C和一轮冷冻-融化的细胞一样，对于仅接收UV-C的细胞获得了相同的结果。
通过重悬细胞的标准测定法测定了经处理的细胞的脲酶活性。简言之，将25μl包含
0.1M柠檬酸，2g/L尿素和0.01％酚红(phenol red)的脲酶缓冲液加入到等体积的经处理的细胞悬液中，并在30分钟的时间内在室温下测定该混合物的pH。在该测定中，在测定样品的颜色从黄色改变成红色指示由于尿素分解和产生铵导致pH升高。从两个独立的实验获得的数据表明，经UV-C照射的细胞相对于未经处理的细胞具有残余的脲酶活性，估计是未经处理的幽门螺旋杆菌细胞(如在UV照射前)的脲酶活性的小于10％。
与经照射细胞减少的脲酶活性一致，来自暴露于UV-C照射的幽门螺旋杆菌细胞的提取物的SDS/PAGE证明相比于未经处理的细胞，经照射的细胞经历蛋白质降解，和蛋白质聚集成高分子量复合体(数据未显示)。在1-4J/cm2的UV-C剂量范围中，这种降解和聚集的水平是剂量依赖性的，即，较高的UV-C剂量，例如，2J/cm2或4J/cm2产生增加的降解和聚集(数据未显示)。
总之，数据表明幽门螺旋杆菌的UV-C照射和任选地额外的冷冻-融化，提供了用于灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌的有效手段。
实施例2：灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌细胞的处理-方法II
本实施例证明紫外线照射或氧限制，和在紫外线照射或氧限制后任选的额外的热处理和/或仅通过热处理对于灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌细胞的有效性。
在包含Columbia琼脂基(Product Code CM0311,Thermo Fisher Scientific,Oxoid 
Ltd)和7％(v/v)的无菌去纤维蛋白的马血液的Columbia琼脂(CBA)板上培养幽门螺杆菌菌株OND79的细胞或以登录号V14/013016保藏于澳大利亚国家计量研究院(NMI)的幽门螺旋杆菌菌株OND86细胞(记载于实施例15)，或幽门螺旋杆菌菌株J99细胞达24小时，并根据标准程序，通过将生长的细胞重悬于盐溶液[0.9％(w/v)氯化钠]中，然后离心来收获细胞。然后将细胞重悬于盐水溶液，并且调整重悬细胞的浓度到每ml 1个光密度(OD)单位的在
600nm波长处测量的吸光度。将等体积(1ml)的重悬细胞铺板到含有7％(v/v)的无菌去纤维蛋白马血液的CBA板上。在37℃在含有5％(v/v)CO2和小于5％(v/v)O2的微需氧的环境下将板温育24小时(若然后将细胞进行UV照射的话)，或备选地18小时(若然后细胞经历氧饥饿的话)。
如实施例1所述，在微需氧条件下24小时后，使用UV-C光对板样品进行紫外线照射，然后从平板上收集经照射的细菌，重悬于盐溶液中，并且将重悬细胞的浓度调整到在每ml 20个光密度(OD)单位的在600nm波长处测量的吸光度。任选地，然后对重悬浮细胞在正常大气条件下进行以下的热处理：暴露于约70℃的第一升高的温度10分钟，随后立即暴露于约94℃或95℃的第二升高的温度5分钟。
备选地，如上所述在微需氧条件温育18小时后，然后通过将板转移至含气体囊剂的板气密性密封罐(AnaeroGen,AN0025A,ThermoScientific)中以产生厌氧条件，对培养的幽门螺旋杆菌细胞进行对幽门螺旋杆菌培养物消耗氧的氧限制处理。然后在厌氧条件在37℃温育板24小时或48小时或72小时的时间段。然后从板收集经历氧饥饿处理的细菌，重悬于盐水溶液中，并且将悬浮细胞的浓度调整到每ml 20个光密度(OD)单位的在600nm波长处测量的吸光度。任选地，然后对重悬浮细胞在正常大气条件下进行以下的热处理：暴露于约70℃的第一升高的温度10分钟，随后立即暴露于约94℃或95℃的第二升高的温度5分钟。
备选地，将如上所述在微需氧条件下在CBA板上培养24小时后的幽门螺旋杆菌细胞重悬于盐水溶液中，并且将浓度调整到每ml20个光密度(OD)单位的在600nm波长处测量的吸光度。然后，通过在正常大气条件下通过单独的热处理对重悬浮细胞进行灭活和/或杀死，通过将细胞暴露于约70℃的第一升高的温度10分钟，随后暴露于约94℃或95℃的第二升高的温度5分钟。
为了测试经处理的幽门螺旋杆菌细胞的复制能力，活的未经处理的幽门螺旋杆菌
OND86细胞(活的对照)的细菌悬液和经处理的幽门螺旋杆菌的细菌悬液系列地稀释在盐水中，铺板于CBA板上，并在37℃在含有5％(v/v)CO2和小于5％(v/v)O2的微氧环境下温育平板
3天，所述经处理的幽门螺旋杆菌经历以下处理：使用UV-C光(UV)的紫外线照射任选地进一步经历热处理(UV+加热)或经历48小时氧饥饿处理(O2限制)和任选地进一步经历热处理(O2限制+加热)。然后确定各种稀释液的细胞计数。从两个独立的实验得到的结果显示于图2中。结果表明，通过UV照射，UV照射和热处理，氧限制和热处理来处理幽门螺旋杆菌细胞消除了经处理的幽门螺旋杆菌细胞复制和形成菌落的能力。虽然在一个独立的实验中，其中幽门螺旋杆菌细胞经历48小时的氧限制而不经历进一步的热处理导致在CBA板上的幽门螺旋杆菌菌落，相对于未经处理的活幽门螺旋杆菌，经处理的细胞复制的能力大幅降低。在另一个独立实验中，经历用于灭活和/或杀死细胞的单独热处理的幽门螺旋杆菌细胞始终没有在CBA板上产生菌落(数据未显示)，这表明暴露于(例如，如本文所述的)单独热处理也消除了幽门螺旋杆菌细胞的复制能力。
为了测试各种氧限制处理期对幽门螺旋杆菌细胞复制的能力的作用，如上所述在厌氧条件下温育后，从板收集经受24小时，或48小时或72小时时期的氧限制而没有额外的热处理的幽门螺旋杆菌OND86细胞，重悬于盐水溶液中，并且将重悬细胞的浓度调整到每ml 1个光密度(OD)单位的在600nm波长处测量的吸光度，并且在一系列10倍稀释后接种到新鲜的CBA板上。然后在37℃在含有5％(v/v)CO2和小于5％(v/v)O2的微需氧环境下温育平板3天。
幽门螺旋杆菌能够在氧限制处理24小时后形成菌落，但是氧限制48小时后，幽门螺旋杆菌培养物表明在CBA板上的有限生长，并且在氧限制72小时后，在CBA板上没有幽门螺旋杆菌的菌落形成(结果未显示)。这些结果表明，通过约48小时或更长的时间段，例如48小时至72小时或更长时间的氧限制处理活的幽门螺旋杆菌细胞有效地降低和/或防止幽门螺旋杆菌的复制能力，从而灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌细胞。
通过标准脲酶试验测定活的未经处理的幽门螺旋杆菌OND86细胞(活的对照)和经历以下处理的幽门螺旋杆菌OND86细胞的细菌悬液的脲酶活性：使用UV-C光(UV)的紫外线照射和任选地进一步经历热处理(UV+加热)或经历48小时氧饥饿处理(O2限制)和任选地进一步经历热处理(O2限制+加热)。简言之，将25μl脲酶缓冲液(其包含0.1M柠檬酸，2g/l尿素和
0.01％酚红)加入到等体积的活的未经处理的细胞和经处理的细胞悬液中，在室温下在5分钟的时段里温育细胞后，用分光光度计在560nm处测量混合物的pH。在该测定中，确定定性的脲酶活性作为经处理的细胞的代谢活性的测量。基于测定样品的颜色从黄色改变成红色指示由于尿素分解和产生铵导致pH升高，评估幽门螺杆菌脲酶酶活性。
在下面的表1中提供了定性脲酶活性的结果。
幽门螺旋杆菌OND86细胞的处理 脲酶活性
无处理(活的对照细胞) ++
UV照射(UV) -/+
UV照射+加热 -
O2限制 ++
O2限制+加热 -
表1.定性脲酶活性。基于在室温下在5分钟的时段里温育细胞后在560nm处测量的颜色从黄色变化到红色评价了酶活性。使用四种定性水平；负，-；弱，-/+；中度，+；强++。幽门螺旋杆菌OND86细胞的处理如上所示。
在第二个独立的实验中通过上文的脲酶测试进行了活的未经处理的幽门螺旋杆菌
OND86细胞(活的对照)和经处理的幽门螺旋杆菌OND86细胞的细菌悬液的脲酶活性，只是在室温下温育细胞1分钟后在560nm处测量脲酶酶活性。将活的未经处理的细菌的脲酶活性设定为100％，将用于经处理的(即，灭活和/或杀死的细菌)的相对脲酶活性读数输出计算为对活的未经处理幽门螺旋杆菌测量的脲酶活性的百分比。在该实验中，在仅热处理后(即如上所述的，通过暴露于约70℃的升高的温度10分钟，然后暴露于约94℃或95℃的升高的温度5分钟)后，还测试幽门螺旋杆菌OND86细胞悬液的脲酶活性。经历了以下处理的幽门螺旋杆菌细胞的脲酶活性相对于活的未经处理细胞的脲酶活性读数的结果显示在图3中：仅热处理(热)，UV-C照射(UV)照射和任选地进一步热处理(UV+加热)，48小时氧饥饿(O2限制)和任选地进一步热处理(O2限制+加热)。
图2中显示的结果和表1中和图3中显示的脲酶活性结果指示虽然通过例如单独的UV处理，UV和热处理，氧饥饿和加热，或通过单独的热处理来灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌的处理可以消除幽门螺旋杆菌的复制能力，但是如通过脲酶测试确定的，经处理细胞显示残余的代谢活性。
为了进一步研究经处理的幽门螺旋杆菌细胞的代谢活性，通过测量经处理细胞的膜氧化还原电位评估了经处理的幽门螺旋杆菌细胞的呼吸(respire)的能力，所述测量通过使用来自Invitrogen(Molecular ProbesTM Invitrogen detection technologies)的
BacLightTM RedoxSensorTM CTC(产品目录号B34956)根据制造商的说明使用流式细胞术来进行。幽门螺旋杆菌OND86株的活细胞经历如上所述的单独热处理，氧饥饿48小时和任选地进一步热处理，或UV-C照射和任选地进一步热处理以灭活和/或杀死细胞。按照制造商的说明，在黑暗中大约每次(per tune)将107个细胞的等同物与5-氰基-2,3-二甲基苯交四氮唑氯(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride,CTC)温育6小时，然后通过加入4％的甲醛固定。计算了相对于活的或在热处理后经处理细胞获得的氧化还原电位，通过FACS分析获得的活的未经处理的幽门螺旋杆菌细胞或通过氧饥饿或UV-C照射处理的细胞的相对氧化还原电位的比值，以标准化不同的灭活和/或杀死的处理方案的氧化还原电位。不受限于任何特定的作用模式理论，本发明人推测，如本文所述热处理幽门螺旋杆菌细胞可以导致在经处理的细胞中破坏大部分代谢活性，并且可以进一步导致细胞形状和/或细胞聚集模式的改变。因此，考虑到可能由于细胞形状或细胞聚集的差异(其可能由于细胞的热处理导致)导致的在FACS细胞分选中的变化，进行了对热处理之后的细胞的氧化还原电位的标准化。结果显示于图4。结果表明，活的和经UV-C处理的细胞两者都是代谢活性的，并且在在热处理之前是呼吸的(respiring)(比率分别为0.85和1.1)，而通过暴露于氧限制来处理活幽门螺旋杆菌细胞通导致了0.1的比率，这指示通过氧饥饿处理细胞显著减弱了幽门螺旋杆菌的代谢活性。通过氧限制处理导致了相比于从活细胞获得的氧化还原电位比率，氧化还原电位比率的8.5倍降低，但UV-C照射对相对于活细胞的氧化还原电位比率的影响不大。
总之，本文中的数据表明，UV-C照射和任选地热处理细胞，或氧饥饿和任选热处理细胞，提供了用于灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌的有效的手段。
实施例3:在变应性气道疾病的OVA模型中幽门螺旋杆菌改善了变应性哮喘的结果
用野生型幽门螺旋杆菌(WT)，表达哮喘诱导抗原的野生型幽门螺旋杆菌(OVA)，或经处理的幽门螺旋杆菌(KD)感染成年C57BL/6小鼠(6至8周)或者保持未感染。幽门螺旋杆菌接种物包含在盐水溶液中的0.2ml幽门螺旋杆菌OND79细胞悬液，其调整到每ml 20个OD单位的在600nm波长处测量的吸光度。如实施例1所述灭活和/或杀死经处理的幽门螺旋杆菌。八(8)周后，通过用OVA/明矾i.p.致敏小鼠(第0天和14天)诱导变应性哮喘表型，然后用OVA气溶胶从第21-25天攻击5天。对照小鼠是未感染的，致敏的和攻击的(阳性)或仅致敏(阴性)。
在第26天，小鼠接受增加剂量的乙酰甲胆碱(MCh)的攻击，并测量肺部的气道阻力。图5显示了幽门螺旋杆菌保护小鼠免于诱导变应性哮喘表型。
实施例4:在变应性气道疾病的OVA模型中幽门螺旋杆菌减少总细胞计数和嗜酸粒细胞增多
用野生型幽门螺旋杆菌(WT)，表达哮喘诱导抗原的野生型幽门螺旋杆菌(HpOVA)，或经处理的幽门螺旋杆菌(KD)通过管饲法经口感染成年C57BL/6小鼠(6至8周)，或者保持未感染。幽门螺旋杆菌接种物包含在盐水溶液中的0.2ml幽门螺旋杆菌OND79细胞悬液，其调整到每ml 20个OD单位的在600nm波长处测量的吸光度。如实施例1所述灭活和/或杀死经处理的幽门螺旋杆菌。八(8)周后，通过用OVA/明矾i.p.致敏小鼠(第0天和14天)诱导变应性哮喘表型，然后用OVA气溶胶从第21-25天攻击5天。对照小鼠是未感染的，致敏的和攻击的(阳性)或仅致敏(阴性)。在第26天处死小鼠，并收集细支气管肺泡肺液。计算了在BALF中的总细胞计数(图A)和嗜酸性粒细胞计数(图B)，并且呈现了来自每组10只小鼠的募集到肺的嗜酸性粒细胞的平均数目。图6显示幽门螺旋杆菌减少总细胞计数和嗜曙红细胞增多。
实施例5:在变应性气道疾病的OVA模型中幽门螺旋杆菌减少OVA特异性IgE和OVA特异
性IgG
用野生型幽门螺旋杆菌(WT)，表达哮喘诱导抗原的野生型幽门螺旋杆菌(HpOVA)，或经处理的幽门螺旋杆菌(KD)通过管饲法经口感染成年C57BL/6小鼠，或保持未感染。幽门螺旋杆菌接种物包含在盐水溶液中的0.2ml幽门螺旋杆菌OND79细胞悬液，其调整到每ml 20个OD单位的在600nm波长处测量的吸光度。如实施例1所述灭活和/或杀死经处理的幽门螺旋杆菌。八(8)周后，通过用20μg OVA/1mg明矾i.p.致敏小鼠(第0天和14天)，然后用在盐水中的2μg OVA从第21-24天鼻内攻击4天。对照小鼠是未感染的，致敏的和攻击的(阳性)或仅致敏(阴性)。在第25天，使小鼠放血，并且通过ELISA，从分别以1:60和1：6000稀释的血清测定OVA特异性IgE(图A)和IgG(图B)抗体。结果表示为在OD405nm的个体和平均的吸光度。图7显示了在变应性气道疾病的OVA模型中幽门螺旋杆菌减少OVA特异性IgE(图A)和OVA特异性IgG(图B)的应答。
实施例6:幽门螺旋杆菌诱导IL-13
用野生型幽门螺旋杆菌(WT)，经处理的幽门螺旋杆菌(KD)通过管饲法经口感染成年
C57BL/6小鼠，或保持未感染。幽门螺旋杆菌接种物包含在盐水溶液中的0.2ml幽门螺旋杆菌OND79细胞悬液，其调整到每ml 20个OD单位的在600nm波长处测量的吸光度。如实施例1所述灭活和/或杀死经处理的幽门螺旋杆菌。作为对照，也测试了幽门螺旋杆菌10700。八(8)周后，通过用20μg OVA/1mg明矾i.p.致敏小鼠(第0天和14天)，然后用在盐水中的2μg OVA从第21-24天鼻内攻击4天。对照小鼠是未感染的，致敏的和攻击的(阳性)或仅致敏(阴性)。在第25天，从麻醉小鼠肺部收集细支气管肺灌洗液(BALF)。使用细胞因子珠阵列从未稀释的BALF测量IL-13，并表示为每组10只小鼠的平均值(pg/ml)。图8示显示在变应性哮喘模型中，在感染了幽门螺旋杆菌的小鼠的肺中降低了IL-13。
实施例7:幽门螺旋杆菌降低OVA特异性CD8T细胞
用约1x109CFU幽门螺旋杆菌(WT)通过管饲法经口感染成年C57BL/6小鼠或保持未感染
8个月，然后在0天和28天接受2个剂量的20μg OVA/2mg明矾。幽门螺旋杆菌接种物包含在盐水溶液中的0.2ml幽门螺旋杆菌OND79细胞悬液，其调整到每ml 20个OD单位的在600nm波长处测量的吸光度。在OVA/明矾攻击前一天，小鼠i.v.接受5×104经MACS纯化的CD8OT-I细胞。在第35天收获脾，并且在BrefA的存在下用SIINFEKL肽刺激及脾细胞的单细胞悬浮液4小时。进行了细胞内细胞因子染色，以通过FACS测量IFNγ的分泌。通过CD45.1表达鉴定了CD8OT-I细胞。来自胃的定殖结果表明，定殖了所有的WT感染小鼠。幽门螺旋杆菌降低了OVA特异性CD8T细胞应答并削弱了OVA特异性CD8T细胞的功能。图9显示在OVA/明矾攻击后，相比于对照小鼠，在感染幽门螺旋杆菌的小鼠中OVA‐特异性CD8T细胞的降低的数目(图A)和功能(图B)。
实施例8:幽门螺旋杆菌降低抗原特异性IgG
用约1x109CFU幽门螺旋杆菌(WT)通过管饲法经口感染成年C57BL/6小鼠或保持未感染
8周，然后i.p.注射20μg OVA/mg明矾。14天后收集血清，并且通过ELISA测定OVA特异性IgG。
在一些小鼠中，在第14天i.p.施用第二剂量的OVA/明矾。在第21天观察到(加强后7天)没有观察到OVA特异性IgG滴度的差异。在足够的免疫刺激物的存在下，小鼠能够克服幽门螺旋杆菌介导的免疫抑制的。图10(图A)显示在初次OVA/明矾攻击后，相比于对照小鼠，在感染幽门螺旋杆菌的小鼠中抗原特异性IgG的减少。图10(图B)显示在第二次攻击后7天的抗原特异性IgG应答。
实施例9:幽门螺旋杆菌降低CD4和CD8T细胞的反应性
用约1x109CFU幽门螺旋杆菌(WT)通过管饲法经口感染成年C57BL/6小鼠或保持未感
染。攻击后7个月分离脾细胞，并且在布雷菲德菌素(brefeldin)A的存在下用PMA/离子霉素刺激细胞的单悬浮液4小时。使用胞内细胞因子染色和FACS评估了IFNγ CD4+和CD8+T细胞的数目。图11显示来自感染幽门螺旋杆菌的小鼠CD4和CD8T细胞对非特异性刺激物的反应性的减少。
实施例10:在新生儿变应性哮喘模型中幽门螺旋杆菌定殖的影响
用约1x109CFU活的幽门螺旋杆菌(WT)饲喂5天龄雌性C57BL/6小鼠(n＝5-10)连续5天，或使小鼠未感染。8周后，用2个剂量的50μgOVA/1mg明矾i.p.(第0天和14)致敏小鼠，然后从第21-25天用OVA气溶胶攻击5天。对照小鼠未感染，致敏和攻击(阳性对照，即未经处理的的变应性小鼠)或仅致敏(阴性对照，即未经处理的的健康小鼠)。在第26天，小鼠接受增加剂量的乙酰甲胆碱(MCh)，测量肺组织的气道高反应性(AHR)并收集细支气管肺灌洗液
(BALF)。
图12，在图A中，显示出了结果，其中AHR结果表示为每组小鼠的平均cmH2o.s/ml。假设正态高斯分布，使用单向学生t检验来确定统计学显著性，，其中p<0.5。适用于非高斯分布的非参数Wilcoxon秩和检验显示在MCh的三个最高浓度上的统计学显著性。在图12中，图B，确定了来自肺的总的细胞浸润物并且表示为来自每组小鼠的BALF的总活细胞的平均数目。
棒表示与平均值的标准差。假设正态高斯分布，使用单向学生t检验来确定统计学显著性，其中p<0.5。
此处的结果表明，幽门螺旋杆菌减少变应性哮喘的症状。图12(A图)表明，在未感染活幽门螺旋杆菌的变应性成年小鼠中气道阻力增加，而从第5天起用活幽门螺旋杆菌攻击的小鼠与非变应性小鼠表现相当的气道阻力。图12(图B)还表明，幽门螺旋杆菌的定殖在变应原攻击后阻止肺中的细胞浸润，并且总细胞计数与非变应性对照小鼠相似。因此，活幽门螺旋杆菌保护新生小鼠免于在以后的生活中响应变应原而形成变应性显哮喘，并减少肺部的细胞浸润物。
图12表明，幽门螺旋杆菌定殖(例如在新生儿中)改善变应性气道疾病的结果，并降低发展成变应性气道疾病的风险，如使用本文描述的新生儿变应性哮喘模型中所显示的。
实施例11:新生儿变应性哮喘模型中幽门螺旋杆菌定殖对免疫学结果的影响
本发明人尤其还进行了对针对变应性疾病，如变应性气道疾病的保护的影响的并排
(side-by-side)比较，其可通过对施用活的定殖性细菌或重复经口施用经处理的幽门螺旋杆菌实现。幽门螺旋杆菌接种物包含在盐水溶液中的0.2ml幽门螺旋杆菌OND79细胞悬液，其调整到每ml 20个OD单位的在600nm波长处测量的吸光度。如实施例1所述灭活和/或杀死经处理的幽门螺旋杆菌。简言之，给5天龄C57BL/6小鼠(n＝10)喂养约109CFU的活幽门螺杆菌达连续5天或者仅处理的细菌(每周达3天，持续10周)或者保持未处理。8周后，通过用2个剂量的50μg OVA/1mg明矾i.p.致敏小鼠(第0天和14天)，然后用OVA气溶胶从第21-25天攻击5天。对照小鼠是未感染，致敏和攻击的(阳性对照，即，未经处理变应性小鼠)或是仅致敏(阴性对照，即未经处理的健康小鼠)。在第26天处死小鼠，并收集血清和细支气管肺泡肺液(BALF)。确定了每组小鼠在肺部的总细胞浸润物并表示为来自BALF的活的总细胞数的单个数目和平均数目。如图13所示，施用经处理的或活的幽门螺旋杆菌有效地减少了在经幽门螺旋杆菌处理的小鼠的肺中的细胞浸润(图A)。此外，变应原(OVA)特异性的IgE抗体通过标准ELISA方法从1:60稀释的血清测量。抗体滴度表示为在OD405nm处个体和平均吸光度。如图
13(图B)所示，经处理的幽门螺旋杆菌或活幽门螺旋杆菌的施用也减少了在经幽门螺旋杆菌处理的受试者中的变应性变应原特异性IgE抗体。*统计学显著性使用单向学生t检验，假设正态高斯分布来确定，其中p<0.5。总之，在图13的图(A)和图(B)中的数据显示施用经处理的，即灭活的和/或经杀死的(或活的)幽门螺旋杆菌在降低变应性炎症和/或变异性免疫应答中有效。
使用细胞因子珠阵列试剂盒测量来自未稀释的BALF的炎性细胞因子，IL-5和IL-13，结果表示为每组的细胞因子的平均浓度(pg/ml)并显示于图13(图C和D)中。在图13(图C和D)所示的结果表明施用经处理的(或活的)幽门螺旋杆菌成功地减少了哮喘和变应性呼吸系统疾病的细胞因子介质和生物标志物，IL-5和IL-13在肺中的产生。
在如图14所示的另一实验中，本发明人还表明施用了经处理的(即灭活的和/或经杀死的)幽门螺旋杆菌或活的幽门螺旋杆菌的成年和新生小鼠具有减少的变应性气道阻力应答。用5日龄的雌性C57BL/6小鼠(n＝5-10)以及成年C57BL/6小鼠(6-8周，n＝10)，基本上如
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实施例10所述测量肺气道高反应性(AHR)。简言之，用约10CFU/剂量经处理的细菌饲喂新生和成年小鼠，每周3次持续8周，或用约109CFU/剂量活的新鲜培养的细菌饲喂连续6天。经处理的幽门螺旋杆菌如实施例1所述被灭活和/或杀死。在第0天和14天，所有小鼠接受腹膜内OVA/明矾。从第21天用OVA气溶胶诱导变应性哮喘表型连续5天。对照小鼠未感染，致敏和攻击(阳性对照，即未经处理的的变应性小鼠)或仅致敏(阴性对照，即未经处理的的健康小鼠)。换句话说，阳性和阴性对照未接受细菌。在第26天，小鼠接受增加剂量的乙酰甲胆碱(MCh)，测量了肺组织响应MCh攻击的气道高反应性(AHR)并处死小鼠。
如图14，小图A所示，与接受经处理的幽门螺旋杆菌或活的幽门螺旋杆菌制剂的成年小鼠的气道阻力相比，未接受幽门螺旋杆菌的变应性成年小鼠(阳性对照)在变应原攻击后显示升高的气道阻力。如图14中的图B和C所示，与接受经处理的幽门螺旋杆菌或活的幽门螺旋杆菌制剂的新生小鼠的气道阻力相比，未接受幽门螺旋杆菌的变应性新生小鼠(阳性对照)在变应原攻击后显示升高的气道阻力。在图14的图A，B和C中所示的结果代表三个独立的实验，并证明幽门螺旋杆菌能够降低或减弱成人和新生儿受试者两者中响应变应原的变应性应答，例如变应性气道疾病(如哮喘)的。这些结果进一步证明，在使用活幽门螺旋杆菌或灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌时这种效应同等地出现。换句话说，结果表明灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌细菌与活幽门螺旋杆菌同样有效地减低或减弱成人和新生儿受试者两者中响应变应原的变应性应答，如呼吸道变应性疾病(如哮喘)的，从而保护受试者免受变应性疾病，如变应性哮喘。
实施例12:灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌细胞没有活的幽门螺旋杆菌细胞的相
同的定殖能力
这个实施例表明了在成年变应性哮喘模型中，灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌细胞的处理在降低幽门螺旋杆菌细胞定殖变应性受试者的胃粘膜的效力中的效用。
用约1x 109CFU OND79幽门螺旋杆菌(WT)或经处理的幽门螺旋杆菌通过管饲法经口感染成年C57BL/6小鼠(6至8周，n＝10)，每周三(3)次，持续时间为八(8)周。幽门螺旋杆菌接种物包含在盐水溶液中的0.2ml幽门螺旋杆菌OND79细胞悬液，其调整到每ml 20个OD单位的在600nm波长处测量的吸光度。如实施例1所述灭活和/或杀死经处理的幽门螺旋杆菌。在
8周期结束，通过用2个剂量的50μg OVA/1mg明矾i.p.致敏小鼠(第0天和14天)，然后用OVA气溶胶从第31-35天攻击5天。对照小鼠是未感染的，致敏的和攻击的(阳性)或仅致敏(阴性)。在第36天处死小鼠并收获胃组织。沿大弯(greater curvature)切开胃并通过用PBS轻轻洗涤除去残留食物。将打开的胃放置在500μl PBS中，并用5mm的不锈钢珠以30的频率匀浆30秒(Qiagen TissueLyserⅡ)。以10的频率进一步匀浆样品2分钟。将系列稀释的匀浆铺板到BHI琼脂平板上，所述BHI琼脂平板补充了两性霉素B(8μg/ml)，甲氧苄啶(5μg/ml)，万古霉素(6μg/ml)，萘啶酸(10μg/ml)，多粘菌素B(10μg/ml)和杆菌肽(200μg/ml)。将平板置于含有两个Campygen试剂盒气体包(Product Code CN0025A,Thermo Fisher Scientific,Oxoid Ltd)的气控室中，并在37℃温育。在铺板后5-7天测定细菌生长。幽门螺旋杆菌在感染小鼠的胃粘膜中的定殖结果显示于图15，并表示为每小鼠每个胃的菌落形成单位(CFU)的数目。
图15中的结果证明尽管活的未经处理的幽门螺旋杆菌能定殖变应性小鼠的胃粘膜，但经处理的幽门螺旋杆菌不能定殖感染的变应性成年小鼠的胃粘膜。这表明，经处理的幽门螺旋杆菌细胞不具有与具有相同基因型的活细菌相同的定殖能力。
发明人还测试了在新生变应性哮喘模型中幽门螺旋杆菌定殖的效力。具体地，发明人重复了上述实验，只是代替使用成年小鼠，用约1x 109CFU OND79幽门螺旋杆菌(WT)或经处理的幽门螺旋杆菌通过管饲法经口感染5日龄的C57BL/6小鼠(n＝5-10)，每周三(3)次，持续时间为八(8)周。幽门螺旋杆菌接种物包含在盐水溶液中的0.2ml幽门螺旋杆菌OND79细胞悬液，其调整到每ml 20个OD单位的在600nm波长处测量的吸光度。如实施例1所述灭活和/或杀死经处理的幽门螺旋杆菌。在8周期结束，如上处理小鼠。得到的结果显示，在研究开始时在5只新生小鼠的1只中实现了活的未经的处理(WT)幽门螺旋杆菌的定殖。另一方面，如通过在铺板了未稀释的和以1:10和1:100连续稀释的匀浆胃样品的BHI琼脂平板缺少任何可检测的幽门螺旋杆菌CFU显示的，没有观察到感染了经处理的幽门螺旋杆菌的任何小鼠中的定殖(数据未显示)。这些结果证实，相对于具有相同基因型的活细菌，灭活的和/或被杀死的经处理的幽门螺旋杆菌在新生受试者中也具有降低的定殖能力。
实施例13:灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌细胞不能定殖胃粘膜
本实施例支持实施例12中的发现，并进一步表明，灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌细胞的处理消除了幽门螺旋杆菌细胞定殖成年小鼠胃粘膜的能力。
用大约1x 109CFU经处理的OND79幽门螺旋杆菌通过管饲法经口重复接种成年C57BL/6小鼠(6至8周，n＝10)，每周3次持续2周。幽门螺旋杆菌接种物包含在盐水溶液中的0.2ml幽门螺旋杆菌OND79细胞悬液，其调整到每ml 20个OD单位的在600nm波长处测量的吸光度。如实施例2所述，通过使用UV-C光对活的幽门螺旋杆菌细胞进行紫外线照射和任选地进一步进行热处理，或者通过对活的幽门螺旋杆菌细胞进行48小时氧饥饿处理和任选地进一步进行热处理来灭活和/或杀死经处理的幽门螺旋杆菌。
为了测定定殖水平，在最终经口接种后2周从动物收获胃组织。沿大弯切开胃并通过用PBS轻轻洗涤除去残留食物。将打开的胃放置在500μl PBS中，并用5mm的不锈钢珠以30的频率匀浆30秒(Qiagen TissueLyserⅡ)。以10的频率进一步匀浆样品2分钟。将系列稀释的匀浆铺板到幽门螺旋杆菌选择性(DENT补充物,萘啶酸和杆菌肽)F12琼脂培养基平板上。如上所述温育平板，并且在37℃温育三天后(Anoxomat,83％N2,7％CO2,6％O2和4％H2)，计数单菌落以确定铺板后5-7天的细菌生长。
基于每个胃中的菌落形成单位(CFU)的数目评估了经处理的幽门螺旋杆菌的小鼠胃粘膜感染和定殖的效力。结果显示于图16中并证实了通过UV-C照射和任选地热处理或通过48小时氧饥饿处理和任选地进一步热处理来处理幽门螺杆菌消除了幽门螺旋杆菌细胞的定殖能力。这些结果证实了实施例12中的发现，并进一步证实，有可能通过超过仅一种处理活幽门螺旋杆菌细胞的手段灭活和/或杀死幽门螺旋杆菌和防止幽门螺旋杆菌的定殖。
实施例14:灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌在新生变应性中的免疫效力不是菌株
特异性的。
这个实例表明对针对变应性疾病的免疫保护的作用的并列比较，其通过施用来自不同地理来源并且属于幽门螺旋杆菌的遗传上远离的祖先群体的经处理的，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌菌株实现。存在通过多基因座序列定型分析鉴定的6种不同的幽门螺旋杆菌菌株的祖先群体，并且已经命名为祖先欧洲1、祖先欧洲2、祖先东亚、祖先非洲、祖先非洲2和祖先Sahul。在这个实施例中使用的幽门螺旋杆菌菌株OND79是欧洲菌株，并且在这个实施例中使用的幽门螺旋杆菌菌株J99是非洲菌株。
如实施例1和2所述通过UV-C照射处理灭活和/或杀死活的幽门螺旋杆菌OND79细胞或
幽门螺旋杆菌J99细胞。将经处理的幽门螺旋杆菌OND79细胞和经处理的幽门螺旋杆菌J99细胞施用于5日龄的C57BL/6小鼠，并且通过遵循实施例11所述的相同的方法用变应原(OVA)致敏并攻击小鼠。对照小鼠是未感染的，致敏的和攻击的(阳性对照，即未经处理的变应性小鼠)或仅致敏(阴性对照，即未经处理的健康小鼠)。在第26天，处死小鼠并且收集血清。另外，通过标准ELISA方法从1:60稀释的血清测量了变应原(OVA)特异性IgE和IgG抗体。
抗体的滴度表示为OD 405nm处单个和平均的吸光度。
如图17中显示，施用经UV-C处理的幽门螺旋杆菌OND79细胞或经UV-C处理的幽门螺旋杆菌J99细胞减少了小鼠中的变应原(OVA)特异性IgE和IgG抗体。这些结果证明通过施用经处理的，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌(如经UV-C处理的幽门螺旋杆菌)在变应性哮喘小鼠模型中赋予的效力不是菌株特异性的。这是因为相对于未经处理的变应性小鼠，不同来源的经处理的，即灭活的和/或经杀死的幽门螺旋杆菌在降低对变应原的变应性免疫应答中是有效的。
实施例15:产生在人类宿主中传代的幽门螺旋杆菌菌株以用于本发明的组合物和/或
方法。
这个实施例表明在人类宿主中传代后获得的幽门螺旋杆菌OND79的传代菌株或衍生物的产生和表征。所得到的幽门螺旋杆菌的传代菌株或衍生物适于灭活和/或杀死细胞的处理和用于本发明的组合物和/或方法中。
扩充幽门螺旋杆菌OND79以施用于人类
通过以下方法扩充幽门螺旋杆菌OND79以施用于人类。具体地，购买了可商购的
PyloriAgar(PA)板(来自BioMerieux,France)用于幽门螺旋杆菌OND79的培养以制备OND79菌株的接种物，用于人攻击。为此，将已经储存在-80℃的幽门螺旋杆菌OND79菌株的甘油原液小瓶(心脏浸出液[H1]肉汤培养基，其含有20％(v/v)的甘油和10％(v/v)的幽门螺旋杆菌OND79细胞)解冻并接种到5PA琼脂板上。使用Anoxomat(ANCTS2,Mart Microbiology,Drachten,The Netherlands)对接种了细菌的平板进行大气排空/替换循环，以产生微需氧条件(大约83％N2,7％CO2,6％O2和4％H2)并且在37℃培养72h。然后将总的平板内容物扩展到新的PA平板上。收获细菌并悬浮在1ml的无菌盐水溶液(0.9％)中。然后，用100μl的细菌悬液接种6个平板。用无菌的一次性环使细胞平均分布在平板上并且如上所述在微需氧条件下在37℃培养72h。在24h后，将4个平板收获到10ml的常规的牛肉原液(beef stock solution)(在80ml通过0.2μm Millipore注射器式滤器无菌过滤的预热的水中为1克[Continental,Unilever,Australia])中。进行了包括脲酶，过氧化氢酶和氧化酶测试以及Gram染色的生化测试以证实原液(stock solution)包含纯的幽门螺旋杆菌培养物。将细菌原液放置于冰上并运输到查尔斯爵士医院(Sir Charles Gairdner Hospital，SCGH)(Western Australia)的胃肠病学和肝脏病学部门以施用于SCGH Human Research Ethics 
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Committee批准#2009-062下的人类受试者志愿者。将大约10个活细菌通过摄取经口施用于人类受试者志愿者。施用后两周，对患者进行内窥镜检查和胃活组织检查以证实幽门螺旋杆菌定殖胃粘膜，并且在施用后至少12周的期间不处理患者以维持在人类受试者中的幽门螺旋杆菌定殖。
从人类胃活组织检查分离幽门螺旋杆菌OND86菌株
细菌接种后12周，对人类受试者进行内窥镜检查以收集一些胃活检组织。通过匀浆化[Qiagen Tissue Lyser]处理从受试者获得的一份胃窦活检组织检查，并且连续地稀释在无菌生理盐水中，以用于在幽门螺旋杆菌选择性(DENT补充物,萘啶酸和杆菌肽)F12琼脂培养基平板(Thermoscientific,Australia)上培养来自胃活组织检查的细菌。如上所述在微需氧条件下(大约83％N2,7％CO2,6％O2和4％H2)，在37℃温育细菌培养物72h，然后分离单细菌菌落并且扩展3-4倍以产生从患者的胃活组织检查分离的幽门螺旋杆菌菌株的克隆培养物。通过上述的Gram染色和生化测试证实纯的克隆的幽门螺旋杆菌培养物，并且将扩展的单菌落一式三份地冷冻和在具有20％(v/v)的植物性甘油的F12肉汤培养基(broth)(冷冻培养基)中在-80℃储存。在人受试者中传代后的来源于幽门螺旋杆菌OND79的幽门螺旋杆菌菌株的纯的克隆培养物命名为幽门螺旋杆菌OND86菌株，并且依照布达佩斯条约的规定，在2014年06月10日将样品保藏在国家计量研究院(NMI)，1/153Bertrie Street,Port Melbourne,Victoria，澳大利亚，分配NMI登录号V14/013016。
表征在人类宿主中传代后的来源于OND79的幽门螺旋杆菌的临床分离株
使用如Akopyanz et al.,(1992)Nucleic Acids Research,20:5137-5142所述的，基于PCR的随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹法，分析幽门螺旋杆菌亲本菌株OND79和如上所述从施用了亲本OND79菌株的3个人类志愿者的胃活组织检查获得的幽门螺旋杆菌的六个临床分离株之间的基因组DNA多态性。将幽门螺旋杆菌的六个临床分离株标记为“#1157克隆
1”，“#1157克隆9”，“#86198克隆1”，“#86198克隆9”，“#45156克隆1”和“#45156克隆9”。临床分离株#1157克隆1和#1157克隆9代表从施用了亲本OND79菌株的相同人类志愿者(志愿者
1)的相同胃活组织检查获得的2个克隆分离株。相似地，临床分离株#86198克隆1,和#86198克隆9代表从施用了亲本OND79菌株的相同人类志愿者(志愿者2)的相同胃活组织检查获得的2个克隆分离株。临床分离株#86198克隆1,和#86198克隆9代表从施用了亲本OND79菌株的相同人类志愿者(志愿者3)的相同胃活组织检查获得的2个克隆分离株。如上所述，选择了幽门螺旋杆菌的临床分离株#1157克隆9的纯的克隆培养物以NMID登录号V14/013016保藏为幽门螺旋杆菌OND86。
使用在SEQ ID NO:3中给出的引物“1254”(具有序列5'-CCG CAG CCA A)，或在SEQ ID NO:4中给出的引物“1281”(具有序列5’-AAC GCG CAA C-3’)对幽门螺杆菌亲本株OND79和6个临床分离株进行RAPD指纹法。如图18所示，对于亲本OND79株和人类传代衍生株的各临床分离株，包括保藏的OND86株，基因组RAPD指纹法是相同的。此种结果表明已经通过动物宿主传代的幽门螺旋杆菌菌株，如人类宿主传代的临床分离株具有和亲本OND79株相似(如果不是相同的)基因构成。
实施例16:已经在人类中传代的来源于OND79的幽门螺旋杆菌菌株显示了在感染动物
胃粘膜中的强定殖效力。
此实施例证明在人类宿主中传代后获得的幽门螺旋杆菌菌株OND79的传代菌株或衍生物能够定殖动物的胃粘膜。
成年C57BL/6(n＝5)小鼠经口胃接种大约1x 109活细菌，其来自如实施例15所述，幽门螺旋杆菌OND79在人宿主中传代后获得的幽门螺旋杆菌的六个临床分离株即#1157克隆1，#
1157克隆9，#86198克隆1，#86198克隆9，#45156克隆1和#45156克隆9中的每一个的纯培养物。为确定六个临床分离株(包括以NMI登录号V14/013016保藏的幽门螺旋杆菌OND86菌株的临床分离株)的定殖水平，在细菌施用后2周从动物收获胃组织。沿大弯切开胃并通过用PBS轻轻洗涤除去残留食物。将打开的胃放置在500μl PBS中，并用5mm的不锈钢珠以30的频率匀浆30秒(Qiagen TissueLyserⅡ)。以10的频率进一步匀浆样品2分钟。将系列稀释的匀浆铺板到幽门螺旋杆菌选择性(DENT补充物,萘啶酸和杆菌肽)F12琼脂培养基平板上。如上所述在37℃在微需氧条件(Anoxomat,83％N2,7％CO2,6％O2和4％H2)下温育平板72h，然后在铺板后5-7天计数单菌落(即细菌生长)。基于每个胃中的菌落形成单位(CFU)的数目测量了幽门螺旋杆菌OND79在人宿主中传代后获得的幽门螺旋杆菌衍生株的六个分离株中的每一个感染和定殖小鼠胃粘膜的效力。如图19中所示，全部六个临床分离株(包括保藏的幽门螺旋杆菌OND86菌株)能够有效地感染并定殖小鼠胃粘膜。
实施例17:已经在人宿主中传代的来源于幽门螺旋杆菌OND79的幽门螺旋杆菌菌株显
示在定殖动物的胃粘膜中的强效力。
本实施例表明在人宿主中传代后获得的幽门螺旋杆菌OND79的传代菌株或衍生物在动物中诱导特异性抗幽门螺旋杆菌IgG抗体。
使用成年C57BL/6小鼠来确定如上所述的幽门螺旋杆菌的六个临床分离株的免疫原性效力，所述成年C57BL/6小鼠经口胃接种有活细菌，其来自如实施例14所述的幽门螺旋杆菌的六个临床分离株中的每一个的纯培养物。。在如实施例16所述的定殖实验的终点时从小鼠收集血清。用10μg/ml的幽门螺旋杆菌X47菌株的细胞裂解液包被96孔板(Nunc 
Maxisorp)，并在4℃温育过夜。然后用PBS/0.05％Tween-20洗涤板5次，并在37℃下用2％牛血清白蛋白(BSA)封闭2小时。洗涤板两次并且将血清样品(1/20稀释)一式两份地加入到各孔中。然后在室温(RT)下温育板1小时，随后洗涤，并加入检测抗体(缀合至碱性磷酸酶的抗小鼠IgG，1/1000,Sigma)。在室温再温育平板1小时，然后洗涤。使用p-NPP对板显色60min分钟，之后用2M NaOH终止反应。抗体滴度表示为在405nm处测定的OD值。如图20所示，所有六个临床分离株(包括保藏的幽门螺旋杆菌菌株OND86)能够诱导针对幽门螺旋杆菌的抗体特异性免疫应答。
总之，本文呈现的这些结果尤其表明将幽门螺旋杆菌的活的，经杀死的或灭活形式施用于哺乳动物受试者可调节哺乳动物宿主的免疫应答以抑制或减弱针对变应原的变应性免疫应答，和/或抑制或减弱变应性气道疾病如变应性哮喘。本文呈现的这些结果尤其还表明，包含活的，经杀死的或灭活的幽门螺旋杆菌的制剂可以防止变应性免疫应答或变应性疾病的发展，如变应性气道疾病，并且可用于儿童中如新生儿和/或幼儿的免疫治疗，以防止或限制受试者中的特应性行进和变应性疾病的进展，例如预防或限制具有湿疹的儿童中的变应性疾病在以后的生活中进展成食物过敏和/或严重的哮喘。此外，如本文所证实的，通过经杀死和/或灭活的幽门螺旋杆菌赋予的抑制或减弱针对变应原的变应性免疫应答的效力不是菌株特异性的。
本发明的进一步的非限制性实施例